Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

Sätesriktad Spin Labeling och EPR Spektroskopiska studier av pentamer ligandreglerade jonkanaler

Published: July 4, 2016 doi: 10.3791/54127

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Under det senaste decenniet har den strukturella förståelse av penta ligandreglerade jonkanaler (pLGIC) odlas i stormsteg, på grund av mängder av högupplösta strukturer för flera familjemedlemmar. Viktiga faktorer som ledde till den nuvarande framsteg inom området inkluderar upptäckten av prokaryota pLGIC kanaler, 1-3 stora framsteg i eukaryot membranproteinuttryck, 4-6 och enorma genombrott i strukturbestämning metoder. 7 Dessa strukturer ger en tydlig enighet om den totala bevarandet av den tredimensionella arkitekturen i pLGIC. Men två viktiga områden som verkar släpa bakom är den funktionella karakteriseringen av dessa kanal preparat och mekanistiska beskrivning av kanalfunktionen.

Grindkonformationsändringar är komplexa och sker under en 60 ett avstånd utmed längden av kanalen och dessa övergångar är i stor utsträckning moduleras avmembranlipider. I synnerhet, har negativa lipider, kolesterol och fosfolipider visat sig modulera funktionen av pLGIC 8-11. Medan den exakta rollen för dessa lipid beståndsdelar i kanalen funktion är okänd, skulle en fullständig molekylär förståelse av grind kräver att studera dessa kanaler i sin ursprungliga miljö. Platsriktad Spin Labeling (SDSL) och elektronspinnresonans (EPR) spektroskopi är de metoder för val för att studera proteindynamik i ombildade system. EPR-spektroskopi är inte begränsad av molekylstorleken (som är NMR) eller optisk egenskap av provet (som är fluorescensspektroskopi), och därigenom tillåter mätningar av fullängds konstruktioner rekonstituerade i nativa lipid förhållanden. Tekniken är extremt känslig och har krav relativt låga prov (i pico-mol range). Båda dessa aspekter gör tekniken väl lämpad för att studera stora membranproteiner som är svåra att uttrycka i över milligramkvantiteter.

Användningen av EPR-spektroskopi i kombination med ställesriktad spinnmärkning har utvecklats av Wayne Hubbell och kollegor, och har anpassats för att studera en mängd av proteintyper. 12-24 EPR uppgifter har använts för att undersöka sekundärstrukturer, förändringar i proteinet konformation, membraninsättningsdjup, och protein-protein / protein-ligandinteraktioner.

Metoden involverar cystein substitution vid positionerna av intresse genom ställesriktad mutagenes. Att säkerställa platsspecifik märkning, är det nödvändigt att ersätta nativa cysteiner med en annan aminosyra (t.ex.., Serin) för att skapa ett cystein-mindre mall. Den överlägset, är den mest populära spin label en tiol-specifik MTSL: (1-oxyl-2,2,5,5-tetrametyl-Δ3-pyrrolin-3-metyl) methanethiosulfonate som fäster till proteinet genom en disulfidbindning bro. Tack vare sin höga specificitet, relativt liten storlek (något större än tryptofan), och flexiheten av länk regionen har här rotations etikett visat sig ha utmärkt reaktivitet även med en nedgrävd cystein. Vidare, för att maximera reaktiviteten, är märkningsreaktionen av proteinet utförs i detergent-solubiliserad form. Efter separation av överskottet av fria spin-label genom storleksuteslutningskromatografi proteinet rekonstitueras in i liposomer eller dubbelskiktsliknande system med definierad lipidkomposition. I allmänhet är cystein mutagenes tolereras väl i de flesta delar av proteinet, och den relativt lilla storleken på spin-sonden orsakar minimal störning för de sekundära och tertiära strukturer. För att säkerställa att ändringen behålls vildtyp funktioner, kan de märkta och som rekonstitueras kanaler studeras genom patch-clamp-mätningar.

Det märkta-funktionellt protein utsätts sedan för spektroskopiska mätningar, som i huvudsak ger tre huvudsakliga typer av information: 12,14,15,20,22,23,25-27 spinnsond dynamik genom lineshape-analys; tillgängligheten av proben till paramagnetiska relaxationsmedel; och avstånd fördelning. 27 EPR avstånd mäts med två olika metoder. Den första är baserad på kontinuerlig våg (CW) teknik, där spektral breddning till följd av dipolära interaktioner mellan spin-etiketter (i 8-20 ett avståndsintervall). Används för att bestämma avstånd 28,29 Den andra är en pulsad EPR metod där avståndsmätningar kan förlängas upp till 70 Å. 30-34 i Double Electron Electron Resonance (hjort), är svängningar i spinn-eko amplitud analyseras för att bestämma avstånd och avståndsfördelningar. Här spinnekot moduleras vid frekvensen för det dipolära växelverkan. Tillsammans är dessa parametrar som används för att bestämma protein topologi, sekundära strukturelement, och proteinkonformationsförändringar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. ställesriktad mutagenes och Cys Mutationer

  1. Kloning och mutagenes
    OBS: GLIC vildtyp (wt) 35 har en enda-nativ cystein (C27), som är muterad till serin för att skapa ett cystein-mindre bakgrund. Cystein mutationer introduceras på cystein-mindre bakgrunds genom ställesriktad mutagenes med användning av primrar som bär en cysteinkodonet vid den önskade positionen 36.
    1. Blanda 5 | j, l av 10 x reaktionsbuffert, 1 ^ il av 100 ng / pl cystein-less GLIC templat-DNA 35, 0,5 pl vardera av 40 pM framåt- och bakåt primer 36, 1 | il dNTP (100 mM), och 41 | il avjoniserat vatten . Pipett provet ett par gånger för att blanda det ordentligt, snurra (6000 rpm) och slutligen till 1 pl av DNA-polymeras.
    2. Ställ in termo cykler med följande protokoll:
      1. Denaturering vid 95 ° C under 4 min.
      2. Denaturering vid 95 ° C under 30 sek.
      3. Glödgaing vid 55 ° C under 1 minut.
      4. Töjning vid 68 ° C i 10 min (ungefär 1 min per kb plasmid längd).
      5. Upprepa steg 1.1.2.2 - 1.1.2.4 för 18 cykler.
      6. En slutlig förlängning vid 68 ° C under 10 min.
      7. Håller temperaturen vid 4 ° C
        OBS: Glödgning Temperaturen beräknas baserat på primern Tm.
    3. Tillsätt 1 pl Dpnl till reaktionsblandningen och blanda väl genom att pipettera och spinn ner (6000 rpm) under 1 minut. Inkubera i 2 h vid 37 ° C.
  2. Omvandling
    1. E. coli-kompetenta celler på is. Alikvotera 30 ul av celler i en 14 ml steril omvandling rör och tillsätt 1 pl smält DNA till cellerna. Blanda genom att knacka på sidan av röret. Inkubera under 20 min på is.
    2. Placera röret i ett 42 ° C vattenbad under 45 sekunder och sedan placera den tillbaka på is i 2 min. Tillsätt 400 pl steril SOC media och skaka cellerna i en incubator vid 37 ° C under 1 timme.
    3. Plattan 100 pl celler på LB-plattor innehållande kanamycin (50 | iM) och 1% glukos. Inkubera plattorna O / N vid 37 ° C.
    4. Skörda en enda koloni från plattan och inokulera i 5 ml O / N kulturer innehållande LB / kanamycin medier. Inkubera kulturen O / N (~ 16 timmar) vid 37 ° C i en inkubator shaker.
    5. Extrahera DNA från O / N-kulturen genom minipreparation 37. Kvantifiera utbytet av DNA med användning av en spektrofotometer genom mätning av absorbansen vid 260 nm våglängd. Koncentrationen bör vara ~ 100-200 ng / l. Bekräfta närvaron av mutationen genom vanliga rekombinant-DNA-sekvenseringsstrategier 38,39.

2. GLIC expression och rening

  1. Omvandling
    1. Efter de steg som beskrivs i avsnitt 1.2, omvandla 30 pl C43 kompetenta celler med 1 pl (~ 100-200 ng / l) av den plasmid som innehåller genen som kodar för GLIC tillsammans med en humant rhinovirus (HRV) 3C proteasklyvningsställe (För plasmiden och gensekvensen hänvisas till kompletterande text) 35 (från steg 1.2.5).
    2. Plattan 100 pl celler på LB-agarplattor innehållande 1% glukos och 50 | j, g / ml kanamycin, och inkubera dem O / N (~ 16 h) vid 37 ° C i en inkubator.
    3. Kontrollera visuellt för kolonier och se till att de inte är över vuxen eller visa närvaron av satellitkolonier. Omgående täta plattorna med parafilm och förvara dem vid 4 ° C.
  2. Ställa upp O / N-kulturer och Beredning av tillväxtmedier
    1. Plocka en enda isolerad koloni med användning av sling inokulering tråd och överför till en 100 ml steril kolv innehållande 20 ml av Luria Broth (LB) medium med tillsats av steril 1% glukos och 50 | j, g / ml kanamycin. Inkubera dem O / N (~ 16 h) vid 37 ° C i en skakapparat vid 250 rpm.
    2. Autoklav 900 ml Terrific Broth (TB) media (se media och buffertsammansättning) i 2,8L Fernbach glaskolvar för bakteriekulturen i ånga cykel vid 121 ° C under 20 min.
  3. Ställa upp stora tillväxtkulturer
    1. Tillsätt 100 ml steril kaliumfosfatbuffert (se media och buffertkomposition) till den autoklaverade TB media. Tillsätt steril glukos (0,2% slutkoncentration), kanamycin (50 | ig / ml), och 10 ml av O / N-kulturen. Inkubera vid 37 ° C i en skakapparat vid 250 rpm.
    2. Kontrollera den optiska densiteten vid 600 nm våglängd (OD600) med användning av densitometer eller en spektrofotometer varje timme tills den når 0,5 (~ 2 h). Vid denna tidpunkt minska hastigheten till 150 rpm och sänka temperaturen till 18 ° C. Övervaka OD 600 var 30 min tills den når 0,8 (~ 1 h).
    3. Tillsätt 50 ml glycerol och fortsätta att skaka odlingen tills OD 600 når 1,0-1,2 (~ 15-30 min).
      OBS: Under dessa förhållanden, det tar ungefär en timme för kulturen att nå 18 ° C från 37 ° C. Det är important att glycerol tillsätts till odlingen efter att den har kylts till 18 ° C.
    4. Förmå cellerna med 200 ^ M IPTG (isopropyl-tio-β-galaktosid) och återställ shaker tillbaka till 250 rpm och inkubera ytterligare för ~ 16 timmar vid 18 ° C.
  4. protein Purification
    1. Se till att OD 600 vid slutet av 16 h är ~ 16 - 18. Skörda cellerna i 1,0 L centrifugflaskor genom spinning vid 8500 xg, 4,0 ° C i 15 min. Dekantera supernatanten och väg flaskan med cellpelleten. Beräkna vikten av pelleten genom att subtrahera vikten av den tomma flaskan från den totala vikten.
      OBS: Den förväntade cellpelleten vikten är ~ 30-35 g / L. Även om det är att märka att det kan finnas variationer i den slutliga OD 600 och cellpelleten vikt över mutanter.
    2. Återsuspendera den bakteriella pelleten i 150 ml iskall buffert A (100 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 7,4) per 1,0 L av kulturen. Lägg DNas I (100 | j, g / ml) och protease-hämmare (fenylmetylsulfonylfluorid (1 mM), leupeptin (2,0 | j, g / ml), aprotinin (2,0 jig / ml) och pepstatin A (1 | ig / ml)).
    3. Homogenisera cellerna genom att passera dem genom en cell disrupter i en 4,0 ° C kallt rum. Upprepa processen tre gånger så att det mesta av bakterierna lyseras. Centrifugera cellerna vid 14.000 xg under 15 min och pipettera supernatanten ut och överför till ett rent centrifugrör. Kasta pelleten, som innehåller un-lyserade celler och inklusionskroppar.
    4. Centrifugera supernatanten vid 168.000 xg under 1 h. Dekantera försiktigt supernatanten utan att störa membranet pelleten.
    5. Pool membranet pelleten från 1 L kultur och återsuspendera den i buffert A (som kompletterats med 10% glycerol) till en slutlig volym av 50 ml. Tillsätt 0,5 g n-Docecyl-β-D-maltopyranosid (DDM) till membransuspensionen och nutera under 2 h vid 4,0 ° C.
    6. Efter membran solubilisering avlägsna cellrester från lysatet genom centrifugeation vid 168000 xg under 1 timme. Under tiden förbereder amylosharts. Överföring 3 ml harts med hjälp av en pipett till en tom polypropylen-kolonn. Tvätta hartset genom att passera 10 bäddvolymer av vatten 3 gånger och därefter med 10 bäddvolymer av buffert A innehållande 0,5 mM DDM.
    7. Efter centrifugering, ta varsamt supernatanten ut med användning av en pipett och överföra till ett rent 50 ml koniska rör. För satsvis bindning, tillsätt förjämviktad amylosharts till det koniska röret. Binda det extraherade proteinet till amylos hartset genom nuterande av blandningen under 2 h vid 4,0 ° C.
    8. Passera hela uppslamningen genom en kromatografikolonn och samla genomströmning. Därefter passerar hela samlas genomströmning över hartset en andra gång för att maximera bindning.
    9. Passera 10 bäddvolymer av buffert A med 0,5 mM DDM, 0,5 mM tris (2-karboxietyl) fosfin (TCEP) och 1 mM etylendiamintetraättiksyra (EDTA) för att avlägsna obundna proteiner.
    10. Eluera GLIC proteinet med 10 ml Buffer A innehållande 40 mM maltos utöver 0,5 mM DDM och 0,05 mM TCEP. TCEP förhindrar oxidation av cystein sidokedjor. Samla hela eluerar.
    11. Koncentrera det eluerade proteinet med användning av centrifugalkoncentrator (molekylviktsgräns = 50 KDa) till 4 - 6 mg / ml och tillsätt HRV-3C-proteas (200 | j, g per 10 mg protein) och inkubera O / N vid 4,0 ° C.
      OBS: Fastställ fullbordandet av proteasdigestion genom att köra proverna på SDS PAGE-gel (se steg 2.5.5 och figur 1).
  5. Ställesriktad Spin-märkning
    1. Gör cirka 100 pl 200 mM lager av (1-oxyl-2,2,5,5-tetrametyl-Δ3-pyrrolin-3-metyl) MTSL 40 i DMSO och förvara lager vid -20 ° C i 25 ul alikvoter.
    2. Använd proteasdigererat prov för spin-märkning med MTSL. Tillsätt 10-faldigt molärt överskott av MTSL spin-label (GLIC monomer: MTSL i 01:10 molförhållande). Inkubera på is under 1 h. Lägga till en andra skott av spinnetikett vid ett 5-faldigt molärt överskottförhållande och inkubera under ytterligare en timme.
      OBS: För begravda positioner (med låg verkningsgrad spinnmärkning, som beskrivs nedan), en 30 gånger molärt överskott av spinnetikett tillsättes och proteinet inkuberas under 6 timmar.
    3. Sålla provet genom en snabb Protein kolonnstorlek uteslutning vätskekromatografi (FPLC) som är för-jämviktad med buffert A och 0,5 mM DDM för att separera det kluvna MBP och överskottet fria spin-etikett från GLIC pentamerer. Samla in 1 ml fraktioner i totalt 30 ml eluering. Pool fraktionerna innehållande GLIC pentamerer (Figur 1). Följ tillverkarens instruktioner för att köra FPLC.
    4. Bestämma koncentrationen av provet med användning av en spektrofotometer genom mätning av absorbansen vid 280 nm våglängd. Molära extinktionskoefficienten och den uppskattade molekylvikten för GLIC monomer är 49.850 M -1 cm -1 och 36380 Da, respektive. Koncentrera proteinlösningen med hjälp av en centrifugalkoncentrator (MolecularVikt Cut-off = 50 KDa) till en slutlig koncentration av ~ 8-10 mg / ml och placera den på is. Provet är nu färdigt för rekonstitution.
    5. Som en ytterligare kontroll kvalitet för att säkerställa att preparatet är biokemiskt homogen, köra ett reducerande (1,0% β-ME) SDS-PAGE-gel.
      OBS: Commassie färgade gelén bör visa en enda band vid ~ 33 kDa motsvarande den GLIC monomer (Figur 1).
    6. För spin-märkta mutanter som misstänks uppvisa dipolära breddning, under märka proverna i närvaro av diamagnetiska etiketten 41. Inkubera det eluerade-proteinet med 0,1-faldig MTSL och inkubera på is under 1,0 h. Efteråt, tillsätt 20-faldigt molärt överskott av diamagnetiska etikett (1-acetoxi-2,2,5,5-tetrametyl-Δ3-pyrrolin-3-metyl) metan thiosulfonate.
      OBS: diamagnetiska reagens som används här är iso-steriskt till paramagnetiska etikett med en identisk märkning kemi.
    7. Inkubera provet på is under 2 h. Sålla provet genom en size kromatografi kolonn som är förekvilibrerats med buffert A och 0,5 mM DDM som i steg 2.5.3.
  6. Effektivitet av spinnmärkning
    1. effektivitet spin-märkning definieras som förhållandet av spinnmärket koncentration till koncentrationen av cystein-sidokedjan (GLIC-monomer). För att bestämma effektiviteten för spin-märkning av provet, kommer den integrerade intensiteten av provet jämföras med en standard med känd koncentration med användning av en kalibreringskurva. Göra lösningar av en EPR standard (såsom 2,2,6,6-tetrametyl-1-piperidinyloxyl: TEMPO) i ett intervall av koncentrationer (10-250 | iM) genom upplösning i vatten.
    2. Mät EPR-signalen för var och en av dessa lösningar och bestämma arean under kurvan (dubbel integration av EPR-signalen) för varje koncentration (såsom beskrivs i steg 6.1). Generera en kalibreringskurva genom att plotta det uppmätta området som en funktion av TEMPO-koncentration och passande med en rak linje.
      OBS: ären enligt ett derivat EPR-signal är en bättre beskrivning av den spektrala intensiteten än den topp till topp amplitud. Integrera den första-derivatan EPR-signal kommer att ge absorptionsspektrum kommer en andra integration sedan ge ytan under absorptionsspektrum (som är proportionell mot spinnkoncentration). Säkerställa en konstant baslinje både i låg-området och hög fält området av spektrum.
    3. Mäta koncentrationen av spinnmärkt protein i detergent med användning av en spektrofotometer (som i steg 2.5.4). Nu mäta EPR signalen från provet och sedan bestämma området för dubbelintegral av EPR-signalen att följa stegen i avsnitt 6.1. Genom att använda den kalibreringskurva, bestämma koncentrationen av etiketten som motsvarar den uppmätta EPR-signal. Beräkna verkningsgraden spinnmärkning som molförhållandet mellan spinnetikett och proteinkoncentration.

3. GLIC Rekonstituering i Asolectin Membranes

  1. Skölj en ren 25 ml rundkolv med 5 ml kloroform och torka kolven i en ström av N2-gas i dragskåp. Överförings 10 mg asolectin (sojaböna polärt extrakt 25 mg / ml stock i kloroform) i kolven och torka lipiderna enligt en kontinuerlig ström av N2-gas.
    OBS: Valet av lipider för beredning baseras på resultat från experiment i avsnitt 4.
  2. När kloroform har avdunstat, placera kolven i ett vakuum under 1 h för att säkerställa fullständig torkning. Tillsätt 1 ml beredning buffert A till den torkade lipid och skaka kolven kraftigt för att få lipid pelleten i suspension.
  3. För att framställa små unilamellära vesiklar, sonikera lipidsuspensionen i ett kallt badsonikator tills vesikel lösningen blir mer eller mindre genomskinlig och inga klumpar observeras (ca 10 - 15 min). Till denna blandning, tillsätt DDM till en slutlig koncentration av 4 mM och inkubera vid RT i 30 min.
<li> Rekonstitution
  1. Lägga det renade proteinet från steg 2.5.4 till lipidblandningen.
    OBS: Det protein-till-lipid faktorn beror på vilken typ av experiment. För makroskopiska strömmätningar, en 1: är 10.000 förhållande används. För EPR studier, är beredning görs på en högre protein till lipid-förhållande (1: 2500) för att maximera signal. Det är tidigare visat att vid dessa koncentrationer, ingen lateral aggregering observeras 42.
    OBS: Typisk arbets mängd GLIC för EPR är ~ 1 mg, men baserat på positionen sonde skulle mindre mängder fungera lika bra.
  2. Inkubera provet vid 4 ° C under 1 timme med varsam rotation sedan späda provet till 15 ml med buffert A.
    OBS: Detta steg ger tvättmedelskoncentration under den kritiska micellkoncentration (CMC).
  3. Avlägsna kvarvarande detergent i suspensionen genom tillsats av polystyrenpärlor (med hydrofoba porer den fällan detergent). Tillsätt 80 mg ren pärlorna och inkubera liposome fjädring O / N på en nutator vid 4 ° C.
    1. För att framställa pärlorna för användning, väga ~ 100 mg och överföra dem till en 50 ml koniskt rör. Tillsätt 10 ml metanol, skaka kraftigt, spinn ner kulorna på 8000 xg under 2 minuter, och dekantera metanol. Upprepa denna process metanol tvätta tre gånger. Upprepa samma process med 30 ml avjoniserat vatten, tvättning tre gånger.
  4. Nästa dag, överföra liposomen till en 25 ml ultracentrifugrör användning av en kolonn filter för att avlägsna kulorna och ytterligare späda provet till 25 ml. Centrifugera proverna vid 168.000 xg under 2 h. Dekantera supernatanten och återsuspendera pelleten med användning av 100 pl av buffert B.

4. Bestäm Optimal Lipid Sammansättning för beredning av FRET

  1. Använda en fluorescensresonansenergiöverföring (FRET) -baserad analys för bestämning av membrankompositionen som bibehåller proteinet monodispersa.
  2. rena vikt-
  3. Följande stegen i avsnitt 3.2 för rekonstituering, förbereda tre olika prover för varje lipidkomposition som skall testas, det första, fluoresceinmärkt GLIC i ett molärt förhållande av 1:. 1500 (pentamer: lipid) För det andra, rodamin-märkt GLIC i ett molförhållande 1: 1500 (pentamer: lipid). Tredje, blanda detergent solubiliserad fluorescein och rodamin märkt GLIC (1: 1 molförhållande). Rekonstituera denna blandning i 1: 750 (pentamer: lipid) förhållande.
    OBS: Vi använde tre lipidsystem: asolectin, POPC: POPG (3: 1 molförhållande), och E. coli polära extrakt. Proteinet till lipid rekonstitution förhållandet i FRET experiment är högre än den som används för EPR mätningar (1: 750 i jämförelse med en: 1500 används för EPR studier).
  4. Utspäddliposomsuspensionen (för att minska ljusspridande signalen; ~ 5 ul i 995 pl buffert A) sedan pipett provet i en kvartskyvett och placera den i en fluorimeter.
  5. Ställ excitationsvåglängden vid 490 (vilken motsvarar den absorptionsmaxima för givaren: fluorescein). Med hjälp av tillverkarens instruktioner, spela in emissionsspektra från 500 nm till 660 nm.
    OBS: För fluoresceinmärkta GLIC prov, kommer du att se en topp vid 518 nm (motsvarande fluorescein emission) med någon topp vid 572 nm (motsvarande rodamin emission). För rodaminmärkt GLIC prov, kommer du inte se en topp vid 518 nm utan vid 572 nm i samband med direkt excitation av rodamin vid 490 nm. För provet som innehåller både fluorescein och rodamin etiketter, är en minskning av fluorescein toppintensiteten och en motsvarande ökning av rodamin topp en FRET-signal, som är ägnad en indikator på lateral aggregation av proteinet på membranet.
  6. övervakaamplitud av rodamin emission vid 572 nm vid olika tidsintervall (0-24 h) inspelning vid varje timme för första sex timmar och sedan efter O / N inkubation (Figur 2). För varje intervall, mäta fluorescensintensiteten vid 572 nm (för Rhodamine: Ia) och vid 518 nm (för fluorescein: Id). Subtrahera bidrag direkt rodamin aktivering (prov 2 i steg 4,3) från Ia (IAC). Bestäm FRET förhållandet som lac / (IAC + Ib). Jämför FRET vid olika tidsintervall och i olika lipidkompositioner.
    OBS: Som en kontroll, utför steg 4,5 och 4,6 för tvättmedels solubiliserades prover och jämföra emissionsspektra dem från ombildade liposomer. Använda en ekvimolär blandning av märkt protein i detergent (beskrivet i steg 4.3) och späd i buffert A kompletterad med 0,5 mM DDM. Det förväntas att tvättmedels prover kommer att visa minimal FRET signal.

5. Funktionella Mätningar av Patch-clamp inspelningar

  1. förbereda proteoliposomes för patch-clamp mätningar på exakt samma sätt som för EPR studier (avsnitt 3.1).
    OBS: Men justera protein: lipid beroende på vilken typ av mätning görs (Single-kanal vs Makroskopiska inspelningar). Flash-frysa proteoliposomer i flytande kväve och förvara vid -80 ° C fram till användning. Vanligtvis rekonstituera GLIC i 1: 10.000 protein: lipid (molförhållande) för makroskopiska strömmar och 1: 50.000 molförhållande för enkanaliga inspelningar.
  2. Tina liposomer på is. Skölj en ren glasskiva med vatten och etanol och torka helt. Placera en 10 | il droppe av proteoliposome på mitten av objektglaset och torr O / N i en exsickator vid 4 ° C under vakuum.
  3. Återfukta de torkade proteoliposomer genom tillsats av 20 pl buffert B (150 mM NaCl, 10 mM HEPES, pH 7,0) och placera bilden i en petriplate ovanpå en fuktig filterpapper. Täck plattan och göra det möjligt för rehydrering ske under omkring 2 timmar.
    OBS: Denna process YieLDS jätte multilamellära liposomer som främjar patch från.
  4. Dra patch pipetter från tunnväggiga borosilikatglas kapillärer (~ 1-2 um spets diameter) med hjälp av tillverkarens rekommenderade inställningen på pipetten avdragare. Värme polska med hjälp av en brand förfalska till ett motstånd på 1,5 - 2MΩ när den är fylld med buffert B.
  5. Fyll inspelningen kammaren med buffert B med hjälp av en pipett och fäst Ag / AgCl jordelektrod. Med hjälp av en 2 mikroliter pipettspets försiktigt loss liposomerna från kanten och förflyttning 1 pl av suspensionen på inspelningen kammaren. Vänta några minuter för liposomerna att sedimentera till botten.
  6. Fylla patch-pipett med buffert B med användning av en icke-metallisk sprutnål och montera den på förstärkaren head-stadium. Identifiera en enda isolerad vesikel att lappa. Applicera ett svagt positivt tryck för att förhindra att patch-pipett täpps, och in spetsen i inspelningen kammaren.
  7. Applicera testpulser för att mäta pipetten resistaiou och kompensera för pipetten spänningsoffset. Närmar vesikeln, och när kontakt görs, tillämpa ett litet negativt tryck för att försiktigt dra vesikeln mot plåstret pipetten för att bilda en gigaohm tätning.
  8. Övervaka resistansen hos pipetten under hela processen. När gigaohm försegling bildas, återkalla pipetten försiktigt bort från liposomen för att bilda en inside-out patch. Stänga av testpulsen.
  9. Ställa in hållpotential till -100 mV, och applicera en pH-puls. Lågt pH erhölls med användning av 10 mM natriumcitrat buffert C (150 mM NaCl, 10 mM citrat, pH 3,0). (Figur 3)
    OBS: Inspelningar görs vid en samplingsfrekvens på 10 kHz för makroskopisk och 40 kHz för enskilda mätningar kanal.

6. EPR Mätningar

  1. Kontinuerlig våg EPR-spektroskopi
    1. Överför liposomsuspensionen från steg 3,2 i en 200 pl rör och pellets prover med hjälp av en centrifug. Kassera supernatant och provet är redo för EPR mätningar.
      OBS: För EPR mätningar är det viktigt att avlägsna så mycket buffert från liposomen provet som möjligt. Eftersom vattenhaltiga prover absorbera den elektriska delen av mikrovågsenergin resulterar i uppvärmning och förlust av känslighet.
    2. För att utföra buffertbyte, överföra 20 pl liposompelleten med hjälp av en pipett till ett mikrofugrör. Lägg 180 pl av buffert D (100 mM NaCl, 10 mM citrat, pH 3,0) och inkubera vid 42 ° C vattenbad under 5 min. Centrifugera provet, avlägsna supernatanten med användning av en pipett och upprepa processen tre gånger för att säkerställa fullständig buffertbyte.
      OBS: Alternativt kan buffertbyte göras genom att utsätta proverna för flera frysnings / upptiningscykler.
    3. Gaspermeabla plast kapillärer lämpar sig för mätning av både spektral linje former och lösningsmedel tillgänglighet. Tryck på kapillär på pellet proteoliposome att dra provet inuti och försegla änden med ben vax.
      INTEE: Typiska provvolymer är ~ 5 pl och en önskvärd spin koncentration är 150 ^ M. Om målet är att mäta former linje ensam, kan en använda 0,4 mm OD kvarts kapillärrör. Vid behov kan en pipett kan användas för fyllning av provet inuti kapillären.
    4. Driva spektrometern
      1. Utför CW-EPR mätningar vid RT (292-297 K) på en X-band spektrometer utrustad med en dielektrisk resonator enligt tillverkarens bruksanvisning.
      2. Slå på vatten kylaggregat, strömförsörjning och mikrovågsugn bro konsol. Tillåta systemet att termiskt jämvikt under ca 30 min innan inspelningen. Öppna förvärv programvara.
      3. Sätt provröret / kapillär i resonatorn, se till att den del av röret fylls med provet är i centrum av resonatorkaviteten. Tune resonatorn enligt anvisningarna på spektrometern manual.
      4. Spela första derivatan absorptionsspektrum område svep påen infallande mikrovågseffekt av 1,0 mW, en moduleringsfrekvens på 100 kHz och en svepbredd av 100 G. Bestäm optimal kraft för experimentet genom att utföra en progressiv kraftmättnadsexperiment där topp-till-topp-höjden av den första derivatan CW EPR signalen mäts såsom en funktion av kvadratroten av den infallande mikrovågseffekt.
        OBS: Vid lägre mikrovågsugn krafter, är opåverkad intensiteten hos signalen ökar i proportion mot kvadratroten av ström så länge jämvikts populationen av spinntillstånd. Men om strömmen ökas ytterligare, spin-gitter relaxation kan inte längre bibehålla balansen befolkningen skillnaden mellan de två spinntillstånd och signalamplituden börjar platå eller "mätta". Bortom denna punkt kan signalamplituden faktiskt minskar med ökande observera kraft på grund av befolknings inversion av spinn sates. Dessutom, för breddad spektra med omfattande vingar där en väldefinierad platt baslinjen är inte viligt förlänga svepbredd 150-200 G för att förhindra område förlust.
      5. Börja med att använda en modulering amplitud av 1,0 G.
        OBS: Detta värde är provberoende och justeras för att minska lågfrekvensbuller i signalen. Om alltför stor värde används kan det snedvrida eller bredda signal.
      6. Ställ in konstant och omvandlingstid tid till 20,48 ms, sopa tid till 20,97 sek, och upplösning till 1024 punkter.
        ANMÄRKNING: Tidskonstanten är också baserad på provet, och justeras för att filtrera bort högfrekvent brus.
      7. Efter den första skanningen, ställ in mittfältet i mitten av EPR-signalen och välj svepbredd så att spår innehåller signalen och tillräcklig baslinjen på vardera sidan.
        OBS: Dessutom, för att förbättra signal / brusförhållandet, ökar antalet avsökningar som bygger på styrkan av EPR-signalen. Inkludera svepbredd och antal punkter
      8. Mät tillgängligheten av spin etiketten kollisions avkopplande medel O 2 27 beskrivs i steg 6.1.4.4.
        OBS: Förbered Niedda såsom beskrivits tidigare 26.
      9. Först BEGJUTA provet i hålrummet med N2 under 5 min (för att spola ut O2). Mät spektra för varje mikrovågseffekt mellan 5-35 dB i steg om 3 dB med en svepbredd av 30 G.
      10. Sedan BEGJUTA provet i kaviteten med luft under 10 minuter och mäta spektra vid olika mikrovågsugn befogenheter (5-35 dB i steg om 3 dB) som i steget 6.1.4.9.
      11. Inkubera 20 pl liposompelleten med 180 pl 50 mM Niedda (i buffert B eller buffert D) i en 42 ° C vattenbad under 5 minuter. Centrifugera provet och avlägsna supernatanten med en pipett. Ladda provet i kapillären och placera den i resonatorkaviteten. Upprepa steg 6.1.4.9.
        OBS: Principen bakom experimentet är att interaktionen med paramagnetiska relaxing agenter genom Heisenberg spinnutbyte skulle förhindra mättnad av signalen och befolknings inversion. Vattenlöslig Niedda och lipidlösliga molekyl O 2 används som reportrar för vatten (både bulk och intraprotein hallar) och membranet exponerades positioner på proteinet, respektive.
  2. Dataanalys:
    OBS: Analysen av EPR uppgifter omfattar följande steg: 14,22,23,25-27
    1. Beräkna rörlighet av spinnsonden (AH o -1), som inversen av den centrala linjebredden för förstaderivatan absorptionsspektrum. AH o -1 är reflekterande av rörelsefriheten eller dynamiken i sonden.
    2. Beräkna tillgängligheten parameter (П), som är en uppskattning av tillgängligheten av proben till andra paramagnetiska kollisioner avslappnande medel, med hjälp av steg som beskrivs nedan.
      OBS: Samverkan mellan spin-sonden med paramagnetiska avkopplande medelförbättrar spinngitterrelaxationshastigheten (T 1) av nitroxiden genom Heisenspinnutbyte. 27
      1. Uppskatta tillgänglighetsparametern (П) från strömmättnadsförsök (6.1.4.8), i vilken den vertikala topp-till-topp-amplituden hos den centrala linjen av den första derivatan EPR spektrum mäts vid olika mikrovågseffekt. 25 Plot amplituden hos signalen som en funktion av kvadratroten av mikrovågseffekt och passform med följande ekvation 27.
        ekvation 1
        NOTERA: När A är amplituden av signalen, är ett mått på homogeniteten hos mättnad av resonanslinjen (som vanligtvis är mellan 0,5 och 1,5), I är en skalfaktor, P är infallande effekt, och representerar värde vid vilket förstaderivatan amplituden är hälften av dess omättade värde.
  3. Beräkna AP 1/2 värden i närvaro (o 2 eller Niedda) och frånvaro (perfuserades med N 2) av paramagnetiska avslappnande medel. Beräkna tillgängligheten parametern (П) med användning av ekvationen:
    ekvation 2
    OBS: Där P 1/2 referens och AH o referens är halv maximal effekt mättnadsvärdet och den centrala linjebredd, respektive, för referensstandard (såsom DPPH (2,2-difenyl-1-picrylhydrazyl)) 27.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Biokemisk karakterisering av Spin-märkt GLIC mutanter

Efter den ovan beskrivna protokollet typiskt skulle ge GLIC-MBP-fusionsprotein i intervallet av 10 - 12 mg / L av kulturen. Även detta värde kan variera mellan olika mutanter, särskilt för positioner begravda inom proteinet, kan utbytet avsevärt äventyras. I dessa fall kan de kulturvolymer kräver skala upp. Klyvningen av fusionskonstruktion av HRV3C proteas utföres O / N för bekvämlighet. Genom att köra proverna på SDS PAGE-gel, fann vi att denna klyvning är fullständig inom 30-60 min. (Figur 1A). Renad GLIC på size exclusion gelfiltreringskolonn eluerar huvudsakligen som en pentamer med en kvarhållande volym av 11,3 ml. MBP-fraktionen elueras vid 15 ml och ballastmaterial eluerar vid voidvolymen för kolonnen (~ 7,0 ml). Spin-märkningen kommer påslutet av elueringen (~ 24 ml) (Figur 1B)

FRET Based Assay för övervakning Aggregation av GLIC rekonstitueras i olika membranlipider

FRET-analys används för att utvärdera aggregation av GLIC pentamerer i rekonstituerade vesiklar (kom tillsammans inom ett avstånd <50 Å på membran). Figur 2 visar data från GLIC wt (med C27, märkta med antingen fluorescein eller tetrametylrodamin) och rekonstitueras i E .coli polära lipider, POPC: POPG (3: 1), POPE: POPG (3: 1) eller asolectin. Fluorescensmätningar visar att GLIC rekonstrueras asolectin visade ingen FRET och även frysa / tina provet (betingelser som är kända för att främja aggregering) gav minimal förändring i FRET nivåerna 43. Av denna anledning är asolectin lipidblandningen valt för funktionella och spektroskopiska mätningar som används i dessa studör.

Makroskopisk Beteende av GLIC i proteoliposomer

Funktionella egenskaper hos renat GLIC kännetecknas av patch-clamp mätning i ombildade proteoliposomer. Representativ makroskopisk aktuella inspelningen från wt GLIC från en inside-out patch som svar på en pH-hopp visas i figur 3 vid -100 mV hållpotential, byta till pH 3,0 buffert producerar snabbt aktiverande aktiv strömmar. (10-100 ms) som sönderfall till ca 10% av toppamplituden inom sekunder 43 (1 - 3 sek, figur 3). Strömmar återhämta sig från denna makroskopisk förfall eller hyposensibilisering genom att växla tillbaka till neutralt pH. Medan kanaler i inside-out patch var känsliga för förändringar i badet pH, fanns det ingen effekt av pH-förändring i pipetten lösning (data ej visade) vilket antyder att GLIC övervägande var orienterad i ett trängandeInsatser så att plåstret den extracellulära domänen inför bad / lösning värmeväxlare.

Strukturella omdisponeringar under kanalaktivering

Vid RT, kan spin-sonden anta multipla rotamer konformationer, och den spektrala linjeform är känslig inte bara för att rörelsen av spin-label sidokedjor i förhållande till peptidstommen, men också för att fluktuationer stam- och till globala protein rörelser. Därför kan förändringar i EPR lineshapes visa sig vara ett utmärkt diagnostiskt verktyg för att övervaka proteinkonformationsförändringar. Figur 4 visar spektra vid position L241 (17) R1 i den extracellulära hydrofoba regionen av por-foder M2 region (position markeras som svarta cirklar i figur 4, Inset) vid pH 7,0 och pH 3,0. Spektra visar skillnader inom de två villkor, både i signalens amplitud och omfattningen avmotional breddning. Som med funktionella mätningar 42, konformationsförändringarna som rapporterades av EPR signaler är också helt reversibla. Spektral breddning påverkas både av rörelsebegränsningar av sonden och dipolär koppling. För att bestämma bidraget från två, L241 (17) är sam-märkt med en diamagnetisk spin-etikett. De under märkt och fullt märkta spektra jämförs vid pH 7,0 och pH 3,0 (figur 4B). Omfattningen av dipolära breddning i detta läge minskar när kanalerna i märkta, vilket tyder på interaktion mellan spinnmärken mellan olika subenheter.

Figur 5 visar spektra för två positioner på M4 helix som ligger vid periferin av kanalen. AH o -1 mäts som inversen av den centrala linjebredden (visad i infälld). Som nitroxiden rotationsrörelse reduceras, vilket framgår under bildandettertiära eller kvartära kontakter, linjebredden ökar (och därmed AH o -1 minskar) för någon särskild rörelse geometri. Tvärtom är strukturella rörelser leder till en ökning av sondens rörelsefrihet återspeglas som en ökning av AH o -1. F312R1 är mer mobil medan R296R1 är orörlig, i överensstämmelse med deras exponerade och mycket begränsade miljöer, respektive.

Baserat på tillgänglighetsparametrar kan en spin-etikett vid en specifik position på proteinet klassificeras som något av följande: begravda inom proteinkärnan oåtkomlig för antingen vatten eller lipider på ytan exponeras för en vattenlösning, eller på ytexponerade till lipider (fig 5 och 6). Tillgänglighets parametrarna, som erhölls för en serie av på varandra följande platser kan sedan användas för att bestämma den sekundära strukturen på en region, sond områden av protein-proteinkontakt, mäta lutningen av ett protein i membranet, uppskatta nedsänkningsdjup av gräns slingor, och identifiera vatten hallar och lipid-bundna fickor inom trans spiraler. 26 Som ett exempel, power-mättnadskurvor i Figur 6 visar att F312R1 har en relativt högre P 1/2 för O 2, i jämförelse med R296R1, vilket tyder på sidokedjorna vid position F312 är lipid-exponerade. Dessutom är F312R1 också mer tillgängligt för Niedda i jämförelse med R296R1 överensstämmer med dess läge vid lipid-vattengränsytan. Å andra sidan, är L180R1 i slingan C-regionen av den extracellulära domänen mobil och tillgänglig för Niedda, i överensstämmelse med dess läge i en vattenexponerad slinga.

Sond dynamik och tillgänglighetsdata vid en given position tillhandahålla lokal strukturell information om den specifika position inom den totala protein gånger. Dessa parametrar bestäms för alinear sekvens av rester längs proteinet kan analyseras ytterligare med hjälp av analytiska metoder baserade på Fouriertransformen metoder. Dessa analyser är användbara för att utvärdera periodiska variationer i EPR miljöparametrar och att vägleda i att förutsäga och orientera sekundärstrukturer. För ett särskilt protein segment, en diskret Fourier-transform effektspektrum P (ω) beräknas som en funktion av vinkeln mellan intilliggande positioner (co) i det segmentet. Denna kurva används sedan för att bestämma den huvudsakliga vinkelfrekvenskomponenten av spektrumet och jämfört med de förväntade (co) värden för ett α-helix (80-120 °) eller p-strängar (150 - 180 °).
ekvation 3
P där P (ω) är Fouriertransformen effektspektrumet som funktion av vinkelfrekvens ω, n är antalet rester i segmentet, är miljöparameter vid positionen. ("ω") får utvärderas för värdet ω = ekvation 6 som maximerar P ( 'ω').

Vidare kan en periodicitet indexparameter (ger betydelsen av den förutsagda sekundära strukturen) beräknas som ett förhållande mellan arean under effektspektrumet för den vinkel som representerar en given strukturelement med den för den totala arean av spektrumet. Ett glidande fönster-metoden används sedan för att identifiera början och slutet av en given sekundär strukturelement. Den relativa orienteringen detta segment med avseende på resten av proteinet kan inte beräknas från riktningen för P ( "ω") ögonblicket.

För α-helix:

ekvation 4

ekvation 5

Dessa metoder har med framgång tillämpas på ett flertal system för att bestämma tredimensionella topologier och förutsäga konformationsförändringar underliggande proteinfunktion 14,23,24,41,44-53.

Bestämning Avstånd Distribution från EPR

Inter-subenheten nitroxid avstånd kan bestämmas från elektronelektron dipolära interaktioner. I CW-EPR, såsom visas i fig 4, genom-space dipolära interaktioner leder till spektral breddning och är en funktion av närhet mellan etiketterna. För avstånd upp till ~ 15-20 Å, omfattningen av bredda (jämfört mellan fullt märkt spektra och under märkt spektra) kan användas för att semi-kvantitativt uppskatta avstånd med hjälp avFourier avfaltning metoder. 28,29

Inter-subenhet avstånd (<50 A) kan mätas med hjälp av dubbel Electron-Electron Resonance (hjort) metoder. 30-34 HJORT uppgifter samlas in i tvättmedelsprov eller rekonstruerad i nanodiscs på grund av de begränsningar som är förknippade med dessa mätningar i liposomer 54. För spin-märkta prover i tvättmedel (~ 100 | iM) i buffert A med 0,5 mM DDM är 30% (vikt / volym) glycerol används för kryoskydd. De Evolution Data dipolär tid erhålls vid 83 K med en vanlig HJORT fyra pulsprotokoll (π / 2) MW1-τ1- (π) MW1-τ1- (π) MW2-τ2- (π) MW1-τ2-eko 55 på en pulsad EPR spektrometer som arbetar vid Q-bandsfrekvensen (33,9 GHz). Pulslängder för (π / 2) MW1 och (π) MW1 är 10 och 20 ns, respektive, och 40 ns för (π) MW2. HJORT signaler sedan bakgrundskorrigerade antar en 3D homogen background och analyseras av Tikhonov regularisering 31,56 för att fastställa de genomsnittliga avstånd och fördelningar i avstånd.

Intramolekylära avstånd för en representativ position i M4 (F314R1) bestäms av rådjur experiment vid pH 7,0 visas i figur 7 Eftersom det finns fem spin-etiketter inom GLIC pentameren, är åtminstone två avstånd väntat. en som motsvarar de intilliggande subenheter och den andra från icke närliggande subenheter, även om ytterligare toppar kan uppstå från alternerande rotamer spinnorienteringar. Rådjur signalen avklingar och motsvarande sannolikhetsfördelningarna visas. Den första kortväga topp (~ 42A) representerar avstånden mellan intilliggande underenheter, och den andra toppen (~ 53A) motsvarar den icke-intilliggande avstånd. Toppen för diagonalen avståndet verkar vara på kortare avstånd, och det är sannolikt att underskattas, eftersom tillförlitliga mätningar bortom 60 Åär inte möjligt under de experimentella betingelser på grund av tekniska problem med bakgrundskorrigering.

Figur 1
Figur 1. Biokemisk karakterisering Spin-märkt GLIC mutanter. (A) representant gelfiltreringskromatogram spin-märkt-GLIC efter proteolytisk klyvning av MBP tag. Topparna motsvarar GLIC pentamer och fri MBP. (B) SDS-PAGE visar uncut mono GLIC-MBP-fusionsprotein (före gelfiltrering) och MBP och GLIC fraktioner slås samman från gelfiltrering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2. FR ET-baserad analys för uppföljning av aggregationstillstånd av GLIC rekonstrueras olika membranlipider. FRET mätningar visas för prover efter O / N beredning (till vänster) och efter frysning / upptining proverna (höger). (Modifierad från den ursprungliga bilden). 43 klicka god här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3. Makroskopisk Beteende av GLIC i proteoliposomer. I en inside-out patch ut från rekonstituerat asolectin blåsor är GLIC aktiveras av pH hopp med hjälp av en snabb lösning värmeväxlare. Kanalerna ses att aktivera i ~ 10 ms och okänsliga med en tidskonstant på 1-3 sek. (Modifierad från den ursprungliga bilden). 43ig3large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 4
Figur 4. Struktur omflyttningar under kanalaktivering. (A) representant CW-EPR-spektra för en position i poren foder M2 helix, visar förändringar i amplitud och linjeformer som svar på pH-ändringar. I varje fall, de spektra är normaliserad till det totala antalet snurrar. Spinnmärkta positionen visas som en svart cirkel. Endast två subenheter är visade för tydlighets skull. (B) EPRspectra visar dipolära breddning av spin-spin interaktioner. Spektra i streckade var från under-märkta kanaler (i närvaro av diamagnetiska etiketter) och i fast-linje var från fullt märkta kanaler. Den infällda bilden visar en överlagring av amplitud-normaliserade spektra. Bredda under fullständigt märkta förhållanden är högupplyst av pilar. Scan bredd är 150 G. (Ändrad från den ursprungliga bilden). 36 Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 5
Figur 5. rest Specifik miljö parametrar som mäts av ström mättnad. Mätningar av spektral bredd (AH 0) och lösningsmedel tillgänglighet (P 1/2) för två kontrasterande positioner i M4 helix av transmembrandomänen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 6
Figur 6. miljö en representant Loop C Rester i den extracellulära domänen GLIC. Spin-normaliserade CW-spektra och motsvarande tillgänglighetsmätningar för L180R1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 7
Figur 7. avståndsmätningar av pulsad-EPR Approaches (hjort). GLIC struktur som visar placeringen av Phe314 och motsvarande Cp-Cp avstånden för angränsande och icke-angränsande subenheter. CW-spektra för denna position visas till höger. Bakgrund subtraheras DEER- ekointensitet plottas mot evolutions tid och montera med hjälp av modell-fri Tikhonov regularisering för prover i tvättmedel. Motsvarande inter spin avstånd fördelning (till höger).pload / 54.127 / 54127fig7large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

EPR-spektroskopi har visat sig vara en enastående strukturell strategi i kvantifiera konformationsändringar i membranproteiner i en nästan infödda miljö. Detta tillvägagångssätt ger oss en inblick i de molekylära detaljerna av protein dynamik som skyms i högupplösta strukturer från röntgenkristallografi och Cryo-elektronmikroskopi. Det är dock viktigt att beakta de tekniska begränsningar av denna metod som kan påverka den allmänna tillämpligheten till andra system och även att tänka på de potentiella experimentella hinder på vägen. Vi diskuterar några av dessa aspekter nedan tillsammans med rekommenderade strategier för felsökning.

Bland de mer vanliga problem som man stöter på med en teknik som innebär omfattande mutations störningar är det låga utbytet och dålig oligomera stabiliteten hos proteinet. Denna aspekt förvärras ytterligare när man arbetar med komplexa multimembranproteiner såsom jonkanaler. Det är therefore avgörande för att optimera dessa två biokemiska aspekter innan man börjar på en utbredd mutagenes. Vi fann att uttrycket av toxiska GLIC mutanter bättre tolereras i C41 och C43 stammar av BL21-celler 3,36 Vidare sänker efter induktion temperaturen till 15 -. 18 ºC, minskar IPTG koncentrationen till 100 iM, och med 5% glycerol under induktion verkar hjälpa till med att sänka protein aggregation förmodligen genom att fördröja hastigheten av proteinuttryck och minska omfattningen av misfolding. Cystein mutationer vid vissa positioner (särskilt i trängnings vägen) har visat sig öka den konstitutiva aktiviteten hos kanalen och dessa mutanter kommer sannolikt att innebära större hinder i uttryck. Användning av tvåvärda pore blockerare (10-25 mM Ba 2+) under induktion minskar toxicitet och förbättrar celltillväxt 57 Dessa strategier har visat sig vara effektiva i många fall till att öka avkastningen, sänka protein aggregation och öka oligo.meric stabilitet. 36,58

En annan kritisk steg i SDSL är effektiviteten i märkningsprocessen. Medan ytexponerade cysteiner bör utgöra något problem i MTSL reaktivitet (> 90% märkning avkastning), får positioner där cystein sidokedjor är begravda och otillgängliga kräva högre spin-label koncentrationer och längre inkubationstider. Ökning av spinnmärket koncentration till 30-faldigt molärt överskott och inkubation O / N vid 4 ° C hjälper till med att förbättra effektiviteten märkning. Dessutom är det också viktigt att mäta spektra av den märkta Cys-mindre mall för att bestämma bakgrundstillskott. För webbplatser som är dåligt märkta (<10%), överväldigar bakgrundssignalen den totala spektra. Medan bestämma effektiviteten spin-märkning, notera att noggrannheten påverkas av ett antal faktorer som inkluderar provvolym, prov kapillär diameter, positionering av kapillär inuti resonatorn, hålighet temperatur, och resonator Qvärde (vilket är förhållandet mellan den energi som lagras i den över energi avleds ut). Försiktighet måste vidtas för att upprätthålla dessa villkor är identiska mellan prov och standard. Vidare bör det noteras att för orörliga webbplatser, där spektra i sig är breda, droppar mätnoggrannheten märkningen ytterligare. Alternativt kan vätskekromatografi Time of Flight-elektrosprayjonisering masspektrometri (LCT-ESI-MS) användas för att direkt bestämma molekylmassan och därmed märkningseffektivitet. Emellertid är MS känslighet äventyras för prover i tvättmedel och för tätt vikta membranproteiner.

När mutanterna renas som en homogen population, är det viktigt att förvissa sig om funktionaliteten hos preparatet. Patch-clamp mätningar av spin-märkta mutanter i nyckelregioner i kanalen kommer att avslöja effekten av störning på ligandaffinitet och kanal gating. Alternativt kan kanalegenskaper studeras i svart LIPID Membran (BLM) 59 eller genom att injicera proteoliposomer i oocyter och mäta strömmar från två-elektrodspänning klämma. 59-61 Om det visar sig att den cystein substitution och spin-label vid vissa positioner förändrar ligand-känslighet eller grind kinetik kanaler, experimentella betingelser (ligandkoncentration, modulatorer, lipider komposition) kan varieras på lämpligt sätt för att stabilisera konformationstillstånd under utredning. Vidare skall det noteras att EPR-mätningar görs under steady-state förhållanden och därför förändringar i snabb kinetik av kanalen är mindre benägna att påverka den strukturella tolkningen.

Uppenbarligen är en stor fördel med denna teknik möjligheten att studera kanal dynamik i membran med definierad sammansättning och direkt sond hur lipid-medierad effekter på dynamik ändrar kanalfunktion. Emellertid är en begränsning att vissa lipidkompositioner kan orsaka lateral aggregation av kanalerna on membranet och därmed lämpligheten av lipider måste fastställas. 45 För förhållanden som ger upphov till aggregering, sänkning protein-till-lipid, som utför beredning vid lägre temperatur, och förkorta varaktigheten av beredning tid kan bidra till att upprätthålla kanalerna monodispers 62 Alternativt kan kanalerna rekonstitueras i nanodiscs, som är nanoskala lipida aggregat omgivna av en ring av amfipatisk membran scaffold protein (apolipoprotein A1). 63 genom att optimera det molära förhållandet av kanalproteinet, lipidbeståndsdelar, och membran byggnadsställningar protein, det är möjligt att uppnå en homogen och mono-dispers population av enkanaliga enheter införlivade i enskilda nanodiscs. Detta system har flera ytterligare fördelar i det att de nanodiscs är optiskt klara och ger enkel tillgång till både intracellulära och extracellulära sidorna av membranet.

Slutligen, på nivånav EPR mätningar kan man ställas inför CW-EPR-spektra som inte är lätt att tolka, särskilt för positioner visar fler spektra. Sådan konforma heterogenitet kan uppkomma från långsamt utbyta konformationer av proteinet och / eller multipla orienteringar av spinnmärket i ett givet protein konformation. Bestämning av den relativa bidraget från de två scenarierna är inte trivial och kan kräva användning av alternativa spin-label-derivat, eller ändra experimentell temperatur, 64 tryck, 65 fältstyrka / mikrovågsugn frekvens, 66 eller genom osmolyt störning. 67

Dessutom kan HJORT mätningar i liposomer begränsas av ett antal faktorer, bland annat lägre känslighet, högre bakgrund bidrag till följd av förbättrade intermolekylära interaktioner, och en minskning av mätbara avstånd intervallet (<50 Å). I allmänhet, för längre avstånd (<50 Å), finns det en storER osäkerheten i bredderna hos fördelningsavstånd på grund av otillräckliga dipolära evolution gånger. Emellertid har användningen av Q-bandet (34 GHz) mikrovågsfrekvens och märkning med ett bifunktionelit spinnetikett (med reducerade inneboende dynamik) visat sig lindra en del av dessa begränsningar. 54 rekonstitution i nanodiscs har även visat sig oerhört förbättra HJORTAR känslighet genom minskar bakgrunds bidrag som uppstår från intermolekylära dipolära interaktioner. 15

Trots dessa begränsningar, SDSL / EPR studier, särskilt i system med några infödda cysteiner, har visat sig vara anmärkningsvärt informativ. Framtida tekniska framsteg är inriktat mot att anpassa denna kraftfull metod för att studera mer komplexa mänskliga kanaler, där mutera infödda cysteiner inte är genomförbar. I detta avseende utveckling av alternativa märknings strategier såsom de som baseras på platsspecifik inkorporering av onaturliga aminosyror, 68 eller synthesis av etiketter som är riktade mot andra aminosyror, 69 verkar mycket lovande.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Vi är mycket tacksamma för nuvarande och tidigare medlemmar i Chakrapani lab för kritisk läsning och synpunkter på manuskriptet. Detta arbete stöddes av National Institutes of Health bidrag (1R01GM108921) och American Heart Association (NCRP Scientist Development Grant 12SDG12070069) och SC.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Site-Directed Mutagenesis and Cys mutations
10x PfuUltra HF reaction buffer Agilent Technologies 600380-52
dNTPS New England BioLabs Inc‎ N0447L 10 mM each dNTP
pfu Ultra DNA polymerase Agilent Technologies 600380-51 2.5 U/ul
DPNI New England BioLabs Inc‎ R0176S 20,000 U/ml
XL10 GOLD Agilent Technologies 200314
SOC media New England BioLabs Inc‎ B9020S
Kanamycin Fisher Scientfic BP905
LB media Invitrogen 127957084
Miniprep kit QIAGEN 27106
C43 competent cells Lucigen 60446
Expression and Purification
Glucose Fisher Scientfic D16
Tryptone Fisher Bioreagents BP1421-500
Yeast extract Amresco J850
Glycerol Fisher Bioreagents BP229
K2HPO4 Amresco 0705
K2HPO4 Amresco 0781
IPTG (isopropyl-thio-β-galactoside) Gold Biotechnology I2481C25
Trizma Base Sigma Life Science T1503
NaCl Sigma-Aldrich S7653
DNase I Sigma Life Science DN25
PMSF Amresco M145
Leupeptine Amresco J580
Pepstatin Amresco J583
DDM (n-Docecyl-β-D-Maltopyranoside) Anatrace D310S
Amylose resin New England BioLabs Inc‎ E8021L
TCEP Amresco K831
EDTA Fisher Scientfic BP118
Maltose Acros Organics 329915000
Superdex 200 GL GE Healthcare 17-5175-01
Empty polypropylene Chromatography column BioRad 731-1550
Site-Directed Spin Labeling
MTSL (1-oxyl-2,2,5,5-tetramethyl-3-pyrroline-3-methyl) Methanethiosulfonate Toronto Reaserch chemicals Inc O873900
(1-acetoxy-2,2,5,5-tetramethyl-Δ3-pyrroline-3-methyl) methanethiosulfonate Toronto Reaserch chemicals Inc A167900
DMSO J.T. Baker 9224-01
Reconstitution
Asolectin lipid Avanti polar lipids Inc 541602C
Biobeads (Polystyrine beads) Bio Rad 152-3920
Methanol Fisher chemicals A413
FRET
Fluorescein-maleimide ThermoFisher Scientific F-150
Tetramethylrhodamine-maleimide ThermoFisher Scientific T-6027
POPC Avanti polar lipids Inc 850457C
POPG Avanti polar lipids Inc 840457C
E.coli polar lipid extract Avanti polar lipids Inc 100600C
HEPES Sigma Life Science H3375
EPR measurement
TPX plastic capillaries Bruker ER221
EDDA (Ethylenediamine-N, N'-diacetic acid) Aldrich 158186
Ni(OH)2 Aldrich 283622

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tasneem, A., Iyer, L. M., Jakobsson, E., Aravind, L. Identification of the prokaryotic ligand-gated ion channels and their implications for the mechanisms and origins of animal Cys-loop ion channels. Genome Biol. 6, 4 (2005).
  2. Hilf, R. J., Dutzler, R. X-ray structure of a prokaryotic pentameric ligand-gated ion channel. Nature. 452, (7185), 375-379 (2008).
  3. Bocquet, N., et al. X-ray structure of a pentameric ligand-gated ion channel in an apparently open conformation. Nature. 457, (7225), 111-114 (2009).
  4. Hibbs, R. E., Gouaux, E. Principles of activation and permeation in an anion-selective Cys-loop receptor. Nature. 474, (7349), 54-60 (2011).
  5. Miller, P. S., Aricescu, A. R. Crystal structure of a human GABAA receptor. Nature. 512, (7514), 270-275 (2014).
  6. Hassaine, G., et al. X-ray structure of the mouse serotonin 5-HT3 receptor. Nature. 512, (7514), 276-281 (2014).
  7. Du, J., Lu, W., Wu, S., Cheng, Y., Gouaux, E. Glycine receptor mechanism elucidated by electron cryo-microscopy. Nature. (2015).
  8. Sunshine, C., McNamee, M. G. Lipid modulation of nicotinic acetylcholine receptor function: the role of neutral and negatively charged lipids. Biochim Biophys Acta. 1108, 240-246 (1992).
  9. Fong, T. M., McNamee, M. G. Correlation between acetylcholine receptor function and structural properties of membranes. Biochemistry. 25, (4), 830-840 (1986).
  10. daCosta, C. J., Baenziger, J. E. A lipid-dependent uncoupled conformation of the acetylcholine receptor. J Biol Chem. 284, (26), 17819-17825 (2009).
  11. Criado, M., Eibl, H., Barrantes, F. J. Functional properties of the acetylcholine receptor incorporated in model lipid membranes. Differential effects of chain length and head group of phospholipids on receptor affinity states and receptor-mediated ion translocation. J Biol Chem. 259, (14), 9188-9198 (1984).
  12. Hubbell, W. L., Lopez, C. J., Altenbach, C., Yang, Z. Technological advances in site-directed spin labeling of proteins. Curr Opin Struct Biol. 23, (5), 725-733 (2013).
  13. Columbus, L., Hubbell, W. L. A new spin on protein dynamics. Trends Biochem Sci. 27, (6), 288-295 (2002).
  14. Hubbell, W. L., Cafiso, D. S., Altenbach, C. Identifying conformational changes with site-directed spin labeling. Nat Struct Biol. 7, (9), 735-739 (2000).
  15. McHaourab, H. S., Steed, P. R., Kazmier, K. Toward the fourth dimension of membrane protein structure: insight into dynamics from spin-labeling EPR spectroscopy. Structure. 19, (11), 1549-1561 (2011).
  16. Bordignon, E. Site-directed spin labeling of membrane proteins. Top Curr Chem. 321, 121-157 (2012).
  17. Klare, J. P., Steinhoff, H. J. Spin labeling EPR. Photosynth Res. 102, (2-3), 377-390 (2009).
  18. Drescher, M. EPR in protein science : intrinsically disordered proteins. Top Curr Chem. 321, 91-119 (2012).
  19. Perozo, E., Cuello, L. G., Cortes, D. M., Liu, Y. S., Sompornpisut, P. EPR approaches to ion channel structure and function. Novartis Found Symp. 245, 146-158 (2002).
  20. Fanucci, G. E., Cafiso, D. S. Recent advances and applications of site-directed spin labeling. Curr Opin Struct Biol. 16, (5), 644-653 (2006).
  21. Sahu, I. D., McCarrick, R. M., Lorigan, G. A. Use of electron paramagnetic resonance to solve biochemical problems. Biochemistry. 52, (35), 5967-5984 (2013).
  22. Hubbell, W. L., McHaourab, H. S., Altenbach, C., Lietzow, M. A. Watching proteins move using site-directed spin labeling. Structure. 4, (7), 779-783 (1996).
  23. Altenbach, C., Marti, T., Khorana, H. G., Hubbell, W. L. Transmembrane protein structure: spin labeling of bacteriorhodopsin mutants. Science. 248, (4959), 1088-1092 (1990).
  24. McHaourab, H. S., Lietzow, M. A., Hideg, K., Hubbell, W. L. Motion of spin-labeled side chains in T4 lysozyme. Correlation with protein structure and dynamics. Biochemistry. 35, (24), 7692-7704 (1996).
  25. Farahbakhsh, Z. T., Altenbach, C., Hubbell, W. L. Spin labeled cysteines as sensors for protein-lipid interaction and conformation in rhodopsin. Photochem Photobiol. 56, (6), 1019-1033 (1992).
  26. Altenbach, C., Greenhalgh, D. A., Khorana, H. G., Hubbell, W. L. A collision gradient method to determine the immersion depth of nitroxides in lipid bilayers: application to spin-labeled mutants of bacteriorhodopsin. Proc Natl Acad Sci U S A. 91, (5), 1667-1671 (1994).
  27. Altenbach, C., Froncisz, W., Hemker, R., McHaourab, H., Hubbell, W. L. Accessibility of nitroxide side chains: absolute Heisenberg exchange rates from power saturation EPR. Biophys J. 89, (3), 2103-2112 (2005).
  28. Rabenstein, M. D., Shin, Y. K. Determination of the distance between two spin labels attached to a macromolecule. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, (18), 8239-8243 (1995).
  29. Altenbach, C., Oh, K. J., Trabanino, R. J., Hideg, K., Hubbell, W. L. Estimation of inter-residue distances in spin labeled proteins at physiological temperatures: experimental strategies and practical limitations. Biochemistry. 40, (51), 15471-15482 (2001).
  30. Borbat, P. P., McHaourab, H. S., Freed, J. H. Protein structure determination using long-distance constraints from double-quantum coherence ESR: study of T4 lysozyme. J Am Chem Soc. 124, (19), 5304-5314 (2002).
  31. Chiang, Y. W., Borbat, P. P., Freed, J. H. The determination of pair distance distributions by pulsed ESR using Tikhonov regularization. J Magn Reson. 172, (2), 279-295 (2005).
  32. Jeschke, G. DEER distance measurements on proteins. Annu Rev Phys Chem. 63, 419-446 (2012).
  33. Jeschke, G., Polyhach, Y. Distance measurements on spin-labelled biomacromolecules by pulsed electron paramagnetic resonance. Phys Chem Chem Phys. 9, (16), 1895-1910 (2007).
  34. Jeschke, G., Wegener, C., Nietschke, M., Jung, H., Steinhoff, H. J. Interresidual distance determination by four-pulse double electron-electron resonance in an integral membrane protein: the Na+/proline transporter PutP of Escherichia coli. Biophys J. 86, (4), 2551-2557 (2004).
  35. Hilf, R. J., Dutzler, R. Structure of a potentially open state of a proton-activated pentameric ligand-gated ion channel. Nature. 457, (7225), 115-118 (2009).
  36. Velisetty, P., Chalamalasetti, S. V., Chakrapani, S. Conformational transitions underlying pore opening and desensitization in membrane-embedded Gloeobacter violaceus ligand-gated ion channel (GLIC). J Biol Chem. 287, (44), 36864-36872 (2012).
  37. Birnboim, H. C., Doly, J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 7, (6), 1513-1523 (1979).
  38. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A. 74, (12), 5463-5467 (1977).
  39. Sanger, F., Coulson, A. R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. J Mol Biol. 94, (3), 441-448 (1975).
  40. McHaourab, H. S., Kalai, T., Hideg, K., Hubbell, W. L. Motion of spin-labeled side chains in T4 lysozyme: effect of side chain structure. Biochemistry. 38, (10), 2947-2955 (1999).
  41. Gross, A., Columbus, L., Hideg, K., Altenbach, C., Hubbell, W. L. Structure of the KcsA potassium channel from Streptomyces lividans: a site-directed spin labeling study of the second transmembrane segment. Biochemistry. 38, (32), 10324-10335 (1999).
  42. Velisetty, P., Chakrapani, S. Desensitization mechanism in a Prokaryotic ligand-gated ion channel. J Biol Chem. 287, (22), (2012).
  43. Velisetty, P., Chakrapani, S. Desensitization mechanism in prokaryotic ligand-gated ion channel. J Biol Chem. 287, (22), 18467-18477 (2012).
  44. Chakrapani, S., Cuello, L. G., Cortes, D. M., Perozo, E. Structural dynamics of an isolated voltage-sensor domain in a lipid bilayer. Structure. 16, (3), 398-409 (2008).
  45. Cuello, L. G., Cortes, D. M., Perozo, E. Structural dynamics of the KvAP pore domain lacking the voltage sensing domain. Biophysical Journal. 88, (1), 19-20 (2005).
  46. Perozo, E., Cortes, D. M., Cuello, L. G. Structural rearrangements underlying K+-channel activation gating. Science. 285, (5424), 73-78 (1999).
  47. Chakrapani, S., Sompornpisut, P., Intharathep, P., Roux, B., Perozo, E. The activated state of a sodium channel voltage sensor in a membrane environment. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, (12), 5435-5440 (2010).
  48. Vasquez, V., Sotomayor, M., Cordero-Morales, J., Schulten, K., Perozo, E. A structural mechanism for MscS gating in lipid bilayers. Science. 321, (5893), 1210-1214 (2008).
  49. Perozo, E., Cortes, D. M., Sompornpisut, P., Kloda, A., Martinac, B. Open channel structure of MscL and the gating mechanism of mechanosensitive channels. Nature. 418, (6901), 942-948 (2002).
  50. Kim, M., Xu, Q., Murray, D., Cafiso, D. S. Solutes alter the conformation of the ligand binding loops in outer membrane transporters. Biochemistry. 47, (2), 670-679 (2008).
  51. Kazmier, K., Sharma, S., Islam, S. M., Roux, B., McHaourab, H. S. Conformational cycle and ion-coupling mechanism of the Na+/hydantoin transporter Mhp1. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, (41), 14752-14757 (2014).
  52. Durr, K. L., et al. Structure and dynamics of AMPA receptor GluA2 in resting, pre-open, and desensitized states. Cell. 158, (4), 778-792 (2014).
  53. Borbat, P. P., et al. Conformational motion of the ABC transporter MsbA induced by ATP hydrolysis. PLoS Biol. 5, (10), e271 (2007).
  54. Zou, P., McHaourab, H. S. Increased sensitivity and extended range of distance measurements in spin-labeled membrane proteins: Q-band double electron-electron resonance and nanoscale bilayers. Biophys J. 98, (6), 18-20 (2010).
  55. Pannier, M., Veit, S., Godt, A., Jeschke, G., Spiess, H. W. Dead-time free measurement of dipole-dipole interactions between electron spins. J Magn Reson. 142, (2), 331-340 (2000).
  56. Jeschke, G., et al. DeerAnalysis2006-a comprehensive software package for analyzing pulsed ELDOR data. Applied Magnetic Resonance. 30, (3-4), 473-498 (2006).
  57. Ruta, V., Jiang, Y., Lee, A., Chen, J., MacKinnon, R. Functional analysis of an archaebacterial voltage-dependent K+ channel. Nature. 422, (6928), 180-185 (2003).
  58. Velisetty, P., Chalamalasetti, S. V., Chakrapani, S. Structural basis for allosteric coupling at the membrane-protein interface in Gloeobacter violaceus ligand-gated ion channel (GLIC). J Biol Chem. 289, (5), 3013-3025 (2014).
  59. Dellisanti, C. D., et al. Site-directed spin labeling reveals pentameric ligand-gated ion channel gating motions. PLoS Biol. 11, (11), e1001714 (2013).
  60. Labriola, J. M., et al. Structural sensitivity of a prokaryotic pentameric ligand-gated ion channel to its membrane environment. J Biol Chem. 288, (16), 11294-11303 (2013).
  61. Kinde, M. N., et al. Conformational Changes Underlying Desensitization of the Pentameric Ligand-Gated Ion Channel ELIC. Structure. 23, (6), 995-1004 (2015).
  62. Vasquez, V., Cortes, D. M., Furukawa, H., Perozo, E. An optimized purification and reconstitution method for the MscS channel: strategies for spectroscopical analysis. Biochemistry. 46, (23), 6766-6773 (2007).
  63. Bayburt, T. H., Sligar, S. G. Membrane protein assembly into Nanodiscs. FEBS Lett. 584, (9), 1721-1727 (2010).
  64. Hanson, S. M., Francis, D. J., Vishnivetskiy, S. A., Klug, C. S., Gurevich, V. V. Visual arrestin binding to microtubules involves a distinct conformational change. J Biol Chem. 281, (14), 9765-9772 (2006).
  65. McCoy, J., Hubbell, W. L. High-pressure EPR reveals conformational equilibria and volumetric properties of spin-labeled proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, (4), 1331-1336 (2011).
  66. Mobius, K., et al. Combining high-field EPR with site-directed spin labeling reveals unique information on proteins in action. Magn Reson Chem. 43, Spec no. 4-19 (2005).
  67. Lopez, C. J., Oga, S., Hubbell, W. L. Mapping Molecular Flexibility of Proteins with Site-Directed Spin Labeling: A Case Study of Myoglobin. Biochemistry. 51, (33), 6568-6583 (2012).
  68. Fleissner, M. R., et al. Site-directed spin labeling of a genetically encoded unnatural amino acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, (51), 21637-21642 (2009).
  69. Lorenzi, M., et al. Tyrosine-targeted spin labeling and EPR spectroscopy: an alternative strategy for studying structural transitions in proteins. Angew Chem Int Ed Engl. 50, (39), 9108-9111 (2011).
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Basak, S., Chatterjee, S., Chakrapani, S. Site Directed Spin Labeling and EPR Spectroscopic Studies of Pentameric Ligand-Gated Ion Channels. J. Vis. Exp. (113), e54127, doi:10.3791/54127 (2016).More

Basak, S., Chatterjee, S., Chakrapani, S. Site Directed Spin Labeling and EPR Spectroscopic Studies of Pentameric Ligand-Gated Ion Channels. J. Vis. Exp. (113), e54127, doi:10.3791/54127 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter