Summary
이 프로토콜은 시약 정제 반응 조건 bioconjugate 정화 및 bioconjugate 특성화를 포함하여 말레이 미드로 단백질을 함유하는 시스테인의 바이오 콘쥬 게이션에 필요한 중요한 단계를 자세히.
Introduction
바이오 콘쥬 게이션는 공유와 같은 염료, 약물 또는 고분자로 합성 분자 다른 또는 하나의 생체 분자를 연결하는 것을 포함한다. 단백질 바이오 콘쥬 게이션 방법은 현재 광범위하게 단백질로 만드는 형광 염료 라벨 1, 2에 이르기까지 응용 프로그램과 많은 화학, 생물학 및 나노 기술 연구 그룹에 사용된다 (항체) 3 (항체 약물 접합체 - ADC)는 -prodrugs 단백질 이량 체 4,5의 합성을 , 나노 의학 (8) 및 시스템 화학 (9)에 사용되는 자기 조립 단백질 폴리머 하이브리드 6,7에 이르기까지.
화학 반응의 특이성은 항상 중요하지 동안 표적 단백질의 활성 부위를 방해하지 않도록, 가장 기능적 단백질 bioconjugates위한 가장 중요하다 바이오 콘쥬 게이션을 위해 사용된다. 관심의 단백질에 ⅰ) 대상으로 드문 또는 고유 사이트 : 이상적인 바이오 콘쥬 게이션 반응은 다음과 같은 몇 가지 기준을 충족해야합니다ⅱ) ⅲ) 전개 단백질을 방지하기 위해 비 변성 조건에서 진행이 대상으로 선택하고 표적 단백질은 일반적으로 서브 밀리몰 농도에서만 사용할 수 있습니다로 ⅳ) 높은 산출을합니다. 말레이 미드 - 시스테인 마이클 부가이 모든 기준을 충족에 근접하고, 그 이유는 긴 bioconjugate 화학 (10)의 분야에서 특별한 지위를 주장하기위한 있습니다. ⅰ) 그 표면에 단 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 다수의 단백질이 유전자 정확한 pH에서 반응 시스테인 향해 높은 선택성 II)가 설계 될 수 있기 때문에, Ⅲ)는 수성 완충액 원활하게 진행하고, ⅳ) 매우 빨리이다 일부 경우 11 M 5000 -1 초 -1 초과보고 시스테인 - 함유 단백질 말레이 미드의 2 차 속도 상수. (12) 관심의 단백질이 유기의 작은 (≈ 5 ~ 10 %) 금액 견딜 수 제공 공동 용매, 거의 모든 말레이 미드 기능화 된 염료, 포lymer은 표면 또는 다른 단백질을 단백질에 결합 될 수있다. 또한, 말레이 미드는 높은 pH에서 다른 친핵체와 반응하는 경향이다 요오도 아세트 아미드,보다 단백질에 시스테인에 대한보다 구체적인이다; 및 이황화 교환 (13)을 방지하기 위해 산성 pH를 유지해야 이황화 활용형보다 안정적.
여기에서 우리는의 Ru (II) 기반 발색단 및 예로서, 산화 환원 단백질의 사이토 크롬 C의 반응을 사용하여 단일 시스테인 잔기를 함유하는 단백질의 말레이 미드 - 작용 분자의 결합을위한 일반적인 프로토콜을보고한다. 이 프로토콜은 접근 가능한 표면 시스테인 잔기 및 대응 말레이 미드 기능화 대상을 포함한 대부분의 다른 단백질에 동일하게 적용 가능하고, 그것을 또 다른 단백질, 형광 염료, 발색단 또는 합성 중합체 일 수.
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Protocol
참고도 1에 나타낸 바와 같이 다음과 같은 프로토콜은 단백질 염색 bioconjugate의 합성 설계 메모를 삽입하여 막 단백질을 지원하기 위해 해당되는 그것이 자유 표면 시스테인 함유 단백질과 말레이 미드의 반응을위한 일반적인 프로토콜이다. bioconjugates 단백질 폴리머 bioconjugates, 합성 단백질 이량 체 (단백질 - 단백질) bioconjugates. 특히이 경우, 단백질 이소 한 시토크롬 C는 매우 구체적인 표시가 발생할 수있게 반응 할 수 일면 시스테인 잔기를 갖는다. 목적 단백질 다중 시스테인 잔기를 갖는 경우, 동일한 프로토콜이 특이 제품의 균질성의 손실이라도 적용된다. 특이성이 요구되지 않는 경우, N -hydroxysuccinimidyl 에스테르 또는 이소 티오 시아 네이트를 사용하여 화학 타겟팅 표면 리신 잔기는 단순한 방식 일 수있다.
시토크롬 C 1. 정제
참고 :이 단계는 모든 단백질에 적용 할 수 없습니다. 그러나, 상업적 공급 업체로부터 얻은 단백질을 추가로 정제 (13)에 의해 제거 할 수있는 다른 원하지 않는 단백질 이소 형을 포함 할 수 있다는 것을 아는 것이 중요하다.
- PR에 초순수에 1 L (= 120g 몰 -1 승 M) 인산이 수소 나트륨 2.4 g을 녹이고20 밀리미터에 NaH 2 PO 4를 함유하는 완충액을 epare. pH 7로 1 M NaOH로 pH를 조정합니다.
주 :이 프로토콜에서 사용하는 인산 버퍼 매일 신선하게 제조하고, 사용 전에 0.2 ㎛의 셀룰로오스 멤브레인 필터를 통해 여과한다. - 20 밀리미터에 NaH 2 PO 4, 1 M의 NaCl 완충액을 염화나트륨 29.22 g (w M = 58.44 g 몰 -1)하는 20 mM의 NaH 2 PO 4 완충액 500ml에 녹인다. 이 단계 1.6)의 정제에 대해 용출 버퍼이다.
- pH가 7하는 20 mM 인산 완충액 6 ml의 동결 건조 시토크롬 C (CYT의 C) 12.0 mg을 녹이고.
- 별도로 1 M 스톡 용액을 제조 초순수 95.3 μL 디티 오 트레이 톨에 14.7 mg의 (DTT, w M = 154.25 g / 몰)을 녹인다.
주 :이 시약 수용액 산화 비활성화되기 쉽다 같이 DTT 원액이 새로 제조한다. - 씨단백질 용액에 1 M DTT 용액 60 ㎕를두기가이 CYT의 C를 줄일 수 있습니다. 용액의 색이 혼합에 밝은 빨간색 진한 빨간색으로 변경됩니다.
- 모든 크로마토 그래피 매체 상으로 주입하기 전에 0.22 ㎛의 저 단백질 결합 주사기 PVDF 필터를 통해 감소 된 단백질 용액을 필터.
- 주입 루프와 고속 단백질 액체 크로마토 그래피 (FPLC) 악기의 UV-마주 검출기 사이에 3.3 ml의 강한 양이온 교환 컬럼을 연결합니다.
- 1 ml / 분의 유속을 사용하여 20 mM의 pH를 7 포스페이트 완충액의 3 컬럼 부피 다음 초순수의 3 컬럼 부피로 컬럼을 평형화.
- 로드 1 주입 루프로 감소 원유 CYT (c)의 ml의 328에서 그라데이션 방법 시작 - 5 열 볼륨을 통해 450 mM의 염화나트륨을. 자외선 마주 검출기의 280 nm 내지 410 nm의 채널을 모니터링하고, 가장 큰 피크를 수집합니다.
- 이소 - 2 시토크롬을 용출 1 M 2 열 볼륨에 염 농도를 증가전자 C 및 열 플러싱 한 후, 다음 조 분취 량을 주입하기 전에 인산 완충액 20 mM의 2 컬럼 부피로 열을 재 - 평형.
- 모든 원유 단백질을 정제 할 때까지 반복 1.9-1.10 단계를 반복합니다.
- 이소-1 포함하는 분획을 수영장과 3.5 kDa의 분자량 컷오프 (MWCO) 스핀 필터를 사용하여 X g 3,000에서 원심을 집중한다.
- 3.5 kDa의 MWCO 투석 카세트에 집중 단백질을로드하고 물이 변경, 초순수 하룻밤에 투석.
- 10 μl를 복용 초순수 100 μL로 희석하고, 흡광 스펙트럼을 취함으로써 순수, 농축 된 단백질 용액의 농도를 결정한다. 적은 양을 사용하여 100 ㎕의 석영 큐벳 단백질 흡광도 스펙트럼을 얻었다. 100 μM - 전형적으로, 희석 된 단백질 농도는 50 정도이다.
- concentratio을 정량화하는 CYT (c)의 특성 410 nm의 피크를 사용하여N 97.6 cm -1 mM의 -1의 몰 흡수율 값과 맥주 - 램버트 법칙을 사용하여 :
A = ε × C × ι
A는 흡광도이고, ε는 몰 흡광 계수는, C는 mm 단위 농도이고, ι는 13 cm 큐벳의 광로 길이이다.
- concentratio을 정량화하는 CYT (c)의 특성 410 nm의 피크를 사용하여N 97.6 cm -1 mM의 -1의 몰 흡수율 값과 맥주 - 램버트 법칙을 사용하여 :
- 이 때, 1 mL의 분취 액으로 단백질을 분할하여 사용하기 전까지 -20 ℃에서 냉동 보관. CYT C는 냉동 구조 나 기능의 손실없이 해동하지만, 반복주기는 단백질을 변성 시작합니다 할 수 있습니다.
참고 : 단백질은 다른도에 냉동 용납. 예를 들어, 5,9 냉동되지 않아야 녹색 형광 단백질 대신 냉장고에 보관.
Bioconjugates C 시토크롬 2. 합성
- 루테늄 0.9 mg의 용해 (II) bisterpyridine maleimIDE (RU (II) (TPY) 2 말레이 미드, 0.975 μmol, 6 당량)을 아세토 니트릴 600 ㎕를한다.
주 : 사용 된 말레이 미드가 수용성 인 경우 물 대신에 아세토 니트릴의 스톡 용액을 제조 하였다. 말레이 미드를 반응 완충액에 용해되는 것이 중요하다. 디메틸 술폭 시드, N, N 디메틸 포름 아미드, 아세토 니트릴은 모두 공통의 저 분자량 (12)들은 소수성 말레이 미드 시약의 용해 보조제를 돕기 위해 사용된다. - 20 mm로 희석시 EDTA가 용해 될 때까지 통상적으로 (수 g을 고체 수산화 나트륨을 추가의 pH 7에서 100 mM의 포스페이트 완충액, 100 mM의 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA, M w = 292.24 g / 몰)을 함유하는 완충액을 준비 ) 및 pH를 7로 조정합니다.
- (286.65 g / 몰 = W TCEP 15 M) 초순수 한 용액에가 10mM의 스톡 용액을 제조 트리스 (2- 카르복시 에틸) 포스 핀 하이드로 클로라이드 2.87 mg을 녹인다. 이 단계는 수입입니다개미는 단백질의 시스테인이 완전히 (15)를 결합 말레이 미드 이전에 감소되는 것을 확인합니다.
참고 :이 시약은 수용액에서 산화 비활성화에 영향을 받기 쉽다 같이 TCEP 원액이 각 반응에 갓 준비를해야합니다. - 50㎖의 플라스틱 튜브에서 100 mM의 인산 / EDTA 원액 3 ㎖로 초순수 11.4 ml의 결합. 단백질과 말레이 미드 재고 솔루션을 추가로 희석하면 버퍼 농도는 20 mM의 것입니다.
주 : 표지되는 단백질은 막 관통 단백질 인 경우, 적합한 세제는 단백질을 가용화 버퍼에 추가되도록. 세제를 사용하지 않는 경우, 막 단백질을 천천히 반응 수율에 부정적인 영향을 미칠 것이다 석출된다. 모든 후속 정제 단계에서 세제를 사용하십시오. - 인산-EDTA 버퍼로 정제 CYT (c)의 0.15 μmol (50 μM 용액 3 ㎖, 1 당량)를 추가합니다.
- TCEP 스톡 오디오 솔루션의 7.5 μl를 추가단백질 용액에 이온 (0.075 μmol, 0.5 당량) 및 시스테인 산화에 의한 이량 체화 할 수있는 어떤 단백질을 줄이기 위해 5 분 동안 교반를두고.
참고 : 관심의 단백질이 쉽게 이량하지 않는 경우 TCEP를 추가하지 마십시오. 비 환원 조건 하에서 단백질 젤을 실행하여이 옵션을 선택합니다. - 24 시간 동안 실온에서 어두운 곳에서의 Ru (II) (TPY) CYT C의 감소, 완충 용액이 말레이 미드의 아세토 니트릴 용액을 600 μL를 추가하고, 반응 액의 교반을 떠난다.
- 3.5 kDa의 MWCO 스핀 필터를 사용하여 상기 반응 혼합물에, 3000 × g으로 원심 분리 여과 분명히 실행까지 신선하는 20 mM 인산 완충액으로 2-3 회 반복을 농축시킨다. 정제의 다음 단계 전에 가능한 반응 혼합물로부터 많은 미 반응 말레이 미드를 제거한다.
주 :이 시점에서, 조 바이오 콘쥬 게이션 혼합물을 어두운 곳에서 냉장고에 저장 될 수있다. CENTR에 의해 미 반응 말레이 미드 염료를 제거하는 것이 중요하다저장 전에 투석 ifuge 말레이 미드로 천천히 비특이적 단백질의 표면 상에 리신 잔기와 반응 할 수있다.
사이토 크롬 c Bioconjugates 3. 정제
- 20 밀리미터에 NaH 2 PO 4, 0.5 M NaCl을 함유하는 완충액을 제조 인산이 수소 나트륨 2.4 g과 초순수의 1 L의 염화나트륨 29.22 g을 녹인다. 이 고정화 된 금속 친 화성 크로마토 그래피 (IMAC) 정제 누적 버퍼이다.
- 이미 다졸 17 g (w M = 68.077 g 몰 -1)하는 20 mM의 NaH 2 PO 4, 0.5 M의 NaCl 완충액 500ml에 녹인다. 이것은 IMAC 정화용 용출 버퍼이다.
- 1 M 수산화 나트륨 또는 염산을 사용하여 pH 7로 모두 버퍼의 pH를 조정하고 FPLC에 사용하기 전에 0.22 μm의 재생 셀룰로오스 멤브레인을 통해 필터링.
- 구입 한 IMAC 열이 COL에로드 된 금속 이온 않은 상태로 제공되기 때문에UMN 초순수 3 초순수 ㎖, 100 mM의 아세트산 니켈 수용액 3 ㎖, 6 ㎖로 칼럼을 세척하여 니켈 2+ 기반 정제 용 컬럼을 준비한다. 열을 즉시 사용하지 않으면 20 % 에탄올 3 mL를 통해 세척 및 박테리아 성장을 방지하기 위해 냉장고의 열을 저장한다.
- 나 Ni 2+가 주입 루프와 UV-마주 검출기 사이의 FPLC에 1 ml의 IMAC 열을 -loaded 연결합니다.
- 20mM의 인산의 3 컬럼 부피, 0.5 ㎖ / 분의 유속을 사용하는 0.5 M의 NaCl 완충액으로 칼럼을 평형화.
- 로드 니켈 2+ IMAC 컬럼에 (0.22 μm의 주사기 필터를 통해 여과), 조 반응 혼합물의 100 μL. 루테늄 bisterpyridine - 시토크롬 C의 bioconjugate을 용리 125 내지 3mm 이상의 컬럼 부피에 0 내지 다졸 구배이어서 미 반응 CYT에 c 용출 완충액을 실행하는 3 컬럼 부피로 컬럼을 씻으 (RU (II) -cyt c) .
- ㄴ을 씻으십시오모든 원유 bioconjugate 정제 될 때까지 olumn 5 열 볼륨 250 mM의 이미 다졸 버퍼, 다음 20 mM의 인산, 0.5 M의 NaCl 단계를 반복 3.7과 열을 다시 평형.
- bioconjugate 분수 수영장과 3,000 x g에서 원심 분리, 3.5 kDa의 MWCO 스핀 필터를 사용하여 집중한다.
- 3.5 kDa의 MWCO 투석 카세트에 집중 bioconjugate를 넣고 물 2 변경, 초순수 하룻밤에 투석.
- 이소 시토크롬 C 1과 동일한 몰 흡광 계수 값을 이용하여, UV-비스하여 순수한 bioconjugate 농축 용액의 농도를 결정 (97.6 mM의 -1 cm-1) 410 nm에서. 100 μM - 일반적 bioconjugate 농도는 50 정도이다.
- 25 μL 씩에 bioconjugate를 나누고 필요할 때까지 -20 ℃에서 냉동 보관합니다.
사이토 크롬 c Bioconjugates 4. 특성
- 그만 두게 하다MALDI-TOF MS에 의해 bioconjugate 질량의 mination
- 아세토 니트릴 / 물 / 트리 플루오로 아세트산 수용액 1 ㎖에 카페 산 10 ㎎을 용해 (20 : 80, 0.1, V / V / V).
- 카페 인산 용액 5 μL 농축 단백질 용액 5 μL를 희석.
- 스팟 0.5 MALDI 대상 접시에 카페 산 용액의 μL 및 솔루션을 건조 할 수 있습니다.
- 스팟 0.5이 카페 산 지점의 상단에 시료 / 매트릭스 솔루션 μL, 현장 건조 할 수 있습니다. "샌드위치"매트릭스의 층 사이의 샘플이 위에 시료 매트릭스의 또 다른 0.5 μl를 발견하고, 건조 할 수 있습니다.
- 단백질 16에 적합한 기기 설정을 사용하여 선형 모드에서 질량 스펙트럼을 획득.
- 겔 전기 영동에 의해 bioconjugates의 조사
- 각각의 단백질 시료 10 μL는 미리 혼합 리튬 도데 실 설페이트 (LDS, 산도 8.4) 버퍼 (4 배) t으로 단백질 시료를 희석하여 실행 준비OA 아니라 당 약 20 μg의 최종 농도. 조건을 줄일 필요 웰를 들어, 500 mM 디티 오 트레이 톨 (DTT) 제 (10 배) 감소 1 μl를 추가합니다.
- 10 분 동안 70 ℃에서 가열 된 샘플.
- 겔 실행 버퍼를 준비하는 혼합 50 ml의 1 M MES, 1 M 트리스베이스, 2 % SDS, 20 mM의 EDTA (PH 7.7) 초순수 950 ml의에 상용 소스에서 버퍼 혼합물 (20 배)를 실행을 추가합니다.
- 겔에서 플라스틱 빗를 제거하고 젤 실행중인 탱크에 젤을 배치합니다. 우물은 버퍼로 덮여되도록 젤 실행 버퍼 탱크를 채우십시오.
- 로드 샘플을 조심스럽게 프리 캐스트 12 % 비스 - 트리스에 1 mm의 긴 피펫 팁을 사용하여 10 웰 젤 로딩을 지원합니다. 분석을 돕기 위해 젤의 중간 잘으로 미리 염색 10 단백질 분자량 마커 (3-188 kDa의)를 넣습니다.
- 35 분 동안 200 V 일정한 전압에서 젤을 실행합니다.
- 2 시간 동안 상용 쿠마 블루 용액으로 젤 얼룩 및 ultrap 씻어48 시간 동안 URE 물.
- UV - 마주 분광에 의한 bioconjugate 순도의 결정
- 의 Ru (II) (TPY) 2 말레이 미드, 이소 - 1 CYT의 c 및의 Ru (Ⅱ) -cyt (c)의 5 μm의 솔루션을 120 μl를 준비합니다.
- 250 ㎚ 내지 650 ㎚, 초순수만을 함유하는 석영 큐벳의 기준선 스펙트럼을 측정한다.
- 큐벳을 세정하고 각 측정 사이에 건조 있도록 각 구성 요소의 스펙트럼을 측정한다.
- 파장의 함수로서 각각의 성분의 흡광도를 플롯하고, 하나를 결정하기 위해 최종 생성물과 출발 물질의 선형 합과 비교 :의 Ru (II) (TPY) CYT C까지 2 말레이 미드의 한 비 반응했다.
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Representative Results
bioconjugates의 합성은 세 가지 주요 방법으로 확인 : 비행 질량 분석 (MALDI-TOF MS), 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동의 매트릭스를 이용한 레이저 탈착 이온화 시간 및 자외선 - 가시 (UV-비스) 분광법,도 2에 나타낸 바와 같이, (3, 4). 첨부 된 작은 분자의 질량에 대응하는 질량의 증가, 및 미 반응 된 단백질의 부재의 Ru (II)을 성공적으로 공유 결합 (TPY) CYT (C) 및 bioconjugate 후속 정제 말레이 미드 (2)을 보여준다. bioconjugate의 조성을 유추 할 수있는 원료의 1 부가 스펙트럼 다음 bioconjugate의 자외선 - 가시 광선 스펙트럼 수율은 410 nm에서 및 예측 (1) 스펙트럼을 비교하여 흡광도를 산출 할 수있다. 위의 예에서, 수율은 FPLC 정수기 후 15-27% 사이에 일반적으로 뱃치 다소 다르지만기 15.
또한, 정제 동안 크로마토 새로운 피크의 모양이 새로운 종의 합성을 확인한다. 이것은 다른 UV-마주 흔적의 분석이 종은의 Ru (II) (TPY) 2 말레이 미드 성분을 함유 여부를 표시 할 수도 5에 예시되어있다.
그림 2. 단백질의 MALDI-TOF 질량 스펙트럼. 순수한 ISO-1 시토크롬 C (검정)과의 Ru (II) -cyt C (빨간색)의 질량 스펙트럼. 봉우리는 179 다에서 보이는 카페 산 부가 물과 이소 - 1 CYT의 C (12706 다)과의 Ru (II) -cyt C (13559 다)의 계산 된 질량에 해당하는 것을 관찰 할 수있다. 이 부가 물은 미 반응 CYT C 형의 더 높은 금액에서 볼 수있다인해 카페 산의 α, β 불포화 카르 보닐 및 고 에너지 MALDI 조건 하에서 단백질의 유리 티올의 반응에 pectra. 매트릭스 부가 물은 일반적으로 MALDI-MS에서 볼 수 있습니다 및 공유 자연에서 비공유 모두가 될 수 있습니다. 스펙트럼은베이스 라인 보정, 노이즈 필터링, 및 비교를위한 표준화이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3 SDS-PAGE 단백질. 환원 및 비 환원 CYT C와의 Ru (II) -cyt (C)의 12 % 비스 - 트리스 겔. 레인 3 각 밴드 (kDa의)의 오른쪽에 주석 폴리 펩타이드의 질량, 사전 스테인드 단백질 표준을 포함하고 있습니다. 더 큰 버전?을 보려면 여기를 클릭하십시오이 그림의 N.
그림 4. UV-마주 단백질의 스펙트럼 : Ru로의 흡수 스펙트럼 (II) -cyt C (녹색) 순수, 미 반응 CYT의 C (빨간색) 및 미 반응의 Ru의 선형뿐만 아니라 (파란색 점선)에 밀접하게 대응 (II) ( TPY) 2 말레이 미드 (검은 색). 이것은 bioconjugate가 1로 구성되어 있음을 보여줍니다. 단백질의 말레이 미드의 1 첨부 파일 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
bioconjugates의 니켈 IMAC 정제의 그림 5. 크로마토 그램 :의 Ru (II) -cyt C 정제 IMAC 추적. UV는-비스는 추적 : CY의 Soret 밴드에 해당하는 나노 미터 (410)CYT c와의 Ru (II) 루테늄 (II) 착물의 금속 - 리간드 전하 전송 대역에 해당하는 나노 미터 (TPY) 2 말레이 미드, 및 475 모두에 해당하는 나노 t의 C, 280. 을 보려면 여기를 클릭하십시오 이 그림의 더 큰 버전.
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Discussion
바이오 콘쥬 게이션 전에 출발 물질의 정제는 매우 중요하다. 상업 재조합 소스에서 얻은 단백질은 종종 다른 표면 화학 및 반응성을 가질 수 있습니다 관심있는 단백질의 다른 이성체를 포함한다. 예를 들어, 설명 바이오 콘쥬 게이션에서 시판 CYT C는 모두 ISO-1, ISO-2 CYT C 형 12,14,17의 혼합물을 포함한다. ISO -2- 이소 -1- 시토크롬 C 형태의 주요 차이는 ISO-1 시토크롬 C의 C 말단 근처의 자유 시스테인 잔기의 존재 인 상태 상동 크게한다. 여기 실시 예에서, 정제는 강한 수용성 달성된다 양이온 교환 FPLC 그러나, 이러한 음이온 교환, 친 화성, 소수성 또는 크기 배제 크로마토 그래피와 같은 다른 형태의 FPLC 더 적용될 수있다. 단백질은 또한 관심 단백질의 시스테인 잔기 (여기서 시토크롬 C)는 푸이되도록하여이 단계에서 감소에서야 베드로 말레이 미드 링크 대상으로 바이오 콘쥬 게이션 전에 감소. 또한, 말레이 미드 첨부 소분자가 단백질을 함유하는 시스테인 순수와 말레이 저장소에서 반응을 실시하지 않은 것을 사용할 경우에는 말레이 미드 빛과 온도 민감성이기 때문에, 확인하는 것이 유용하다. 손상되지 말레이 미드의 비닐 양성자가 6-6.5 ppm으로 단일 선으로 표시됩니다으로 이것은 빠르고 쉽게 업 필드 이동합니다 오픈 말레이 미드의 양자 반면, 1 H NMR에 의해 확인 될 수있다; 및 오픈 말레이 미드 반지도 질량 분석은, 18 다 질량 증가에 대응.
버퍼 선택의 pH, 및 세제, 유기 용제 등의 보조제를 포함하고, 환원제는 바이오 콘쥬 게이션 수익률 5,15에 지대한 영향을 미칠 것입니다. 말레이 미드와 티올 마이클 첨가의 경우, pH는 발생할 빠르고 특정 반응 6 아직 8도 이하이어야한다. pH가 6 이하, 특이도는 높다말레이 미드는 아민과 반응 할 수 없지만 티올는 양성자이고, 따라서 느린 반응 선도 마이클 첨가 불량한 친 핵성이다. pH가 8 위 표면 리신 잔기가 탈 양자화 될 수 있으며, 단백질과 말레이 미드 성분의 비특이적 공유 결합에 이르는 가능한 말레이 미드와 반응. 그것은이 pH 범위에서 강력한 버퍼이고, 시약의 모든 상호 작용하지 않기 때문에 포스페이트 완충액이 바이오 콘쥬 게이션에 사용된다. 트리스 (히드 록시 메틸) 아미노 메탄 (트리스) 버퍼는 예를 들어, 잠재적으로 불량한 수율로 이어질 것이다 말레이 미드와 반응 할 수있는 버퍼의 아민 기와 같은 열악한 선택 일 것이다. 모든 시약의 용해도는 높은 수율의 핵심입니다. 소량의 첨가 (<10 % v / v)의 정확한 pH 및 염 농도는 용액에서 단백질을 유지하기위한 필수 12 접는 동안 비극성 성분의 용해 지원할 수있는 유기 용제. 큰 막 PROTEI에 대한NS 중요한 소수성 표면 잔기와, 계면 활성제 (18)에서 침전 된 단백질을 방지 할 필요가있다.
바이오 콘쥬 게이션의 단백질 산화 이량 화하는 경향이 있다면, 그러한 TCEP 같은 환원제의 첨가는 바이오 콘쥬 게이션 수율 15을 개선시킨다. 그 모노머, 자유 티올 형태 단백질의 원위치 감소 활성 티올 사이트의 큰 비율이 말레이 미드에 의해 액세스 될 수있다. 그러나, 가산 및 화학량 순서는 말레이 미드와 반응 TCEP 같은 수율로 성공적으로 증가시키는 열쇠이다. TCEP 후의 말레이 미드를 첨가함으로써, TCEP는 제 단백질을 환원에 의해 소비 될 것이다. 과잉 TCEP가 무료 말레이 미드에 불리하게 반응 할 수 없습니다 때문에 단백질 TCEP의 절반 동등한은, 같은 이유로 사용됩니다. 단백질의 내부 구조에 이황화 다리 TCEP의 첨가에 의해 영향을받을 가능성이없는또는 DTT 같은 다른 환원제, 단백질이 고온 또는 우레아 고농도로 변성 상태로 유지되지 않는다는 것을 제공했다. 예를 들어, DTT 과량 첨가 정제 후에 회수 된 단백질의 양에 큰 영향을 미치지 않는 종래 FPLC로 정제 된 c CYT한다. TCEP 의해 구조적 시스테인 브릿지의 감소가 의심되는 경우, 이는 천연의 비 변성 조건 하에서 단백질 겔을 실행하여 확인할 수있다.
이 방법에서 합성의 Ru (II) - 표지 bisterpyridine 시토크롬 C는 니켈 2+ 고정화 금속 친 화성 크로마토 그래피 (14)를 통해 정제한다. 다른 정제 방법은 항체 정지상 같은 크기 배제 크로마토 그래피, 음이온 / 양이온 교환 크로마토 그래피, 및 특이 적 친 화성 크로마토 그래피로 존재한다. 일반적으로, 상기 방법은 농도 및 투석 단계 따라와 함께, 전술 한 바와 같이 동일하게 유지g 크로마토 그래피 정제 저장에 적합한 버퍼에 bioconjugate 제품을 반환합니다.
바이오 콘쥬 게이션이 성공하는지 여부를 결정하는 기본 방법은, MALDI-TOF MS로한다. 이는 공유 소분자, 차분 종종 1,000 미만 다 표지 천연 단백질과 단백질 사이의 질량에 작은 차이를 확인하기 위해 가장 정확한 방법이다. MALDI-TOF MS 실험을 실행하는 가장 어려운 부분은 매트릭스 선택과 기술을 안보이다 그러나, 카페 인산이 연구에 사용 된 단백질 및 bioconjugates의 분석을위한 신뢰성 범용 행렬 것으로 밝혀졌다. 잠재적 대안으로 sinapinic 산은 단백질의 분석을 위해 일반적으로 사용되는 또 다른 MALDI 행렬이다. MALDI-TOF MS 데이터 분석이 비교적 간단하다.이 모두 순수한 이소 한 CYT C의 전형적인 MALDI-TOF MS 스펙트럼을 나타낸다 순수의 Ru (II) -cyt C (M (M = 12706 다 w)밀접하게 계산 된 분자 질량에 해당 둘 = 13559 다), w 순도는 미 스펙트럼 이소 -2- 시토크롬 C 피크의 결여 (w M = 12532 다) 상기 bioconjugate 스펙트럼 이소 한 시토크롬 C 피크의 부족을 지적 관찰 될 수있다. bioconjugate 질량은, 3 12 % 비스 - 트리스 단백질 겔 도표. 겔 전기 영동을 이용하여 추정 바이오 콘쥬 게이션 증거 두 개를 제공 할 수있다. 먼저의 Ru (II) 비 환원 조건 하에서 이량 밴드의 부재는 -cyt C 더이상 프리 시스테인 있음을 표시하지 않고, 둘째, bioconjugate 대역의 약간의 변화는 상향 분자량 증가로 변환한다. 단백질 겔은 매우 중요하고 결정적으로 작은 분자 첨부 파일뿐만 아니라, 단백질 이량 체 (5) 또는 단백질 폴리머 bioconjugates (9)의 합성뿐만 아니라 성공적인 바이오 콘쥬 게이션의 증거를 제공 할 수 있습니다.
단백질이러한 녹색 형광 단백질 또는 헴 함유 사이토 크롬, UV-마주 분광법 등이 포함 발색단은 bioconjugate의 구성 및 수율을 결정하는 데 사용됩니다. 1 :도 4에 도시 된 바와 같이 원료 스펙트럼 1 선형 첨가는 bioconjugate의 가상 UV-비스 스펙트럼의 구성을 허용이 1 실제 bioconjugate 스펙트럼 비교하여 :. 1 부가 스펙트럼, 조성물 추론 될 수있다 . 예를 들어, 두 개 이상의의 Ru (II) (TPY)이 -maleimides는 비특이적 단백질에 부착 한 경우 bioconjugate의 480 nm의 대역 예측 스펙트럼보다 더 높은 것이다. 또한 bioconjugate의 농도는 97.6 cm -1 -1 mM의 410 nm의 몰 흡광 계수 값을 이용하여 근사화 될 수있다. 이는의 Ru (II) (TPY) 말레이 미드 (2)이 영역에서 최소 흡광도를 가지므로 bioconjugate 대해 동일한 것으로 가정된다.
그것은 그쪽에 유의해야한다시스테인 - 말레이 미드 화학을 통해 t의 바이오 콘쥬 게이션 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 첫째, 관심있는 단백질은 하나의 접근 시스테인 잔기, 또는 다른 단백질 공학이 하나를 소개하기 위해 수행해야 있어야합니다. 둘째, 시스테인 말레이 미드 결합 플라즈마 (19)의 애플리케이션 문맥에서 알부민 및 글루타치온과 같은 다른 자유 티올과 교환되기 쉽다. 이러한 교환은 단백질의 표면에 용매 접근성 로컬 전하에 크게 의존한다. 말레이 미드 티올 결합 여전히 플라즈마 응용에 적합 할 수 있지만, 장기간 안정성은 질량 분석 및 겔 전기 영동을 사용하여 확인한다.
그럼에도 불구하고, 예컨대 시스테인 말레이 미드 화학 물질을 통해 단백질에 형광 염료, 레 독스 센터 중합체 및 다른 단백질로서 신규 한 분자의 높은 특이 적으로 높은 항복 첨부가 될 흥미 고분자 구조체의 범위를 수있는 강력한 기술이다ccessed. 화학적으로 잘 정의 된 단백질 bioconjugates 많은 양을 갖는 단백질 결합, 자기 조립, 효소 역학 및 단백질 지방화를 포함하는 미래 연구의 핵심입니다. 물질의 정제, 반응 매질의 선택과 같은 환원제와 같은 보조 시약의 첨가를 시작하고, 상기 증명 또는 계면 모두 바이오 콘쥬 게이션 수율에 큰 영향을 미친다. 정제 된 단백질 쉽게 호환 크로마토 그래피에 의해 달성되고, 특성화는 MALDI-TOF MS, 겔 전기 영동을 조합하여 수행하고, UV-비스 분광법.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| sodium dihydrogen phosphate | Sigma-Aldrich | 71496 | |
| sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 71691 | |
| sodium chloride | Sigma-Aldrich | 73575 | |
| cytochrome c, from saccaromyces cerevisiae | Sigma-Aldrich | C2436 | |
| dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43819 | |
| TSKgel SP-5PW | Sigma-Aldrich | Tosoh SP-5PW, 07161 | 3.3 ml strong cation exchange column |
| Amicon Ultra-15 | Merck-Millipore | UFC900308 | 3.5 kDa spin filter |
| Slide-A-Lyzer mini dialysis units | Thermo Scientific | 66333 | 3.5 kDa dialysis cassetes |
| Ru(II) bisterpyridine maleimide | Lab made | see ref (14) | |
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | A3396 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | 03609 | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 93284 | |
| imidazole | Sigma-Aldrich | 56749 | |
| nickel acetate | Sigma-Aldrich | 244066 | |
| AcroSep IMAC Hypercell column | Pall | via VWR: 569-1008 | 1 ml IMAC column |
| 0.2 micron cellulose membrane filter | Whatman | Z697958 | 47 mm filter for buffers |
| 0.2 micron PVDF membrane filter | Merck-Millipore | SLGV013SL | syringe filters for proteins |
| hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 84426 | Extremely corrosive! Use caution. |
| caffeic acid | Sigma-Aldrich | 60018 | MALDI matrix |
| trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 91707 | extremely corrosive! Use caution |
| SimplyBlue SafeStain | Thermo Scientific | LC6060 | Coomassie blue solution |
| NuPAGE Novex 12% Bis-Tris Gel | Thermo Scientific | NP0342BOX | precast protein gels |
| SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard | Thermo Scientific | LC5925 | premade protein ladder |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Thermo Scientific | NP0008 | premade gel sample buffer |
| NuPAGE Sample Reducing Agent (10x) | Thermo Scientific | NP0004 | premade gel reducing agent |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x) | Thermo Scientific | NP0002 | premade gel running buffer |
| Voyager DE STR MALDI reflectron TOF MS | Applied Biosystems | ||
| Acta FPLC | GE | Fast Protein Liquid Chromatography | |
| Cary 50 Bio Spectrophotometer | Varian-Agilent | UV-Vis | |
| Milli-Q ultrapure water dispenser | Merck-Millipore | ultrapure water | |
| Low volume UV-Vis Cuvette | Hellma | 105-201-15-40 | 100 microliter cuvette |
References
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