This article describes methods for site-directed spin labeling and reconstitution of pentameric ligand-gated channels for Electron Paramagnetic Resonance studies. This protocol can be adapted for any membrane protein. The reconstitution method described here can also be used for patch-clamp measurements of macroscopic and single-channel currents in a defined lipid system.
Ion channel gating is a stimulus-driven orchestration of protein motions that leads to transitions between closed, open, and desensitized states. Fundamental to these transitions is the intrinsic flexibility of the protein, which is critically modulated by membrane lipid-composition. To better understand the structural basis of channel function, it is necessary to study protein dynamics in a physiological membrane environment. Electron Paramagnetic Resonance (EPR) spectroscopy is an important tool to characterize conformational transitions between functional states. In comparison to NMR and X-ray crystallography, the information obtained from EPR is intrinsically of lower resolution. However, unlike in other techniques, in EPR there is no upper-limit to the molecular weight of the protein, the sample requirements are significantly lower, and more importantly the protein is not constrained by the crystal lattice forces. Therefore, EPR is uniquely suited for studying large protein complexes and proteins in reconstituted systems. In this article, we will discuss general protocols for site-directed spin labeling and membrane reconstitution using a prokaryotic proton-gated pentameric Ligand-Gated Ion Channel (pLGIC) from Gloeobacter violaceus (GLIC) as an example. A combination of steady-state Continuous Wave (CW) and Pulsed (Double Electron Electron Resonance-DEER) EPR approaches will be described that will enable a complete quantitative characterization of channel dynamics.
За последнее десятилетие, структурное понимание пентамерной лиганд-ионных каналов (pLGIC) вырос в дрожжах, благодаря множеству людей структур высокого разрешения нескольких членов семьи. Ключевые факторы , которые привели к текущим достижениям в этой области включают в себя, открытие прокариотических каналов pLGIC, 1-3 крупных достижений в области эукариотической экспрессии мембранного белка, 4-6 и огромные прорывы в подходах определения структуры. 7 Эти структуры обеспечивают четкий консенсус по общее сохранение трехмерной архитектуры pLGIC. Тем не менее, две основные области, которые, кажется, плестись в хвосте являются функциональные характеристики этих препаратов канала и механистический описание функции канала.
Стробирование конформационные изменения являются сложными и происходят в течение более 60 Расстояние по длине канала и эти переходы широко модулируетсямембранные липиды. В частности, отрицательные липиды, холестерин и фосфолипиды , чтобы модулировать функцию pLGIC 8.11. Хотя точная роль этих липидных компонентов в функции канала остается неизвестным, полный молекулярный понимание стробирования потребует изучения этих каналов в их родной среде. Сайт-направленный Спин Этикетировочное (SDSL) и электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) спектроскопии являются методы выбора для изучения динамики белков в реконструированных системах. ЭПР-спектроскопии не ограничивается размером молекул (как ЯМР) или оптическое свойство образца (как флуоресцентная спектроскопия), и, таким образом, позволяет измерять полнометражных конструктов восстанавливали в нативных условиях липидных. Техника чрезвычайно чувствительна и имеет относительно низкие требования выборки (в пределах пико-моль). Обе эти аспекты делают этот метод хорошо подходит для изучения больших мембранных белков, которые трудно выразить в более миллиграммавеличины.
Использование ЭПР – спектроскопии в сочетании с сайт-направленного спина маркировки была разработана Уэйном Hubbell и его коллегами, и был адаптирован для изучения целого ряда типов протеина. 12-24 ЭПР данные были использованы для исследования вторичных структур, изменения в белке конформации, глубины мембранной вставки, и белок-белок / белок-лиганд взаимодействия.
Способ включает в себя цистеин замену в положениях, представляющих интерес сайт-направленного мутагенеза. Для того, чтобы обеспечить сайт-специфическую маркировку, необходимо заменить родной цистеина с другой аминокислотой (например., Серин) , чтобы создать цистеином менее шаблон. До сих пор самым популярным этикетки спин является тиол конкретным мТл: (1-окси-2,2,5,5-тетраметил-Δ3-пирролин-3-метил) methanethiosulfonate который прикрепляется к белку через мост дисульфидных связей. Благодаря своей высокой специфичности, относительно небольшой размер (чуть больше, чем триптофан) и флексичивости линкерной области, этот спин метка было показано, имеют отличную реакционную способность даже при заглубленный цистеина. Кроме того, чтобы максимизировать реактивность, реакция мечение белка осуществляется в стиральном-растворимой форме. После отделения избытка свободного спин-метки с помощью вытеснительной хроматографии, белок восстанавливают в липосомы или двухслойных имитирующих систем определенного состава липидов. В общем, цистеин мутагенеза хорошо переносится в большинстве частей белка, и относительно небольшой размер спин-зонда вызывает минимальное возмущение на вторичных и третичных структур. Для того, чтобы гарантировать, что модификация сохранила функции дикого типа, меченые и реконструированные каналы могут быть изучены с помощью измерений патч-зажим.
Меченый-функциональный белок затем подвергают спектроскопических измерений, которые по существу обеспечивают три основных вида информации: 12,14,15,20,22,23,25-27 динамику спин-зонде lineshАнализ обезьяну; доступность зонда к парамагнитной релаксации агентов; и расстояние распространения. 27 ЭПР расстояния измеряются с помощью двух различных подходов. Первый основан на непрерывной волны (CW) техники, где спектральное уширение , возникающие из дипольных взаимодействий между спин-метками (в 8 – диапазон расстояний 20 Å). Используется для определения расстояния 28,29 Второй представляет собой импульсный ЭПР- метод измерения расстояния , где может быть продлен до 70 Å. 30-34 в Double Electron Electron Resonance (DEER), колебания амплитуды спинового эха анализируются для определения расстояний и распределения расстояний. Здесь спинового эха модулируется на частоте дипольной взаимодействия. В совокупности эти параметры используются для определения топологии белка, вторичные структурные элементы, а также белок-конформационных изменений.
ЭПР-спектроскопии оказалось беспрецедентным структурный подход при количественной оценке конформационные изменения мембранных белков в почти родной среде. Такой подход позволяет нам заглянуть в молекулярные детали динамики белков, которые затемнены в структурах с высокой разрешаю…
The authors have nothing to disclose.
Мы очень благодарны нынешних и бывших членов лаборатории Чакрапани для критического чтения и замечания по рукописи. Эта работа была поддержана Национальным институтом здравоохранения (грант 1R01GM108921) и Американской ассоциации сердца (НКРЗ ученый развития Грант 12SDG12070069) и СК.
Site-Directed Mutagenesis and Cys mutations | |||
10x PfuUltra HF reaction buffer | Agilent Technologies | 600380-52 | |
dNTPS | New England BioLabs Inc | N0447L | 10mM each dNTP |
pfu Ultra DNA polymerase | Agilent Technologies | 600380-51 | 2.5 U/ul |
DPNI | New England BioLabs Inc | R0176S | 20,000 U/ml |
XL10 GOLD | Agilent Technologies | 200314 | |
SOC media | New England BioLabs Inc | B9020S | |
Kanamycin | Fisher Scientfic | BP905 | |
LB media | Invitrogen | 127957084 | |
Miniprep kit | QIAGEN | 27106 | |
C43 competent cells | Lucigen | 60446 | |
Expression and Purification | |||
Glucose | Fisher Scientfic | D16 | |
Tryptone | Fisher Bioreagents | BP1421-500 | |
Yeast extract | Amresco | J850 | |
Glycerol | Fisher Bioreagents | BP229 | |
K2HPO4 | Amresco | 0705 | |
KH2PO4 | Amresco | 0781 | |
IPTG (isopropyl-thio-β-galactoside) | Gold Biotechnology | I2481C25 | |
Trizma Base | Sigma Life Science | T1503 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
DNase I | Sigma Life Science | DN25 | |
PMSF | Amresco | M145 | |
Leupeptine | Amresco | J580 | |
Pepstatin | Amresco | J583 | |
DDM (n-Docecyl-β-D-Maltopyranoside) | Anatrace | D310S | |
Amylose resin | New England BioLabs Inc | E8021L | |
TCEP | Amresco | K831 | |
EDTA | Fisher Scientfic | BP118 | |
Maltose | Acros Organics | 329915000 | |
Superdex 200GL | GE Healthcare | 17-5175-01 | |
Empty polypropylene Chromatography column | BioRad | 731-1550 | |
Site-Directed Spin Labeling | |||
MTSL (1-oxyl-2,2,5,5-tetramethyl-3-pyrroline-3-methyl) Methanethiosulfonate | Toronto Reaserch chemicals Inc | O873900 | |
(1-acetoxy-2,2,5,5-tetramethyl-Δ3-pyrroline-3-methyl) methanethiosulfonate | Toronto Reaserch chemicals Inc | A167900 | |
DMSO | J.T. Baker | 9224-01 | |
Reconstitution | |||
Asolectin lipid | Avanti polar lipids Inc | 541602C | |
Biobeads (Polystyrine beads) | Bio Rad | 152-3920 | |
Methanol | Fisher chemicals | A413 | |
FRET | |||
Fluorescein-maleimide | ThermoFisher Scientific | F-150 | |
Tetramethylrhodamine-maleimide | ThermoFisher Scientific | T-6027 | |
POPC | Avanti polar lipids Inc | 850457C | |
POPG | Avanti polar lipids Inc | 840457C | |
E.Coli polar lipid extract | Avanti polar lipids Inc | 100600C | |
HEPES | Sigma Life Science | H3375 | |
EPR measurement | |||
TPX plastic capillaries | Bruker | ER221 | |
EDDA (Ethylenediamine-N, N'-diacetic acid) | Aldrich | 158186 | |
Ni(OH)2 | Aldrich | 283622 |