Summary

Síntesis de Proteínas bioconjugados<em> vía</em> Química cisteína-maleimida

Published: July 20, 2016
doi:

Summary

Este protocolo detalla los pasos importantes que se requieren para la bioconjugación de una cisteína que contiene proteína a una maleimida, incluyendo la purificación de reactivos, condiciones de reacción, purificación y caracterización bioconjugado bioconjugado.

Abstract

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the development of antibody drug conjugates (ADCs) and nanomedicine, fluorescent microscopy and systems chemistry. For many of these applications, specificity of the bioconjugation method used is of prime concern. The Michael addition of maleimides with cysteine(s) on the target proteins is highly selective and proceeds rapidly under mild conditions, making it one of the most popular methods for protein bioconjugation.

We demonstrate here the modification of the only surface-accessible cysteine residue on yeast cytochrome c with a ruthenium(II) bisterpyridine maleimide. The protein bioconjugation is verified by gel electrophoresis and purified by aqueous-based fast protein liquid chromatography in 27% yield of isolated protein material. Structural characterization with MALDI-TOF MS and UV-Vis is then used to verify that the bioconjugation is successful. The protocol shown here is easily applicable to other cysteine – maleimide coupling of proteins to other proteins, dyes, drugs or polymers.

Introduction

La bioconjugación implica la unión covalente de una biomolécula con otra o con una molécula sintética, tal como un tinte, fármaco o un polímero. Métodos bioconjugation proteína ahora se utilizan ampliamente en muchos grupos de investigación química, biología y nanotecnología con aplicaciones que van desde el etiquetado colorante fluorescente 1,2, haciendo de proteína (anticuerpo) -prodrugs 3 (conjugados de fármaco anticuerpo – ADC) síntesis de dímeros de proteína de 4,5 , a través de los híbridos de proteína-polímero auto-montaje de 6,7 utilizadas en nanomedicina 8 y 9 sistemas de la química.

La especificidad de la química utilizada para bioconjugation, aunque no siempre crítico, es de suma importancia para bioconjugados proteína más funcionales, a fin de no interferir con el sitio activo de la proteína diana. La reacción bioconjugation ideales necesita cumplir varios criterios, incluyendo: i) dirigidas a sitios raros o únicos en la proteína de interés,ii) ser selectiva hacia este objetivo, iii) proceda en condiciones no desnaturalizantes para evitar desplegamiento de la proteína y iv) ser de alto rendimiento como la proteína diana es por lo general sólo está disponible a una concentración sub-milimolar. La maleimida – cisteína adición de Michael se acerca a cumplir con todos estos criterios, y tiene por ello reclamó durante mucho tiempo un estatus especial en el campo de la química de bioconjugados 10. Esto se debe a que i) muchas proteínas que contienen residuos sólo una cisteína en su superficie pueden ser modificadas por ingeniería genética allí, ii) en el pH correcto de la reacción es altamente selectiva hacia cisteína, iii) se produce más fácilmente en tampones acuosos y iv) es muy rápido con la segunda constante de velocidad orden de maleimidas a las proteínas que contienen cisteína reportados exceda de 5.000 M -1 s -1 en algunos casos 11. Siempre que la proteína de interés puede tolerar una cantidad pequeña (≈ 5-10%) de co-disolvente orgánico 12, casi cualquier colorante de maleimida-funcionalizado, poLymer, superficie u otra proteína puede estar ligada a las proteínas. Además, maleimidas son más específicos para las cisteínas en proteínas que yodoacetamidas, que son más propensos a reaccionar con otros nucleófilos a pH elevado; y más estable que conjugaciones a base de disulfuro que deben mantenerse a un pH ácido para impedir el intercambio de disulfuro de 13.

Aquí se presenta un protocolo genérico para la conjugación de moléculas de maleimida-funcionalizado para una proteína que contiene un único residuo de cisteína mediante la reacción entre un cromóforo Ru basado en (II) y la proteína citocromo c redox como un ejemplo. Este protocolo es igualmente aplicable a la mayoría de otras proteínas que contienen un residuo de cisteína superficie accesible y el objetivo maleimida-funcionalizado correspondiente, ya sea otra proteína, un colorante fluorescente, un cromóforo o un polímero sintético.

Protocol

Nota: El siguiente protocolo está diseñado para la síntesis de un bioconjugado de proteína-colorante como se muestra en la Figura 1 Se trata de un protocolo general para la reacción de una maleimida con las proteínas de cisteína superficie libre que contienen, con notas insertan en su caso para ayudar con la proteína de la membrana. bioconjugados, bioconjugados de proteína-polímero, y dímero de proteínas sintéticas (proteína-proteína) bioconjugados. En este caso particular, la proteína de iso-1 citocromo <em…

Representative Results

La síntesis de bioconjugados se confirma por tres métodos principales: Matrix-Assisted Laser Desorption ionización tiempo de vuelo espectrometría de masas (MALDI-TOF MS), electroforesis en gel de poliacrilamida, y ultravioleta-visible espectroscopia (UV-Vis), como se muestra en las figuras 2, 3 y 4. Un aumento de la masa correspondiente a la masa de la molécula pequeña anexa, y la falta de una proteína sin reaccionar demuestra la exitosa unión co…

Discussion

La purificación de los materiales de partida antes de una bioconjugation es de suma importancia. Las proteínas obtenidas a partir de fuentes recombinantes comerciales contienen a menudo otras isoformas de la proteína de interés, que puede tener diferente química de la superficie y reactividad. Por ejemplo, en la bioconjugación descrito, el cyt c comercialmente disponible contiene una mezcla de ambos cyt c 12,14,17 iso-1 e iso-2. Iso-2 y las formas de citocromo c 1 Iso-son en g…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank the Australian Research Council (ARC) for ARC Future Fellowship (FT120100101) and ARC Centre of Excellence CE140100036) grants to P.T. and the Mark Wainwright Analytical Centre at UNSW for access to mass spectrometry and NMR facilities.

Materials

sodium dihydrogen phosphate Sigma-Aldrich 71496
sodium hydroxide Sigma-Aldrich 71691
sodium chloride Sigma-Aldrich 73575
cytochrome c, from saccaromyces cerevisiae Sigma-Aldrich C2436
dithiothreitol Sigma-Aldrich 43819
TSKgel SP-5PW Sigma-Aldrich Tosoh SP-5PW, 07161 3.3 mL strong cation exchange column
Amicon Ultra-15  Merck-Millipore UFC900308 3.5 kDa spin filter
Slide-A-Lyzer mini dialysis units Thermo Scientific 66333 3.5 kDa dialysis cassetes
Ru(II) bisterpyridine maleimide Lab made see ref (14)
acetonitrile Sigma-Aldrich A3396
ethylenediaminetetraacetic acid Sigma-Aldrich 03609
tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride  Sigma-Aldrich 93284
imidazole Sigma-Aldrich 56749
nickel acetate Sigma-Aldrich 244066
AcroSep IMAC Hypercell column Pall via VWR: 569-1008 1 mL IMAC column
0.2 micron cellulose membrane filter Whatman Z697958 47 mm filter for buffers
0.2 micron PVDF membrane filter Merck-Millipore SLGV013SL syringe filters for proteins
hydrochloric acid Sigma-Aldrich 84426 extremely corrosive! Use caution
caffeic acid Sigma-Aldrich 60018 MALDI matrix
trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich 91707 extremely corrosive! Use caution
SimplyBlue SafeStain Thermo Scientific LC6060 Coomassie blue solution
NuPAGE Novex 12% Bis-Tris Gel Thermo Scientific NP0342BOX precast protein gels
SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard Thermo Scientific LC5925 premade protein ladder
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) Thermo Scientific NP0008 premade gel sample buffer
NuPAGE Sample Reducing Agent (10X) Thermo Scientific NP0004 premade gel reducing agent
NuPAGE MES SDS Running Buffer (20X) Thermo Scientific NP0002 premade gel running buffer
Voyager DE STR MALDI reflectron TOF MS Applied Biosystems
Acta FPLC GE Fast Protein Liquid Chromatography
Cary 50 Bio Spectrophotometer Varian-Agilent UV-Vis
Milli-Q ultrapure water dispenser Merck-Millipore ultrapure water
Low volume UV-Vis Cuvette Hellma 105-201-15-40 100 microliter cuvette

References

  1. Griffin, B. A., Adams, S. R., Tsien, R. Y. Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells. Science. 281, 269-272 (1998).
  2. Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. Bioorthogonal chemistry: Fishing for selectivity in a sea of functionality. Angew. Chem. Int. Ed. 48, 6974-6998 (2009).
  3. Lyon, R. P., Meyer, D. L., Setter, J. R., Senter, P. D. Conjugation of anticancer drugs through endogenous monoclonal antibody cysteine residues. Meth. Enzymol. 502, 123-138 (2012).
  4. Natarajan, A., Xiong, C. Y., Albrecht, H., DeNardo, G. L., DeNardo, S. J. Characterization of site-specific ScFv PEGylation for tumor-targeting pharmaceuticals. Bioconjug. Chem. 16, 113-121 (2005).
  5. Hvasanov, D., et al. One-Pot Synthesis of High Molecular Weight Synthetic Heteroprotein Dimers Driven by Charge Complementarity Electrostatic Interactions. J. Org. Chem. 79, 9594-9602 (2014).
  6. Thordarson, P., Le Droumaguet, B., Velonia, K. Well-defined protein-polymer conjugates–synthesis and potential applications. Appl. Microbiol. Biotechnol. 73, 243-254 (2006).
  7. Lutz, J. F., Börner, H. G. Modern trends in polymer bioconjugates design. Prog. Polym. Sci. 33, 1-39 (2008).
  8. Nicolas, J., Mura, S., Brambilla, D., Mackiewicz, N., Couvreur, P. Design, functionalization strategies and biomedical applications of targeted biodegradable/biocompatible polymer-based nanocarriers for drug delivery. Chem. Soc. Rev. 42, 1147-1235 (2013).
  9. Wong, C. K., et al. Polymersomes Prepared from Thermoresponsive Fluorescent Protein-Polymer Bioconjugates: Capture of and Report on Drug and Protein Payloads. Angew. Chem. Int. Ed. , 5317-5322 (2015).
  10. Hermanson, G. T. . Bioconjugate Techniques. , (2013).
  11. Li, J., Xu, Q., Cortes, D. M., Perozo, E., Laskey, A., Karlin, A. Reactions of cysteines substituted in the amphipathic N-terminal tail of a bacterial potassium channel with hydrophilic and hydrophobic maleimides. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (18), 11605-11610 (2002).
  12. Peterson, J. R., Smith, T. A., Thordarson, P. Synthesis and room temperature photo-induced electron transfer in biologically active bis(terpyridine)ruthenium(II)-cytochrome c bioconjugates and the effect of solvents on the bioconjugation of cytochrome c. Org. Biomol. Chem. 8, 151-162 (2010).
  13. Borges, C. R., Sherma, N. D. Techniques for the Analysis of Cysteine Sulfhydryls and Oxidative Protein Folding. Antioxid. Redox Signal. (3), 1-21 (2014).
  14. Peterson, J. R., Thordarson, P. Optimising the purification of terpyridine-cytochrome c bioconjugates. Chiang Mai J. Sci. 36 (2), 236-246 (2009).
  15. Hvasanov, D., Mason, A. F., Goldstein, D. C., Bhadbhade, M., Thordarson, P. Optimising the synthesis, polymer membrane encapsulation and photoreduction performance of Ru(II)- and Ir(III)-bis(terpyridine) cytochrome c bioconjugates. Org. Biomol. Chem. 11 (28), 4602-4612 (2013).
  16. Signor, L., Boeri Erba, E. Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight (MALDI-TOF) Mass Spectrometric Analysis of Intact Proteins Larger than 100 kDa. J. Vis. Exp. , e50635 (2013).
  17. Foucher, M., Verdière, J., Lederer, F., Slonimski, P. P. On the presence of a non-trimethylated iso-1 cytochrome c in a wild-type strain of Saccharomyces cerevisiae). Eur. J. Biochem. 31, 139-143 (1972).
  18. Müller, M., Azzi, A. Selective labeling of beef heart cytochrome oxidase subunit III with eosin-5-maleimide. FEBS Lett. 184 (1), 110-114 (1985).
  19. Shen, B. Q., et al. Conjugation site modulates the in vivo stability and therapeutic activity of antibody-drug conjugates. Nat. Biotechnol. 30 (2), 184-189 (2012).

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Cite This Article
Mason, A. F., Thordarson, P. Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry. J. Vis. Exp. (113), e54157, doi:10.3791/54157 (2016).

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