Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

Сайт Направленный Спин Этикетировочное и ЭПР спектроскопических исследований пентамерной лигандами ионных каналов

Published: July 4, 2016 doi: 10.3791/54127

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

За последнее десятилетие, структурное понимание пентамерной лиганд-ионных каналов (pLGIC) вырос в дрожжах, благодаря множеству людей структур высокого разрешения нескольких членов семьи. Ключевые факторы , которые привели к текущим достижениям в этой области включают в себя, открытие прокариотических каналов pLGIC, 1-3 крупных достижений в области эукариотической экспрессии мембранного белка, 4-6 и огромные прорывы в подходах определения структуры. 7 Эти структуры обеспечивают четкий консенсус по общее сохранение трехмерной архитектуры pLGIC. Тем не менее, две основные области, которые, кажется, плестись в хвосте являются функциональные характеристики этих препаратов канала и механистический описание функции канала.

Стробирование конформационные изменения являются сложными и происходят в течение более 60 Расстояние по длине канала и эти переходы широко модулируетсямембранные липиды. В частности, отрицательные липиды, холестерин и фосфолипиды , чтобы модулировать функцию pLGIC 8.11. Хотя точная роль этих липидных компонентов в функции канала остается неизвестным, полный молекулярный понимание стробирования потребует изучения этих каналов в их родной среде. Сайт-направленный Спин Этикетировочное (SDSL) и электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) спектроскопии являются методы выбора для изучения динамики белков в реконструированных системах. ЭПР-спектроскопии не ограничивается размером молекул (как ЯМР) или оптическое свойство образца (как флуоресцентная спектроскопия), и, таким образом, позволяет измерять полнометражных конструктов восстанавливали в нативных условиях липидных. Техника чрезвычайно чувствительна и имеет относительно низкие требования выборки (в пределах пико-моль). Обе эти аспекты делают этот метод хорошо подходит для изучения больших мембранных белков, которые трудно выразить в более миллиграммавеличины.

Использование ЭПР - спектроскопии в сочетании с сайт-направленного спина маркировки была разработана Уэйном Hubbell и его коллегами, и был адаптирован для изучения целого ряда типов протеина. 12-24 ЭПР данные были использованы для исследования вторичных структур, изменения в белке конформации, глубины мембранной вставки, и белок-белок / белок-лиганд взаимодействия.

Способ включает в себя цистеин замену в положениях, представляющих интерес сайт-направленного мутагенеза. Для того, чтобы обеспечить сайт-специфическую маркировку, необходимо заменить родной цистеина с другой аминокислотой (например., Серин) , чтобы создать цистеином менее шаблон. До сих пор самым популярным этикетки спин является тиол конкретным мТл: (1-окси-2,2,5,5-тетраметил-Δ3-пирролин-3-метил) methanethiosulfonate который прикрепляется к белку через мост дисульфидных связей. Благодаря своей высокой специфичности, относительно небольшой размер (чуть больше, чем триптофан) и флексичивости линкерной области, этот спин метка было показано, имеют отличную реакционную способность даже при заглубленный цистеина. Кроме того, чтобы максимизировать реактивность, реакция мечение белка осуществляется в стиральном-растворимой форме. После отделения избытка свободного спин-метки с помощью вытеснительной хроматографии, белок восстанавливают в липосомы или двухслойных имитирующих систем определенного состава липидов. В общем, цистеин мутагенеза хорошо переносится в большинстве частей белка, и относительно небольшой размер спин-зонда вызывает минимальное возмущение на вторичных и третичных структур. Для того, чтобы гарантировать, что модификация сохранила функции дикого типа, меченые и реконструированные каналы могут быть изучены с помощью измерений патч-зажим.

Меченый-функциональный белок затем подвергают спектроскопических измерений, которые по существу обеспечивают три основных вида информации: 12,14,15,20,22,23,25-27 динамику спин-зонде lineshАнализ обезьяну; доступность зонда к парамагнитной релаксации агентов; и расстояние распространения. 27 ЭПР расстояния измеряются с помощью двух различных подходов. Первый основан на непрерывной волны (CW) техники, где спектральное уширение , возникающие из дипольных взаимодействий между спин-метками (в 8 - диапазон расстояний 20 Å). Используется для определения расстояния 28,29 Второй представляет собой импульсный ЭПР- метод измерения расстояния , где может быть продлен до 70 Å. 30-34 в Double Electron Electron Resonance (DEER), колебания амплитуды спинового эха анализируются для определения расстояний и распределения расстояний. Здесь спинового эха модулируется на частоте дипольной взаимодействия. В совокупности эти параметры используются для определения топологии белка, вторичные структурные элементы, а также белок-конформационных изменений.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Сайт-направленный мутагенез и Cys Мутации

  1. Клонирование и мутагенеза
    Примечание: СЛС дикого типа (вес) 35 имеет один чужеродные цистеин (С27), который мутирован в серин , чтобы создать цистеином менее фона. Цистеин мутации вводят на цистеином менее фоне с помощью сайт-направленного мутагенеза с использованием праймеров , которые несут цистеин кодон в желаемом положении 36.
    1. Смешайте 5 мкл 10х реакционного буфера, 1 мкл 100 нг / мкл цистеин-менее СЛС ДНК - матрицы 35, 0,5 мкл каждого из 40 мкМ вперед и обратного праймера , 36, 1 мкл дНТФ (100 мМ) и 41 мкл деионизованной воды , Пипетировать образца несколько раз, чтобы смешать его тщательно, спин (6000 оборотов в минуту) и, наконец, добавить 1 мкл ДНК-полимеразы.
    2. Установите термо-циклер к следующему протоколу:
      1. Денатурации при 95 ° С в течение 4 мин.
      2. Денатурация при 95 ° С в течение 30 сек.
      3. отжигатьING при 55 ° С в течение 1 мин.
      4. Относительное удлинение при 68 ° С в течение 10 мин (примерно 1 мин на кб длины плазмиды).
      5. Повторите шаги 1.1.2.2 - 1.1.2.4 в течение 18 циклов.
      6. Окончательное удлинение при 68 ° С в течение 10 мин.
      7. Удержание температуры при 4 ° С
        Примечание: температура отжига рассчитывается на основе праймера Tm.
    3. Добавить 1 мкл ДПНИ к реакционной смеси, тщательно перемешать с помощью пипетки, и спином вниз (6000 оборотов в минуту) в течение 1 мин. Инкубировать в течение 2 ч при 37 ° С.
  2. трансформация
    1. Оттепель Е. палочки компетентные клетки на льду. Аликвоты 30 мкл клеток в 14 мл стерильной трансформации пробирку и добавляют 1 мкл расщепленной ДНК в клетки. Смешать, нажав на стороне трубки. Инкубировать в течение 20 мин на льду.
    2. Поместите пробирку в водяной бане при 42 ºC в течение 45 сек, а затем поместить его обратно на льду в течение 2 мин. Добавить 400 мкл стерильной SOC СМИ и встряхнуть клетки в INCUBator при 37 ° С в течение 1 ч.
    3. Пластина 100 мкл клеток на LB-планшеты, содержащие канамицин (50 мкМ) и 1% глюкозы. Инкубируйте пластин O / N при 37 ° С.
    4. Урожай одну колонию из планшета и прививают в 5 мл / N O культур, содержащих LB / канамицину носитель. Выдержите культуры O / N (~ 16 ч) при 37 ° С в инкубаторе шейкере.
    5. Извлечение ДНК из O / N культуре minipreparation 37. Количественно выход ДНК с помощью спектрофотометра путем измерения оптической плотности при 260 нм. Концентрация должна быть ~ 100 - 200 нг / мкл. Подтвердить наличие мутации при помощи стандартных рекомбинантных стратегий секвенирования ДНК 38,39.

2. СЛС Экспрессия и очистка

  1. трансформация
    1. После операции, описанные в разделе 1.2, преобразование 30 мкл компетентных клеток С43 с 1 мкл (~ 100 - 200 нг / мкл) плазмиды, содержащей ген, кодирующий GLIC вместе с сайтом расщепления протеазы -3C Человеческий риновирус (HRV) (для плазмиды и гена последовательности, относятся к дополнительному тексту) 35 (со стадии 1.2.5).
    2. Пластина 100 мкл клеток на LB-агаром, содержащих 1% глюкозы и 50 мкг / мл канамицина, и инкубируют их O / N (~ 16 ч) при 37 ° С в инкубаторе.
    3. Проверьте визуально для колоний и убедитесь, что они не слишком выращены или показывают наличие спутниковых колоний. Незамедлительно запечатать пластины с парафином и хранить их при температуре 4 ° С.
  2. Настройка O / N-культур и подготовка питательной среды
    1. Выбор одной изолированной колонии с использованием затравочной петли проволоки и переносят в 100 мл стерильной колбе, содержащей 20 мл бульона Луриа (LB), дополненной стерильного 1% глюкозы и 50 мкг / мл канамицина. Выдержите их O / N (~ 16 ч) при 37 ° С в качалке при 250 оборотах в минуту.
    2. Автоклавы 900 мл Потрясающе Бульон (TB) СМИ (См СМИ и буферные композиции) в версии 2.8L Фернбах стеклянные флаконы для бактериальной культуры в паровом цикле при температуре 121 ° С в течение 20 мин.
  3. Настройка больших культур роста
    1. Добавляют 100 мл стерильного калий - фосфатного буфера (см носителя и буферные композиции) для автоклавного СМИ ТБ. Добавить стерильную глюкозу (конечная концентрация 0,2%), канамицин (50 мкг / мл), и 10 мл O / N культуры. Инкубировать при 37 ° С в качалке при 250 оборотах в минуту.
    2. Проверьте оптическую плотность при длине волны 600 нм (OD 600) с использованием денситометра или спектрофотометра каждый час до тех пор , пока не достигнет 0,5 (~ 2 ч). На этом этапе уменьшить скорость до 150 оборотов в минуту и ​​понизить температуру до 18 ° С. Монитор OD 600 каждые 30 мин до тех пор , пока не достигнет 0,8 (~ 1 час).
    3. Добавьте 50 мл глицерина и продолжают встряхивания культуры до OD 600 достигает 1,0 - 1,2 (~ 15 - 30 мин).
      Примечание: В этих условиях, она занимает около часа культуру, чтобы достичь 18 ° С от 37 ° С. Это импortant что глицерин добавляется к культуре после того, как она остынет до 18 ° С.
    4. Индуцируют клетки с 200 мкМ IPTG (изопропил-тио-β-галактозид) и сбросить шейкер обратно до 250 оборотов в минуту и ​​инкубировать еще в течение ~ 16 часов при температуре 18 ° С.
  4. Protein Purification
    1. Убедитесь , что оптическая плотность 600 в конце 16 ч составляет ~ 16 - 18. сбора клеток в 1,0 л центрифужные бутылки центрифугированием при 8500 х г , 4,0 ° С в течение 15 мин. Слейте супернатант и взвесьте бутылку с клеточного осадка. Рассчитывают вес гранул путем вычитания веса пустой бутылки от общего веса.
      Примечание: Ожидаемая масса Клеточный осадок ~ 30 - 35 г / л. Несмотря на то , что следует отметить , что могут быть изменчивость в конечной OD 600 и клеточному осадку массы через мутантов.
    2. Повторное приостановить бактериальных гранул в 150 мл охлажденного льдом буфера А (100 мМ NaCl, 20 мМ Трис, рН 7,4) в 1,0 л культуры. Добавить ДНКазы I (100 мкг / мл) и ProteasИнгибиторы е (фенилметил сульфонил фторид (1 мМ), лейпептин (2,0 мкг / мл), апротинин (2,0 мкг / мл) и пепстатин А (1 мкг / мл)).
    3. Однородный клетки, пропуская их через клетки разрушителя в 4.0 ºC холодном помещении. Повторите этот процесс три раза, так что большинство бактерий лизируют. Центрифуга клеток при 14000 х г в течение 15 мин и пипеткой супернатант, и перенесите в чистую центрифужную пробирку. Выбросите осадок, который содержит не-лизированных клеток и телец включения.
    4. Центрифуга супернатант при 168000 х г в течение 1 часа. Осторожно сливают супернатант, не нарушая осадок мембран.
    5. Из бассейна на мембранный осадок из 1 л культуры и повторно приостанавливать его в буфере А (с добавлением 10% глицерина) до конечного объема 50 мл. Добавить 0,5 г н-Docecyl-бета-D-Maltopyranoside (DDM) к суспензии мембран и качаться в течение 2 ч при 4,0 ° С.
    6. После того, как мембраны солюбилизации удаления клеточного мусора из лизата centrifugвания на 168,000 XG для 1hr. В то же время подготовить амилозы смолу. Передача 3 мл смолы с помощью пипетки в пустой колонке полипропиленовый хроматографии. Промыть смолу путем пропускания 10 объемов слоя воды в 3 раза, а затем 10 объемами сло буфера А, содержащего 0,5 мМ DDM.
    7. После центрифугирования, осторожно возьмите супернатант с помощью пипетки и переносят в чистую 50 мл коническую трубку. Для порционно связывания, добавляют предварительно уравновешенную амилозную смолы в конической трубе. Bind извлеченного белка к амилозы смолы путем нутационное смесь в течение 2 ч при 4,0 ° С.
    8. Пройди всю суспензию через хроматографическую колонку и собирают проточные. Затем пройти весь собранный проточного через смолу во второй раз, чтобы максимизировать связывание.
    9. Pass 10 объемами сло буфера А с использованием 0,5 мМ DDM, 0,5 мМ трис (2-карбоксиэтил) фосфин (ТСЕР) и 1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) для удаления несвязанных белков.
    10. Элюции белок ИЦГЛ 10 мл BufFER А, содержащего 40 мМ мальтозы в дополнение к 0,5 мМ DDM и 0,05 мМ TCEP. ТСЕР предотвращает окисление цистеина боковых цепей. Соберите всю элюата.
    11. Концентрат элюированного белка с использованием центробежной Концентратор (молекулярный вес СВЕТОТЕНЕВОЙ = 50 кДа) до 4 - 6 мг / мл и добавляют ВСР-3С протеазы (200 мкг на 10 мг белка) и инкубировать o / n при 4,0 ° С.
      Примечание: Выяснить завершение протеазы пищеварения, запустив образцы на стр гель SDS (см шаг 2.5.5 и рисунок 1).
  5. Сайт-направленный Спин-маркировка
    1. Сделайте около 100 мкл 200 мМ запаса (1-окси-2,2,5,5-тетраметил-Δ3-пирролин-3-метил) мТл 40 в ДМСО и хранить запас при -20 ° С в 25 мкл аликвоты.
    2. С помощью протеазы-переваренной образец для выделения маркировки с мТл. Добавить 10-кратный молярный избыток мТл спин-этикетки (СЛС мономера: мТл в 1:10 молярном соотношении). Инкубируют на льду в течение 1 часа. Добавьте второй выстрел спиновой метки на 5-кратным молярным избыткомотношение и инкубировать в течение еще одного часа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для заглубленных позиций (с низкой эффективностью спиновой маркировки, описанных ниже), добавляют в 30 раз молярный избыток спиновой метки и белок инкубируют в течение 6 ч.
    3. Пропускают пробу через быстрый Protein гель-фильтрационной колонке жидкостной хроматографии (FPLC), который предварительно уравновешенную буфером А, и 0,5 мМ DDM, чтобы отделить расщепленный MBP и избыток свободного спин-метки из СЛС пентамеры. Соберите 1 мл фракции в общей сложности 30 мл элюирования. Объединяют фракции , содержащие СЛС пентамеры (рисунок 1). Следуйте инструкциям производителя для запуска FPLC.
    4. Определить концентрацию образца с использованием спектрофотометра путем измерения оптической плотности при 280 нм. Молярный коэффициент поглощения и расчетная молекулярная масса СЛС мономера 49850 М -1 см -1 и 36380 Da соответственно. Концентрат раствора белка с использованием центробежного концентратора (молекулярнаяВес Отсечная = 50 кДа) до конечной концентрации ~ 8-10 мг / мл и поместите его на льду. Образец теперь готов для восстановления.
    5. В качестве дополнительной проверки качества, чтобы гарантировать, что препарат является биохимически гомогенной, запустите восстанавливающий (1,0% β-ME) SDS-PAGE гель.
      ПРИМЕЧАНИЕ: commassie окрашивали гель должен показать одну полосу при ~ 33 кДа , соответствующий мономер СЛС (рисунок 1).
    6. Для спин-меченых мутантов , подозреваемых в выставке дипольное уширение, под маркировать образцы в присутствии диамагнитных этикетки 41. Выдержите элюированного-белок с 0,1-кратным мТл и инкубировать на льду в течение 1,0 ч. Затем добавляют 20-кратный молярный избыток диамагнитному метки (1-ацетокси-2,2,5,5-тетраметил-Δ3-пирролин-3-метил) тиосульфонат метан.
      Примечание: Диамагнитное реагент, используемый здесь изо-Стерический с меткой парамагнитного с идентичной химии маркировки.
    7. Инкубируйте образца на льду в течение 2 ч. Пропускают пробу через СИЗе исключение колоночная хроматография, которая предварительно уравновешенную буфером А, и 0,5 мМ РГМ, как и на шаге 2.5.3.
  6. Эффективность спиновой маркировки
    1. Эффективность отжима маркировка определяется как отношение спиновой концентрации метки к концентрации цистеиновой боковой цепью (СЛС-мономер). Для определения эффективности выделения маркировки образца, интегральная интенсивность образца будет по сравнению с эталоном известной концентрации с использованием калибровочный график. Сделать решения ЭПР стандарта (например, 2,2,6,6-тетраметил-1-piperidinyloxyl: подвижно) в диапазоне концентраций (10 - 250 мкМ) при растворении в воде.
    2. Измерьте сигнал ЭПР для каждого из этих решений и определить площадь под кривой (двойное интегрирование сигнала ЭПР) для каждой концентрации (как описано в шагах 6.1). Генерирование калибровочную кривую, откладывая отслеживаемой области в зависимости от концентрации темпу и фитинг с прямой линией.
      Примечание: естьа при производной сигнала ЭПР является лучшее описание спектральной интенсивности, чем от пика до пика амплитуды. Интегрирование первого производной сигнала ЭПР дает спектр поглощения, второй интегрирование тогда даст площадь под спектром поглощения (который пропорционален концентрации спинов). Обеспечить постоянную базовую линию как в низкополевой и высокой полевой области спектра.
    3. Измерить концентрацию спин-меченого белка в моющем средстве, используя спектрофотометр (как на этапе 2.5.4). Теперь измерить сигнал ЭПР образца, а затем определить область двойного интеграла сигнала ЭПР следующих шагов в разделе 6.1. Используя калибровочный график, определить концентрацию метки, которая соответствует измеренному сигнала ЭПР. Расчет эффективности спиновой маркировке мольного соотношения спиновой метки и концентрации белка.

3. СЛС Воссоздание в Asolectin мембранах

  1. Промыть чистую 25 - мл круглодонную колбу с 5 мл хлороформа и высушить колбу в потоке N 2 газа в вытяжном шкафу. Передача 10 мг asolectin (соевый полярная экстракт 25 мг / мл хлороформа в акции) в колбу и высушить липиды при непрерывном потоке N 2 газа.
    Примечание: Выбор липидов для восстановления основан на результатах экспериментов, в разделе 4.
  2. Когда хлороформ испарилась, колбу помещают в вакууме в течение 1 ч, чтобы обеспечить полное высыхание. Добавить 1 мл буфера А восстанавливающей к высушенного липида и вихревые колбу энергично, чтобы получить липидную осадок в суспензию.
  3. Для приготовления небольших однослойных везикул, разрушать ультразвуком липидной суспензии в холодной ванне ультразвуковом пока раствор пузырек не станет более или менее прозрачным и не наблюдаются сгустки (примерно 10 - 15 мин). К этой смеси добавляют DDM до конечной концентрации 4 мМ и инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин.
<LI> Воссоздание
  1. Добавьте очищенный белок из стадии 2.5.4 к липидной смеси.
    Примечание: Соотношение белка к липидной зависит от типа эксперимента. Для макроскопических измерений тока, 1: используется соотношение 10000. Для исследования ЭПР, восстановление делается на более высоком белка в соотношении липида (1: 2500), чтобы максимально увеличить сигнал. Ранее было показано , что при этих концентрациях, не боковой агрегации не наблюдается 42.
    Примечание: Типичный рабочий объем СЛС для ЭПР составляет ~ 1 мг, хотя на основе позиции зондировали, более низкие суммы будут работать.
  2. Инкубируйте образца при температуре 4 ° С в течение 1 ч при осторожном вращении затем разбавить образец до 15 мл буфером А.
    Примечание: Этот шаг приближает концентрацию моющего средства ниже критической концентрации мицеллярной (CMC).
  3. Удаления остаточного моющего средства в суспензии путем добавления гранул полистирола (с гидрофобными порами, которые улавливают моющее средство). Добавить 80 мг чистой бисера и инкубировать liposОме подвеска O / N на nutator при 4 ° С .
    1. Для приготовления бусинки для использования, вес ~ 100 мг и передавать их в 50 мл коническую пробирку. Добавьте 10 мл метанола, энергично встряхивают, спином вниз шарики при 8000 мкг в течение 2 мин и сливают метанола. Повторите этот процесс метанола мыть три раза. Повторите тот же процесс с 30 мл деионизированной воды, трехкратной промывки.
  4. На следующий день, передача липосом в ультрацентрифуге трубки 25 мл с использованием колонки с фильтром для удаления бусинки и дальнейшего разбавления пробы до 25 мл. Центрифуга образцов при 168000 х г в течение 2 часов. Слейте супернатант и повторно приостанавливать осадок в 100 мкл буфера В.

4. Определение оптимального липидного состава для разведения по FRET

  1. С помощью флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET) основе анализа для определения состава мембраны, которая сохраняет белок монодисперсных.
  2. очищают мас
  3. После действия , описанные в разделе 3.2 , для восстановления, подготовить трех различных образцов для каждого липида испытуемой композиции, Во- первых, меченных флуоресцеином СЛС в мольном соотношении 1:. 1500 (пентамера: липид) Во- вторых, родамин-меченого СЛС в мольном соотношении 1: 1500 (пентамера: липид). В-третьих, смешайте моющее средство солюбилизации флуоресцеин и родамин меченый СЛС (1: 1 мольное отношение). Развести эту смесь в соотношении 1: 750 (пентамера: липидный) соотношение.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы использовали три липидные системы: asolectin, POPC: POPG (3: 1 мольное отношение), и E. полярная палочка экстракт. Соотношение белка восстановление липид в эксперименте FRET выше, чем используется для ЭПР измерений (1: 750, по сравнению с 1: 1500 используются для исследований ЭПР).
  4. разбавлятьсуспензию липосом (для уменьшения светового сигнала рассеяния; ~ 5 мкл в 995 мкл буфера А), затем пипеткой пробу в кварцевую кювету и поместите его в флуориметре.
  5. Установите длину волны возбуждения при 490 (что соответствует максимумам поглощения для донора: флуоресцеина). Используя инструкции производителя, записывать спектры излучения от 500 нм до 660 нм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для флуоресцентную метку СЛС образца, вы увидите пик при 518 нм (что соответствует флуоресцеина эмиссии) без пика при 572 нм (что соответствует эмиссии родамина). Для родамина меченных СЛС образца, вы не увидите пик при 518 нм, но вместо того, чтобы при 572 нм, вытекающие из прямого возбуждения родамина при 490 нм. Для получения образца, содержащего оба флуоресцеин и родамин этикетки, уменьшение интенсивности пика флуоресцеина и соответствующее увеличение пика родамина является FRET сигнал, который, вероятно, является показателем боковой агрегации белка на мембране.
  6. следить заАмплитуда излучения родамина при 572 нм через различные интервалы времени (от 0 - 24 ч) записи в каждый час в течение первых 6 часов , а затем после того, как O / N инкубации (Рисунок 2). Для каждого интервала, измерения интенсивности флуоресценции при 572 нм (для родамина: Ia) и при 518 нм (для флуоресцеина: Id). Вычтите вклад прямой активации родамина (образец 2 в шаге 4.3) из Ia (IAC). Определить отношение FRET как Iac / (IAC + Ib). Сравните FRET в различные временные интервалы и в различных липидных композиций.
    Примечание: В качестве контроля выполнения шага 4.5 и 4.6 для моющего средства солюбилизироваться образцов и сравнить спектры излучения для тех из реконструированных липосом. С помощью эквимолярной смеси меченого белка в моющем средстве (описано в пункте 4.3) и разбавляют в буфере А с добавлением 0,5 мМ DDM. Ожидается, что образцы моющими покажет минимальный сигнал разъедать.

5. Функциональные Измерения с помощью патч-зажим Recordings

  1. Подготовить прoteoliposomes для измерения патч-зажим точно так же, как и для ЭПР исследований (раздел 3.1).
    Примечание: Тем не менее, отрегулировать белок: липид соотношение в зависимости от типа измерения делаются (одноканальный против макроскопических записей). Флэш-не замораживать Протеолипосомы в жидком азоте и хранят при -80 ° С до использования. Как правило, воссоздавать СЛС в соотношении 1: 10000 белок: липид (мольное отношение) для макроскопических токов и 1: 50000 молярного соотношения для записей одноканальных.
  2. Оттепель липосом на льду. Ополосните чистой стекло с водой и этанолом и полностью высохнуть. Поместите каплю 10 мкл proteoliposome по центру слайда и сухого O / N в эксикаторе при 4 ° С в вакууме.
  3. Регидрировать высушенные протеолипосомах путем добавления 20 мкл буфера В (150 мМ NaCl, 10 мМ HEPES, рН 7,0) и поместить стекло в petriplate поверх влажной фильтровальной бумагой. Закройте планшет и позволяют регидратации протекать в течение приблизительно 2 часов.
    Примечание: Этот процесс YieLDS гигантские мульти-пластинчатые липосомы, которые способствуют заплатку.
  4. Извлечь патч пипетки из тонкостенных боросиликатного стекла капилляров (~ 1 - мкм диаметр наконечника 2) с использованием рекомендованная производителем настройки на пипетки съемника. Тепло-польский с помощью пожарно-подделать к сопротивлению 1,5 - 2мОм при заполнении буфера B.
  5. Заполните записи камеры с буфером B с помощью пипетки и прикрепите заземляющий электрод Ag / AgCl. С помощью 2 мкл пипетки, осторожно выбивать липосом от края и передачи 1 мкл суспензии на записи камеры. Подождите несколько минут, чтобы липосом оседают на дно.
  6. Заполните патч-пипетки с буфером B с использованием неметаллического иглы шприца и смонтировать его на усилитель головной стадии. Определить единый изолированный пузырек залатать. Нанесите небольшое положительное давление, чтобы предотвратить патч-пипетку от засорения, а затем вставьте наконечник в записи камеры.
  7. Применение тестовых импульсов для измерения пипеток resistaсть и компенсировать напряжения смещения пипетки. Подойдите к пузырек, и при контакте, нанесите небольшое отрицательное давление, чтобы мягко тянуть пузырек против патч пипетку, чтобы сформировать gigaohm уплотнение.
  8. Монитор сопротивление пипеткой в ​​течение всего процесса. После того, как gigaohm уплотнение образуется, снять пипеткой тщательно от липосом, чтобы сформировать наизнанку патч. Выключите тестовый импульс.
  9. Установить удерживающий потенциал до -100 мВ, а также применять импульс рН. Низкий уровень рН получали с использованием 10 мМ цитрат натрия буфером С (150 мМ NaCl, 10 мМ цитрата, рН 3,0). (Рисунок 3)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Записи выполняются с частотой дискретизации 10 кГц для макроскопических и 40 кГц для одиночных измерений канала.

6. Измерения ЭПР

  1. Непрерывный ЭПР - спектроскопии
    1. Перенесите суспензию липосом с шага 3.2 в 200 мкл пробирку и осадить образцов с помощью центрифуги. Откажитесь от supernataнт и образец готов для ЭПР измерений.
      Примечание: Для измерений ЭПР, важно, чтобы удалить как можно больше буфера из образца липосом, как это возможно. Так как водные образцы поглощают электрическую часть микроволновой печи, что приводит к нагрева и потери чувствительности.
    2. Для того, чтобы осуществить замену буфера, передать 20 мкл липосом гранул с помощью пипетки в пробирке. Добавьте 180 мкл буфера D (100 мМ NaCl, 10 мМ цитрата, рН 3,0) и инкубируют при 42 ºC водяной бане в течение 5 мин. Центрифуга образец, удалить супернатант с помощью пипетки и повторить процесс трижды, чтобы гарантировать полный обмен буфера.
      Примечание: В качестве альтернативы, обмен буфер может быть сделано путем воздействия на образцы для многократных циклов замораживания / оттаивания.
    3. Газопроницаемый пластиковые капилляры подходят для измерений как спектральных линий-форм и доступности растворителя. Нажмите на капилляр осажденной proteoliposome нарисовать образец внутри и запечатать конец с костным воском.
      НЕE: Типичные объемы образцов составляют ~ 5 мкл и желательной концентрации спина составляет 150 мкМ. Если цель состоит в том, чтобы измерить формы линий в одиночку, можно использовать 0,4 мм OD кварцевые капиллярные трубки. При необходимости пипетка может быть использован для наполнения пробы внутри капилляра.
    4. Эксплуатировать спектрометр
      1. Провести измерения CW-ЭПР при комнатной температуре (292 - 297 К) на Х-диапазона спектрометра, оснащенного диэлектрического резонатора в соответствии с инструкцией по эксплуатации завода-изготовителя.
      2. Включите охладитель воды, источника питания и консоли СВЧ-моста. Дайте системе термически уравновешиваться в течение примерно 30 мин перед записью. Открытое программное обеспечение сбора данных.
      3. Вставьте пробирку / капилляр в резонатор, чтобы убедиться, что часть трубки, заполненной образца находится в центре резонатора. Настройтесь резонатор в соответствии с инструкцией по инструкции спектрометра.
      4. Запись первой производной спектра поглощения по полю развертки припроисшествие СВЧ-мощность 1,0 мВт, частота модуляции 100 кГц и шириной развертки 100 G. Определение оптимальной мощности для эксперимента путем проведения прогрессивную эксперимента мощность насыщения, где высота пика до пика первой производной CW ЭПР сигнала измеряется как функция квадратного корня из падающей СВЧ-мощности.
        Примечание: При более низких мощностях СВЧ, интенсивность сигнала возрастает пропорционально квадратному корню из власти до тех пор, равновесная населенность спиновых состояний не влияет. Тем не менее, если питание дополнительно увеличивается, спин-решеточной релаксации больше не может поддерживать разницу равновесие населения двух спиновых состояний и амплитуда сигнала начинает плато или «насытить». За этой точкой, амплитуда сигнала может фактически уменьшаться с увеличением мощности наблюдать за счет инверсии населенности спиновых насыщает. Кроме того, для уширенных спектров с обширными крыльями, где четко определенная плоская исходная информация не является VIможные, расширить ширину развертки до 150 - 200 G, чтобы предотвратить потерю площади.
      5. Начните с использованием амплитудной модуляции 1,0 G.
        Примечание: Это значение выборки зависит и регулируется для уменьшения низкочастотного шума в сигнале. Если используется слишком большое значение, оно может привести к искажению или расширить сигнал.
      6. Установите постоянную времени и преобразования времени 20,48 мс, время развертки до 20.97 сек и разрешением до 1024 точек.
        Примечание: Постоянная времени также основан на образце и корректируется, чтобы отфильтровать высокочастотный шум.
      7. После первого сканирования установите поле центром в центре сигнала ЭПР и выбрать ширину развертки таким образом, что след включает сигнал и достаточную базовую линию по обе стороны.
        Примечание: Кроме того, чтобы улучшить отношение сигнал / шум, увеличить количество сканирований, основанных на силе сигнала ЭПР. Включите ширину развертки и число точек
      8. Мера доступности спиновой метки к Столкновительная отдыхаете агентов O 2 27 описано в шаге 6.1.4.4.
        Примечание: Подготовка NiEDDA , как описано выше 26.
      9. Сначала заливать образец в полости с N 2 в течение 5 мин (для промывки O 2). Измерение спектров для каждого СВЧ-мощности от 5 - 35 дБ с шагом 3 дБ при ширине развертки 30 G.
      10. Затем заливать образец в полости воздуха в течение 10 мин и измерения спектров при различных мощностях СВЧ (5 - 35 дБ с шагом 3 дБ), как на этапе 6.1.4.9.
      11. Инкубируют 20 мкл липосом осадку 180 мкл 50 мМ NiEDDA (в буфере B или буфер D) в 42 ºC водяной бане в течение 5 мин. Центрифуга образца и удалить супернатант с помощью пипетки. Загрузите образец в капилляр и поместить его в резонаторе. Повторите шаг 6.1.4.9.
        Примечание: Принцип эксперимента является то, что взаимодействие с парамагнитного релаксинаг агентов через Гейзенберга спинового обмена бы предотвратить насыщение сигнала и инверсной населенности. Водорастворимый NiEDDA и жирорастворимых молекулярного O 2 используются в качестве репортеров для воды (как навалом и intraprotein прихожих) и мембраны подвергаются позиции на белка, соответственно.
  2. Анализ данных:
    Примечание: Анализ данных ЭПР включает в себя следующие этапы: 14,22,23,25-27
    1. Вычислить подвижность спинового зонда (H O -1), как обратная величина ширины центральной линии первой производной спектра поглощения. & Dgr ; H O -1 является отражением двигательной свободы или динамики зонда.
    2. Вычислить параметр доступности (П), который является оценкой доступности зонда к другим парамагнитных столкновительными расслабляющих агентов, используя шаги, описанные ниже.
      Примечание: Взаимодействие спин-зонда с парамагнитными отдыхаете агентовувеличивает скорость спин-решеточной релаксации (T 1) нитроксила Гейзенберга спинового обмена. 27
      1. Расчетный параметр доступности (П) из экспериментов насыщения мощности (6.1.4.8) , в котором вертикальная амплитуда от пика до пика центральной линии первой производной спектра ЭПР измеряется при различной мощности СВЧ. 25 Plot амплитуду сигнала как функции квадратного корня из СВЧ - мощности и подходят со следующим уравнением 27.
        Уравнение 1
        Примечание: в случае когда амплитуда сигнала, является мерой однородности насыщения резонансной линии (обычно от 0,5 до 1,5), I является коэффициент масштабирования, Р мощность падающего, и представляет собой значение, при котором первая производная амплитуда равна половине ее ненасыщенного значения.
  3. Вычислить ΔP 1/2 значения в присутствии (O 2 или NiEDDA) и отсутствии (перфузию N 2) парамагнитных отдыха агентов. Вычислить параметр доступности (П) с помощью уравнения:
    Уравнение 2
    Примечание: Где P 1/2 справка и & Dgr ; H O ссылка являются половину максимального значения насыщения мощность и ширина центральной линии, соответственно, для эталонного стандарта (например, ДФПГ (2,2-дифенил-1-пикрилгидразила)) 27.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Биохимический характеристика спин-меченых СЛС Мутанты

После описанного выше протокола, как правило, дают СЛС-МОБ слитого белка в диапазоне от 10 - 12 мг / л культуры. Хотя это значение может изменяться в различных мутантов, в частности, для позиций, захороненных в белке, выход может быть значительно нарушена. В этих случаях объемы культуры может потребовать расширения. Расщепление слитой конструкции по HRV3C протеазы осуществляют O / N для удобства. Выполнив образцов на стр геле, мы обнаружили, что это расщепление завершается в течение 30 - 60 мин. (Рисунок 1А). Очищенная СЛС на эксклюзионной гель-фильтрационной колонки элюируется преимущественно в виде пентамера с объемом удерживания 11,3 мл. Фракция МВР элюируется 15 мл и агрегаты элюирования в пустом объеме колонки (~ 7,0 мл). Спин-метка приходит вконец элюции (~ 24 мл) (Фигура 1В)

FRET Based Пробирной для мониторинга агрегацию СЛС восстанавливали в различных мембранными липидами

FRET-анализ используется для оценки агрегации СЛС пентамеров в реконструированных пузырьках (сходились на расстоянии <50 Å на мембране). На рисунке 2 представлены данные СЛС вес (с C27, обозначалась либо с помощью флуоресцеина или тетраметилродамин) и восстановленного в Е .coli полярные липиды, POPC: POPG (3: 1), Папа Римский: POPG (3: 1) или asolectin. Измерения флуоресценции показывают , что СЛС восстанавливали в asolectin не показал FRET и даже замораживать / оттаивание образца (условия, способствующие наращиванию агрегации) получают минимальные изменения уровней FRET 43. По этой причине, asolectin является липидная смесь выбора для функциональных и спектроскопических измерений, используемых в этих STUумирает.

Макроскопическое поведение СЛС в Протеолипосомы

Функциональные свойства очищенного ИЦГЛ характеризуются измерением пэтч-кламп в реконструированных протеолипосомах. Представитель макроскопический ток записи от СЛС вес от наизнанку патч в ответ на рН-скачка показан на рисунке 3 при -100 мВ держит потенциал, переключение рН 3,0 буфера производит быстро активизируя внутренние токи. (10 - 100 мс) , что распада до приблизительно 10% от пиковой амплитуды в течение нескольких секунд 43 (1 - 3 сек, рисунок 3). Токи оправиться от этого макроскопического распада или десенсибилизации путем переключения в нейтральное рН. В то время как каналы в патче наизнанку были чувствительны к изменениям в ванне рН, не было никакого эффекта изменения рН в растворе пипетки (данные не показаны), что СЛС предполагая был преимущественно ориентированы в одном тяжеломфикция таким образом, что в патче внеклеточный домен перед обменник ванны / раствор.

Структурных перестроек в процессе активации канала

При комнатной температуре, спин-зонд может принять несколько ротамерных конформации, а спектральная форма линии чувствительна не только к движению спин-меток боковых цепей по отношению к пептидной цепи, но и системообразующим колебаний и глобальных белковых движений. Таким образом, изменения в ЭПР формы линий может оказаться отличным диагностическим инструментом для мониторинга белковых конформационных изменений. Рисунок 4 показывает спектры в положении L241 (17) R1 во внеклеточной гидрофобной области поровой-подкладка M2 области (позиция выделены в виде черных кругов на рисунке 4, врезка) при рН 7,0 и рН 3,0. Спектры показывают различия в рамках этих двух условий, как в амплитуде сигнала и степеньдвигательная уширение. Как и в случае функциональных измерений 42, конформационные изменения , о которых сообщают сигналов ЭПР также полностью обратимы. Спектральный уширение влияют как двигательными ограничениями зонда и дипольной связью. Для того, чтобы определить вклад двух, L241 (17) совместно метили диамагнитном спин-метки. Спектры под меченных и полностью меченные сравниваются при рН 7,0 и рН 3,0 (фиг.4В). Степень диполярного уширения в этом положении уменьшается, когда каналы под маркировку, которая указывает на взаимодействие между спин-меток между различными подразделениями.

На рисунке 5 показаны спектры для двух положений по винтовой линии M4 , который расположен на периферии канала. & Dgr ; H O -1 измеряется как обратная величина центральной ширины линии ( как показано на врезке). Как нитроксила вращательное движение уменьшается, о чем свидетельствует в процессе формированиятретичных или четвертичных контактов, ширина линии увеличивается (и , следовательно , & delta ; H O -1 убывает) для какой - либо конкретной геометрии двигательной. Напротив, структурные движения , приводящие к увеличению свободы зонда движения отражается как увеличение & Dgr ; H O -1. F312R1 является более мобильным в то время как R296R1 неподвижен, в соответствии с их открытыми и очень стесненных условиях, соответственно.

На основе параметров, доступности, спин-метка в определенном положении на белке могут быть классифицированы как одно из следующих значений: погребенного в ядре белка в недоступных для воды или липидов, на поверхности, обработанной водным раствором, или на поверхность подвергается воздействию липидов (5 и 6). Параметры доступности, полученные для серии последовательных участков могут быть использованы для определения вторичной структуры области, зондировать области белок-белокконтакт, измеряют наклон белка в мембране, оценить глубину погружения соприкасающихся петель, а также определение воды вестибюлей и липидных переплете карманы в трансмембранных спиралей. 26 В качестве примера, кривые насыщения мощности на рисунке 6 , показывают , что F312R1 имеет относительно выше Р 1/2 для O 2, по сравнению с R296R1, предлагая боковые цепи в положениях F312 липоидными подвергшихся воздействию. Кроме того, F312R1 также является более доступным для NiEDDA по сравнению с R296R1 в соответствии с его расположением на границе раздела липид-вода. С другой стороны, L180R1 в области петли C внеклеточного домена является мобильным и доступным для NiEDDA, ​​в соответствии с его местоположением в водяную подвергается петле.

Динамика пробником и доступность данных в заданном положении обеспечивают структурную локальную информацию об этой конкретной позиции в пределах общего белка раза. Эти параметры, определенные для алInear последовательность остатков вдоль белка может быть дополнительно проанализированы с использованием аналитических подходов, основанных на преобразовании Фурье методов. Эти анализы могут быть использованы для оценки периодических изменений в ЭПР параметров окружающей среды и для руководства при прогнозировании и ориентируя вторичных структур. Для конкретного сегмента белка, дискретное преобразование Фурье спектра мощности P (со) вычисляется как функция от угла между соседними позициями (со) в этом сегменте. Этот график используется для определения основной угловой частоты составляющей спектра и по сравнению с ожидаемыми (со) значений альфа-спирали (80 - 120 º) или бета-цепей (150 - 180 º).
Уравнение 3
где Р ( 'ω') является преобразованием Фурье спектра мощности в зависимости от угловой частоты со, N есть число остатков в сегменте, является параметр среды в положении. Р ('ω') получает оценку для значения со = Уравнение 6 которая максимизирует P ( 'со').

Кроме того, параметр индекса периодичности (дает значение предсказанной вторичной структуре) рассчитывается как отношение площади под спектром мощности для угла, который представляет заданный структурный элемент в том, что из общей площади спектра. Раздвижная метод окна затем используется для идентификации начала и конца данного вторичного структурного элемента. Относительную ориентацию этого сегмента по отношению к остальной части белка может быть оценена по направлению Р ( 'со') момент.

Для альфа-спирали:

Уравнение 4

Уравнение 5

Эти методы были успешно применены к нескольким системам для определения трехмерных топологий и предсказать конформационные изменения , лежащие в основе функции белка 14,23,24,41,44-53.

Определение дальности передачи от ЭПР

Inter-субъединиц расстояния нитрооксидные можно определить из электрон-электронных дипольных взаимодействий. В CW-ЭПР, как показано на рисунке 4, через космос дипольных взаимодействий приводят к уширению спектра и являются функцией близости между метками. Для расстояний до ~ 15 - 20 А, степень расширения (по сравнению между полностью меченой спектров и спектров при меченных) могут быть использованы для полуколичественно оценить расстояния с использованиемМетоды деконволюции Фурье. 28,29

Inter-субъединиц расстояния (<50 A) может быть измерена с помощью методов двойного электронно-электронного резонанса (DEER). 30-34 DEER данные собираются в образцах моющего средства или восстановленный в nanodiscs из - за ограничений , связанных с этими измерениями в липосом 54. Для получения спин-меченых проб в производстве моющих средств (~ 100 мкм) в буфере А с использованием 0,5 мМ DDM, 30% (вес / объем) глицерин используется для криозащиты. Данные эволюции диполярный время получены при 83 К , используя стандартный протокол Олень четырех импульсов (π / 2) MW1-τ1- (π) MW1-τ1- (π) MW2-τ2- (π) MW1-τ2-эхо 55 на импульсном спектрометре ЭПР работающий на частоте Q-диапазона (33,9 ГГц). Длина импульса для (n 2 /) MW1 и (π) MW1 равны 10 и 20 нс, соответственно, и 40 нсек для (я) MW2. DEER сигналы затем корректируются фон предполагая однородный backgro 3Dунд и анализировали с помощью регуляризации Тихонова 31,56 определить средние расстояния и распределения в расстоянии.

Внутримолекулярные расстояния для репрезентативного позиции в M4 (F314R1) , определяемом Олень экспериментов при рН 7,0, показаны на рисунке 7 Так как существует пять спин-метки в пределах СЛС пентамера, по крайней мере , два расстояния , как ожидается. один, соответствующий соседних субъединиц, а другой из несмежных субъединиц, хотя дополнительные пики могут возникать из альтернативных ротамерных ориентации спинов. Сигнал ОЛЕНЕЙ затухает и соответствующие распределения вероятностей показаны. Первый пик на короткие расстояния (~ 42А) представляет собой расстояние между соседними субъединицами, а второй пик (~ 53A) соответствует несмежных расстояния. Пик для диагонального расстояния, как представляется, на более близком расстоянии, и это, вероятно, следует недооценивать, поскольку надежных измерений за пределами 60 Åне представляется возможным в условиях эксперимента из-за технических трудностей, связанных с коррекцией фона.

Рисунок 1
Рисунок 1. Биохимический характеристика Спин-меченый СЛС мутантами. (А) представитель хроматограмма гель - фильтрации спин-меченого-ИЦГЛ после протеолитического расщепления MBP тега. Пики соответствуют СЛС пентамера и свободный MBP. (B) SDS-PAGE , показывающий режиссерский мономерный СЛС-MBP слитый белок (перед гель - фильтрацией) и MBP и СЛС фракции объединяли от гель - фильтрации. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2. FR ET на основе анализа мониторинга агрегацию государство СЛС восстанавливали в различных мембранными липидами. FRET измерения приведены для образцов после того, как O / N восстановления (слева) и после замораживания / оттаивания образцов (справа). (Modified от исходной фигуры). 43 Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3. макроскопическое поведение СЛС в Протеолипосомы. В наизнанку патч вырезают из восстановленного asolectin везикул, СЛС активируется рН прыжками с использованием быстрого обменник раствора. Каналы видно, чтобы активировать в ~ 10 мс и десилицировать с постоянной времени, равной 1 - 3 сек. (Modified из исходной фигуры). 43ig3large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4
Рисунок 4. Структурные перестройки канала Во время активации. (A) Представитель CW-ЭПР - спектры для положения в поры крепи спирали M2, где отображаются изменения амплитуды и формы линий в ответ на изменения рН. В каждом случае, спектры нормализуют по отношению к общему числу спинов. Спин-меченых положение показано, как черный круг. Только две субъединицы показаны для ясности. (B) EPRspectra показать дипольное уширение спин-спиновых взаимодействий. Спектры в пунктирной линией были из-под-меченных каналов (в присутствии диамагнитных меток) и в твердой линии были из полностью меченных каналов. На вставке показана наложение амплитудно-нормированных спектров. Расширяя при полностью меченых условиях высокойосвещенные стрелками. Ширина сканирования составляет 150 G. (Modified от исходной фигуры). 36 Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5
Рисунок 5. Остаточные Конкретные параметры окружающей среды измеряется мощность насыщения. Измерение ширины спектра (H 0) и доступность растворителя (P 1/2) для двух противоположных позиций в спирали M4 трансмембранного домена. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 6
Рисунок 6. Окружающей среды Представителем Loop C остатков пищи в внеклеточного домена СЛС. Спин-нормализуется CW-спектры и соответствующие измерения доступности для L180R1. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 7
Рисунок 7. Измерения расстояний по импульсно-ЭПР подходы (Олень). СЛС структура с указанием местоположения Phe314 и соответствующих cβ-cβ расстояния для смежных и несмежных субъединиц. CW-спектры для этой позиции показаны на рисунке справа. Фон вычитается DEER- эхо интенсивности в зависимости от времени эволюции и установить с помощью безмодельного Тихонова регуляризацию для образцов в моющем средстве. Соответствующее распределение расстояния между спином (справа).pload / 54127 / 54127fig7large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ЭПР-спектроскопии оказалось беспрецедентным структурный подход при количественной оценке конформационные изменения мембранных белков в почти родной среде. Такой подход позволяет нам заглянуть в молекулярные детали динамики белков, которые затемнены в структурах с высокой разрешающей способностью от рентгеновской кристаллографии и крио-электронной микроскопии. Тем не менее, важно учитывать технические ограничения такого подхода, которые могут повлиять на общую применимость к другим системам, а также иметь в виду потенциальные экспериментальные препятствия на этом пути. Мы обсудим некоторые из этих аспектов ниже наряду с рекомендуемыми стратегиями для устранения неполадок.

Среди наиболее распространенных проблем, которые встречаются с техникой, включавшие широкие мутационные возмущения низкий выход и плохой олигомерные стабильность белка. Этот аспект еще более усугубляется при работе со сложными многомерным мембранных белков, таких как ионные каналы. Этerefore решающее значение для оптимизации этих двух биохимических аспектов, прежде чем приступать к широко распространенным мутагенеза. Мы обнаружили , что экспрессия токсичных мутантов СЛС лучше переносится в C41 и C43 штаммов клеток BL21 3,36 Кроме того, понижение температуры после индукции до 15 -. 18 ° С , чтобы уменьшить концентрацию IPTG до 100 мкМ, и в том числе 5% глицерина во время индукции, кажется, помогает при снижении агрегации белков, предположительно за счет замедления скорости экспрессии белка и снижение степени неправильного сворачивания. Цистеина мутации в определенных позициях (в частности, в пути проникания) было показано увеличение конститутивной активности канала, и эти мутанты, скорее всего, создают большие препятствия в выражении. Использование двухвалентный пор блокаторы (10 - 25 мМ Ba 2+) во время индукции снижает токсичность и улучшает клеточный рост 57 Эти стратегии доказали свою эффективность во многих случаях на повышение урожайности, снижение агрегации белков и повышение олиго.Meric стабильность. 36,58

Другим важным шагом в SDSL является эффективность процесса маркировки. В то время как поверхность подвергается цистеина не должно вызывать никаких проблем в мТл реактивности (> 90% урожайности маркировки), позиции, где цистеина боковые цепи захоронены и недоступных могут потребоваться более высокие концентрации спин-меток и более длительное время инкубации. Увеличение концентрации спин-метка до 30-кратного молярного избытка и инкубирование O / N при температуре 4 ° С помогает при повышении эффективности маркировки. Кроме того, важно также, чтобы измерить спектры меченых Cys-менее шаблон для определения фонового вклада. Для сайтов, которые плохо помечены (<10%), фоновый сигнал переполняет общего спектра. При определении эффективности спин-маркировки, обратите внимание, что точность зависит от целого ряда факторов, которые включают в объем образца, образец-капиллярный диаметр, позиционирование капилляра внутри резонатора, температура полости, и добротности резонаторазначение (которое представляет собой отношение энергии, запасенной в нем по энергии, рассеиваемой из). Необходимо соблюдать осторожность, чтобы поддерживать эти условия идентичные между образцами и стандартом. Кроме того, следует отметить, что за лежачими участков, где спектры неразрывным широк, точность измерения маркировки падает дальше. В качестве альтернативы, жидкостная хроматография и времяпролетная-ионизацией электрораспылением масс-спектрометрии (LCT-ESI-MS) может быть использован непосредственно для определения молекулярной массы и, следовательно, этикетирование эффективность. Однако чувствительность МС скомпрометирована для образцов в составе моющих средств и для плотно сложенных мембранных белков.

После того, как мутанты очищают в виде гомогенной популяции, важно установить, функциональность препарата. Измерения Patch-Clamp спин-меченых мутантов в ключевых регионах канала позволит выявить влияние возмущения на лиганда сродства и стробирования канала. В качестве альтернативы, свойства канала могут быть изучены в Black LIPID Мембраны (BLM) 59 или путем введения Протеолипосомы в ооциты и измерения токов от зажима напряжения два электрода. 59-61 Если обнаруживается , что замещение цистеина и спин-метка в некоторых положениях изменяют кинетику лиганд-чувствительности или стробирование каналы, условия проведения эксперимента (лиганд концентрации, модуляторы, липиды композиции) можно варьировать соответствующим образом стабилизировать конформационное состояние под следствием. Кроме того, следует отметить, что измерения ЭПР производятся в стационарных условиях и, следовательно, изменения в быстрой кинетикой канала, менее вероятно, чтобы повлиять на структурной интерпретации.

Очевидно, что основным преимуществом этого метода является возможность изучения динамики каналов в мембранах определенного состава и непосредственно исследовать как опосредованного липидами воздействие на динамику изменяет функцию канала. Тем не менее, ограничение состоит в том, что некоторые липидные композиции могут привести к боковой агрегации каналов Oп мембраны и , следовательно , пригодность липидов должно быть установлено. 45 Для условий , которые делают агрегацию причины, снижение белка-к-липидного соотношения, осуществляющая воссоздание при более низкой температуре, и сокращения продолжительности времени восстанавливающей может помочь в поддержании каналов монодисперсных 62 в качестве альтернативы, каналы могут быть восстановлены в nanodiscs, которые являются наноразмерные липидные агрегаты , окруженные кольцевое пространство амфипатических мембранного белка подмостей (аполипопротеина A1). 63 за счет оптимизации молярное отношение канального белка, липидов , составляющих, и мембранным подмостей белка, можно достичь гомогенной и монодисперсным популяция одиночных блоков каналов, включенных в отдельные nanodiscs. Эта система имеет ряд дополнительных преимуществ в том, что nanodiscs являются оптически прозрачными и обеспечивают легкий доступ к внутриклеточным и внеклеточным сторонах мембраны.

И, наконец, на уровнеЭПР измерений, можно столкнуться с спектров CW-ЭПР, которые не просто интерпретировать, особенно для позиций, отображающих многокомпонентный спектров. Такое конформационное гетерогенность может возникать из медленно обмена конформации белка и / или нескольких ориентаций спина метки в той или иной конформации белка. Определение относительного вклада двух сценариев не является тривиальным и может потребовать использования альтернативных производных спин-меток или изменение экспериментальной температуры, давления 64, 65 значения напряженности поля / СВЧ, 66 или по осмолита возмущения. 67

Кроме того, измерения Олени в липосом может быть ограничена целым рядом факторов, в том числе более низкую чувствительность, более высокий вклад фона в результате усиленными межмолекулярных взаимодействий, а также уменьшение диапазона измерения расстояния (<50A). В общем, для больших расстояний (<50 Å), существует большаянеопределенность в эр ширины распределения расстояния из-за недостатка времени дипольных эволюции. Тем не менее, использование Q диапазона (34 ГГц) сверхвысокой частоты и маркировки с бифункциональным спиновой метки (с уменьшенными внутренними динамики) , как было показано , чтобы облегчить некоторые из этих ограничений. 54 воссоздании в nanodiscs также было показано , что чрезвычайно улучшить чувствительность Олень путем уменьшения фонового вклада , который возникает от межмолекулярных взаимодействий дипольных. 15

Несмотря на эти ограничения, SDSL / ЭПР исследований, в частности, в системах с несколькими носителями цистеинов, оказались чрезвычайно информативными. Будущие технологические достижения ориентированы на адаптацию этот мощный подход к изучению более сложных человеческих каналов, где мутирует родной цистеина может оказаться невозможным. В связи с этим, разработка альтернативных стратегий маркировки , такие как основанные на регистрации конкретных участков неестественных аминокислот, 68 или Synthesis этикеток, которые ориентированы на другие аминокислоты, 69 , по всей видимости весьма перспективны.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Мы очень благодарны нынешних и бывших членов лаборатории Чакрапани для критического чтения и замечания по рукописи. Эта работа была поддержана Национальным институтом здравоохранения (грант 1R01GM108921) и Американской ассоциации сердца (НКРЗ ученый развития Грант 12SDG12070069) и СК.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Site-Directed Mutagenesis and Cys mutations
10x PfuUltra HF reaction buffer Agilent Technologies 600380-52
dNTPS New England BioLabs Inc‎ N0447L 10 mM each dNTP
pfu Ultra DNA polymerase Agilent Technologies 600380-51 2.5 U/ul
DPNI New England BioLabs Inc‎ R0176S 20,000 U/ml
XL10 GOLD Agilent Technologies 200314
SOC media New England BioLabs Inc‎ B9020S
Kanamycin Fisher Scientfic BP905
LB media Invitrogen 127957084
Miniprep kit QIAGEN 27106
C43 competent cells Lucigen 60446
Expression and Purification
Glucose Fisher Scientfic D16
Tryptone Fisher Bioreagents BP1421-500
Yeast extract Amresco J850
Glycerol Fisher Bioreagents BP229
K2HPO4 Amresco 0705
K2HPO4 Amresco 0781
IPTG (isopropyl-thio-β-galactoside) Gold Biotechnology I2481C25
Trizma Base Sigma Life Science T1503
NaCl Sigma-Aldrich S7653
DNase I Sigma Life Science DN25
PMSF Amresco M145
Leupeptine Amresco J580
Pepstatin Amresco J583
DDM (n-Docecyl-β-D-Maltopyranoside) Anatrace D310S
Amylose resin New England BioLabs Inc‎ E8021L
TCEP Amresco K831
EDTA Fisher Scientfic BP118
Maltose Acros Organics 329915000
Superdex 200 GL GE Healthcare 17-5175-01
Empty polypropylene Chromatography column BioRad 731-1550
Site-Directed Spin Labeling
MTSL (1-oxyl-2,2,5,5-tetramethyl-3-pyrroline-3-methyl) Methanethiosulfonate Toronto Reaserch chemicals Inc O873900
(1-acetoxy-2,2,5,5-tetramethyl-Δ3-pyrroline-3-methyl) methanethiosulfonate Toronto Reaserch chemicals Inc A167900
DMSO J.T. Baker 9224-01
Reconstitution
Asolectin lipid Avanti polar lipids Inc 541602C
Biobeads (Polystyrine beads) Bio Rad 152-3920
Methanol Fisher chemicals A413
FRET
Fluorescein-maleimide ThermoFisher Scientific F-150
Tetramethylrhodamine-maleimide ThermoFisher Scientific T-6027
POPC Avanti polar lipids Inc 850457C
POPG Avanti polar lipids Inc 840457C
E.coli polar lipid extract Avanti polar lipids Inc 100600C
HEPES Sigma Life Science H3375
EPR measurement
TPX plastic capillaries Bruker ER221
EDDA (Ethylenediamine-N, N'-diacetic acid) Aldrich 158186
Ni(OH)2 Aldrich 283622

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tasneem, A., Iyer, L. M., Jakobsson, E., Aravind, L. Identification of the prokaryotic ligand-gated ion channels and their implications for the mechanisms and origins of animal Cys-loop ion channels. Genome Biol. 6, 4 (2005).
  2. Hilf, R. J., Dutzler, R. X-ray structure of a prokaryotic pentameric ligand-gated ion channel. Nature. 452, (7185), 375-379 (2008).
  3. Bocquet, N., et al. X-ray structure of a pentameric ligand-gated ion channel in an apparently open conformation. Nature. 457, (7225), 111-114 (2009).
  4. Hibbs, R. E., Gouaux, E. Principles of activation and permeation in an anion-selective Cys-loop receptor. Nature. 474, (7349), 54-60 (2011).
  5. Miller, P. S., Aricescu, A. R. Crystal structure of a human GABAA receptor. Nature. 512, (7514), 270-275 (2014).
  6. Hassaine, G., et al. X-ray structure of the mouse serotonin 5-HT3 receptor. Nature. 512, (7514), 276-281 (2014).
  7. Du, J., Lu, W., Wu, S., Cheng, Y., Gouaux, E. Glycine receptor mechanism elucidated by electron cryo-microscopy. Nature. (2015).
  8. Sunshine, C., McNamee, M. G. Lipid modulation of nicotinic acetylcholine receptor function: the role of neutral and negatively charged lipids. Biochim Biophys Acta. 1108, 240-246 (1992).
  9. Fong, T. M., McNamee, M. G. Correlation between acetylcholine receptor function and structural properties of membranes. Biochemistry. 25, (4), 830-840 (1986).
  10. daCosta, C. J., Baenziger, J. E. A lipid-dependent uncoupled conformation of the acetylcholine receptor. J Biol Chem. 284, (26), 17819-17825 (2009).
  11. Criado, M., Eibl, H., Barrantes, F. J. Functional properties of the acetylcholine receptor incorporated in model lipid membranes. Differential effects of chain length and head group of phospholipids on receptor affinity states and receptor-mediated ion translocation. J Biol Chem. 259, (14), 9188-9198 (1984).
  12. Hubbell, W. L., Lopez, C. J., Altenbach, C., Yang, Z. Technological advances in site-directed spin labeling of proteins. Curr Opin Struct Biol. 23, (5), 725-733 (2013).
  13. Columbus, L., Hubbell, W. L. A new spin on protein dynamics. Trends Biochem Sci. 27, (6), 288-295 (2002).
  14. Hubbell, W. L., Cafiso, D. S., Altenbach, C. Identifying conformational changes with site-directed spin labeling. Nat Struct Biol. 7, (9), 735-739 (2000).
  15. McHaourab, H. S., Steed, P. R., Kazmier, K. Toward the fourth dimension of membrane protein structure: insight into dynamics from spin-labeling EPR spectroscopy. Structure. 19, (11), 1549-1561 (2011).
  16. Bordignon, E. Site-directed spin labeling of membrane proteins. Top Curr Chem. 321, 121-157 (2012).
  17. Klare, J. P., Steinhoff, H. J. Spin labeling EPR. Photosynth Res. 102, (2-3), 377-390 (2009).
  18. Drescher, M. EPR in protein science : intrinsically disordered proteins. Top Curr Chem. 321, 91-119 (2012).
  19. Perozo, E., Cuello, L. G., Cortes, D. M., Liu, Y. S., Sompornpisut, P. EPR approaches to ion channel structure and function. Novartis Found Symp. 245, 146-158 (2002).
  20. Fanucci, G. E., Cafiso, D. S. Recent advances and applications of site-directed spin labeling. Curr Opin Struct Biol. 16, (5), 644-653 (2006).
  21. Sahu, I. D., McCarrick, R. M., Lorigan, G. A. Use of electron paramagnetic resonance to solve biochemical problems. Biochemistry. 52, (35), 5967-5984 (2013).
  22. Hubbell, W. L., McHaourab, H. S., Altenbach, C., Lietzow, M. A. Watching proteins move using site-directed spin labeling. Structure. 4, (7), 779-783 (1996).
  23. Altenbach, C., Marti, T., Khorana, H. G., Hubbell, W. L. Transmembrane protein structure: spin labeling of bacteriorhodopsin mutants. Science. 248, (4959), 1088-1092 (1990).
  24. McHaourab, H. S., Lietzow, M. A., Hideg, K., Hubbell, W. L. Motion of spin-labeled side chains in T4 lysozyme. Correlation with protein structure and dynamics. Biochemistry. 35, (24), 7692-7704 (1996).
  25. Farahbakhsh, Z. T., Altenbach, C., Hubbell, W. L. Spin labeled cysteines as sensors for protein-lipid interaction and conformation in rhodopsin. Photochem Photobiol. 56, (6), 1019-1033 (1992).
  26. Altenbach, C., Greenhalgh, D. A., Khorana, H. G., Hubbell, W. L. A collision gradient method to determine the immersion depth of nitroxides in lipid bilayers: application to spin-labeled mutants of bacteriorhodopsin. Proc Natl Acad Sci U S A. 91, (5), 1667-1671 (1994).
  27. Altenbach, C., Froncisz, W., Hemker, R., McHaourab, H., Hubbell, W. L. Accessibility of nitroxide side chains: absolute Heisenberg exchange rates from power saturation EPR. Biophys J. 89, (3), 2103-2112 (2005).
  28. Rabenstein, M. D., Shin, Y. K. Determination of the distance between two spin labels attached to a macromolecule. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, (18), 8239-8243 (1995).
  29. Altenbach, C., Oh, K. J., Trabanino, R. J., Hideg, K., Hubbell, W. L. Estimation of inter-residue distances in spin labeled proteins at physiological temperatures: experimental strategies and practical limitations. Biochemistry. 40, (51), 15471-15482 (2001).
  30. Borbat, P. P., McHaourab, H. S., Freed, J. H. Protein structure determination using long-distance constraints from double-quantum coherence ESR: study of T4 lysozyme. J Am Chem Soc. 124, (19), 5304-5314 (2002).
  31. Chiang, Y. W., Borbat, P. P., Freed, J. H. The determination of pair distance distributions by pulsed ESR using Tikhonov regularization. J Magn Reson. 172, (2), 279-295 (2005).
  32. Jeschke, G. DEER distance measurements on proteins. Annu Rev Phys Chem. 63, 419-446 (2012).
  33. Jeschke, G., Polyhach, Y. Distance measurements on spin-labelled biomacromolecules by pulsed electron paramagnetic resonance. Phys Chem Chem Phys. 9, (16), 1895-1910 (2007).
  34. Jeschke, G., Wegener, C., Nietschke, M., Jung, H., Steinhoff, H. J. Interresidual distance determination by four-pulse double electron-electron resonance in an integral membrane protein: the Na+/proline transporter PutP of Escherichia coli. Biophys J. 86, (4), 2551-2557 (2004).
  35. Hilf, R. J., Dutzler, R. Structure of a potentially open state of a proton-activated pentameric ligand-gated ion channel. Nature. 457, (7225), 115-118 (2009).
  36. Velisetty, P., Chalamalasetti, S. V., Chakrapani, S. Conformational transitions underlying pore opening and desensitization in membrane-embedded Gloeobacter violaceus ligand-gated ion channel (GLIC). J Biol Chem. 287, (44), 36864-36872 (2012).
  37. Birnboim, H. C., Doly, J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 7, (6), 1513-1523 (1979).
  38. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A. 74, (12), 5463-5467 (1977).
  39. Sanger, F., Coulson, A. R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. J Mol Biol. 94, (3), 441-448 (1975).
  40. McHaourab, H. S., Kalai, T., Hideg, K., Hubbell, W. L. Motion of spin-labeled side chains in T4 lysozyme: effect of side chain structure. Biochemistry. 38, (10), 2947-2955 (1999).
  41. Gross, A., Columbus, L., Hideg, K., Altenbach, C., Hubbell, W. L. Structure of the KcsA potassium channel from Streptomyces lividans: a site-directed spin labeling study of the second transmembrane segment. Biochemistry. 38, (32), 10324-10335 (1999).
  42. Velisetty, P., Chakrapani, S. Desensitization mechanism in a Prokaryotic ligand-gated ion channel. J Biol Chem. 287, (22), (2012).
  43. Velisetty, P., Chakrapani, S. Desensitization mechanism in prokaryotic ligand-gated ion channel. J Biol Chem. 287, (22), 18467-18477 (2012).
  44. Chakrapani, S., Cuello, L. G., Cortes, D. M., Perozo, E. Structural dynamics of an isolated voltage-sensor domain in a lipid bilayer. Structure. 16, (3), 398-409 (2008).
  45. Cuello, L. G., Cortes, D. M., Perozo, E. Structural dynamics of the KvAP pore domain lacking the voltage sensing domain. Biophysical Journal. 88, (1), 19-20 (2005).
  46. Perozo, E., Cortes, D. M., Cuello, L. G. Structural rearrangements underlying K+-channel activation gating. Science. 285, (5424), 73-78 (1999).
  47. Chakrapani, S., Sompornpisut, P., Intharathep, P., Roux, B., Perozo, E. The activated state of a sodium channel voltage sensor in a membrane environment. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, (12), 5435-5440 (2010).
  48. Vasquez, V., Sotomayor, M., Cordero-Morales, J., Schulten, K., Perozo, E. A structural mechanism for MscS gating in lipid bilayers. Science. 321, (5893), 1210-1214 (2008).
  49. Perozo, E., Cortes, D. M., Sompornpisut, P., Kloda, A., Martinac, B. Open channel structure of MscL and the gating mechanism of mechanosensitive channels. Nature. 418, (6901), 942-948 (2002).
  50. Kim, M., Xu, Q., Murray, D., Cafiso, D. S. Solutes alter the conformation of the ligand binding loops in outer membrane transporters. Biochemistry. 47, (2), 670-679 (2008).
  51. Kazmier, K., Sharma, S., Islam, S. M., Roux, B., McHaourab, H. S. Conformational cycle and ion-coupling mechanism of the Na+/hydantoin transporter Mhp1. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, (41), 14752-14757 (2014).
  52. Durr, K. L., et al. Structure and dynamics of AMPA receptor GluA2 in resting, pre-open, and desensitized states. Cell. 158, (4), 778-792 (2014).
  53. Borbat, P. P., et al. Conformational motion of the ABC transporter MsbA induced by ATP hydrolysis. PLoS Biol. 5, (10), e271 (2007).
  54. Zou, P., McHaourab, H. S. Increased sensitivity and extended range of distance measurements in spin-labeled membrane proteins: Q-band double electron-electron resonance and nanoscale bilayers. Biophys J. 98, (6), 18-20 (2010).
  55. Pannier, M., Veit, S., Godt, A., Jeschke, G., Spiess, H. W. Dead-time free measurement of dipole-dipole interactions between electron spins. J Magn Reson. 142, (2), 331-340 (2000).
  56. Jeschke, G., et al. DeerAnalysis2006-a comprehensive software package for analyzing pulsed ELDOR data. Applied Magnetic Resonance. 30, (3-4), 473-498 (2006).
  57. Ruta, V., Jiang, Y., Lee, A., Chen, J., MacKinnon, R. Functional analysis of an archaebacterial voltage-dependent K+ channel. Nature. 422, (6928), 180-185 (2003).
  58. Velisetty, P., Chalamalasetti, S. V., Chakrapani, S. Structural basis for allosteric coupling at the membrane-protein interface in Gloeobacter violaceus ligand-gated ion channel (GLIC). J Biol Chem. 289, (5), 3013-3025 (2014).
  59. Dellisanti, C. D., et al. Site-directed spin labeling reveals pentameric ligand-gated ion channel gating motions. PLoS Biol. 11, (11), e1001714 (2013).
  60. Labriola, J. M., et al. Structural sensitivity of a prokaryotic pentameric ligand-gated ion channel to its membrane environment. J Biol Chem. 288, (16), 11294-11303 (2013).
  61. Kinde, M. N., et al. Conformational Changes Underlying Desensitization of the Pentameric Ligand-Gated Ion Channel ELIC. Structure. 23, (6), 995-1004 (2015).
  62. Vasquez, V., Cortes, D. M., Furukawa, H., Perozo, E. An optimized purification and reconstitution method for the MscS channel: strategies for spectroscopical analysis. Biochemistry. 46, (23), 6766-6773 (2007).
  63. Bayburt, T. H., Sligar, S. G. Membrane protein assembly into Nanodiscs. FEBS Lett. 584, (9), 1721-1727 (2010).
  64. Hanson, S. M., Francis, D. J., Vishnivetskiy, S. A., Klug, C. S., Gurevich, V. V. Visual arrestin binding to microtubules involves a distinct conformational change. J Biol Chem. 281, (14), 9765-9772 (2006).
  65. McCoy, J., Hubbell, W. L. High-pressure EPR reveals conformational equilibria and volumetric properties of spin-labeled proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, (4), 1331-1336 (2011).
  66. Mobius, K., et al. Combining high-field EPR with site-directed spin labeling reveals unique information on proteins in action. Magn Reson Chem. 43, Spec no. 4-19 (2005).
  67. Lopez, C. J., Oga, S., Hubbell, W. L. Mapping Molecular Flexibility of Proteins with Site-Directed Spin Labeling: A Case Study of Myoglobin. Biochemistry. 51, (33), 6568-6583 (2012).
  68. Fleissner, M. R., et al. Site-directed spin labeling of a genetically encoded unnatural amino acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, (51), 21637-21642 (2009).
  69. Lorenzi, M., et al. Tyrosine-targeted spin labeling and EPR spectroscopy: an alternative strategy for studying structural transitions in proteins. Angew Chem Int Ed Engl. 50, (39), 9108-9111 (2011).
Сайт Направленный Спин Этикетировочное и ЭПР спектроскопических исследований пентамерной лигандами ионных каналов
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Basak, S., Chatterjee, S., Chakrapani, S. Site Directed Spin Labeling and EPR Spectroscopic Studies of Pentameric Ligand-Gated Ion Channels. J. Vis. Exp. (113), e54127, doi:10.3791/54127 (2016).More

Basak, S., Chatterjee, S., Chakrapani, S. Site Directed Spin Labeling and EPR Spectroscopic Studies of Pentameric Ligand-Gated Ion Channels. J. Vis. Exp. (113), e54127, doi:10.3791/54127 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter