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Chemistry

साइट निर्देशित स्पिन लेबल और Pentameric ligand-gated आयन चैनलों के EPR स्पेक्ट्रोस्कोपी अध्ययन

Published: July 4, 2016 doi: 10.3791/54127

Introduction

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पिछले दशक के दौरान, pentameric ligand-गेटेड आयन चैनल के संरचनात्मक समझ (pLGIC) कई गुना में वृद्धि हुई है, परिवार के कई सदस्यों के उच्च संकल्प संरचनाओं की भीड़ के कारण। महत्वपूर्ण कारक है कि क्षेत्र में वर्तमान प्रगति के लिए नेतृत्व संरचना निर्धारण दृष्टिकोण में prokaryotic pLGIC चैनलों की खोज, यूकेरियोटिक झिल्ली प्रोटीन अभिव्यक्ति में 1-3 प्रमुख प्रगति, 4-6 और जबरदस्त सफलताओं शामिल हैं। 7 इन संरचनाओं पर एक स्पष्ट आम सहमति प्रदान करते हैं pLGIC के तीन आयामी वास्तुकला के समग्र संरक्षण। हालांकि, दो प्रमुख क्षेत्रों है कि पीछे निशान लग रहे हो इन चैनल की तैयारियों के कार्यात्मक विशेषताओं और चैनल समारोह के यंत्रवत वर्णन कर रहे हैं।

Gating गठनात्मक परिवर्तन जटिल हैं और चैनल की लंबाई के साथ एक 60 दूरी पर पाए जाते हैं और ये बदलाव बड़े पैमाने पर कर रहे हैं द्वारा संग्राहकझिल्ली लिपिड। विशेष रूप से, नकारात्मक लिपिड, कोलेस्ट्रॉल, और फॉस्फोलिपिड pLGIC 8-11 के समारोह मिलाना दिखाया गया है। चैनल समारोह में इन लिपिड घटक की सटीक भूमिका अनजान बनी हुई है, वहीं gating की एक पूरी समझ आणविक उनके पैतृक वातावरण में इन चैनलों का अध्ययन करने की आवश्यकता होगी। साइट निर्देशित स्पिन लेबलिंग (SDSL) और इलेक्ट्रॉन समचुंबक अनुनाद (EPR) स्पेक्ट्रोस्कोपी का पुनर्गठन प्रणालियों में प्रोटीन की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए पसंद की तकनीक है। EPR स्पेक्ट्रोस्कोपी आणविक आकार के द्वारा सीमित नहीं है (एनएमआर है के रूप में) या नमूना के ऑप्टिकल संपत्ति (के रूप में प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोस्कोपी है), और इस तरह के मूल निवासी लिपिड की स्थिति में पुनर्गठन पूर्ण लंबाई निर्माणों की माप की अनुमति देता है। तकनीक बेहद संवेदनशील है और अपेक्षाकृत कम नमूना आवश्यकताओं (पिको-तिल रेंज में) है। इन दोनों पहलुओं मिलीग्राम ओवर में व्यक्त करने के लिए बड़ी झिल्ली प्रोटीन है कि मुश्किल हो जाता है के अध्ययन के लिए तकनीक अच्छी तरह से अनुकूल बनानामात्रा।

साइट निर्देशित स्पिन लेबलिंग के साथ संयोजन में EPR स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग वेन Hubbell और उनके सहयोगियों द्वारा विकसित किया गया था, और प्रोटीन प्रकार की एक सीमा के अध्ययन के लिए अनुकूलित किया गया है। 12-24 EPR डेटा माध्यमिक संरचनाओं की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, प्रोटीन में परिवर्तन रचना, झिल्ली प्रविष्टि गहराई, और प्रोटीन, प्रोटीन / प्रोटीन ligand बातचीत।

विधि साइट निर्देशित mutagenesis द्वारा ब्याज की स्थिति में सिस्टीन प्रतिस्थापन शामिल है। साइट विशेष लेबलिंग सुनिश्चित करने के लिए यह एक और एमिनो एसिड के साथ (जैसे।, सेरीन) देशी cysteines स्थानापन्न करने के लिए एक सिस्टीन-कम टेम्पलेट बनाने के लिए आवश्यक है। (1-oxyl-2,2,5,5-tetramethyl-Δ3-pyrroline-3-मिथाइल) methanethiosulfonate कि एक डाइसल्फ़ाइड बंधन पुल के माध्यम से प्रोटीन के लिए देता है: अब तक, सबसे लोकप्रिय स्पिन लेबल एक thiol-विशिष्ट MTSL है। इसकी उच्च विशिष्टता, अपेक्षाकृत छोटे आकार (नियासिन तुलना में थोड़ा बड़ा है), और फ्लेक्सी के कारणलिंकर क्षेत्र की साख, इस स्पिन लेबल भी एक दफन सिस्टीन के साथ उत्कृष्ट जेट के लिए दिखाया गया है। इसके अलावा, जेट अधिकतम करने के लिए, प्रोटीन की लेबलिंग प्रतिक्रिया बाहर डिटर्जेंट solubilized रूप में किया जाता है। अतिरिक्त मुक्त स्पिन लेबल आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी द्वारा की जुदाई के बाद, प्रोटीन liposomes या परिभाषित लिपिड रचना की bilayer नकल उतार सिस्टम में पुनर्गठित किया गया है। सामान्य तौर पर, सिस्टीन म्युटाजेनेसिस अच्छी तरह से प्रोटीन के अधिकांश भागों में सहन किया है, और स्पिन जांच के अपेक्षाकृत छोटे आकार द्वितीयक और तृतीयक संरचनाओं के लिए कम से कम गड़बड़ी का कारण बनता है। यह सुनिश्चित करें कि संशोधन जंगली प्रकार के कार्यों को बनाए रखा, लेबल और पुनर्गठन चैनलों पैच दबाना माप द्वारा अध्ययन किया जा सकता है।

लेबल कार्यात्मक प्रोटीन तो स्पेक्ट्रोस्कोपी माप, जो अनिवार्य रूप से जानकारी के तीन मुख्य प्रकार प्रदान करने के अधीन है: linesh द्वारा 12,14,15,20,22,23,25-27 स्पिन जांच गतिशीलताबंदर विश्लेषण; समचुंबक छूट एजेंटों के लिए जांच की पहुंच; और दूरी वितरण। 27 EPR दूरी दो अलग अलग दृष्टिकोण से मापा जाता है। पहली निरंतर तरंग (सीडब्ल्यू) तकनीक है, जहां वर्णक्रम विस्तार स्पिन लेबल के बीच dipolar बातचीत से उत्पन्न होने वाली (8 में - 20 एक दूरी रेंज) पर आधारित है। दूरी तय करने के लिए प्रयोग किया जाता है 28,29 दूसरा एक स्पंदित EPR है विधि जहां दूरी माप 70। 30-34 तक बढ़ाया जा सकता है डबल इलेक्ट्रॉन इलेक्ट्रॉन अनुनाद (हिरण) में, स्पिन गूंज आयाम में दोलनों दूरी और दूरी वितरण निर्धारित करने के लिए विश्लेषण कर रहे हैं। यहाँ स्पिन गूंज dipolar बातचीत की आवृत्ति पर संग्राहक है। साथ में, इन मानकों प्रोटीन टोपोलॉजी, माध्यमिक संरचनात्मक तत्वों, और प्रोटीन गठनात्मक परिवर्तन का निर्धारण करने के लिए उपयोग किया जाता है।

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Protocol

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1. साइट निर्देशित mutagenesis और Cys उत्परिवर्तनों

  1. क्लोनिंग और mutagenesis
    नोट: GLIC जंगली प्रकार (डब्ल्यूटी) 35 एक भी देशी सिस्टीन (C27), जो एक सिस्टीन-कम पृष्ठभूमि बनाने के लिए सेरीन उत्परिवर्तित है है। सिस्टीन म्यूटेशन साइट निर्देशित प्राइमरों कि इच्छित स्थान 36 पर एक सिस्टीन कोडोन ले जाने का उपयोग कर mutagenesis द्वारा सिस्टीन कम पृष्ठभूमि पर पेश कर रहे हैं।
    1. 10x प्रतिक्रिया बफर के 5 μl, 100 एनजी के 1 μl मिश्रण / μl सिस्टीन-कम GLIC टेम्पलेट डीएनए 35, 0.5 μl 40 माइक्रोन के आगे से प्रत्येक और रिवर्स प्राइमर 36, dNTPs (100 मिमी) के 1 μl, और विआयनीकृत पानी के 41 μl । नमूना एक बार कुछ पिपेट यह मिश्रण अच्छी तरह से करने के लिए, स्पिन (6000 आरपीएम) और अंत में डीएनए पोलीमरेज़ की 1 μl जोड़ें।
    2. सेट निम्नलिखित प्रोटोकॉल के लिए थर्मामीटरों साइक्लर:
      1. 4 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर विकृतीकरण।
      2. 30 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर विकृतीकरण।
      3. पानी रखना1 मिनट के लिए 55 डिग्री सेल्सियस पर हैैं।
      4. 10 मिनट के लिए 68 डिग्री सेल्सियस (प्रति केबी प्लाज्मिड लंबाई लगभग 1 मिनट) में बढ़ाव।
      5. दोहराएँ 1.1.2.2 कदम - 1.1.2.4 18 चक्र के लिए।
      6. 10 मिनट के लिए 68 डिग्री सेल्सियस पर एक अंतिम बढ़ाव।
      7. 4 डिग्री सेल्सियस पर होल्डिंग तापमान
        नोट: annealing तापमान प्राइमर टीएम के आधार पर गणना की है।
    3. प्रतिक्रिया मिश्रण को DpnI के 1 μl जोड़ें, pipetting द्वारा मिश्रण अच्छी तरह से, और 1 मिनट के लिए नीचे स्पिन (6000 आरपीएम)। 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए सेते हैं।
  2. परिवर्तन
    1. पिघलना बर्फ पर कोलाई सक्षम कोशिकाओं। विभाज्य एक 14 मिलीलीटर बाँझ परिवर्तन ट्यूब में कोशिकाओं के 30 μl और कोशिकाओं को पचा डीएनए की 1 μl जोड़ें। ट्यूब के किनारे पर दोहन से मिलाएं। बर्फ पर 20 मिनट के लिए सेते हैं।
    2. 45 सेकंड के लिए एक 42 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में ट्यूब रखें और फिर इसे बर्फ पर वापस 2 मिनट के लिए जगह है। एक incu में 400 μl बाँझ समाज मीडिया कोशिकाओं जोड़ें और हिला1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर Bator।
    3. प्लेट केनामाइसिन (50 माइक्रोन) के और 1% ग्लूकोज युक्त लेग प्लेटों पर कोशिकाओं के 100 μl। 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों हे / एन सेते हैं।
    4. थाली से एक भी कॉलोनी फसल और 5 मिलीलीटर हे / एन पौंड / केनामाइसिन मीडिया वाले संस्कृतियों में टीका लगाना। एक मशीन प्रकार के बरतन में संस्कृति हे / एन (~ 16 घंटा) 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    5. Minipreparation 37 से हे / एन संस्कृति से डीएनए निकालने। 260 एनएम तरंगदैर्ध्य पर absorbance को मापने के द्वारा एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग डीएनए की उपज यों। 200 एनजी / μl - एकाग्रता ~ 100 होना चाहिए। मानक पुनः संयोजक डीएनए अनुक्रमण रणनीतियों 38,39 द्वारा उत्परिवर्तन की उपस्थिति की पुष्टि करें।

2. GLIC अभिव्यक्ति और शोधन

  1. परिवर्तन
    1. कदम धारा 1.2 में वर्णित के बाद, 1 μl के साथ C43 सक्षम कोशिकाओं के 30 μl बदलना - जीएल के लिए जीन कोडिंग युक्त प्लाज्मिड की (~ 100 से 200 एनजी / μl)एक मानव rhinovirus (HRV) -3C प्रोटीज दरार साइट के साथ-साथ आईसी (प्लाज्मिड और जीन अनुक्रम के लिए, पूरक पाठ को देखें) 35 (कदम 1.2.5 से)।
    2. प्लेट 1% ग्लूकोज और 50 माइक्रोग्राम / एमएल केनामाइसिन युक्त लेग अगर प्लेटों पर कोशिकाओं के 100 μl, और एक मशीन में 37 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें हे / एन (~ 16 घंटा) सेते हैं।
    3. कालोनियों के लिए नेत्रहीन जाँच करें और सुनिश्चित करें कि वे नहीं पर बड़े हो रहे हैं या उपग्रह कालोनियों की उपस्थिति दिखाने के लिए। तुरंत parafilm के साथ प्लेटों सील करने और उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
  2. / एन-संस्कृतियों और विकास मीडिया की तैयारी हे स्थापना
    1. पाश inoculating तार का उपयोग कर एक अलग कॉलोनी उठाओ और एक 100 मिलीलीटर बाँझ Luria शोरबा के 20 मिलीलीटर युक्त कुप्पी में स्थानांतरित (पौंड) मीडिया बाँझ 1% ग्लूकोज के साथ पूरक और 50 माइक्रोग्राम / एमएल केनामाइसिन। 250 rpm पर एक प्रकार के बरतन में 37 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें सेते हे / एन (~ 16 घंटा)।
    2. आटोक्लेव 900 मिलीलीटर भयानक शोरबा (टीबी) मीडिया (मीडिया और बफर संरचना देखें) 2.8 मेंबैक्टीरियल 20 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर भाप चक्र में संस्कृति के लिए एल Fernbach कांच की बोतल।
  3. बड़ी वृद्धि संस्कृतियों की स्थापना
    1. Autoclaved टीबी मीडिया को बाँझ पोटेशियम फॉस्फेट बफर के 100 मिलीलीटर (मीडिया और बफर संरचना देखें) जोड़ें। बाँझ ग्लूकोज (0.2% अंतिम एकाग्रता), केनामाइसिन (50 माइक्रोग्राम / एमएल), और हे / एन संस्कृति के 10 मिलीलीटर जोड़ें। 250 rpm पर एक प्रकार के बरतन में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    2. 600 एनएम तरंगदैर्ध्य (आयुध डिपो 600) densitometer का उपयोग कर या एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर हर घंटे पर ऑप्टिकल घनत्व की जाँच करें जब तक यह 0.5 (~ 2 घंटा) तक पहुँचता है। इस बिंदु पर 150 आरपीएम की गति को कम करने और 18 डिग्री सेल्सियस तक तापमान कम है। आयुध डिपो के 600 हर 30 मिनट पर नजर रखने के लिए जब तक यह 0.8 (~ 1 घंटा) तक पहुँचता है।
    3. 1.2 (~ 15 - - 30 मिनट) ग्लिसरॉल के 50 मिलीलीटर जोड़ें और आयुध डिपो तक संस्कृति मिलाते जारी 600 1.0 तक पहुँचता है।
      नोट: इन शर्तों के तहत, यह एक घंटे के बारे में संस्कृति 37 से 18 डिग्री सेल्सियस डिग्री सेल्सियस तक पहुंचने के लिए ले जाता है। यह छोटा सा भूत हैortant कि ग्लिसरॉल संस्कृति से जोड़ा जाता है के बाद से यह 18 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा किया गया है।
    4. 200 माइक्रोन के IPTG (isopropyl-thio-β-galactoside) के साथ कोशिकाओं को उत्पन्न और शेखर वापस 250 आरपीएम पर रीसेट और आगे के लिए ~ 18 डिग्री सेल्सियस पर 16 घंटा सेते हैं।
  4. प्रोटीन शुद्धीकरण
    1. सुनिश्चित करें 16 घंटा के अंत में 600 आयुध डिपो है कि ~ 16 - 18 हार्वेस्ट 8500 XG, 15 मिनट के लिए 4.0 डिग्री सेल्सियस पर कताई द्वारा 1.0 एल सेंट्रीफ्यूज की बोतलों में कोशिकाओं। सतह पर तैरनेवाला छानना और सेल गोली के साथ बोतल तौलना। कुल वजन से खाली बोतल का वजन घटा कर गोली के वजन की गणना।
      नोट: उम्मीद सेल गोली वजन है ~ 30 - 35 ग्राम / एल। हालांकि, यह नोट किया जाना है वहां म्यूटेंट भर में अंतिम 600 आयुध डिपो और सेल गोली वजन में परिवर्तनशीलता हो सकता है।
    2. प्रति संस्कृति के 1.0 एल ठंडा बफर के 150 मिलीलीटर (100 मिमी NaCl, 20 मिमी Tris, 7.4 पीएच) में बैक्टीरिया गोली फिर से निलंबित। DNase मैं (100 माइक्रोग्राम / एमएल) और दक्षिण अफ्रीका जोड़ेई अवरोधकों (phenylmethyl Sulfonyl फ्लोराइड (1 मिमी), leupeptin (2.0 माइक्रोग्राम / एमएल), aprotinin (2.0 माइक्रोग्राम / एमएल), और एक (1 माइक्रोग्राम / एमएल pepstatin))।
    3. एक 4.0 डिग्री सेल्सियस ठंडे कमरे में एक सेल disrupter के माध्यम से उन्हें गुजर द्वारा कोशिकाओं Homogenize। प्रक्रिया को दोहराएं तीन बार तो यह है कि बैक्टीरिया का सबसे lysed है। 15 मिनट के लिए 14,000 XG पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला बाहर पिपेट और एक साफ अपकेंद्रित्र ट्यूब में हस्तांतरण। गोली है, जो संयुक्त राष्ट्र के lysed कोशिकाओं और शामिल किए जाने के शव शामिल त्यागें।
    4. 1 घंटे के लिए 168,000 XG पर सतह पर तैरनेवाला अपकेंद्रित्र। ध्यान से झिल्ली गोली परेशान बिना सतह पर तैरनेवाला छानना।
    5. संस्कृति के 1 एल से झिल्ली गोली पूल और 50 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा करने के लिए बफर (10% ग्लिसरॉल के साथ पूरक) में यह फिर से निलंबित। 4.0 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए झिल्ली निलंबन और डोलना एन Docecyl-β-D-Maltopyranoside (DDM) के 0.5 ग्राम जोड़ें।
    6. झिल्ली solubilization के बाद, centrifug द्वारा lysate से सेल मलबे को हटाने1hr के लिए 168,000 XG पर समझना। इस बीच में amylose राल तैयार करते हैं। स्थानांतरण एक खाली polypropylene क्रोमैटोग्राफी स्तंभ में एक पिपेट का उपयोग राल के 3 मिलीलीटर। बफर के 10 बिस्तर की मात्रा युक्त 0.5 मिमी DDM के साथ 3 बार पानी के 10 बिस्तर मात्रा में गुजर रहा है और तब तक राल धो लें।
    7. centrifugation के बाद, धीरे सतह पर तैरनेवाला एक पिपेट का उपयोग कर बाहर ले और एक साफ 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब को हस्तांतरण। बैच के लिहाज से बाध्य करने के लिए, शंक्वाकार ट्यूब पूर्व equilibrated amylose राल जोड़ें। 4.0 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए मिश्रण nutating द्वारा amylose राल के लिए निकाले गए प्रोटीन बाँध।
    8. एक क्रोमैटोग्राफी स्तंभ के माध्यम से पूरे घोल पास और प्रवाह के माध्यम से इकट्ठा। फिर राल से अधिक बाध्यकारी को अधिकतम करने के लिए दूसरी बार पूरे एकत्र प्रवाह के माध्यम से गुजरती हैं।
    9. 0.5 मिमी DDM, 0.5 मिमी Tris (2 carboxyethyl) phosphine (TCEP) और 1 मिमी ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) के साथ एक बफर के 10 बिस्तर की मात्रा दर्रा अनबाउंड प्रोटीन को हटाने के लिए।
    10. Buf के 10 मिलीलीटर के साथ GLIC प्रोटीन Eluteफेर एक 0.5 मिमी DDM और 0.05 मिमी TCEP के अलावा 40 मिमी माल्टोज हैं। TCEP सिस्टीन पक्ष-चेन के ऑक्सीकरण से बचाता है। पूरे Elute लीजिए।
    11. 4 से eluted प्रोटीन केन्द्रापसारक concentrator (आण्विक भार की कट-ऑफ = 50 केडीए) का उपयोग करते हुए ध्यान लगाओ - 6 मिलीग्राम / एमएल और HRV -3 सी प्रोटीज (प्रोटीन 200 10 मिलीग्राम प्रति माइक्रोग्राम) जोड़ने और हे / एन सेते 4.0 डिग्री सेल्सियस पर।
      नोट: एसडीएस पृष्ठ जेल पर नमूने चलाने के द्वारा प्रोटीज पाचन के पूरा पता लगाना (कदम 2.5.5 और चित्रा 1 देखें)।
  5. साइट निर्देशित स्पिन लेबलिंग
    1. (1-oxyl-2,2,5,5-tetramethyl-Δ3-pyrroline-3-मिथाइल) DMSO में MTSL 40 से 200 मिमी स्टॉक के बारे में 100 μl बनाओ और 25 μl aliquots में -20 डिग्री सेल्सियस पर शेयर की दुकान।
    2. MTSL साथ स्पिन लेबलिंग के लिए प्रोटीज पचा नमूना का प्रयोग करें। MTSL स्पिन लेबल का 10 गुना दाढ़ अतिरिक्त जोड़ें (GLIC मोनोमर: 01:10 दाढ़ अनुपात में MTSL)। 1 घंटे के लिए बर्फ पर सेते हैं। एक 5 गुना दाढ़ अतिरिक्त स्पिन पर लेबल के एक दूसरे को गोली मार दी जोड़ेअनुपात और एक घंटे के लिए सेते हैं।
      नोट: दफन पदों (कम स्पिन लेबलिंग दक्षता के साथ, नीचे वर्णित) के लिए, स्पिन लेबल की एक 30 गुना दाढ़ अतिरिक्त जोड़ा जाता है और प्रोटीन 6 घंटे के लिए incubated है।
    3. एक आकार अपवर्जन तेजी से प्रोटीन तरल क्रोमैटोग्राफी (FPLC) स्तंभ है कि बफर और 0.5 मिमी DDM साथ पूर्व equilibrated अलग करने के लिए cleaved MBP और GLIC pentamers से अतिरिक्त नि: शुल्क स्पिन-लेबल के माध्यम से नमूना गुजरती हैं। 30 मिलीलीटर क्षालन की कुल के लिए 1 मिलीलीटर अंशों लीजिए। GLIC pentamers (चित्रा 1) युक्त भिन्न पूल। FPLC चलाने के लिए निर्माता के अनुदेश का पालन करें।
    4. नमूना 280 एनएम तरंगदैर्ध्य पर absorbance को मापने के द्वारा एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग की एकाग्रता का निर्धारण। दाढ़ विलुप्त होने के गुणांक और GLIC मोनोमर की अनुमानित आणविक भार 49,850 एम -1 सेमी -1 और 36,380 दा, क्रमशः रहे हैं। प्रोटीन समाधान एक केन्द्रापसारक concentrator का उपयोग ध्यान लगाओ (आण्विकवजन में कटौती बंद = 50 केडीए) ~ 8-10 मिलीग्राम / एमएल और बर्फ पर जगह के अंतिम एकाग्रता के लिए। नमूना अब पुनर्गठन के लिए तैयार है।
    5. एक अतिरिक्त गुणवत्ता की जांच सुनिश्चित करने के लिए कि तैयारी biochemically समरूप है, एक कम करने (1.0% β-इ) एसडीएस पृष्ठ जेल चला रहे हैं।
      नोट: commassie दाग जेल ~ 33 केडीए GLIC मोनोमर (चित्रा 1) के लिए इसी पर एक एकल बैंड दिखाना चाहिए।
    6. स्पिन लेबल म्यूटेंट dipolar व्यापक प्रदर्शन, के संदिग्ध के लिए प्रति-चुंबकीय लेबल 41 की उपस्थिति में नमूने के तहत लेबल। 0.1 गुना MTSL साथ eluted प्रोटीन सेते हैं और 1.0 घंटे के लिए बर्फ पर सेते हैं। बाद में, प्रति-चुंबकीय लेबल (1-acetoxy-2,2,5,5-tetramethyl-Δ3-pyrroline-3-मिथाइल) मीथेन thiosulfonate का 20 गुना दाढ़ अतिरिक्त जोड़ें।
      नोट: diamagnetic यहां इस्तेमाल किया अभिकर्मक एक समान लेबलिंग रसायन विज्ञान के साथ समचुंबक लेबल करने के लिए आईएसओ steric है।
    7. 2 घंटे के लिए बर्फ पर नमूना सेते हैं। एक siz के माध्यम से नमूना दर्राई अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी स्तंभ है कि चरण 2.5.3 के रूप में बफर और 0.5 मिमी DDM साथ पूर्व equilibrated।
  6. स्पिन लेबलिंग की क्षमता
    1. स्पिन लेबलिंग दक्षता सिस्टीन पक्ष श्रृंखला (GLIC-मोनोमर) की एकाग्रता के लिए स्पिन लेबल एकाग्रता के अनुपात के रूप में परिभाषित किया गया है। नमूने के स्पिन लेबलिंग की क्षमता का निर्धारण करने के लिए, नमूना के एकीकृत तीव्रता एक अंशांकन साजिश का उपयोग कर ज्ञात एकाग्रता का एक मानक के साथ तुलना में किया जाएगा। पानी में भंग करके - (250 सुक्ष्ममापी 10) सांद्रता की एक श्रेणी में: (गति जैसे 2,2,6,6-tetramethyl-1-piperidinyloxyl) एक EPR मानक का समाधान करते हैं।
    2. उपाय इन समाधानों में से प्रत्येक के लिए EPR संकेत और प्रत्येक एकाग्रता के लिए वक्र के तहत क्षेत्र (EPR संकेत के दोहरे एकीकरण) निर्धारित (कदम 6.1 में वर्णित के रूप में)। टेम्पो एकाग्रता के एक समारोह के रूप में मापा क्षेत्र की साजिश रचने और एक सीधी रेखा के साथ फिटिंग द्वारा एक अंशांकन वक्र उत्पन्न करता है।
      नोट: THE हैंएक व्युत्पन्न EPR संकेत के तहत शिखर आयाम करने के लिए चोटी की तुलना में वर्णक्रमीय तीव्रता का एक बेहतर वर्णन है। पहली व्युत्पन्न EPR संकेत घालमेल अवशोषण स्पेक्ट्रम दे देंगे, एक दूसरे एकीकरण तो अवशोषण स्पेक्ट्रम के तहत क्षेत्र (जो स्पिन एकाग्रता के लिए आनुपातिक है) दे देंगे। कम-क्षेत्र और स्पेक्ट्रम की ऊंची क्षेत्र क्षेत्र में एक निरंतर आधार रेखा दोनों सुनिश्चित करें।
    3. डिटर्जेंट एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करने में स्पिन लेबल प्रोटीन की एकाग्रता को मापने (कदम 2.5.4 के रूप में)। अब नमूने के EPR संकेत को मापने के लिए और फिर धारा 6.1 में चरणों का पालन EPR संकेत के दोहरे अभिन्न के क्षेत्र का निर्धारण। अंशांकन साजिश का उपयोग करके, लेबल जो मापा EPR संकेत से मेल खाती की एकाग्रता का निर्धारण। स्पिन लेबल और प्रोटीन एकाग्रता की दाढ़ अनुपात के रूप में स्पिन लेबलिंग दक्षता की गणना।

3. Asolectin झिल्ली में GLIC पुनर्गठन

  1. क्लोरोफॉर्म के 5 मिलीलीटर के साथ एक साफ 25 मिलीलीटर दौर नीचे फ्लास्क कुल्ला और धूआं हुड में एन 2 गैस की एक धारा में कुप्पी सूखी। स्थानांतरण 10 और फ्लास्क में (क्लोरोफॉर्म में सोयाबीन ध्रुवीय निकालने 25 मिलीग्राम / एमएल शेयर) asolectin की मिलीग्राम एन 2 गैस की एक सतत स्ट्रीम के तहत लिपिड सूखी।
    ध्यान दें: पुनर्गठन के लिए लिपिड के विकल्प खंड 4 में प्रयोगों से निष्कर्ष पर आधारित है।
  2. जब क्लोरोफॉर्म हवा हो गया है, 1 घंटे के लिए एक वैक्यूम फ्लास्क में जगह पूरा सुखाने सुनिश्चित करने के लिए। पुनर्गठन बफर के 1 मिलीलीटर सूखे लिपिड को जोड़ें और सख्ती कुप्पी भंवर निलंबन में लिपिड गोली पाने के लिए।
  3. छोटे unilamellar पुटिकाओं तैयार करने के लिए, एक ठंडा स्नान sonicator में लिपिड निलंबन sonicate तक पुटिका समाधान कम या ज्यादा पारदर्शी हो जाता है और कोई झुरमुटों मनाया जाता है (लगभग 10 - 15 मिनट)। इस मिश्रण करने के लिए, 4 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता के लिए DDM जोड़ने के लिए और 30 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं।
<li> पुनर्गठन
  1. लिपिड मिश्रण करने के लिए कदम 2.5.4 से शुद्ध प्रोटीन जोड़ें।
    ध्यान दें: प्रोटीन के लिए लिपिड अनुपात प्रयोग के प्रकार पर निर्भर करता है। स्थूल वर्तमान माप के लिए, एक 1: 10,000 अनुपात प्रयोग किया जाता है। EPR पढ़ाई के लिए, पुनर्गठन लिपिड अनुपात (1: 2500) के लिए एक उच्च प्रोटीन पर किया जाता है संकेत अधिकतम करने के लिए। यह पहले से पता चला है कि इन सांद्रता में, कोई पार्श्व एकत्रीकरण 42 मनाया जाता है।
    नोट: EPR के लिए GLIC की विशिष्ट काम की राशि, ~ 1 मिलीग्राम है, हालांकि स्थिति की जांच के आधार पर कम मात्रा के रूप में अच्छी तरह से काम करेगा।
  2. कोमल रोटेशन के साथ 1 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूना सेते हैं तो बफर ए के साथ 15 मिलीलीटर नमूना पतला
    नोट: यह कदम महत्वपूर्ण micellar एकाग्रता (सीएमसी) नीचे डिटर्जेंट एकाग्रता लाता है।
  3. (हाइड्रोफोबिक pores कि जाल साबुन के साथ) polystyrene मोती जोड़कर निलंबन में अवशिष्ट डिटर्जेंट निकालें। स्वच्छ मोतियों की 80 मिलीग्राम जोड़ें और lipos सेते4 डिग्री सेल्सियस पर ome निलंबन हे / एन एक nutator पर।
    1. उपयोग के लिए माला तैयार करने के लिए, तौलना ~ 100 मिलीग्राम और उन्हें एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब को हस्तांतरण। मेथनॉल के 10 मिलीलीटर जोड़ें, सख्ती से हिला, 2 मिनट के लिए 8000 XG पर मोती नीचे स्पिन, और मेथनॉल छानना। दोहराएँ मेथनॉल की इस प्रक्रिया को तीन बार धोएं। विआयनीकृत पानी की 30 मिलीलीटर, तीन बार धोने के साथ ही इस प्रक्रिया को दोहराएं।
  4. अगले दिन, मोती दूर करने के लिए और आगे 25 मिलीलीटर के लिए नमूना पतला एक स्तंभ फिल्टर का उपयोग कर एक 25 मिलीलीटर ultracentrifuge ट्यूब के लिए liposome हस्तांतरण। 2 घंटे के लिए 168,000 XG पर नमूने अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला छानना और गोली बफर बी के 100 μl का उपयोग कर फिर से निलंबित

4. झल्लाहट से पुनर्गठन के लिए इष्टतम लिपिड संरचना का निर्धारण

  1. झिल्ली संरचना है कि प्रोटीन monodisperse का कहना है निर्धारित करने के लिए एक प्रतिदीप्ति प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट) आधारित परख का प्रयोग करें।
  2. गुम्मट शुद्ध
  3. पुनर्गठन के लिए धारा 3.2 में कदम के बाद, के लिए प्रत्येक लिपिड रचना का परीक्षण किया जा करने के लिए तीन अलग-अलग नमूने तैयार, 1 की एक दाढ़ अनुपात में सबसे पहले, fluorescein लेबल GLIC:। 1,500 (pentamer: लिपिड) दूसरा, rhodamine- लेबल एक दाढ़ अनुपात में GLIC की 1: 1,500 (pentamer: लिपिड)। तीसरा, मिश्रण डिटर्जेंट solubilized fluorescein और rhodamine लेबल GLIC (1: 1 अनुपात दाढ़)। 750 (pentamer: लिपिड) अनुपात 1 में इस मिश्रण Reconstitute।
    नोट: asolectin, POPC: POPG (3: 1 दाढ़ अनुपात), और हम तीन लिपिड प्रणाली का इस्तेमाल किया कोलाई ध्रुवीय निकालने। झल्लाहट प्रयोग में प्रोटीन लिपिड को पुनर्गठन अनुपात EPR माप के लिए इस्तेमाल किया है कि अधिक से अधिक है (1: तुलना में 750 1: 1,500 EPR अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया)।
  4. पतलाliposome निलंबन (प्रकाश बिखरने संकेत को कम करने के लिए; बफर के 995 μl में ~ 5 μl) तो एक क्वार्ट्ज क्युवेट में नमूना पिपेट और एक fluorimeter में जगह है।
  5. 490 में उत्तेजना तरंगदैर्ध्य (: fluorescein जो दाता के लिए अवशोषण Maxima से मेल खाती है) सेट करें। निर्माता के निर्देशों का प्रयोग, 500 एनएम से 660 एनएम के लिए उत्सर्जन स्पेक्ट्रा रिकॉर्ड है।
    नोट: fluorescein लेबल GLIC नमूना के लिए, आप 518 एनएम पर एक चोटी पर 572 एनएम पर कोई चोटी के साथ (fluorescein उत्सर्जन के लिए इसी) (rhodamine उत्सर्जन के लिए इसी) देखेंगे। rhodamine- लेबल GLIC नमूना के लिए, आप 518 एनएम पर एक चोटी पर नहीं देख सकेंगे, लेकिन इसके बजाय 572 एनएम पर 490 एनएम पर rhodamine के प्रत्यक्ष उत्तेजना से उत्पन्न होने वाली। दोनों fluorescein और rhodamine लेबलों युक्त नमूना के लिए, fluorescein शिखर तीव्रता में कमी और rhodamine चोटी में एक इसी वृद्धि एक संकेत झल्लाहट की संभावना है कि झिल्ली पर प्रोटीन के पार्श्व एकत्रीकरण का सूचक है।
  6. की निगरानीविभिन्न समय अंतरालों पर 572 एनएम पर rhodamine उत्सर्जन के आयाम (0 से - 24 घंटे) पहले 6 घंटे के लिए और फिर हे / एन ऊष्मायन (चित्रा 2) के बाद हर घंटे में रिकॉर्डिंग। प्रत्येक अंतराल के लिए, 572 एनएम (rhodamine के लिए: आइए) में प्रतिदीप्ति तीव्रता मापने के लिए और 518 एनएम (fluorescein के लिए: ID)। आइए (आईएसी) से सीधी rhodamine सक्रियण (4.3 चरण में नमूना 2) के योगदान को घटाएँ। के रूप में IAC / (आईएसी + आईबी) झल्लाहट अनुपात निर्धारित करते हैं। तुलना झल्लाहट अलग समय अंतराल पर और विभिन्न लिपिड रचनाओं के पार।
    नोट: एक नियंत्रण के रूप में, डिटर्जेंट solubilized नमूने के लिए कदम 4.5 और 4.6 प्रदर्शन और पुनर्गठन liposomes से उन लोगों के लिए उत्सर्जन स्पेक्ट्रा की तुलना करें। डिटर्जेंट में लेबल प्रोटीन का एक equimolar मिश्रण का प्रयोग करें (4.3 चरण में वर्णित) और पतला बफर एक 0.5 मिमी DDM के साथ पूरक है। यह उम्मीद है कि डिटर्जेंट नमूने न्यूनतम संकेत झल्लाहट में दिखाई देंगे।

5. पैच दबाना रिकॉर्डिंग से कार्यात्मक माप

  1. जनसंपर्क तैयारEPR स्टडीज (धारा 3.1) के लिए के रूप में ठीक उसी तरह पैच दबाना माप के लिए oteoliposomes।
    नोट: माप के प्रकार (एकल चैनल Macroscopic रिकॉर्डिंग बनाम) बनाया जा रहा है पर आधारित लिपिड अनुपात: हालांकि, प्रोटीन समायोजित करें। -80 पर तरल नाइट्रोजन और दुकान में proteoliposomes फ्लैश फ्रीज डिग्री सेल्सियस उपयोग करें जब तक। आमतौर पर, 1 में GLIC पुनर्गठित: 10,000 प्रोटीन: स्थूल धाराओं के लिए लिपिड (दाढ़ अनुपात) और 1: एकल चैनल रिकॉर्डिंग के लिए 50,000 दाढ़ अनुपात।
  2. बर्फ पर पिघलना liposomes। पानी और इथेनॉल के साथ एक साफ कांच स्लाइड कुल्ला और पूरी तरह से सूखे। स्लाइड और सूखे हे के केंद्र पर proteoliposome की एक 10 μl बूंद रखें / एन वैक्यूम के अंतर्गत 4 सी पर Desiccator में।
  3. री-हाइड्रेट बफर बी (150 मिमी NaCl, 10 मिमी HEPES, 7.0 पीएच) के 20 μl जोड़कर सूखे proteoliposomes और एक नम फिल्टर पेपर के शीर्ष पर एक petriplate में स्लाइड जगह। प्लेट कवर और पुनर्जलीकरण के बारे में 2 घंटे के लिए आगे बढ़ने के लिए अनुमति देते हैं।
    नोट: इस प्रक्रिया Yieएलडीएस विशाल बहु-परतदार liposomes कि से पैच करने के लिए अनुकूल हैं।
  4. निर्माता के पिपेट खींचने पर सेट करने की सलाह का उपयोग कर - पतली दीवारों borosilicate ग्लास केशिकाओं (2 माइक्रोन टिप व्यास ~ 1) से पैच pipettes खींचो। गर्मी पोलिश एक का उपयोग कर 1.5 की एक प्रतिरोध करने के लिए आग-Forge - 2MΩ जब बफर बी के साथ भरा
  5. एक पिपेट का उपयोग बफर बी के साथ रिकार्डिंग कक्ष भरें और एजी / AgCl जमीन इलेक्ट्रोड देते हैं। एक 2 μl विंदुक टिप का उपयोग करना, धीरे बढ़त और हस्तांतरण रिकार्डिंग कक्ष पर निलंबन की 1 μl से liposomes बेदखल। liposomes नीचे करने के लिए व्यवस्थित करने के लिए कुछ मिनट तक प्रतीक्षा करें।
  6. एक nonmetallic सिरिंज सुई का उपयोग बफर बी के साथ पैच-पिपेट भरें और एम्पलीफायर सिर मंच पर माउंट। पैच करने के लिए एक एकल पृथक पुटिका को पहचानें। clogging से पैच-पिपेट को रोकने, और रिकार्डिंग कक्ष में नोक डालने के लिए एक मामूली सकारात्मक दबाव लागू करें।
  7. परीक्षण दालों लागू पिपेट resista को मापने के लिएnce और पिपेट वोल्टेज ऑफसेट के लिए क्षतिपूर्ति। पुटिका दृष्टिकोण है, और जब संपर्क किया जाता है, धीरे से एक gigaohm सील फार्म पैच पिपेट के खिलाफ पुटिका खींचने के लिए एक मामूली नकारात्मक दबाव लागू होते हैं।
  8. पूरी प्रक्रिया के दौरान पिपेट के विरोध को मॉनिटर। एक बार जब gigaohm मुहर का गठन किया है, एक के अंदर-बाहर पैच के लिए फार्म का ध्यान liposome से दूर पिपेट वापस ले लें। परीक्षण पल्स बंद कर दें।
  9. -100 एम वी होल्डिंग क्षमता निर्धारित करें, और एक पीएच पल्स लागू होते हैं। कम पीएच 10 मिमी सोडियम साइट्रेट बफर सी (150 मिमी NaCl, 10 मिमी साइट्रेट, पीएच 3.0) का उपयोग कर प्राप्त किया गया था। (चित्रा 3)
    नोट: रिकॉर्डिंग स्थूल के लिए 10 kHz और एक चैनल के मापन के लिए 40 kHz के एक नमूना आवृत्ति पर बना रहे हैं।

6. EPR माप

  1. निरंतर तरंग EPR स्पेक्ट्रोस्कोपी
    1. एक 200 μl ट्यूब में कदम 3.2 से liposome निलंबन स्थानांतरण और एक सेंट्रीफ्यूज का उपयोग कर नमूने गोली। supernata त्यागेंNT और नमूना EPR माप के लिए तैयार है।
      नोट: EPR माप के लिए, यह संभव के रूप liposome नमूना से ज्यादा के रूप में बफर दूर करने के लिए महत्वपूर्ण है। चूंकि जलीय नमूने माइक्रोवेव हीटिंग और संवेदनशीलता के नुकसान में जिसके परिणामस्वरूप के बिजली हिस्सा अवशोषित।
    2. बफर विनिमय बाहर ले जाने के लिए, एक microfuge ट्यूब के लिए एक पिपेट का उपयोग liposome गोली के 20 μl हस्तांतरण। बफर डी (100 मिमी NaCl, 10 मिमी साइट्रेट, पीएच 3.0) के 180 μl जोड़ें और 5 मिनट के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान पर सेते हैं। नमूना अपकेंद्रित्र, एक पिपेट का उपयोग कर सतह पर तैरनेवाला हटाने और इस प्रक्रिया को तीन बार दोहराने पूरा बफर आदान प्रदान सुनिश्चित करने के लिए।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, बफर विनिमय कई / फ्रीज पिघलना चक्र के लिए नमूने subjecting द्वारा बनाया जा सकता है।
    3. गैस पारगम्य प्लास्टिक केशिकाओं दोनों वर्णक्रम लाइन-आकृति और विलायक पहुंच के मापन के लिए उपयुक्त हैं। अंदर नमूना आकर्षित और हड्डी मोम के साथ अंत सील करने के लिए pelleted proteoliposome पर केशिका टैप करें।
      नहींई: ठेठ नमूना संस्करणों ~ 5 μl कर रहे हैं और एक वांछनीय स्पिन एकाग्रता 150 माइक्रोन है। उद्देश्य अकेले लाइन आकार को मापने के लिए है, तो एक 0.4 मिमी आयुध डिपो क्वार्ट्ज केशिका ट्यूब का उपयोग कर सकते हैं। यदि आवश्यक हो, एक पिपेट केशिका के अंदर नमूना भरने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
    4. स्पेक्ट्रोमीटर प्रचालन
      1. एक एक्स-बैंड प्रति निर्माताओं 'अनुदेश पुस्तिका के रूप में एक ढांकता हुआ गुंजयमान यंत्र के साथ सुसज्जित स्पेक्ट्रोमीटर पर - आर टी (297 कश्मीर 292) में सीडब्ल्यू-EPR माप प्रदर्शन।
      2. पानी चिलर, बिजली की आपूर्ति, और माइक्रोवेव पुल कंसोल चालू करें। thermally रिकॉर्डिंग से पहले के बारे में 30 मिनट के लिए संतुलित करने के लिए प्रणाली की अनुमति दें। अधिग्रहण सॉफ्टवेयर खोलें।
      3. , गुंजयमान यंत्र में नमूना ट्यूब / केशिका डालें सुनिश्चित करें कि नमूने के साथ भरे ट्यूब की धारा गुंजयमान गुहा के केंद्र में है बनाते हैं। ट्यून स्पेक्ट्रोमीटर पुस्तिका पर अनुदेश के अनुसार गुंजयमान यंत्र।
      4. पर क्षेत्र झाडू से पहले व्युत्पन्न अवशोषण स्पेक्ट्रम रिकॉर्ड1.0 मेगावाट, 100 किलोहर्ट्ज़ के एक मॉडुलन आवृत्ति और 100 जी के एक झाड़ू चौड़ाई की एक घटना माइक्रोवेव शक्ति एक प्रगतिशील शक्ति संतृप्ति प्रयोग बाहर ले जाने से प्रयोग के लिए इष्टतम शक्ति का निर्धारण जहां पहले व्युत्पन्न सीडब्ल्यू के शिखर से पीक ऊंचाई EPR संकेत घटना माइक्रोवेव शक्ति का वर्गमूल के एक समारोह के रूप में मापा जाता है।
        नोट: निचले माइक्रोवेव शक्तियों में बिजली का वर्गमूल के अनुपात में संकेत की तीव्रता बढ़ जाती जब तक स्पिन राज्यों के संतुलन आबादी अप्रभावित है। हालांकि, अगर सत्ता आगे बढ़ जाती है, स्पिन जाली छूट नहीं रह दो स्पिन राज्यों के संतुलन आबादी अंतर बनाए रख सकते हैं और संकेत आयाम पठार या करने के लिए शुरू होता है "तर।" इस बिंदु से परे है, संकेत आयाम वास्तव में स्पिन Sates की जनसंख्या ह्रास के कारण बिजली का निरीक्षण वृद्धि के साथ कम हो सकती है। इसके अलावा, व्यापक पंखों के साथ चौड़ी स्पेक्ट्रा के लिए जहां एक अच्छी तरह से परिभाषित फ्लैट आधारभूत नहीं vi हैक्षेत्र के नुकसान को रोकने के लिए 200 ग्राम - Sible, 150 झाडू चौड़ाई का विस्तार।
      5. 1.0 की एक मॉडुलन आयाम का उपयोग कर जी के साथ शुरू
        ध्यान दें: यह मान नमूना पर निर्भर है और संकेत में कम आवृत्ति शोर को कम करने के लिए समायोजित है। बहुत बड़ी एक मूल्य प्रयोग किया जाता है, तो यह विकृत या संकेत व्यापक हो सकता है।
      6. 20.48 मिसे के लिए समय निरंतर और रूपांतरण समय सेट, 1024 के अंक के लिए 20.97 सेकंड, और संकल्प के लिए समय झाडू।
        नोट: समय लगातार भी नमूने पर आधारित है और उच्च आवृत्ति शोर बाहर फिल्टर करने के लिए निकाला जाता है।
      7. पहले स्कैन करने के बाद, EPR संकेत के केंद्र में केंद्र क्षेत्र की स्थापना की और झाडू चौड़ाई है कि इस तरह का पता लगाने के संकेत और दोनों तरफ पर्याप्त आधारभूत शामिल चुनें।
        नोट: इसके अलावा, संकेत / शोर अनुपात में सुधार EPR सिग्नल की शक्ति के आधार पर स्कैन की संख्या में वृद्धि करने के लिए। झाडू चौड़ाई और अंक की संख्या में शामिल
      8. स्पिन लेबल की पहुंच उपाय एजेंटों आराम collisional करने हे 2 27 कदम 6.1.4.4 में वर्णित है।
        नोट: के रूप में पहले 26 में वर्णित NiEDDA तैयार करें।
      9. (बाहर निकलवाने के लिए ओ 2) सबसे पहले 5 मिनट के लिए एन 2 के साथ गुहा में नमूना छिड़कना। 30 जी के एक झाड़ू चौड़ाई के साथ 3 DB के चरणों में 35 डीबी - 5 के बीच प्रत्येक माइक्रोवेव सत्ता के लिए स्पेक्ट्रा उपाय
      10. फिर साथ गुहा में नमूना छिड़कना 10 मिनट के लिए हवा और विभिन्न माइक्रोवेव शक्तियों पर स्पेक्ट्रा को मापने (5 - 3 DB के चरणों में 35 डीबी) कदम 6.1.4.9 के रूप में।
      11. 5 मिनट के लिए एक 42 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में 50 मिमी NiEDDA के 180 μl (बफर बी या बफर डी में) के साथ liposome गोली के 20 μl सेते हैं। नमूना अपकेंद्रित्र और एक पिपेट का उपयोग कर सतह पर तैरनेवाला हटा दें। केशिका में नमूना लोड और गुंजयमान गुहा में जगह है। दोहराएँ कदम 6.1.4.9।
        नोट: प्रयोग के पीछे सिद्धांत है कि समचुंबक relaxin के साथ बातचीतहाइजेनबर्ग स्पिन विनिमय के माध्यम से छ एजेंटों संकेत और जनसंख्या ह्रास की संतृप्ति को रोका जा सके। जल घुलनशील NiEDDA और लिपिड घुलनशील आणविक हे 2 पानी (दोनों थोक और intraprotein गलियारे) के लिए संवाददाताओं के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं और झिल्ली क्रमशः उजागर प्रोटीन पर पदों।
  2. डेटा विश्लेषण:
    नोट: EPR आंकड़ों के विश्लेषण निम्नलिखित चरण शामिल हैं: 14,22,23,25-27
    1. स्पिन जांच की गतिशीलता की गणना (ΔH -1), पहले व्युत्पन्न अवशोषण स्पेक्ट्रम की सेंट्रल लाइन चौड़ाई का विलोम के रूप में। ΔH -1 गतिवान स्वतंत्रता या जांच की गतिशीलता को प्रतिबिंबित करता है।
    2. पहुंच पैरामीटर (П) है, जो अन्य समचुंबक collisional आराम एजेंटों के लिए जांच की पहुंच के एक अनुमान है, नीचे वर्णित चरणों का उपयोग कर की गणना।
      नोट: समचुंबक आराम एजेंटों के साथ स्पिन जांच की बातचीतहाइजेनबर्ग स्पिन एक्सचेंज द्वारा nitroxide की स्पिन जाली छूट की दर (टी 1) को बढ़ाता है। 27
      1. संकेत के आयाम शक्ति संतृप्ति प्रयोगों (6.1.4.8), जिसमें पहले व्युत्पन्न EPR स्पेक्ट्रम के सेंट्रल लाइन की खड़ी चोटी से शिखर आयाम अलग माइक्रोवेव सत्ता पर मापा जाता है से पहुंच पैरामीटर (П) का अनुमान है। 25 प्लॉट माइक्रोवेव शक्ति के वर्ग रूट के एक समारोह और निम्न समीकरण 27 के साथ फिट के रूप में।
        1 समीकरण
        नोट: जहां एक संकेत के आयाम है, प्रतिध्वनि लाइन (जो 0.5 और 1.5 के बीच आम तौर पर है) की संतृप्ति की एकरूपता का एक उपाय है, मैं एक स्केलिंग कारक है, पी घटना शक्ति है, और का प्रतिनिधित्व करता है मूल्य, जिस पर पहले व्युत्पन्न आयाम अपनी असंतृप्त मूल्य का आधा है।
  3. गणना ΔP 2 या NiEDDA) और अभाव में 1/2 मूल्यों समचुंबक आराम एजेंटों की (एन 2 के साथ perfused)। गणना पहुंच पैरामीटर (П) समीकरण का उपयोग:
    2 समीकरण
    नोट: जहां पी 1/2 संदर्भ और ΔH संदर्भ, आधा अधिक से अधिक बिजली संतृप्ति मूल्य और सेंट्रल लाइन चौड़ाई क्रमश संदर्भ मानक 27 (जैसे DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) के रूप में) के लिए।

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Representative Results

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स्पिन लेबल GLIC म्यूटेंट की बायोकेमिकल विशेषता

ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल के बाद आम तौर पर 10 रेंज में GLIC-MBP संलयन प्रोटीन उपज होगा - संस्कृति के 12 मिलीग्राम / एल। हालांकि इस मूल्य विशेष रूप से प्रोटीन के भीतर दफन पदों के लिए, विभिन्न म्यूटेंट भर में भिन्न हो सकते हैं, उपज में काफी समझौता किया जा सकता है। इन मामलों में, संस्कृति मात्रा में स्केलिंग आवश्यकता हो सकती है। फ्यूजन की दरार का निर्माण करके HRV3C प्रोटीज सुविधा के लिए हे / एन बाहर किया जाता है। एसडीएस पृष्ठ जेल पर नमूने से चल रहे हैं, हमने पाया है इस दरार 30 के भीतर पूरा हो गया है कि - 60 मिनट। (चित्रा 1 ए)। आकार अपवर्जन जेल निस्पंदन स्तंभ पर शुद्ध GLIC 11.3 मिलीलीटर की एक प्रतिधारण मात्रा के साथ एक pentamer के रूप में मुख्य रूप से elutes। MBP अंश 15 मिलीलीटर पर elutes और समुच्चय स्तंभ (~ 7.0 एमएल) के शून्य मात्रा में elute। स्पिन लेबल पर आता हैक्षालन के अंत (~ 24 मिलीलीटर) (चित्रा 1 बी)

विभिन्न झिल्ली लिपिड में GLIC पुनर्गठन के एकत्रीकरण के लिए निगरानी आधारित परख झल्लाहट

झल्लाहट परख पुनर्गठन पुटिकाओं में GLIC pentamers के एकत्रीकरण का मूल्यांकन करने के लिए प्रयोग किया जाता है (एक दूरी <झिल्ली पर 50 एक के भीतर एक साथ आए थे)। (C27 के साथ, या तो Fluorescein या tetramethylrhodamine के साथ लेबल) GLIC गुम्मट से डेटा चित्रा 2 शो और में पुनर्गठन .coli ध्रुवीय लिपिड, POPC: POPG (3: 1), पोप: POPG (3: 1) या asolectin। प्रतिदीप्ति माप चलता है कि asolectin में पुनर्गठन GLIC कोई झल्लाहट से पता चला है और यहां तक कि फ्रीज / नमूना (एकत्रीकरण को बढ़ावा देने के लिए जाना जाता शर्तों) विगलन झल्लाहट का स्तर 43 में मामूली बदलाव का उत्पादन किया। इस कारण से, asolectin इन स्टू में इस्तेमाल किया कार्यात्मक और स्पेक्ट्रोस्कोपी माप के लिए पसंद की लिपिड मिश्रण हैमर जाता है।

Proteoliposomes में GLIC के macroscopic व्यवहार

शुद्ध GLIC के कार्यात्मक संपत्तियों का पुनर्गठन proteoliposomes में पैच दबाना माप की विशेषता है। एक पीएच-कूद के जवाब में एक अंदर-बाहर पैच से GLIC गुम्मट से प्रतिनिधि स्थूल वर्तमान रिकॉर्डिंग संभावित पकड़े, पीएच 3.0 बफर करने के लिए स्विचन तेजी से आवक धाराओं को सक्रिय करने के उत्पादन में 3 चित्र में दिखाया गया है -100 एम वी पर। (10 - 100 मिसे) है कि (- 3 सेकंड, चित्रा 3 में 1) सेकंड के भीतर 43 शिखर आयाम के बारे में 10% करने के लिए क्षय। धाराओं तटस्थ पीएच वापस करने के लिए स्विचन द्वारा इस स्थूल क्षय या desensitization से उबरने। जबकि अंदर-बाहर पैच में चैनलों स्नान पीएच में परिवर्तन के प्रति संवेदनशील थे, वहाँ (डेटा) नहीं दिखाया पिपेट समाधान में पीएच परिवर्तन का कोई असर नहीं सुझाव है कि GLIC मुख्य रूप से एक सख्त में उन्मुख किया गया थाction कि इस तरह के पैच में बाह्य डोमेन स्नान / समाधान एक्सचेंजर का सामना करना पड़ा।

चैनल सक्रियण के दौरान स्ट्रक्चरल rearrangements

आरटी पर, स्पिन जांच कई rotameric रचना अपनाने कर सकते हैं, और वर्णक्रमीय लाइन आकार न केवल पेप्टाइड रीढ़ की हड्डी के सापेक्ष स्पिन लेबल पक्ष-चेन की गति के लिए, लेकिन यह भी रीढ़ की हड्डी में उतार-चढ़ाव और वैश्विक प्रोटीन गतियों के प्रति संवेदनशील है। (स्थिति में काले घेरे के रूप में प्रकाश डाला इसलिए, EPR lineshapes में परिवर्तन ताकना अस्तर M2 क्षेत्र के बाह्य हाइड्रोफोबिक क्षेत्र में साबित कर सकते हैं प्रोटीन गठनात्मक परिवर्तन की निगरानी के लिए एक उत्कृष्ट नैदानिक ​​उपकरण होने के लिए। 4 चित्रा स्थिति L241 (17) पर स्पेक्ट्रा से पता चलता R1 चित्रा 4, पीएच 7.0 और 3.0 पीएच पर इनसेट)। दो शर्तों के तहत स्पेक्ट्रा शो मतभेद, दोनों संकेत आयाम में और की हदगति का विस्तार। कार्यात्मक माप 42 के साथ के रूप में, EPR संकेतों द्वारा रिपोर्ट गठनात्मक परिवर्तन भी पूरी तरह से प्रतिवर्ती हैं। स्पेक्ट्रल व्यापक जांच की गति की कमी से और dipolar युग्मन द्वारा दोनों को प्रभावित किया है। दो, L241 (17) के योगदान को निर्धारित करने के लिए सह-लेबल एक प्रति-चुंबकीय स्पिन लेबल के साथ है। के तहत लेबल और पूरी तरह से लेबल स्पेक्ट्रा पीएच 7.0 और 3.0 पीएच (चित्रा 4 बी) पर तुलना कर रहे हैं। इस स्थिति में dipolar विस्तार की हद तक कम हो जाती है जब चैनलों के तहत चिह्नित कर रहे हैं, जो विभिन्न यूनिटों के बीच स्पिन लेबल के बीच एक संवाद इंगित करता है।

चित्रा 5 एम 4 हेलिक्स पर दो पदों पर जो चैनल की परिधि में स्थित है के लिए स्पेक्ट्रा से पता चलता है। ΔH -1 सेंट्रल लाइन चौड़ाई (इनसेट में दिखाया गया है) का विलोम के रूप में मापा जाता है। जैसा कि nitroxide घूर्णी गति कम हो जाता है, के रूप में गठन के दौरान देखातृतीयक या चतुर्धातुक संपर्कों की, किसी विशेष गतिवान ज्यामिति के लिए लाइन चौड़ाई बढ़ जाती है (और इसलिए ΔH -1 घट जाती है)। इसके विपरीत, संरचनात्मक आंदोलन की जांच की आजादी में वृद्धि करने के लिए अग्रणी गतियों -1 ΔH में वृद्धि के रूप में दिखाई देता है। F312R1 अधिक मोबाइल, जबकि R296R1, निश्चल उनकी अवगत कराया और अत्यधिक विवश वातावरण के अनुरूप है क्रमशः है।

प्रोटीन कोर या तो पानी या लिपिड के लिए दुर्गम के भीतर दफन, या पर एक जलीय समाधान के संपर्क में सतह पर,: पहुंच मानकों पर आधारित है, प्रोटीन पर एक विशिष्ट स्थान में एक स्पिन लेबल निम्न में से एक के रूप में वर्गीकृत किया जा सकता सतह लिपिड के संपर्क में (आंकड़े 5 और 6)। लगातार साइटों की एक श्रृंखला के लिए प्राप्त पहुंच मापदंडों तो, एक क्षेत्र के माध्यमिक संरचना निर्धारित प्रोटीन, प्रोटीन के क्षेत्रों की जांच के लिए इस्तेमाल किया जा सकतासंपर्क, झिल्ली के भीतर एक प्रोटीन का झुकाव मापने इंटरफेसियल छोरों का विसर्जन गहराई का अनुमान है, और transmembrane सर्पिलों के भीतर पानी गलियारे और लिपिड को बाध्य जेब की पहचान। 26 एक उदाहरण के रूप में, F312R1 है कि चित्रा 6 शो में बिजली-संतृप्ति घटता एक अपेक्षाकृत उच्च पी 1/2 हे 2 के लिए, R296R1 की तुलना में, स्थिति F312 पर पक्ष-चेन सुझाव लिपिड को उजागर कर रहे हैं। इसके अलावा, F312R1 भी R296R1 लिपिड पानी इंटरफेस में अपने स्थान के साथ लगातार की तुलना में NiEDDA के लिए अधिक सुलभ है। दूसरी ओर, बाह्य डोमेन के पाश सी क्षेत्र में L180R1 मोबाइल और एक पानी उजागर पाश में अपने स्थान के साथ संगत, NiEDDA के लिए सुलभ है।

जांच की गतिशीलता और किसी दिए गए स्थान पर पहुंच डेटा समग्र प्रोटीन गुना के भीतर है कि विशिष्ट स्थिति के बारे में स्थानीय संरचनात्मक जानकारी प्रदान करते हैं। ये अल के लिए चुना गया पैरामीटर्सप्रोटीन के साथ अवशेषों की inear अनुक्रम आगे बदलना तरीकों फूरियर के आधार पर विश्लेषणात्मक दृष्टिकोण का उपयोग कर विश्लेषण किया जा सकता है। ये विश्लेषण EPR पर्यावरणीय मानकों में समय-समय पर बदलाव का मूल्यांकन करने के लिए और भविष्यवाणी और माध्यमिक संरचनाओं orienting में मार्गदर्शन करने के लिए उपयोगी होते हैं। एक विशेष प्रोटीन खंड के लिए, एक असतत फूरियर शक्ति स्पेक्ट्रम पी (ω) है कि क्षेत्र में आसन्न पदों (ω) के बीच के कोण के एक समारोह के रूप में गणना की है। इस साजिश तो स्पेक्ट्रम के मुख्य कोणीय आवृत्ति घटक निर्धारित की तुलना में इस्तेमाल किया और एक α-हेलिक्स के लिए उम्मीद की (ω) मूल्यों के लिए किया जाता है (80 - 120 º) या β-किस्में (150 - 180 º)।
3 समीकरण
जहां पी ( 'ω') फूरियर कोणीय आवृत्ति ω के एक समारोह के रूप में शक्ति स्पेक्ट्रम को बदलने, एन खंड में अवशेषों की संख्या है, स्थिति में पर्यावरण पैरामीटर है। पी ('ω') मूल्य ω के लिए मूल्यांकन किया जाता है = समीकरण 6 कि पी ( 'ω') अधिकतम हो।

इसके अलावा, एक अवधि सूचकांक पैरामीटर कोण है कि स्पेक्ट्रम के कुल क्षेत्रफल का है कि करने के लिए एक दिया संरचनात्मक तत्व का प्रतिनिधित्व करने के लिए बिजली स्पेक्ट्रम के तहत क्षेत्र के अनुपात के रूप में गणना की जाती है (भविष्यवाणी माध्यमिक संरचना के महत्व देता है)। एक स्लाइडिंग खिड़की विधि तो शुरुआत है और एक दिया माध्यमिक संरचनात्मक तत्व के अंत की पहचान के लिए प्रयोग किया जाता है। रिश्तेदार उन्मुखीकरण प्रोटीन के आराम करने के लिए सम्मान के साथ इस खंड पी ( 'ω') पल की दिशा से अनुमान लगाया जा सकता है।

α-हेलिक्स के लिए:

4 समीकरण

5 समीकरण

इन तरीकों को सफलतापूर्वक तीन आयामी टोपोलॉजी का निर्धारण और प्रोटीन समारोह 14,23,24,41,44-53 अंतर्निहित गठनात्मक परिवर्तन की भविष्यवाणी करने के लिए कई प्रणालियों के लिए लागू किया गया है।

EPR से दूरी वितरण का निर्धारण

इंटर सबयूनिट nitroxide दूरी इलेक्ट्रॉन इलेक्ट्रॉन dipolar बातचीत से निर्धारित किया जा सकता है। CW-EPR में, के रूप में चित्रा 4 में दिखाया गया है, के माध्यम से अंतरिक्ष dipolar बातचीत वर्णक्रम विस्तार करने के लिए नेतृत्व और लेबल के बीच निकटता के एक समारोह कर रहे हैं। 20 एक, व्यापक बनाने (पूरी तरह से लेबल स्पेक्ट्रा और तहत लेबल स्पेक्ट्रा के बीच तुलना में) की हद तक अर्द्ध मात्रात्मक का उपयोग दूरी का अनुमान किया जा सकता है - अप करने के लिए ~ 15 दूरी के लिएफूरियर deconvolution तरीकों। 28,29

इंटर सबयूनिट दूरी (<50 ए) डबल इलेक्ट्रॉन इलेक्ट्रॉन अनुनाद (हिरण) तरीकों का उपयोग कर मापा जा सकता है। 30-34 हिरण डेटा डिटर्जेंट नमूनों में एकत्र या क्योंकि liposomes 54 में इन मापों के साथ जुड़े सीमाओं की nanodiscs में पुनर्गठन कर रहे हैं। 0.5 मिमी DDM साथ बफर में डिटर्जेंट में स्पिन लेबल नमूने (~ 100 माइक्रोन) के लिए, 30% (वजन / मात्रा) ग्लिसरॉल cryoprotection के लिए इस्तेमाल किया जाता है। Dipolar समय विकास डेटा 83 कश्मीर में प्राप्त कर रहे हैं एक मानक हिरण चार पल्स प्रोटोकॉल (π / 2) का उपयोग कर MW1-τ1- (π) MW1-τ1- (π) MW2-τ2- (π) MW1-τ2 गूंज 55 एक स्पंदित EPR स्पेक्ट्रोमीटर पर क्यू बैंड आवृत्ति (33.9 गीगा) पर काम कर। के लिए (π / 2) MW1 और (π) MW1 पल्स लंबाई 10 और 20 nsec, क्रमशः रहे हैं, और 40 nsec के लिए (π) MW2। हिरण संकेत तो पृष्ठभूमि में एक 3 डी सजातीय backgro संभालने सही कर रहे हैंअंड और Tikhonov नियमितीकरण 31,56 से विश्लेषण दूरी में औसत दूरी और वितरण निर्धारित करने के लिए।

पीएच 7.0 से हिरण प्रयोगों द्वारा निर्धारित एम 4 (F314R1) में एक प्रतिनिधि पद के लिए इंट्रामोलीक्युलर दूरी चित्रा 7 में दिखाया जाता है के बाद से वहाँ GLIC pentamer के भीतर पांच स्पिन लेबल रहे हैं, कम से कम दो दूरी उम्मीद कर रहे हैं। एक आसन्न सब यूनिटों के लिए इसी और असन्निकट सब यूनिटों से अन्य, हालांकि अतिरिक्त चोटियों वैकल्पिक rotameric स्पिन झुकाव से उत्पन्न हो सकती है। हिरण संकेत decays और इसी प्रायिकता वितरण दिखाए जाते हैं। पहले कम दूरी की चोटी (~ 42A) आसन्न सब यूनिटों के बीच दूरी का प्रतिनिधित्व करता है, और दूसरा शिखर (~ 53A) गैर आसन्न दूरी से मेल खाती है। विकर्ण दूरी के लिए पीक कम दूरी पर प्रतीत होता है, और इस वजह से 60 से परे विश्वसनीय माप को कम करके आंका जाने की संभावना हैपृष्ठभूमि सुधार के साथ तकनीकी कठिनाइयों के कारण प्रयोगात्मक परिस्थितियों में संभव नहीं हैं।

आकृति 1
चित्रा 1. बायोकेमिकल विशेषता स्पिन लेबल GLIC म्यूटेंट। (ए) प्रतिनिधि जेल निस्पंदन MBP टैग की प्रोटिओलिटिक दरार के बाद स्पिन लेबल-GLIC की वर्णलेख। चोटियों GLIC को pentamer और मुक्त MBP अनुरूप हैं। (बी) के एसडीएस पृष्ठ (जेल छानने का काम करने से पहले) काटा हुआ monomeric GLIC-MBP संलयन प्रोटीन और MBP और GLIC अंशों जेल निस्पंदन से जमा दिखा। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. एफआर विभिन्न झिल्ली लिपिड में GLIC पुनर्गठन के एकत्रीकरण राज्य निगरानी के लिए एट आधारित परख। झल्लाहट माप हे / एन पुनर्गठन (बाएं) के बाद और ठंड / विगलन के नमूने (दाएं) के बाद नमूनों के लिए दिखाए जाते हैं। (मूल आंकड़ा से संशोधित)। 43 यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. Proteoliposomes में GLIC के macroscopic व्यवहार। एक के अंदर-बाहर पैच पुटिकाओं asolectin पुनर्गठन से excised में, GLIC पीएच से सक्रिय है एक तेजी से समाधान एक्सचेंजर का उपयोग कर कूदता है। 3 सेकंड - चैनलों ~ 10 मिसे में सक्रिय और 1 के एक लगातार समय के साथ असंवेदनशील करने के लिए देखा जाता है। (मूल आंकड़ा से संशोधित)। 43ig3large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चैनल सक्रियण के दौरान चित्रा 4. स्ट्रक्चरल rearrangements। (ए) रोमकूप में एक स्थान M2 हेलिक्स अस्तर, पीएच बदलाव के जवाब में आयाम और लाइन आकार में परिवर्तन को प्रदर्शित करने के लिए प्रतिनिधि CW-EPR स्पेक्ट्रा। प्रत्येक मामले में, स्पेक्ट्रा spins की कुल संख्या के लिए सामान्यीकृत कर रहे हैं। स्पिन लेबल स्थिति एक काले वृत्त के रूप में दिखाया गया है। केवल दो यूनिटों स्पष्टता के लिए दिखाए जाते हैं। (बी) EPRspectra स्पिन स्पिन बातचीत से dipolar विस्तार दिखा। धराशायी लाइन में स्पेक्ट्रा के तहत लेबल चैनलों से (प्रति-चुंबकीय लेबल की उपस्थिति में) और ठोस लाइन में थे पूरी तरह से लेबल चैनलों से थे। इनसेट आयाम सामान्यीकृत स्पेक्ट्रा के एक ओवरले पता चलता है। पूरी तरह से लेबल की शर्तों के तहत विस्तृत बनाने अधिक हैतीर द्वारा जला दी। स्कैन चौड़ाई 150 जी (मूल आंकड़ा से संशोधित)। 36 यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5. अवशेष विशिष्ट पर्यावरणीय मानकों पावर संतृप्ति द्वारा मापा। Transmembrane डोमेन के एम 4 हेलिक्स में दो परस्पर विरोधी पदों के लिए वर्णक्रमीय चौड़ाई (ΔH 0) और विलायक पहुंच (पी 1/2) की माप। एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें यह आंकड़ा की।

चित्रा 6
चित्रा 6 के पर्यावरण GLIC के बाह्य डोमेन, एक प्रतिनिधि लूप सी अवशेष। स्पिन सामान्यीकृत CW-स्पेक्ट्रा और L180R1 के लिए इसी पहुंच माप। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 7
स्पंदित EPR दृष्टिकोण (हिरण)। GLIC संरचना Phe314 के स्थान दिखा रहा है और इसी से सटे और गैर आसन्न सब यूनिटों के लिए cβ-cβ दूरी से 7 चित्रा दूरी माप। इस पद के लिए CW-स्पेक्ट्रा सही पर दिखाए जाते हैं। पृष्ठभूमि घटाया DEER- गूंज तीव्रता विकास समय के खिलाफ साजिश रची और डिटर्जेंट में नमूने के लिए मॉडल-मुक्त Tikhonov नियमितीकरण का उपयोग कर फिट है। इसी अंतर-स्पिन दूरी वितरण (दाएं)।पलोड करें / 54127 / 54127fig7large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

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EPR स्पेक्ट्रोस्कोपी एक के पास देशी वातावरण में झिल्ली प्रोटीन में गठनात्मक परिवर्तन बढ़ाता में एक अद्वितीय संरचनात्मक दृष्टिकोण साबित हो गया है। यह दृष्टिकोण हमें लगता है कि एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी और क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी से उच्च संकल्प संरचनाओं में छिप कर रहे हैं प्रोटीन की गतिशीलता के आणविक विवरण में एक तिरछी नज़र अनुमति देता है। हालांकि, यह इस दृष्टिकोण है कि अन्य प्रणालियों के लिए सामान्य प्रयोज्यता प्रभावित कर सकता है और यह भी ध्यान में जिस तरह से साथ संभावित प्रयोगात्मक बाधाओं रखने के लिए के तकनीकी सीमाओं पर विचार करने के लिए महत्वपूर्ण है। हम नीचे समस्या निवारण के लिए सिफारिश की रणनीतियों के साथ-साथ इन पहलुओं में से कुछ पर चर्चा की।

अधिक आम मुद्दों के अलावा एक से जुड़े व्यापक mutational perturbations कम उपज और प्रोटीन की गरीब oligomeric स्थिरता रहे हैं एक तकनीक के साथ मुठभेड़ों है। इस पहलू को आगे जब इस तरह के आयन चैनल के रूप में जटिल multimeric झिल्ली प्रोटीन के साथ काम विकट हो जाती है। यह वें हैमहत्वपूर्ण erefore एक व्यापक म्युटाजेनेसिस पर तैयार कर पहले इन दोनों पहलुओं को जैव रासायनिक अनुकूलन करने के लिए। हम आगे पाया कि विषाक्त GLIC म्यूटेंट की अभिव्यक्ति बेहतर BL21 कोशिकाओं के C41 और C43 उपभेदों में सहन किया है 3,36, 15 को पोस्ट-प्रेरण तापमान को कम -। 18 डिग्री सेल्सियस, 100 माइक्रोन के लिए IPTG एकाग्रता कम हो रही है, और 5% ग्लिसरॉल सहित अधिष्ठापन के दौरान प्रोटीन अभिव्यक्ति की दर को धीमा और misfolding की हद तक कम करने से शायद प्रोटीन एकत्रीकरण कम करने के साथ मदद करने के लिए लगता है। कुछ पदों (विशेष रूप से पारगमन मार्ग में) पर सिस्टीन म्यूटेशन चैनल के विधान गतिविधियों को बढ़ाने के लिए दिखाया गया है और इन म्यूटेंट अभिव्यक्ति में अधिक से अधिक बाधाओं को खड़ा करने के लिए की संभावना है। (10 - 25 मिमी बा 2 +) द्विसंयोजक ताकना ब्लॉकर्स का उपयोग प्रेरण दौरान विषाक्तता दूर करता है और सेल के विकास में सुधार 57 इन रणनीतियों उपज बढ़ाने, प्रोटीन एकत्रीकरण को कम करने और oligo को बढ़ाने के कई मामलों में प्रभावी सिद्ध कर दिया है।Meric स्थिरता। 36,58

SDSL में एक और महत्वपूर्ण कदम लेबलिंग प्रक्रिया की क्षमता है। सतह से अवगत कराया cysteines MTSL जेट (> 90% लेबलिंग पैदावार) में कोई समस्या नहीं पैदा करना चाहिए, वहीं पदों जहां सिस्टीन पक्ष चेन दफन कर दिया और दुर्गम हैं उच्च स्पिन लेबल सांद्रता और अब ऊष्मायन समय की आवश्यकता हो सकती है। 30 गुना दाढ़ अतिरिक्त करने के लिए स्पिन लेबल एकाग्रता बढ़ती है और हे incubating / 4 डिग्री सेल्सियस पर एन लेबलिंग दक्षता में सुधार के साथ मदद करता है। इसके अलावा, यह भी लेबल Cys-कम टेम्पलेट के स्पेक्ट्रा को मापने के लिए पृष्ठभूमि योगदान निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है। साइटों है कि खराब चिह्नित कर रहे हैं (<10%) के लिए, पृष्ठभूमि संकेत समग्र स्पेक्ट्रा पड़ा। स्पिन लेबलिंग दक्षता का निर्धारण करते हैं, ध्यान दें कि सटीकता कारक है कि नमूना मात्रा, नमूना केशिका व्यास, गुंजयमान यंत्र के भीतर केशिका की स्थिति, गुहा तापमान, और गुंजयमान यंत्र क्यू शामिल की एक संख्या से प्रभावित हैमूल्य (जो ऊर्जा ऊर्जा ओवर में संग्रहित का अनुपात है बाहर छितराया हुआ)। जॉब इन शर्तों के नमूने और मानक के बीच समान बनाए रखने के लिए लिया जाना चाहिए। इसके अलावा, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि स्थिर साइटों, जहां स्पेक्ट्रा आंतरिक रूप से व्यापक हैं के लिए, लेबलिंग माप की सटीकता आगे चला जाता है। वैकल्पिक रूप से, तरल क्रोमैटोग्राफी उड़ान electrospray ionization मास स्पेक्ट्रोमेट्री (LCT-ईएसआई एमएस) के समय सीधे आणविक जन और इसलिए लेबलिंग क्षमता निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, एमएस संवेदनशीलता डिटर्जेंट में और कसकर मुड़ा झिल्ली प्रोटीन के लिए नमूने के लिए समझौता किया है।

एक बार जब म्यूटेंट एक समरूप जनसंख्या के रूप में शुद्ध कर रहे हैं, यह तैयारी की कार्यक्षमता का पता लगाने के लिए महत्वपूर्ण है। चैनल के प्रमुख क्षेत्रों में स्पिन लेबल म्यूटेंट के पैच दबाना माप ligand समानता और चैनल gating पर गड़बड़ी के प्रभाव को उजागर करेंगे। वैकल्पिक रूप से, चैनल गुण काले एल में अध्ययन किया जा सकताipid झिल्ली (BLM) 59 या oocytes में proteoliposomes इंजेक्शन और मापने दो इलेक्ट्रोड वोल्टेज दबाना द्वारा धाराओं। 59-61 यह पाया जाता है कि सिस्टीन प्रतिस्थापन और कुछ पदों पर स्पिन लेबल के ligand-संवेदनशीलता या gating कैनेटीक्स बदल द्वारा चैनल, प्रयोगात्मक शर्तों (ligand एकाग्रता, modulators, लिपिड रचना) के तहत जांच गठनात्मक राज्य को स्थिर करने के लिए उचित रूप से अलग किया जा सकता है। इसके अलावा, यह नोट किया है कि EPR माप स्थिर राज्य की शर्तों के तहत किया जाता है और इसलिए चैनल का तेजी से कैनेटीक्स में परिवर्तन कम संरचनात्मक व्याख्या को प्रभावित करने की संभावना है करने के लिए है।

जाहिर है, इस तकनीक का एक प्रमुख लाभ परिभाषित रचना की झिल्ली में चैनल गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए और सीधे जांच के लिए कैसे गतिशीलता पर लिपिड की मध्यस्थता प्रभाव बदल चैनल समारोह की क्षमता है। हालांकि, एक सीमा है कि कुछ लिपिड रचनाओं चैनलों ओ के पार्श्व एकत्रीकरण का कारण हो सकता हैn झिल्ली और इसलिए लिपिड की उपयुक्तता का पता लगाया जा करने के लिए की स्थिति है कि कारण एकत्रीकरण कर लिए, प्रोटीन के लिए लिपिड अनुपात को कम कम तापमान पर पुनर्गठन के बाहर ले जाने, और पुनर्गठन के समय की अवधि को छोटा चैनलों को बनाए रखने में मदद मिल सकती है की जरूरत है। 45, monodisperse 62 वैकल्पिक रूप से, चैनलों nanodiscs, जो nanoscale लिपिड amphipathic झिल्ली पाड़ प्रोटीन (apolipoprotein A1)। 63 के एक वलय से घिरा चैनल प्रोटीन, लिपिड घटक, और झिल्ली मचान प्रोटीन की दाढ़ अनुपात अनुकूलन के द्वारा विधानसभाओं में पुनर्गठित किया जा सकता है यह एक चैनल व्यक्ति nanodiscs में शामिल इकाइयों के एक समरूप और मोनो फैलाने आबादी को प्राप्त करने के लिए संभव है। इस प्रणाली में कई अतिरिक्त लाभ है कि nanodiscs ऑप्टिकली स्पष्ट कर रहे हैं और दोनों intracellular और झिल्ली के बाह्य पक्षों के लिए आसान पहुँच प्रदान किया है।

अंत में, के स्तर परEPR माप की, एक CW-EPR स्पेक्ट्रा के साथ कि व्याख्या करने के लिए सरल नहीं कर रहे हैं, विशेष रूप से multicomponent स्पेक्ट्रा प्रदर्शित पदों के लिए सामना किया जा सकता है। इस तरह के गठनात्मक विविधता धीरे-धीरे एक दिया प्रोटीन रचना में प्रोटीन या / और स्पिन लेबल के कई झुकाव की रचना का आदान प्रदान से उत्पन्न हो सकती है। दो स्थितियों के रिश्तेदार योगदान निर्धारण तुच्छ नहीं है और वैकल्पिक स्पिन लेबल डेरिवेटिव, या बदलने प्रयोगात्मक तापमान, 64 दबाव, 65 क्षेत्र ताकत / माइक्रोवेव आवृत्ति, 66 या osmolyte गड़बड़ी द्वारा के उपयोग की आवश्यकता हो सकती है। 67

इसके अलावा, liposomes में हिरण माप कारक है, कम संवेदनशीलता, उच्च पृष्ठभूमि बढ़ाया intermolecular बातचीत से उत्पन्न योगदान है, और मध्यम दूरी की सीमा (<50A) में कमी शामिल है, के एक नंबर के द्वारा सीमित किया जा सकता है। सामान्य तौर पर, अब दूरी (<50 ए) के लिए, वहाँ महान हैअपर्याप्त dipolar विकास समय की वजह से दूरी वितरण की चौड़ाई में ईआर अनिश्चितता। हालांकि, एक bifunctional स्पिन लेबल के साथ क्यू बैंड (34 गीगा) माइक्रोवेव आवृत्ति और लेबलिंग के उपयोग (कम आंतरिक गतिशीलता के साथ) इन सीमाओं के कुछ कम करने के लिए दिखाया गया है। Nanodiscs में 54 पुनर्गठन भी काफी द्वारा हिरण संवेदनशीलता में सुधार करने के लिए दिखाया गया है पृष्ठभूमि योगदान है कि आणविक dipolar बातचीत से उत्पन्न होती है कम। 15

इन सीमाओं, SDSL / ई पी आर अध्ययन, विशेष रूप से कुछ देशी cysteines के साथ सिस्टम में होने के बावजूद उल्लेखनीय जानकारीपूर्ण साबित किया है। भविष्य तकनीकी प्रगति और अधिक जटिल मानव चैनल, जहां परिवर्तनशील मूल निवासी cysteines संभव नहीं हो सकता अध्ययन करने के लिए इस शक्तिशाली दृष्टिकोण अनुकूल ढालने की ओर तैयार कर रहे हैं। इस संबंध में अप्राकृतिक एमिनो एसिड की साइट विशेष समावेश, 68 या SYNT के आधार पर इस तरह के लोगों के रूप में वैकल्पिक रणनीतियों लेबलिंग के विकासलेबल की hesis कि अन्य अमीनो एसिड की ओर लक्षित कर रहे हैं, 69 महान वादा धारण करने के लिए दिखाई देते हैं।

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Acknowledgments

हम महत्वपूर्ण पढ़ने और पांडुलिपि पर टिप्पणियों के लिए चक्रपाणि प्रयोगशाला के वर्तमान और पूर्व सदस्यों के लिए बहुत आभारी हैं। इस काम के स्वास्थ्य अनुदान के राष्ट्रीय संस्थान (1R01GM108921) और अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन (NCRP वैज्ञानिक विकास अनुदान 12SDG12070069) और अनुसूचित जाति के लिए समर्थन किया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Site-Directed Mutagenesis and Cys mutations
10x PfuUltra HF reaction buffer Agilent Technologies 600380-52
dNTPS New England BioLabs Inc‎ N0447L 10 mM each dNTP
pfu Ultra DNA polymerase Agilent Technologies 600380-51 2.5 U/ul
DPNI New England BioLabs Inc‎ R0176S 20,000 U/ml
XL10 GOLD Agilent Technologies 200314
SOC media New England BioLabs Inc‎ B9020S
Kanamycin Fisher Scientfic BP905
LB media Invitrogen 127957084
Miniprep kit QIAGEN 27106
C43 competent cells Lucigen 60446
Expression and Purification
Glucose Fisher Scientfic D16
Tryptone Fisher Bioreagents BP1421-500
Yeast extract Amresco J850
Glycerol Fisher Bioreagents BP229
K2HPO4 Amresco 0705
K2HPO4 Amresco 0781
IPTG (isopropyl-thio-β-galactoside) Gold Biotechnology I2481C25
Trizma Base Sigma Life Science T1503
NaCl Sigma-Aldrich S7653
DNase I Sigma Life Science DN25
PMSF Amresco M145
Leupeptine Amresco J580
Pepstatin Amresco J583
DDM (n-Docecyl-β-D-Maltopyranoside) Anatrace D310S
Amylose resin New England BioLabs Inc‎ E8021L
TCEP Amresco K831
EDTA Fisher Scientfic BP118
Maltose Acros Organics 329915000
Superdex 200 GL GE Healthcare 17-5175-01
Empty polypropylene Chromatography column BioRad 731-1550
Site-Directed Spin Labeling
MTSL (1-oxyl-2,2,5,5-tetramethyl-3-pyrroline-3-methyl) Methanethiosulfonate Toronto Reaserch chemicals Inc O873900
(1-acetoxy-2,2,5,5-tetramethyl-Δ3-pyrroline-3-methyl) methanethiosulfonate Toronto Reaserch chemicals Inc A167900
DMSO J.T. Baker 9224-01
Reconstitution
Asolectin lipid Avanti polar lipids Inc 541602C
Biobeads (Polystyrine beads) Bio Rad 152-3920
Methanol Fisher chemicals A413
FRET
Fluorescein-maleimide ThermoFisher Scientific F-150
Tetramethylrhodamine-maleimide ThermoFisher Scientific T-6027
POPC Avanti polar lipids Inc 850457C
POPG Avanti polar lipids Inc 840457C
E.coli polar lipid extract Avanti polar lipids Inc 100600C
HEPES Sigma Life Science H3375
EPR measurement
TPX plastic capillaries Bruker ER221
EDDA (Ethylenediamine-N, N'-diacetic acid) Aldrich 158186
Ni(OH)2 Aldrich 283622

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References

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साइट निर्देशित स्पिन लेबल और Pentameric ligand-gated आयन चैनलों के EPR स्पेक्ट्रोस्कोपी अध्ययन
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Basak, S., Chatterjee, S., Chakrapani, S. Site Directed Spin Labeling and EPR Spectroscopic Studies of Pentameric Ligand-Gated Ion Channels. J. Vis. Exp. (113), e54127, doi:10.3791/54127 (2016).More

Basak, S., Chatterjee, S., Chakrapani, S. Site Directed Spin Labeling and EPR Spectroscopic Studies of Pentameric Ligand-Gated Ion Channels. J. Vis. Exp. (113), e54127, doi:10.3791/54127 (2016).

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