Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

Site Gericht spin labeling en EPR spectroscopische Studies van pentamere Ligand-ionkanalen

Published: July 4, 2016 doi: 10.3791/54127

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

In de afgelopen tien jaar is de structurele begrip van pentamere-Ionotrope receptor (pLGIC) gegroeid in sprongen en grenzen, als gevolg van massa's met een hoge resolutie structuren van een aantal leden van de familie. Belangrijke factoren die tot de huidige ontwikkelingen op het gebied omvatten de ontdekking van prokaryote pLGIC kanalen 1-3 belangrijke vooruitgang in eukaryote membraan eiwitexpressie 4-6 en enorme doorbraken in structuurbepaling benaderingen. 7 Deze structuren een duidelijke consensus de totale bescherming van de driedimensionale architectuur van pLGIC. Echter, twee belangrijke gebieden die lijken te achter parcours zijn de functionele karakterisering van deze kanaal voorbereidingen en de mechanistische beschrijving van het kanaal functie.

Gating conformationele veranderingen zijn complex en komen dus op 60 een afstand langs de lengte van het kanaal en deze overgangen worden uitgebreid gemoduleerd doormembraanlipiden. Met name negatieve lipiden, cholesterol en fosfolipiden blijkt de functie van pLGIC 8-11 moduleren. Hoewel de precieze rol van deze lipide bestanddelen in kanaal functie nog onbekend is, zou een volledige moleculaire begrip van gating vereist het bestuderen van deze kanalen in hun eigen omgeving. Site-Directed Spin Labeling (SDSL) en elektronen paramagnetische resonantie (EPR) spectroscopie zijn de technieken van de keuze voor het bestuderen van eiwit dynamiek in opgeloste systemen. EPR spectroscopie wordt niet beperkt door de molecuulgrootte (volgens NMR) of optische eigenschap van het monster (volgens fluorescentiespectroscopie), waardoor aldus metingen van volledige lengte constructen opgelost in lipide natieve omstandigheden. De techniek is zeer gevoelig en heeft een relatief lage eisen monster (in de pico-mol bereik). Beide aspecten maken de techniek zeer geschikt voor het bestuderen van grote membraaneiwitten die moeilijk in te drukken in milligramhoeveelheden.

Het gebruik van EPR spectroscopie gecombineerd met plaatsgerichte spin labeling werd ontwikkeld door Wayne Hubbell en collega's, en is aangepast voor het bestuderen van verschillende types eiwit. 12-24 EPR gegevens werden gebruikt om secundaire structuren te onderzoeken, veranderingen in het eiwit conformatie, membraan-insteekdieptes en eiwit-eiwit / eiwit-ligand interacties.

De werkwijze omvat cysteïne vervanging op posities plaats door plaatsgerichte mutagenese. Sitespecifieke labeling waarborgen, is het noodzakelijk om natieve cysteïnes te vervangen door een andere aminozuur (bijv. Serine) een cysteïne-less sjabloon. Verreweg de meest populaire spinlabel een thiol-specifieke MTSL: (1-oxyl-2,2,5,5-tetramethyl-Δ3-pyrroline-3-methyl) methanethiosulfonate die hecht aan het eiwit via een disulfidebinding brug. Door de hoge specificiteit, relatief kleine omvang (iets groter dan tryptofaan) en flexibaarheid van het linkergebied, heeft deze spinlabel aangetoond uitstekende reactiviteit zelfs met een begraven cysteïne. Voorts tot de reactiviteit te maximaliseren, de markeringsreactie van het eiwit wordt uitgevoerd in de detergens gesolubiliseerde vorm uitgevoerd. Na afscheiding van de overmaat vrije spin-label door gelpermeatiechromatografie, wordt het eiwit opgelost in liposomen of bilaag nabootsen systemen gedefinieerde lipidesamenstelling. In het algemeen wordt cysteine ​​mutagenese goed verdragen in de meeste delen van het eiwit en de betrekkelijk geringe omvang van de spin-probe geeft vrijwel geen storing van de secundaire en tertiaire structuren. Opdat de modificatie vastgehouden wildtype functies kunnen het gemerkte en geregenereerde kanalen worden bestudeerd door de patch-clamp metingen.

Het gemerkte-functioneel eiwit wordt vervolgens onderworpen aan spectroscopische metingen, die in wezen bevatten drie hoofdtypen informatie: 12,14,15,20,22,23,25-27 spin-probe dynamica van lineshaap analyse; toegankelijkheid van de sonde te paramagnetische ontspanning agenten; en afstand distributie. 27 EPR afstanden worden gemeten door twee verschillende benaderingen. De eerste is gebaseerd op de Continuous Wave (CW) techniek, waarbij spectrale verbreding gevolg van dipolaire interacties tussen spin-labels (in de 8-20 Å afstandsbereik). Wordt gebruikt om de afstand te bepalen 28,29 De tweede is een gepulste EPR methode waar afstand metingen tot 70 Å. 30-34 kan worden verlengd in Double Electron Electron Resonance (herten), oscillaties in de spin-echo amplitude worden geanalyseerd om afstanden en de afstand distributies te bepalen. Hier de spin echo gemoduleerd op de frequentie van de dipool interactie. Samen worden deze parameters gebruikt om eiwit topologie, secundaire structurele elementen, en eiwit-conformationele veranderingen te bepalen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Site mutagenese en Cys Mutaties

  1. Klonering en mutagenese
    OPMERKING: GLIC wildtype (wt) 35 heeft een natieve cysteïne (C27), die is gemuteerd naar serine-cysteïne een minder achtergrond te maken. Cysteïne mutaties worden geïntroduceerd op de cysteïne-less achtergrond door plaatsgerichte mutagenese onder toepassing van primers die een cysteïne codon voeren op de gewenste positie 36.
    1. Meng 5 ui 10x reactiebuffer, 1 pi 100 ng / ul cysteine-loze GLIC matrijs DNA 35, 0,5 pl elk van 40 pM forward en reverse primer 36, 1 pl dNTP's (100 mM), en 41 pl gedeïoniseerd water . Pipetteer het monster een paar keer om het goed te mengen, centrifugeren (6000 rpm) en tot slot voeg 1 pl DNA polymerase.
    2. Stel de thermo-cycler het volgende protocol:
      1. Denaturatie bij 95 ° C gedurende 4 min.
      2. Denaturatie bij 95 ° C gedurende 30 sec.
      3. temperening bij 55 ° C gedurende 1 min.
      4. Verlenging bij 68 ° C gedurende 10 min (ongeveer 1 minuut per kb plasmide lengte).
      5. Herhaal stap 1.1.2.2 - 1.1.2.4 voor 18 cycli.
      6. Een laatste verlenging bij 68 ° C gedurende 10 minuten.
      7. Houden temperatuur op 4 ºC
        OPMERKING: Uitgloeitemperatuur is berekend op basis van de primer Tm.
    3. Voeg 1 pl DpnI aan het reactiemengsel, grondig mengen door pipetteren en spin down (6000 rpm) gedurende 1 min. Incubeer gedurende 2 uur bij 37 ° C.
  2. transformatie
    1. Dooi E. coli competente cellen op ijs. Aliquot 30 pi cellen in een 14 ml steriele transformatie buis en voeg 1 pl gedigereerde DNA aan de cellen. Meng door op de zijde van de buis. Incubeer gedurende 20 min op ijs.
    2. Plaats de buis in een 42 ° C waterbad gedurende 45 seconden en zet hem weer op ijs gedurende 2 minuten. Voeg 400 ul steriele SOC media en schud de cellen in een Incubator bij 37 ° C gedurende 1 uur.
    3. Plaat 100 ul van cellen op LB-platen bevattende kanamycine (50 uM) en 1% glucose. Incubeer de platen O / N bij 37 ºC.
    4. Oogst van een enkele kolonie van de plaat en inoculeren in 5 ml O / N kweken die LB / kanamycine media. Incubeer de cultuur O / N (~ 16 uur) bij 37 ° C in een incubator shaker.
    5. Uittreksel DNA van de O / N kweek door minipreparation 37. Kwantificeren van de opbrengst van DNA onder toepassing van een spectrofotometer door het meten van de absorptie bij 260 nm golflengte. 200 ng / ul - de concentratie moet ~ 100 zijn. Bevestigen de aanwezigheid van de mutatie door middel van standaard recombinant DNA-sequencing strategieën 38,39.

2. GLIC Expressie en zuivering

  1. transformatie
    1. Volgens de in paragraaf 1.2 beschreven, transformatie 30 pi competente cellen C43 met 1 ui (100-200 ng / ul) van het plasmide dat het gen dat codeert voor GLIC samen met een Human Rhinovirus (HRV) -3C proteasesplitsingsplaats (Voor de plasmide en gensequentie, wordt verwezen naar de aanvullende tekst) 35 (vanaf stap 1.2.5).
    2. Plaat 100 ul van cellen op LB-agar platen die 1% glucose en 50 ug / ml kanamycine, en incubeer ze O / N (= 16 uur) bij 37 ° C in een incubator.
    3. Controleer visueel voor kolonies en ervoor zorgen dat ze niet over-geteeld of tonen de aanwezigheid van satelliet-kolonies. Onmiddellijk dichten van de platen met parafilm en op te slaan bij 4 ºC.
  2. Het opzetten van O / N-culturen en de voorbereiding van de groei media
    1. Sla een geïsoleerde kolonie middels lus enten draad en over in een 100 ml steriele kolf die 20 ml Luria Broth (LB) medium aangevuld met steriele 1% glucose en 50 ug / ml kanamycine. Incubeer hen O / N (= 16 uur) bij 37 ° C in een schudinrichting bij 250 rpm.
    2. Autoclaaf 900 ml Terrific Broth (TB) media (zie Media en Buffer Composition) in 2.8L Fernbach glasflessen voor de bacteriecultuur in stoom cyclus bij 121 ° C gedurende 20 min.
  3. Het opzetten van grote groei culturen
    1. Voeg 100 ml steriel kaliumfosfaatbuffer (Zie Media en Buffer Samenstelling) aan de geautoclaveerde TB media. Voeg steriele glucose (0,2% eindconcentratie), kanamycine (50 ug / ml) en 10 ml van de O / N kweek. Incubeer bij 37 ° C in een schudinrichting bij 250 rpm.
    2. Controleer de extinctie bij golflengte 600 nm (OD 600) met behulp van een densitometer of spectrofotometer uur totdat 0,5 (~ 2 uur) bereikt. Op dit moment beperken de snelheid 150 rpm en laat de temperatuur tot 18 ° C. Controleer de OD 600 elke 30 min totdat zij tot 0,8 (~ 1 uur).
    3. Voeg 50 ml glycerol en verder schudden van de kweek tot de OD 600 bereikt 1,0-1,2 (~ 15-30 min).
      NB: Onder deze omstandigheden, het duurt ongeveer een uur voor de kweek tot 18 ºC bereiken vanaf 37 ºC. Het is important dat glycerol wordt toegevoegd aan de kweek na afkoeling tot 18 ° C.
    4. Induceren van de cellen met 200 pM IPTG (isopropyl-thio-β-galactoside) en opnieuw de shaker naar 250 rpm en incubeer verder gedurende 16 uur bij ~ 18 ° C.
  4. Protein Purification
    1. Controleer of de OD 600 eind 16 hr ~ 16 - 18. Oogst de cellen in 1,0 L centrifuge flessen door het draaien bij 8500 xg, 4,0 * C gedurende 15 minuten. Decanteer het supernatant en wegen van de fles met de celpellet. Bereken het gewicht van de pellet door het aftrekken van het gewicht van de lege fles van het totale gewicht.
      OPMERKING: De verwachte gewicht celpellet is ~ 30 - 35 g / l. Hoewel moet worden opgemerkt dat er kan variabiliteit in het eindgewicht OD 600 en celpellet in mutanten.
    2. Resuspendeer de bacteriële pellet in 150 ml ijskoude buffer A (100 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 7,4) per 1.0 L van de cultuur. Voeg DNase I (100 ug / ml) en proteae remmers (fenylmethylsulfonylfluoride (1 mM), leupeptine (2,0 gg / ml), aprotinine (2,0 ug / ml) en pepstatine A (1 ug / ml)).
    3. Homogeniseren van de cellen door ze door een cel disrupter in een 4,0 ºC koude kamer. Herhaal het proces drie keer zo dat de meeste bacteriën gelyseerd. Centrifugeer de cellen bij 14.000 xg gedurende 15 min en de supernatant pipet uit en in een schone centrifugebuis. Gooi de pellet, die niet-gelyseerde cellen en inclusielichamen bevat.
    4. Centrifugeer de supernatant bij 168.000 xg gedurende 1 uur. Scheid voorzichtig de bovenstaande zonder verstoring van het membraan pellet.
    5. Verzamel de membraan pellet van 1 liter cultuur en resuspendeer in Buffer A (aangevuld met 10% glycerol) tot een eindvolume van 50 ml. Voeg 0,5 g n-Docecyl-β-D-Maltopyranoside (DDM) aan de membraansuspensie en nutate gedurende 2 uur bij 4,0 ° C.
    6. Na membraan oplossen, verwijderen cel puin van het lysaat door centrifugatie bij 168.000 xg gedurende 1 uur. In de tussentijd bereiden amylose hars. Overdracht 3 ml hars met een pipet in een lege polypropyleen chromatografiekolom. Was de hars door het passeren van 10 volumes bed van water 3 keer en dan met 10 bed volumes buffer A die 0,5 mM DDM.
    7. Na centrifugeren, verwijder voorzichtig de supernatant met behulp van een pipet overgebracht in een schone 50 ml conische buis. Voor ladingsgewijze binding, voeg vooraf geëquilibreerd amylosehars de conische buis. Bind het geëxtraheerde eiwit amylosehars door Tuimelschijfmeter het mengsel gedurende 2 uur bij 4,0 ° C.
    8. Leid de gehele suspensie door een chromatografie kolom en verzamel het doorstroomkanaal. Laat vervolgens de gehele verzamelde doorstroom op de hars een tweede keer om binding te maximaliseren.
    9. Pass 10 bedvolumes buffer A met 0,5 mM DDM, 0,5 mM tris (2-carboxyethyl) fosfine (TCEP) en 1 mM ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) om ongebonden eiwitten te verwijderen.
    10. Elueer het GLIC eiwit met 10 ml Buffer A met 40 mM maltose naast 0,5 mM DDM en 0,05 mM TCEP. TCEP voorkomt oxidatie van cysteïne zijketens. Verzamel de gehele eluaat.
    11. Concentreer het geëlueerde eiwit middels centrifugale concentrator (Molecular Weight Cut-off = 50 KDa) tot 4-6 mg / ml en voeg HRV-3C protease (200 ug per 10 mg eiwit) en geïncubeerd O / N bij 4,0 ° C.
      OPMERKING: Ga na de voltooiing van protease digestie door uitvoering van de monsters aan SDS-PAGE-gel (zie stap 2.5.5 en figuur 1).
  5. Site-Directed Spin-labeling
    1. Voeg ongeveer 100 pi 200 mM voorraad (1-oxyl-2,2,5,5-tetramethyl-Δ3-pyrroline-3-methyl) MTSL 40 in DMSO en bewaar de voorraad bij -20 ° C in 25 pi aliquots.
    2. Gebruik de-protease verteerde monster voor spin-labeling met MTSL. Voeg 10-voudige molaire overmaat van MTSL spin-label (GLIC monomeer: ​​MTSL in 01:10 molverhouding). Incubeer op ijs gedurende 1 uur. Voeg een tweede schot van spin-label op een 5-voudige molaire overmaatverhouding en incubeer gedurende nog een uur.
      OPMERKING: Bij begraven posities (met klein spin labeling, hieronder beschreven), een 30 maal molaire overmaat van spin label wordt toegevoegd en het eiwit wordt gedurende 6 uur.
    3. Passeert het monster een op grootte-uitsluiting Fast Protein Liquid Chromatography kolom (FPLC) die vooraf geëquilibreerd met buffer A en 0,5 mM DDM voor het gesplitste MBP en de overmaat vrije spin-label van GLIC pentameren scheiden. Verzamel 1 ml fracties in totaal 30 ml elutie. Verzamel de fracties die GLIC pentameren (figuur 1). Volg de instructies van de fabrikant om de FPLC draaien.
    4. Bepaal de concentratie van het monster met een spectrofotometer door het meten van de absorptie bij 280 nm golflengte. Molaire extinctiecoëfficiënt en het geschatte molecuulgewicht van GLIC monomeer 49.850 M-1 cm-1 en 36.380 Da, respectievelijk. Concentreer de eiwitoplossing met een centrifugale concentrator (MolecularWeight Cut-off = 50 KDa) tot een uiteindelijke concentratie van ~ 8-10 mg / ml en plaats het op ijs. Het monster is nu klaar voor reconstitutie.
    5. Als extra kwaliteitscontrole om ervoor te zorgen dat de voorbereiding is biochemisch homogeen, lopen een vermindering van (1,0% β-ME) SDS-PAGE gel.
      OPMERKING: De Coomassie gekleurde gel moet een enkele band zien bij ~ 33 kDa die overeenkomt met de GLIC monomeer (figuur 1).
    6. Voor de spin-gelabelde mutanten vermoedelijk vertonen dipolaire verbreding onder-etiket van de monsters in de aanwezigheid van 41 diamagnetische label. Incubeer het geëlueerde eiwit met 0,1-voudige MTSL en incubeer op ijs gedurende 1,0 uur. Daarna voeg 20-voudige molaire overmaat diamagnetische label (1-acetoxy-2,2,5,5-tetramethyl-Δ3-pyrroline-3-methyl) methaan thiosulfonate.
      OPMERKING: De diamagnetische reagens hier gebruikte iso-sterische de paramagnetische label met dezelfde labeling chemie.
    7. Incubeer het monster op ijs gedurende 2 uur. Passeert het monster door een size uitsluitingschromatografie kolom die vooraf is geëquilibreerd met buffer A en 0,5 mM DDM als in stap 2.5.3.
  6. Efficiëntie van spin labeling
    1. Spin label rendement wordt gedefinieerd als de verhouding van de spin-label concentratie de concentratie van cysteïne zijketen (GLIC-monomeer). Om de efficiëntie van spin label van het monster te bepalen, wordt de geïntegreerde intensiteit van het monster vergeleken met een standaard van bekende concentratie met een kalibratie plot. Maak oplossingen van een EPR standaard (zoals 2,2,6,6-tetramethyl-1-piperidinyloxyl: TEMPO) in verschillende concentraties (10-250 uM) door oplossen in water.
    2. Meet de EPR signaal voor elk van deze oplossingen en het gebied onder de curve (dubbele integratie van het EPR-signaal) voor elke concentratie te bepalen (zoals beschreven in stap 6.1). Genereer een ijkcurve door de gemeten gebied als functie van de TEMPO concentratie en het aanbrengen met een rechte lijn.
      LET OP: Het zijneen onder een derivaat EPR signaal is een betere beschrijving van de spectrale intensiteit dan de piek tot piek amplitude. Integratie van de eerste afgeleide EPR signaal het absorptiespectrum, zullen een tweede integratie dan geeft het oppervlak onder het absorptiespectrum (die evenredig is met de spin concentratie). Zorgen voor een constante basislijn zowel in lage-veld en hoge veldgebied van het spectrum.
    3. Meet de concentratie van de spin-gelabelde eiwit in het detergens met een spectrofotometer (zoals in stap 2.5.4). Nu is het meten van de EPR-signaal van het monster en dan bepalen het gebied van de dubbele integraal van de EPR signaal volgende stappen in paragraaf 6.1. Via de kalibratie plot, het gehalte aan het label dat overeenkomt met de gemeten EPR signaal. Bereken de spin labelingsefficiëntie de molverhouding van spin label en eiwitconcentratie.

3. GLIC Reconstitutie in Asolectin Membranen

  1. Spoel een schone 25 ml rondbodemkolf met 5 ml chloroform en droog de ​​kolf in een stroom N2 gas in de zuurkast. Overdracht 10 mg asolectin (soja polaire extract 25 mg / ml voorraad in chloroform) in de kolf en droog de ​​lipiden onder een continue stroom N2-gas.
    NB: De keuze van de lipiden voor reconstructie is gebaseerd op bevindingen uit experimenten in hoofdstuk 4.
  2. Wanneer de chloroform verdampt, de kolf in een vacuum gedurende 1 uur tot volledige droging. Voeg 1 ml van buffer A reconstitutie aan de gedroogde lipide en vortex de kolf krachtig aan de lipide pellet krijgen suspensie.
  3. Kleine unilamellaire blaasjes te bereiden, ultrasone trillingen de lipide suspensie in een koude badsonicator tot de vesicle oplossing min of meer doorschijnend en geen klonten ontstaan ​​(ongeveer 10 - 15 min). Aan dit mengsel toevoegen DDM tot een eindconcentratie van 4 mM en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 min.
<li> Reconstitutie
  1. Voeg het gezuiverde eiwit uit stap 2.5.4 aan de lipide mengsel.
    OPMERKING: Het eiwit tot lipideverhouding afhankelijk van het type experiment. Voor macroscopische stroommetingen, een 1: 10.000 verhouding gebruikt. Voor EPR studies wordt reconstitutie uitgevoerd bij een hogere eiwit lipideverhouding (1: 2500) om het signaal te maximaliseren. Het is eerder aangetoond dat deze concentraties geen zijdelingse aggregatie waargenomen 42.
    OPMERKING: Typische werkhoeveelheid van GLIC voor EPR is ~ 1 mg, hoewel gebaseerd op de positie gesondeerd, zouden kleinere hoeveelheden zo goed.
  2. Incubeer het monster bij 4 ° C gedurende 1 uur met zachte rotatie verdun vervolgens het monster tot 15 ml met buffer A.
    OPMERKING: Deze stap brengt de concentratie reinigingsmiddel onder de kritische micellaire concentratie (CMC).
  3. Verwijder de zeepresten in de suspensie door het toevoegen van polystyreen korrels (met hydrofobe poriën die val wasmiddel). Voeg 80 mg van het reinigen van de kralen en incubeer de liposome schorsing O / N op een nutator bij 4 ºC.
    1. De korrels gebruiksklaar te maken, weeg ~ 100 mg en overbrengen naar een 50 ml conische buis. Voeg 10 ml van methanol, schud krachtig, spin down de kralen bij 8.000 xg gedurende 2 minuten, en giet de methanol. Herhaal dit proces van methanol Was driemaal. Herhaal dit met 30 ml gedeïoniseerd water, driemaal wassen.
  4. De volgende dag, dragen de liposoom naar een 25 ml buis ultracentrifuge toepassing van een kolom filter om de korrels te verwijderen en het monster verder te verdunnen tot 25 ml. Centrifugeer de monsters bij 168.000 xg gedurende 2 uur. Giet het supernatant en resuspendeer de pellet met 100 pl Buffer B.

4. Bepaal Optimale Lipid Compositie voor Reconstitutie door FRET

  1. Gebruik een fluorescentie-energieoverdracht (FRET) gebaseerde bepaling om het membraan preparaat dat het eiwit handhaaft monodisperse bepalen.
  2. Zuiver gew
  3. Na in paragraaf 3.2 om de oplossing te bereiden drie monsters per lipidesamenstelling te testen, eerste, fluoresceïne-gelabelde GLIC in een molaire verhouding van 1:. 1500 (pentameer: ​​lipide) tweede-rhodamine gemerkte GLIC in een molverhouding van 1: 1500 (pentameer: ​​lipide). Ten derde, meng wasmiddel oplosbaar fluoresceïne en rhodamine gemerkt GLIC (1: 1 molverhouding). Reconstrueren dit mengsel in 1: 750 (pentameer: ​​lipide) ratio.
    LET OP: We gebruikten drie lipide-systemen: asolectin, POPC: POPG (3: 1 molverhouding) en E. coli polaire extract. Het eiwit lipide reconstitutie verhouding in het FRET experiment hoger zijn dan bij EPR metingen (1: 750 in relatie tot 1: 1500 voor EPR studies).
  4. Verdundhet liposoom suspensie (de lichtverstrooiing signaal te verminderen; ~ 5 ul in 995 pl Buffer A), dan pipet het monster in een kwarts cuvet en plaats deze in een fluorimeter.
  5. Stel de golflengte excitatie bij 490 (die overeenkomt met de absorptiemaxima van de donor: fluoresceïne). Volgens de instructies van de fabrikant, nemen de emissiespectra van 500 nm tot 660 nm.
    LET OP: Voor de fluoresceïne-gelabelde GLIC sample, zie je een piek bij 518 nm (overeenkomend met fluoresceïneemissie) zonder piek bij 572 nm (overeenkomend met rhodamine emissie). Voor de-rhodamine gemerkte GLIC sample, zul je niet een piek te zien bij 518 nm, maar in plaats daarvan bij 572 nm als gevolg van directe excitatie van rhodamine bij 490 nm. Voor het monster dat zowel fluoresceïne en rhodamine labels, een afname in fluoresceïne piekintensiteit en een corresponderende toename van rhodamine piek is een FRET signaal dat waarschijnlijk een indicatie van laterale aggregatie van het eiwit op het membraan.
  6. bewaken van deamplitude van rhodamine emissie bij 572 nm op verschillende tijdstippen (0-24 uur) opname op elk uur gedurende de eerste 6 uur en vervolgens na O / N incubatie (Figuur 2). Voor elk interval, het meten van de fluorescentie-intensiteit bij 572 nm (voor rhodamine: Ia) en 518 nm (voor fluoresceïne: Id). Trek de bijdrage van directe rhodamine activering (monster 2 in stap 4.3) van Ia (IAC). Bepaal de FRET-ratio Iac / (IAC + Ib). Vergelijk FRET op verschillende tijdstippen en in verschillende lipide composities.
    Opmerking: Als controle uitvoeren stap 4,5 en 4,6 voor detergent gesolubiliseerd monsters en vergelijkt de emissiespectra voor uit gereconstitueerde liposomen. Gebruik een equimolair mengsel van gemerkt eiwit in detergens (beschreven in stap 4,3) en verdund in buffer A aangevuld met 0,5 mM DDM. Verwacht wordt dat detergens monsters minimale FRET signaal tonen.

5. Functionele Metingen door Patch-clamp Recordings

  1. Bereid proteoliposomes voor patch-clamp metingen op precies dezelfde manier als voor EPR studies (paragraaf 3.1).
    LET OP: Echter, past het eiwit: lipide-ratio op basis van de aard van de meting moet worden verricht (Single-channel vs Macroscopische opnames). Flash-bevriezen de proteoliposomen in vloeibare stikstof en bewaar bij -80 ° C tot gebruik. Typisch, reconstrueren GLIC in 1: 10.000 eiwit: lipide (molverhouding) voor macroscopische stromen en 1: 50.000 molverhouding voor single-channel opnames.
  2. Dooi liposomen op ijs. Spoel een schone glasplaatje met water en ethanol en droog volledig. Plaats een 10 ul druppel van het proteoliposoom in het midden van de schuif en droog O / N in een exsiccator bij 4 ° C onder vacuüm.
  3. Re-hydraat gedroogde proteoliposomen door toevoeging van 20 pl buffer B (150 mM NaCl, 10 mM HEPES, pH 7,0) en plaats de dia in een petriplate bovenop een vochtig filterpapier. Bedek de plaat en laat de rehydratie verlopen gedurende ongeveer 2 uur.
    OPMERKING: Dit proces yields gigantische multi-lamellaire liposomen die bevorderlijk zijn voor patch uit zijn.
  4. Trek patch pipetten van dunwandige borosilicaatglas haarvaten (~ 1-2 micrometer tip diameter) met behulp van de fabrikant aanbevolen instelling op de pipet trekker. Heat-polish met behulp van een brand-smeden tot een weerstand van 1,5 - 2MΩ wanneer gevuld met Buffer B.
  5. Vul de opname kamer met buffer B met behulp van een pipet en bevestig de Ag / AgCl aardelektrode. Met behulp van een 2 pi pipet tip voorzichtig los van de liposomen van de rand en overdracht 1 pl van de schorsing voor de opname kamer. Wacht een paar minuten voor de liposomen om zich te vestigen op de bodem.
  6. Vul het patch-pipet met Buffer B met behulp van een niet-metalen injectienaald en monteren op de versterker hoofd-podium. Identificeer een enkele geïsoleerde blaasje te patchen. Breng een lichte positieve druk om te voorkomen dat de patch-pipet verstopt raakt, en steek de punt in de opname kamer.
  7. Solliciteer testpulsen aan de pipet resistant metennvu en te compenseren voor de pipet spanning te compenseren. Benader het blaasje, en wanneer contact wordt gemaakt, breng dan een lichte onderdruk om trek het blaasje tegen de patch pipet om een ​​gigaohm afdichting te vormen.
  8. Bewaken van de weerstand van de pipet gedurende het gehele proces. Zodra de gigaohm afdichting is gevormd, trekken de pipet voorzichtig uit de buurt van het liposoom om een ​​inside-out patch vormen. Schakel de test puls.
  9. Stel de holding potentiaal -100 mV, en pas een pH puls. Lage pH werd verkregen met 10 mM natriumcitraat buffer C (150 mM NaCl, 10 mM citraat, pH 3,0). (Figuur 3)
    OPMERKING: Opnames worden gemaakt met een sampling frequentie van 10 kHz voor macroscopische en 40 kHz voor single channel metingen.

6. EPR Metingen

  1. Continuous-Wave EPR spectroscopie
    1. Breng de liposoom suspensie van stap 3.2 in een 200 ui buis en pellet de monsters met behulp van een centrifuge. Gooi de supernatant en monster is klaar voor EPR metingen.
      OPMERKING: EPR metingen is het belangrijk om zoveel buffer van het liposoom monster mogelijk te verwijderen. Aangezien waterige monsters absorberen de elektrische deel van de magnetron resulteert in verwarming en minder gevoelig.
    2. Om buffer uitwisseling uit te voeren, overdracht 20 ul van liposoom pellet met behulp van een pipet om een ​​microfugebuis. Voeg 180 ul buffer D (100 mM NaCl, 10 mM citraat, pH 3,0) en incubeer bij 42 ° C waterbad gedurende 5 min. Centrifugeer het monster, de bovenstaande vloeistof met een pipet en herhaal het proces drie keer om volledige bufferuitwisseling waarborgen.
      LET OP: Als alternatief kan de buffer uitwisseling worden gemaakt door het onderwerpen van de monsters aan meerdere vries / dooi cycli.
    3. Gasdoorlatend plastic haarvaten zijn geschikt voor het meten van zowel de spectrale lijn-vormen en solvent toegankelijkheid. Tik op de capillaire op het ingehulde proteoliposoom om het monster binnen te trekken en sluit het uiteinde met bot was.
      NIETE: Typisch sample volumes zijn ~ 5 pl en een wenselijke spin-concentratie van 150 uM. Als het doel is om lijn vormen alleen te meten, kan men gebruik maken van 0,4 mm OD kwarts capillaire buizen. Indien nodig kan een pipet worden gebruikt voor het vullen van het monster in het capillair.
    4. Bedien de spectrometer
      1. Voer CW-EPR metingen bij RT (292-297 K) op een X-band spectrometer uitgerust met een diëlektrische resonator volgens de fabrikant handleiding.
      2. Zet het water chiller, voeding, en een magnetron brug console. Laat het systeem thermisch evenwicht gedurende ongeveer 30 minuten voordat de opname. Open de acquisitie software.
      3. Steek de monsterbus / capillair in de resonator, ervoor te zorgen dat het gedeelte van de buis gevuld met het monster is in het centrum van de resonator holte. Tunen van de resonator volgens de instructies op de spectrometer handleiding.
      4. Noteer de eerste afgeleide absorptiespectrum door veld sweep opeen incident microgolfvermogen van 1,0 mW, een modulatiefrequentie van 100 kHz en een sweep breedte van 100 G. Bepaal de optimale stroom voor het experiment door middel van een progressieve power verzadiging experiment waarbij de piek-tot-piek hoogte van de eerste afgeleide CW EPR signaal wordt gemeten als functie van de vierkantswortel van het invallende microgolfvermogen.
        OPMERKING: Bij lagere magnetron krachten, de intensiteit van het signaal neemt toe met de vierkantswortel van het vermogen zolang het evenwicht van de bevolking spintoestanden niet beïnvloed. Echter, als de stroom verder wordt verhoogd, de spin-rooster relaxatie kan niet langer handhaven evenwicht Verschil populatie van beide spintoestanden en de signaalamplitude gaat plateau of "verzadiging". Voorbij dit punt, kan het signaal amplitude daadwerkelijk afneemt met toenemende macht in acht te wijten aan populatie-inversie van spin verzadigt. Bovendien, voor verbrede spectra met uitgebreide vleugels, waar een welomschreven flat basislijn is niet vilijk, het uitbreiden van de sweep breedte 150-200 G tot gebied te voorkomen.
      5. Begin met behulp van een modulatie-amplitude van 1,0 G.
        LET OP: Deze waarde is sample-afhankelijk en aangepast aan de lage frequentie ruis in het signaal te verlagen. Indien een te grote waarde wordt gebruikt, kan het verstoren of het signaal verbreden.
      6. Stel de tijd constant en de omschakeling tijd om 20,48 msec, vegen de tijd om 20.97 sec, en op 1024 punten.
        OPMERKING: De tijdconstante is ook gebaseerd op het monster en aangepast te filteren hoogfrequente ruis.
      7. Na de eerste scan, ligt het middenveld in het midden van het EPR-signaal en kies sweepbreedte zodat het spoor omvat het signaal en voldoende basislijn aan weerszijden.
        OPMERKING: Ook, het verbeteren van de signaal / ruisverhouding, verhoging van het aantal scans basis van de sterkte van het EPR-signaal. Inclusief sweep breedte en het aantal punten
      8. Meet de toegankelijkheid van de spin-label om botsingen ontspannende agenten O 2 27 beschreven in stap 6.1.4.4.
        LET OP: Bereid Niedda zoals eerder 26 beschreven.
      9. Perfuseren eerst het monster in de holte met N2 gedurende 5 minuten (te spoelen O 2). Meet de spectra voor elke magnetron macht tussen 5 - 35 dB in stappen van 3 dB met een sweep breedte van 30 G.
      10. perfuseren dan het monster in de holte met lucht gedurende 10 min en meet de spectra op verschillende magnetron vermogens (5-35 dB in stappen van 3 dB) als in stap 6.1.4.9.
      11. Incubeer 20 ui liposoom pellet met 180 pl 50 mM Niedda (in Buffer B of Buffer D) in een 42 ° C waterbad gedurende 5 min. Centrifuge het monster en de bovenstaande vloeistof met een pipet. Laad het monster in het capillair en plaats het in de resonator holte. Herhaal stap 6.1.4.9.
        LET OP: Het principe achter het experiment is dat de interactie met paramagnetische relaxing agenten door middel van Heisenberg spin-uitwisseling zou verzadiging van het signaal en de populatie-inversie te voorkomen. Wateroplosbare en vetoplosbare Niedda moleculaire O 2 worden gebruikt als reporters voor water (zowel bulk als intraprotein balkons) en membraan blootgestelde posities op het eiwit.
  2. Analyse gegevens:
    LET OP: De analyse van de EPR-gegevens omvat de volgende stappen: 14,22,23,25-27
    1. Bereken de mobiliteit van de spin probe (AH o -1), als het omgekeerde van de centrale lijn breedte van de eerste afgeleide absorptiespectrum. AH o -1 weerspiegelt de bewegings vrijheid en de dynamiek van de sonde.
    2. Bereken de toegankelijkheid parameter (П), hetgeen een schatting van de toegankelijkheid van de sonde naar andere paramagnetische botsing ontspannende middelen, middels hieronder beschreven stappen.
      LET OP: Interactie van de spin-probe met paramagnetische ontspannende agentenverhoogt de spin-rooster ontspanningsgraad (T 1) van het nitroxide door Heisenberg spin-uitwisseling. 27
      1. Schat de toegankelijkheid parameter (П) van stroom verzadigingsexperimenten (6.1.4.8) waarin de verticale piek-tot-piek amplitude van de middellijn van de eerste afgeleide EPR spectrum wordt gemeten bij verschillende microgolfenergie. 25 Plot de amplitude van het signaal als functie van de vierkantswortel van het microgolfvermogen en past de volgende vergelijking 27.
        vergelijking 1
        OPMERKING: waarbij A de amplitude van het signaal is een maat voor de homogeniteit van de verzadiging van de resonantielijn (gewoonlijk tussen 0,5 en 1,5), I is een schaalfactor, P het incident kracht en de staat voor de waarde waarbij de eerste afgeleide amplitude helft van de onverzadigde waarde.
  3. Bereken AP 1/2 waarden met (O 2 of Niedda) en afwezigheid (geperfuseerd met N2) van paramagnetische ontspannende middelen. Bereken de toegankelijkheid parameter (П) met de formule:
    vergelijking 2
    LET OP: Waar P 1/2 referentie en AH o verwijzing zijn de helft van de maximale kracht verzadiging waarde en de centrale lijn breedte, respectievelijk voor de referentie-standaard (zoals DPPH (2,2-difenyl-1-picrylhydrazyl)) 27.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Biochemische karakterisering van Spin gelabelde GLIC Mutants

Na de hierboven beschreven protocol zou levert doorgaans GLIC MBP-fusie-eiwit in het traject van 10 - 12 mg / l cultuur. Hoewel deze waarde kan variëren in verschillende mutanten, in het bijzonder voor functies begraven in het eiwit, kan de opbrengst aanzienlijk worden aangetast. In deze gevallen kan het kweekmedium volumes vereisen schaalvergroting. De splitsing van het fusieconstruct door HRV3C protease O / N gemakshalve uitgevoerd. Door het uitvoeren van de monsters op SDS PAGE gel, vonden we dat deze splitsing voltooid binnen 30 - 60 minuten. (Figuur 1A). Gezuiverd GLIC op size exclusion gelfiltratiekolom elueerde voornamelijk als pentameer met een retentietijd van 11,3 ml. De MBP fractie elueert bij 15 ml en aggregaten elueren bij het holtevolume van de kolom (~ 7,0 ml). De spin-label komt ophet einde van de elutie (~ 24 ml) (Figuur 1B)

FRET-gebaseerde test voor de monitoring van aggregatie van GLIC Gereconstitueerd in Diverse membraanlipiden

FRET-test wordt gebruikt om de aggregatie van GLIC pentameren evalueren opgelost blaasjes (kwamen samen binnen een afstand <50 Å op het membraan). Figuur 2 toont gegevens van GLIC wt (met C27, gelabeld met hetzij Fluoresceïne of tetramethylrhodamine) en opnieuw in E .coli polaire lipiden, POPC: POPG (3: 1), PAUS: POPG (3: 1) of asolectin. Fluorescentie metingen tonen aan dat GLIC opgelost in asolectin toonde geen FRET en zelfs bevriezen / ontdooien van het monster (voorwaarden bekend te aggregatie te bevorderen) geproduceerd minimale verandering in de FRET niveaus 43. Daarom asolectin het lipidemengsel keuze voor functionele en spectroscopische metingen die in deze stuoverlijdt.

Macroscopische gedrag van GLIC in proteoliposomen

Functionele eigenschappen van gezuiverd GLIC worden gekenmerkt door een patch-clamp meting opgeloste proteoliposomen. Representatieve macroscopische huidige opname van wt GLIC uit een inside-out patch in respons op een pH-sprong is in figuur 3 bij -100 mV met mogelijke overschakeling op pH 3,0 buffer produceert snel activeren naar binnen stromen. (10-100 msec) dat verval tot ongeveer 10% van de piekamplitude binnen 43 seconden (1-3 sec, figuur 3). Currents herstellen van deze macroscopische verval of desensibilisatie door over te schakelen naar een neutrale pH. Terwijl kanalen in de inside-out patch gevoelig voor veranderingen in de pH bad waren, was er geen effect van pH-verandering in de pipetoplossing (gegevens niet getoond) suggereert dat GLIC voornamelijk is georiënteerd in een directie zodanig dat in de patch het extracellulaire domein geconfronteerd met het bad / oplossing wisselaar.

Structurele Herschikkingen Tijdens Channel Activation

Bij kamertemperatuur, kan de spin-probe rotameric meerdere conformaties aannemen, en de spectraallijn gevoelig vorm niet alleen de beweging van spin-label zijketens ten opzichte van de peptide hoofdketen, maar ook backbone schommelingen en algemene bewegingen van proteïnen. Daarom kunnen veranderingen in de EPR lineshapes blijken te zijn een uitstekend diagnostisch hulpmiddel om eiwit conformationele veranderingen te volgen zijn. Figuur 4 toont spectra op positie L241 (17) R1 in de extracellulaire hydrofobe gebied van de poriën voering M2 gebied (positie benadrukt als zwarte cirkels in figuur 4, bijvoegsel) bij pH 7,0 en pH 3,0. De spectra vertonen verschillen onder beide omstandigheden, zowel in de signaalamplitude en de omvang vanbewegingsbeïnvloeding verbreding. Zoals met functionele metingen 42, de conformatieveranderingen van het EPR signalen gerapporteerd zijn ook volledig omkeerbaar. Spectrale verbreding wordt beïnvloed door de verplaatsbaarheid beperkingen van de sonde en dipolaire koppeling beide. Om de bijdrage van de twee, L241 (17) bepalen gelijktijdig wordt gemerkt met een diamagnetisch spin-label. De onder-gemerkte en volledig gelabelde spectra vergeleken bij pH 7,0 en pH 3,0 (Figuur 4B). De omvang van dipolaire verbreding op deze positie neemt af wanneer de kanalen onder gelabeld, waarbij een interactie tussen spin-labels tussen verschillende subeenheden aangeeft.

Figuur 5 toont spectra twee posities op de helix M4 die zich aan de rand van het kanaal. AH o -1 gemeten als het omgekeerde van de centrale lijnbreedte (zie detail). Aangezien het nitroxide rotatiebeweging wordt verminderd, zoals blijkt tijdens de vormingtertiaire of quaternaire contacten, de lijndikte toeneemt (en dus AH o -1 afneemt) voor een bepaald bewegingsbeïnvloeding geometrie. Integendeel, is structurele ontwerp leidt tot een toename van de bewegingsvrijheid van de sonde weergegeven als een verhoging van AH o -1. F312R1 is mobieler terwijl R296R1 immobiel is, in overeenstemming met hun zichtbare en zeer beperkte omgevingen, respectievelijk.

Gebaseerd op de toegankelijkheid parameters kan een spin-label op een specifieke positie op het eiwit worden ingedeeld in een van de volgende: begraven in de eiwitkern ontoegankelijk voor water of lipiden op het oppervlak blootgesteld aan een waterige oplossing of op de oppervlak blootgesteld aan lipiden (figuren 5 en 6). De toegankelijkheid parameters verkregen voor een reeks opeenvolgende locaties kan dan worden gebruikt om de secundaire structuur van een regio te bepalen, sonde gebieden van eiwit-eiwitcontact Meet de helling van een eiwit in het membraan, de mogelijke dompeldiepte van grensvlak lussen en identificatie water balkons en lipiden gebonden opnemers binnen de transmembraan helices. 26 Als voorbeeld, power-verzadigingskrommen in figuur 6 tonen dat F312R1 heeft een relatief hogere P 1/2 voor O 2 in vergelijking met R296R1, wat suggereert dat de zijketens op positie F312 zijn lipide blootgesteld. Daarnaast F312R1 is ook beter toegankelijk zijn voor Niedda in vergelijking met R296R1 overeenstemming is met haar ligging aan de lipide-water interface. Anderzijds, L180R1 in de lus C gebied van het extracellulaire domein is mobiel en toegankelijk Niedda, in overeenstemming met de ligging in een water-blootgestelde lus.

Probe dynamiek en toegankelijkheid van gegevens op een gegeven positie bieden lokale structurele informatie over dat specifieke positie binnen het totale eiwit-vouwen. Deze parameters bepaald alinear sequentie van residuen aan het eiwit kan verder worden geanalyseerd met behulp van analytische methoden gebaseerd op Fourier transformatie methoden. Deze analyses zijn nuttig om periodieke variaties in de EPR milieu parameters te evalueren en te begeleiden bij het voorspellen en oriënteren secundaire structuren. Voor een bepaald eiwit segment, een discrete Fourier transformatie vermogensspectrum P (ω) wordt berekend als een functie van de hoek tussen naburige posities (ω) in dit segment. Deze grafiek wordt gebruikt om de belangrijkste hoekfrequentie component van het spectrum bepaald en vergeleken met de verwachte (ω) waarden voor een α-helix (80-120 °) of β-strengen (150-180 °).
vergelijking 3
waarbij P (ω) is de Fourier transformatie vermogensspectrum als functie van de hoekfrequentie ω, n is het aantal residuen in het segment, is omgevingsparameter op die positie. P ('ω) wordt uitgewerkt voor de waarde ω = vergelijking 6 dat maximaliseert P (ω).

Verder kan een periodiciteit index parameter (geeft de betekenis van de voorspelde secundaire structuur) wordt berekend als een verhouding van het gebied onder het vermogensspectrum van de hoek die een bepaald structureel element en het totale gebied van het spectrum voorstelt. Een schuifraam werkwijze wordt dan gebruikt om het begin en het einde van een gegeven secundair structuurelement identificeren. De relatieve oriëntatie dit segment ten opzichte van de rest van het eiwit kan worden afgeleid uit de richting van de P (ω) pass.

Voor α-helix:

vergelijking 4

vergelijking 5

Deze werkwijzen zijn met succes toegepast op verschillende systemen om driedimensionale topologie bepalen en conformatieveranderingen; protein functie 14,23,24,41,44-53 voorspellen.

Het bepalen van Afstand Distributie van EPR

Inter-subeenheid nitroxide afstanden worden bepaald uit elektronen-elektron dipolaire interacties. In CW-EPR, zoals weergegeven in figuur 4, door ruimtevaartmiddelen dipolaire interacties leiden tot spectrale verbreding en zijn een functie van afstand tussen de etiketten. Voor afstanden tot ~ 15 - 20 A, de mate van verbreding (vergeleken tussen volledig gelabeld spectra en de hieronder gemerkte spectra) kan worden gebruikt voor semi-kwantitatieve schatting afstanden viaFourier deconvolutie. 28,29

Inter-subeenheid afstanden (<50 A) kan gemeten worden met dubbele Elektronische Electron Resonantie (herten) gedefinieerd. 30-34 HERTEN verzamelde gegevens detergens monsters of gereconstitueerd in nanodiscs vanwege de beperkingen in verband met deze metingen in liposomen 54. Voor spin-gelabelde monsters in detergent (~ 100 uM) in Buffer A met 0,5 mM DDM, wordt 30% (gewicht / volume) glycerol gebruikt voor cryoprotection. De dipolaire tijdsevolutie gegevens worden verkregen bij 83 K met een standaard HERT vier-pulse protocol (π / 2) MW1-τ1- (π) MW1-τ1- (π) mw2-τ2- (π) MW1-τ2-echo 55 op een gepulste EPR spectrometer die werkt bij Q-band frequentie (33,9 GHz). De pulslengten van (π / 2) MW1 en (π) MW1 zijn 10 en 20 nsec, respectievelijk, en 40 nsec voor (π) MW2. HERTEN signalen worden vervolgens naar de achtergrond gecorrigeerde uitgaande van een 3D-homogene background en geanalyseerd door de Tikhonov regularisatie 31,56 gemiddelde afstanden en uitkeringen in afstand te bepalen.

Intramoleculaire afstanden voor een representatieve positie M4 (F314R1) bepaald herten experimenten bij pH 7,0 wordt getoond in figuur 7 Aangezien er vijf spin-labels binnen de GLIC pentameer, ten minste twee afstanden worden verwacht.; een die overeenkomt met de aangrenzende subeenheden en de ander van niet-aangrenzende subeenheden, hoewel er meer pieken kunnen voortkomen uit alternatieve rotameric spin orientaties. Het hert signaal vervalt en de bijbehorende kansverdelingen worden getoond. De eerste korte-afstand piek (~ 42A) vertegenwoordigt afstanden tussen aangrenzende subeenheden, en de tweede piek (~ 53A) correspondeert met de niet-aangrenzende afstand. De piek van de diagonale afstand lijkt een kortere afstand, en dit waarschijnlijk onderschat omdat betrouwbare metingen na 60 Åniet haalbaar zijn onder de experimentele omstandigheden te wijten aan technische problemen met de achtergrond correctie.

Figuur 1
Figuur 1. Biochemische karakterisatie Spin-gemerkte GLIC mutanten. (A) Vertegenwoordiger gelfiltratie chromatogram van spin-gelabelde-GLIC na proteolytische splitsing van MBP tag. De pieken corresponderen met pentameer en vrije MBP GLIC. (B) SDS-PAGE toont uncut monomeer GLIC-MBP-fusie-eiwit (voor gelfiltratie) en MBP en GLIC fracties samengevoegd uit gelfiltratie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2. FR ET gebaseerde test voor de monitoring van de aggregatietoestand van GLIC Gereconstitueerd in Diverse membraanlipiden. FRET metingen worden getoond voor monsters na O / N reconstructie (links) en na het bevriezen / ontdooien van de monsters (rechts). (Gewijzigd ten opzichte van de oorspronkelijke afbeelding). 43 Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 3
Figuur 3. Macroscopische Gedrag van GLIC in proteoliposomen. In een inside-out patch uitgesneden uit opgelost asolectin blaasjes, GLIC wordt geactiveerd door pH springt met behulp van een snelle oplossing wisselaar. De kanalen worden gezien activeren ~ 10 msec en ongevoelig met een tijdconstante van 1-3 sec. (Gewijzigd ten opzichte van de oorspronkelijke afbeelding). 43ig3large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 4
Figuur 4. Structurele Herschikkingen Tijdens Channel Activation. (A) Representatieve CW EPR-spectra voor een functie in de porie M2 helix sleutelwoorden veranderingen in amplitude en lijn vormen als reactie op pH-veranderingen. In elk geval zijn de spectra genormaliseerd naar het totale aantal spins. Spin-gelabelde positie wordt weergegeven als een zwarte cirkel. Slechts twee subeenheden worden getoond voor de duidelijkheid. (B) EPRspectra tonen dipolaire verruiming van spin-spin interacties. De spectra in gestippelde waren onder gelabelde kanalen (in aanwezigheid van diamagnetische labels) en vaste-lijn waren tussen volledig gelabeld kanalen. De inzet toont een overlay van amplitude-genormaliseerde spectra. Verbreding onder volledig gelabeld omstandigheden is hoogverlicht door pijlen. Scan breedte is 150 G. (Gewijzigd van de oorspronkelijke afbeelding). 36 Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 5
Figuur 5. Residu Specific Environmental Parameters Gemeten door Power verzadiging. Metingen van de spectrale breedte (AH 0) en oplosmiddel toegankelijkheid (P 1/2) voor twee contrasterende posities in de M4 helix van het transmembraandomein. Klik hier om een grotere versie te bekijken van dit cijfer.

figuur 6
Figuur 6. Milieu van een vertegenwoordiger Loop C Residu in het extracellulaire domein van GLIC. Spin-genormaliseerde CW-spectra en de bijbehorende bereikbaarheid metingen voor L180R1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 7
Figuur 7. Afstand Metingen door Pulsed-EPR Approaches (herten). GLIC structuur van de plaats van Phe314 en de bijbehorende Cp-Cp afstanden voor het aangrenzende en niet-aangrenzende subeenheden. CW-spectra voor deze functie worden getoond aan de rechterkant. Achtergrond afgetrokken herten- echo-intensiteit tegen de evolutie van de tijd wordt uitgezet en monteer met behulp van model-free Tikhonov regularisatie voor monsters in wasmiddel. De bijbehorende inter-spin distributie afstand (rechts).Pbelasting / 54127 / 54127fig7large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

EPR spectroscopie heeft zich bewezen als een ongeëvenaarde structurele aanpak in het kwantificeren van conformationele veranderingen in membraaneiwitten in een near-native omgeving. Deze aanpak stelt ons in staat een kijkje in de moleculaire details van eiwitten dynamiek die in hoge resolutie structuren worden verduisterd van X-ray kristallografie en Cryo-elektronenmicroscopie. Het is echter belangrijk om het technische beperkingen van deze benadering die de algemene toepasbaarheid beïnvloeden andere systemen en ook rekening houden met de mogelijke experimentele wegversperringen onderweg overwegen. We bespreken een aantal van deze aspecten hieronder, samen met de aanbevolen strategieën voor het oplossen van problemen.

Onder de meest voorkomende problemen die men tegenkomt met een techniek die uitgebreide mutationele verstoringen zijn de lage opbrengst en oligomere slechte stabiliteit van het eiwit. Dit aspect wordt nog verergerd bij het werken met complexe multimere membraaneiwitten zoals ionkanalen. Is therefore cruciaal om deze twee biochemische aspecten te optimaliseren alvorens een wijdverspreide mutagenese. Wij vonden dat de expressie van giftige GLIC mutanten beter wordt getolereerd in C41 en C43 stammen van BL21 cellen 3,36 Verder is het verlagen van de post-inductie temperatuur tot 15 -. 18 ºC, het verminderen van de IPTG concentratie tot 100 pm, en met 5% glycerol tijdens de inductie lijkt te helpen bij het verlagen van eiwit aggregatie vermoedelijk door het vertragen van de snelheid van eiwit expressie en het verminderen van de omvang van de verkeerd vouwen. Cysteïne mutaties op bepaalde posities (met name in de permeatie pathway) is aangetoond dat de constitutieve activiteit van het kanaal verhogen en deze mutanten waarschijnlijk grotere hindernissen vormen in expressie. Het gebruik van divalente porie blokkers (10-25 mM Ba 2+) tijdens de inductie vermindert toxiciteit en verbetert de celgroei 57 Deze strategieën zijn effectief in veel gevallen op het verbeteren van de opbrengst, het verlagen van eiwit aggregatie en het verbeteren van oligo bewezen.Meric stabiliteit. 36,58

Een andere belangrijke stap in SDSL het rendement van de etiketteringsproces. Terwijl het oppervlak blootgestelde cysteïnen geen probleem MTSL reactiviteit (> 90% labelingsopbrengsten) zou opleveren, kunnen posities waar de cysteïne zijketens begraven en ontoegankelijk hogere spin-label concentraties en langere incubatietijden vereisen. Het verhogen van de spin-label concentratie 30-voudige molaire overmaat en incubatie O / N bij 4 ºC helpt bij het verbeteren van de etikettering efficiëntie. Bovendien is het ook belangrijk om de spectra van het gemerkte Cys-less template meten om de achtergrondbijdrage bepalen. Sites die slecht gelabeld (<10%), het achtergrondsignaal overspoelt de algehele spectra. Het bepalen van de spin label efficiëntie De nauwkeurigheid wordt beïnvloed door een aantal factoren die monstervolume, monster capillair diameter, positionering van het capillair in de resonator, oventemperatuur en resonator Q omvattenwaarde (dat is de verhouding van de opgeslagen energie in het over de energie afgevoerd uit). Let erop dat deze voorwaarden identieke tussen de monsters en standaard handhaven. Voorts zij opgemerkt dat immobiele gebieden, wanneer de spectra intrinsiek brede, de nauwkeurigheid van de meting etiket verder daalt. Als alternatief kan Liquid Chromatography Time of Flight-electrospray ionisatie massaspectrometrie (LCT-ESI-MS) worden gebruikt om de moleculaire massa en dus etikettering efficiëntie rechtstreeks te bepalen. Echter, de MS gevoeligheid gecompromitteerd monsters detergentia en strak gevouwen membraaneiwitten.

Zodra de mutanten gezuiverd als een homogene populatie, is het belangrijk om de functionaliteit van het preparaat bepalen. Patch-clamp metingen van spin-gelabelde mutanten in belangrijke gebieden van het kanaal zal het effect van storing op ligand affiniteit en kanaal gating onthullen. Als alternatief kan kanaal eigenschappen worden bestudeerd in Black LIPID Membranen (BLM) 59 of door injectie in oöcyten proteoliposomen en meten van stromen door twee elektrode voltage clamp. 59-61 Indien blijkt dat de cysteïne vervanging en de spin-label op bepaalde posities veranderen ligand gevoeligheid of kinetische eigenschappen van de kanalen, experimentele omstandigheden (ligandconcentratie, modulatoren, lipiden samenstelling) kan geschikt worden gevarieerd om de conformationele toestand stabiliseren onderzocht. Verder wordt opgemerkt dat EPR metingen worden verricht onder steady-state condities en verandert daardoor in snelle kinetiek van de kanalen minder waarschijnlijk invloed op de structurele interpretatie.

Duidelijk dat een belangrijk voordeel van deze techniek is de mogelijkheid om kanaal dynamiek in membranen van gedefinieerde samenstelling te onderzoeken en direct onderzoeken hoe lipide gemedieerde effecten op dynamiek verandert kanaalfunctie. Is echter een beperking is dat sommige lipidesamenstellingen laterale samenvoeging van de kanalen o veroorzakenn het membraan en derhalve de geschiktheid van lipiden moet worden vastgesteld. 45 voor aandoeningen die veroorzaakt aggregatie doen verlagen eiwit tot lipideverhouding, uitvoeren reconstitutie bij lagere temperatuur, en het verkorten van de duur van reconstitutietijd kunnen helpen bij het ​​handhaven van de kanalen monodisperse 62 Als alternatief kunnen de kanalen worden gereconstitueerd in nanodiscs die nanoschaal lipide samenstellingen omgeven door een ring van amfipatisch membraan scaffold proteïne (apolipoproteïne A1). 63 door het optimaliseren de molaire verhouding van het kanaal eiwit, lipide bestanddelen en membraan steigers eiwit, is het mogelijk om een ​​homogene en monodisperse populatie van één kanaal eenheden opgenomen in afzonderlijke nanodiscs bereiken. Dit systeem heeft een aantal extra voordelen, dat de nanodiscs optisch helder en zorgen voor een gemakkelijke toegang tot zowel de intracellulaire en extracellulaire zijde van de membraan.

Ten slotte heeft het niveauvan de EPR metingen, zou men geconfronteerd worden met CW-EPR spectra die niet eenvoudig te interpreteren, vooral voor functies weergeven van multicomponent spectra. Dergelijke conformationele heterogeniteit kan voortkomen uit langzaam uitwisseling conformaties van het eiwit en / of oriëntaties van de spin-label in een bepaald eiwit conformatie. Het bepalen van de relatieve bijdrage van de twee scenario is niet triviaal en kunnen het gebruik van alternatieve spin-label derivaten of wijzigen experimentele temperatuur, druk 64, 65 veldsterktes / microgolffrequentie, 66 of osmolyt verstoring vereist. 67

Bovendien kunnen HERTEN metingen liposomen worden beperkt door een aantal factoren, waaronder lagere gevoeligheid hogere achtergrondbijdrage door een toegenomen intermoleculaire interacties, en een vermindering van de meetbare afstandsbereik (<50 A). In het algemeen langere afstand (<50 A), is er groteer onzekerheid in de breedte van de verdeling afstand door onvoldoende dipolaire evolutie keer. Echter, het gebruik van Q-band (34 GHz) microgolffrequentie en labeling met een bifunctionele spinlabel (met lagere intrinsieke dynamiek) is aangetoond dat een aantal van deze beperkingen te verlichten. 54 reconstitueren in nanodiscs is ook aangetoond dat enorm verbeteren DEER gevoeligheid met afnemende achtergrond bijdragen die voortvloeit uit dipolaire intermoleculaire interacties. 15

Ondanks deze beperkingen SDSL / EPR studies, met name in systemen met weinig natieve cysteïnes, bleken opmerkelijk informatief. Toekomstige technologische ontwikkelingen zijn gericht op de aanpassing van deze krachtige aanpak van de meer complexe menselijke kanalen, waarbij het muteren van inheemse cysteïnen niet haalbaar kan zijn te bestuderen. Hierbij ontwikkeling van alternatieve strategieën labeling zoals die gebaseerd op plaatsspecifieke inbouw van onnatuurlijke aminozuren, 68 of Synthesis van labels die zijn gericht op andere aminozuren, 69 blijken grote belofte te houden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

We zijn erg dankbaar voor de huidige en voormalige leden van de Chakrapani lab voor kritisch lezen en opmerkingen over het manuscript. Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health subsidie ​​(1R01GM108921) en de American Heart Association (NCRP Wetenschapper Development Grant 12SDG12070069) en SC.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Site-Directed Mutagenesis and Cys mutations
10x PfuUltra HF reaction buffer Agilent Technologies 600380-52
dNTPS New England BioLabs Inc‎ N0447L 10 mM each dNTP
pfu Ultra DNA polymerase Agilent Technologies 600380-51 2.5 U/ul
DPNI New England BioLabs Inc‎ R0176S 20,000 U/ml
XL10 GOLD Agilent Technologies 200314
SOC media New England BioLabs Inc‎ B9020S
Kanamycin Fisher Scientfic BP905
LB media Invitrogen 127957084
Miniprep kit QIAGEN 27106
C43 competent cells Lucigen 60446
Expression and Purification
Glucose Fisher Scientfic D16
Tryptone Fisher Bioreagents BP1421-500
Yeast extract Amresco J850
Glycerol Fisher Bioreagents BP229
K2HPO4 Amresco 0705
K2HPO4 Amresco 0781
IPTG (isopropyl-thio-β-galactoside) Gold Biotechnology I2481C25
Trizma Base Sigma Life Science T1503
NaCl Sigma-Aldrich S7653
DNase I Sigma Life Science DN25
PMSF Amresco M145
Leupeptine Amresco J580
Pepstatin Amresco J583
DDM (n-Docecyl-β-D-Maltopyranoside) Anatrace D310S
Amylose resin New England BioLabs Inc‎ E8021L
TCEP Amresco K831
EDTA Fisher Scientfic BP118
Maltose Acros Organics 329915000
Superdex 200 GL GE Healthcare 17-5175-01
Empty polypropylene Chromatography column BioRad 731-1550
Site-Directed Spin Labeling
MTSL (1-oxyl-2,2,5,5-tetramethyl-3-pyrroline-3-methyl) Methanethiosulfonate Toronto Reaserch chemicals Inc O873900
(1-acetoxy-2,2,5,5-tetramethyl-Δ3-pyrroline-3-methyl) methanethiosulfonate Toronto Reaserch chemicals Inc A167900
DMSO J.T. Baker 9224-01
Reconstitution
Asolectin lipid Avanti polar lipids Inc 541602C
Biobeads (Polystyrine beads) Bio Rad 152-3920
Methanol Fisher chemicals A413
FRET
Fluorescein-maleimide ThermoFisher Scientific F-150
Tetramethylrhodamine-maleimide ThermoFisher Scientific T-6027
POPC Avanti polar lipids Inc 850457C
POPG Avanti polar lipids Inc 840457C
E.coli polar lipid extract Avanti polar lipids Inc 100600C
HEPES Sigma Life Science H3375
EPR measurement
TPX plastic capillaries Bruker ER221
EDDA (Ethylenediamine-N, N'-diacetic acid) Aldrich 158186
Ni(OH)2 Aldrich 283622

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tasneem, A., Iyer, L. M., Jakobsson, E., Aravind, L. Identification of the prokaryotic ligand-gated ion channels and their implications for the mechanisms and origins of animal Cys-loop ion channels. Genome Biol. 6, 4 (2005).
  2. Hilf, R. J., Dutzler, R. X-ray structure of a prokaryotic pentameric ligand-gated ion channel. Nature. 452, (7185), 375-379 (2008).
  3. Bocquet, N., et al. X-ray structure of a pentameric ligand-gated ion channel in an apparently open conformation. Nature. 457, (7225), 111-114 (2009).
  4. Hibbs, R. E., Gouaux, E. Principles of activation and permeation in an anion-selective Cys-loop receptor. Nature. 474, (7349), 54-60 (2011).
  5. Miller, P. S., Aricescu, A. R. Crystal structure of a human GABAA receptor. Nature. 512, (7514), 270-275 (2014).
  6. Hassaine, G., et al. X-ray structure of the mouse serotonin 5-HT3 receptor. Nature. 512, (7514), 276-281 (2014).
  7. Du, J., Lu, W., Wu, S., Cheng, Y., Gouaux, E. Glycine receptor mechanism elucidated by electron cryo-microscopy. Nature. (2015).
  8. Sunshine, C., McNamee, M. G. Lipid modulation of nicotinic acetylcholine receptor function: the role of neutral and negatively charged lipids. Biochim Biophys Acta. 1108, 240-246 (1992).
  9. Fong, T. M., McNamee, M. G. Correlation between acetylcholine receptor function and structural properties of membranes. Biochemistry. 25, (4), 830-840 (1986).
  10. daCosta, C. J., Baenziger, J. E. A lipid-dependent uncoupled conformation of the acetylcholine receptor. J Biol Chem. 284, (26), 17819-17825 (2009).
  11. Criado, M., Eibl, H., Barrantes, F. J. Functional properties of the acetylcholine receptor incorporated in model lipid membranes. Differential effects of chain length and head group of phospholipids on receptor affinity states and receptor-mediated ion translocation. J Biol Chem. 259, (14), 9188-9198 (1984).
  12. Hubbell, W. L., Lopez, C. J., Altenbach, C., Yang, Z. Technological advances in site-directed spin labeling of proteins. Curr Opin Struct Biol. 23, (5), 725-733 (2013).
  13. Columbus, L., Hubbell, W. L. A new spin on protein dynamics. Trends Biochem Sci. 27, (6), 288-295 (2002).
  14. Hubbell, W. L., Cafiso, D. S., Altenbach, C. Identifying conformational changes with site-directed spin labeling. Nat Struct Biol. 7, (9), 735-739 (2000).
  15. McHaourab, H. S., Steed, P. R., Kazmier, K. Toward the fourth dimension of membrane protein structure: insight into dynamics from spin-labeling EPR spectroscopy. Structure. 19, (11), 1549-1561 (2011).
  16. Bordignon, E. Site-directed spin labeling of membrane proteins. Top Curr Chem. 321, 121-157 (2012).
  17. Klare, J. P., Steinhoff, H. J. Spin labeling EPR. Photosynth Res. 102, (2-3), 377-390 (2009).
  18. Drescher, M. EPR in protein science : intrinsically disordered proteins. Top Curr Chem. 321, 91-119 (2012).
  19. Perozo, E., Cuello, L. G., Cortes, D. M., Liu, Y. S., Sompornpisut, P. EPR approaches to ion channel structure and function. Novartis Found Symp. 245, 146-158 (2002).
  20. Fanucci, G. E., Cafiso, D. S. Recent advances and applications of site-directed spin labeling. Curr Opin Struct Biol. 16, (5), 644-653 (2006).
  21. Sahu, I. D., McCarrick, R. M., Lorigan, G. A. Use of electron paramagnetic resonance to solve biochemical problems. Biochemistry. 52, (35), 5967-5984 (2013).
  22. Hubbell, W. L., McHaourab, H. S., Altenbach, C., Lietzow, M. A. Watching proteins move using site-directed spin labeling. Structure. 4, (7), 779-783 (1996).
  23. Altenbach, C., Marti, T., Khorana, H. G., Hubbell, W. L. Transmembrane protein structure: spin labeling of bacteriorhodopsin mutants. Science. 248, (4959), 1088-1092 (1990).
  24. McHaourab, H. S., Lietzow, M. A., Hideg, K., Hubbell, W. L. Motion of spin-labeled side chains in T4 lysozyme. Correlation with protein structure and dynamics. Biochemistry. 35, (24), 7692-7704 (1996).
  25. Farahbakhsh, Z. T., Altenbach, C., Hubbell, W. L. Spin labeled cysteines as sensors for protein-lipid interaction and conformation in rhodopsin. Photochem Photobiol. 56, (6), 1019-1033 (1992).
  26. Altenbach, C., Greenhalgh, D. A., Khorana, H. G., Hubbell, W. L. A collision gradient method to determine the immersion depth of nitroxides in lipid bilayers: application to spin-labeled mutants of bacteriorhodopsin. Proc Natl Acad Sci U S A. 91, (5), 1667-1671 (1994).
  27. Altenbach, C., Froncisz, W., Hemker, R., McHaourab, H., Hubbell, W. L. Accessibility of nitroxide side chains: absolute Heisenberg exchange rates from power saturation EPR. Biophys J. 89, (3), 2103-2112 (2005).
  28. Rabenstein, M. D., Shin, Y. K. Determination of the distance between two spin labels attached to a macromolecule. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, (18), 8239-8243 (1995).
  29. Altenbach, C., Oh, K. J., Trabanino, R. J., Hideg, K., Hubbell, W. L. Estimation of inter-residue distances in spin labeled proteins at physiological temperatures: experimental strategies and practical limitations. Biochemistry. 40, (51), 15471-15482 (2001).
  30. Borbat, P. P., McHaourab, H. S., Freed, J. H. Protein structure determination using long-distance constraints from double-quantum coherence ESR: study of T4 lysozyme. J Am Chem Soc. 124, (19), 5304-5314 (2002).
  31. Chiang, Y. W., Borbat, P. P., Freed, J. H. The determination of pair distance distributions by pulsed ESR using Tikhonov regularization. J Magn Reson. 172, (2), 279-295 (2005).
  32. Jeschke, G. DEER distance measurements on proteins. Annu Rev Phys Chem. 63, 419-446 (2012).
  33. Jeschke, G., Polyhach, Y. Distance measurements on spin-labelled biomacromolecules by pulsed electron paramagnetic resonance. Phys Chem Chem Phys. 9, (16), 1895-1910 (2007).
  34. Jeschke, G., Wegener, C., Nietschke, M., Jung, H., Steinhoff, H. J. Interresidual distance determination by four-pulse double electron-electron resonance in an integral membrane protein: the Na+/proline transporter PutP of Escherichia coli. Biophys J. 86, (4), 2551-2557 (2004).
  35. Hilf, R. J., Dutzler, R. Structure of a potentially open state of a proton-activated pentameric ligand-gated ion channel. Nature. 457, (7225), 115-118 (2009).
  36. Velisetty, P., Chalamalasetti, S. V., Chakrapani, S. Conformational transitions underlying pore opening and desensitization in membrane-embedded Gloeobacter violaceus ligand-gated ion channel (GLIC). J Biol Chem. 287, (44), 36864-36872 (2012).
  37. Birnboim, H. C., Doly, J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 7, (6), 1513-1523 (1979).
  38. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A. 74, (12), 5463-5467 (1977).
  39. Sanger, F., Coulson, A. R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. J Mol Biol. 94, (3), 441-448 (1975).
  40. McHaourab, H. S., Kalai, T., Hideg, K., Hubbell, W. L. Motion of spin-labeled side chains in T4 lysozyme: effect of side chain structure. Biochemistry. 38, (10), 2947-2955 (1999).
  41. Gross, A., Columbus, L., Hideg, K., Altenbach, C., Hubbell, W. L. Structure of the KcsA potassium channel from Streptomyces lividans: a site-directed spin labeling study of the second transmembrane segment. Biochemistry. 38, (32), 10324-10335 (1999).
  42. Velisetty, P., Chakrapani, S. Desensitization mechanism in a Prokaryotic ligand-gated ion channel. J Biol Chem. 287, (22), (2012).
  43. Velisetty, P., Chakrapani, S. Desensitization mechanism in prokaryotic ligand-gated ion channel. J Biol Chem. 287, (22), 18467-18477 (2012).
  44. Chakrapani, S., Cuello, L. G., Cortes, D. M., Perozo, E. Structural dynamics of an isolated voltage-sensor domain in a lipid bilayer. Structure. 16, (3), 398-409 (2008).
  45. Cuello, L. G., Cortes, D. M., Perozo, E. Structural dynamics of the KvAP pore domain lacking the voltage sensing domain. Biophysical Journal. 88, (1), 19-20 (2005).
  46. Perozo, E., Cortes, D. M., Cuello, L. G. Structural rearrangements underlying K+-channel activation gating. Science. 285, (5424), 73-78 (1999).
  47. Chakrapani, S., Sompornpisut, P., Intharathep, P., Roux, B., Perozo, E. The activated state of a sodium channel voltage sensor in a membrane environment. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, (12), 5435-5440 (2010).
  48. Vasquez, V., Sotomayor, M., Cordero-Morales, J., Schulten, K., Perozo, E. A structural mechanism for MscS gating in lipid bilayers. Science. 321, (5893), 1210-1214 (2008).
  49. Perozo, E., Cortes, D. M., Sompornpisut, P., Kloda, A., Martinac, B. Open channel structure of MscL and the gating mechanism of mechanosensitive channels. Nature. 418, (6901), 942-948 (2002).
  50. Kim, M., Xu, Q., Murray, D., Cafiso, D. S. Solutes alter the conformation of the ligand binding loops in outer membrane transporters. Biochemistry. 47, (2), 670-679 (2008).
  51. Kazmier, K., Sharma, S., Islam, S. M., Roux, B., McHaourab, H. S. Conformational cycle and ion-coupling mechanism of the Na+/hydantoin transporter Mhp1. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, (41), 14752-14757 (2014).
  52. Durr, K. L., et al. Structure and dynamics of AMPA receptor GluA2 in resting, pre-open, and desensitized states. Cell. 158, (4), 778-792 (2014).
  53. Borbat, P. P., et al. Conformational motion of the ABC transporter MsbA induced by ATP hydrolysis. PLoS Biol. 5, (10), e271 (2007).
  54. Zou, P., McHaourab, H. S. Increased sensitivity and extended range of distance measurements in spin-labeled membrane proteins: Q-band double electron-electron resonance and nanoscale bilayers. Biophys J. 98, (6), 18-20 (2010).
  55. Pannier, M., Veit, S., Godt, A., Jeschke, G., Spiess, H. W. Dead-time free measurement of dipole-dipole interactions between electron spins. J Magn Reson. 142, (2), 331-340 (2000).
  56. Jeschke, G., et al. DeerAnalysis2006-a comprehensive software package for analyzing pulsed ELDOR data. Applied Magnetic Resonance. 30, (3-4), 473-498 (2006).
  57. Ruta, V., Jiang, Y., Lee, A., Chen, J., MacKinnon, R. Functional analysis of an archaebacterial voltage-dependent K+ channel. Nature. 422, (6928), 180-185 (2003).
  58. Velisetty, P., Chalamalasetti, S. V., Chakrapani, S. Structural basis for allosteric coupling at the membrane-protein interface in Gloeobacter violaceus ligand-gated ion channel (GLIC). J Biol Chem. 289, (5), 3013-3025 (2014).
  59. Dellisanti, C. D., et al. Site-directed spin labeling reveals pentameric ligand-gated ion channel gating motions. PLoS Biol. 11, (11), e1001714 (2013).
  60. Labriola, J. M., et al. Structural sensitivity of a prokaryotic pentameric ligand-gated ion channel to its membrane environment. J Biol Chem. 288, (16), 11294-11303 (2013).
  61. Kinde, M. N., et al. Conformational Changes Underlying Desensitization of the Pentameric Ligand-Gated Ion Channel ELIC. Structure. 23, (6), 995-1004 (2015).
  62. Vasquez, V., Cortes, D. M., Furukawa, H., Perozo, E. An optimized purification and reconstitution method for the MscS channel: strategies for spectroscopical analysis. Biochemistry. 46, (23), 6766-6773 (2007).
  63. Bayburt, T. H., Sligar, S. G. Membrane protein assembly into Nanodiscs. FEBS Lett. 584, (9), 1721-1727 (2010).
  64. Hanson, S. M., Francis, D. J., Vishnivetskiy, S. A., Klug, C. S., Gurevich, V. V. Visual arrestin binding to microtubules involves a distinct conformational change. J Biol Chem. 281, (14), 9765-9772 (2006).
  65. McCoy, J., Hubbell, W. L. High-pressure EPR reveals conformational equilibria and volumetric properties of spin-labeled proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, (4), 1331-1336 (2011).
  66. Mobius, K., et al. Combining high-field EPR with site-directed spin labeling reveals unique information on proteins in action. Magn Reson Chem. 43, Spec no. 4-19 (2005).
  67. Lopez, C. J., Oga, S., Hubbell, W. L. Mapping Molecular Flexibility of Proteins with Site-Directed Spin Labeling: A Case Study of Myoglobin. Biochemistry. 51, (33), 6568-6583 (2012).
  68. Fleissner, M. R., et al. Site-directed spin labeling of a genetically encoded unnatural amino acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, (51), 21637-21642 (2009).
  69. Lorenzi, M., et al. Tyrosine-targeted spin labeling and EPR spectroscopy: an alternative strategy for studying structural transitions in proteins. Angew Chem Int Ed Engl. 50, (39), 9108-9111 (2011).
Site Gericht spin labeling en EPR spectroscopische Studies van pentamere Ligand-ionkanalen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Basak, S., Chatterjee, S., Chakrapani, S. Site Directed Spin Labeling and EPR Spectroscopic Studies of Pentameric Ligand-Gated Ion Channels. J. Vis. Exp. (113), e54127, doi:10.3791/54127 (2016).More

Basak, S., Chatterjee, S., Chakrapani, S. Site Directed Spin Labeling and EPR Spectroscopic Studies of Pentameric Ligand-Gated Ion Channels. J. Vis. Exp. (113), e54127, doi:10.3791/54127 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter