Summary
Massa phyloproteomics à base de espectrometria (MSPP) foi usado para digitar uma coleção de Campylobacter jejuni ssp. Doylei isola a nível da estirpe em comparação com digitação sequência multilocus (MLST).
Abstract
MALDI-TOF MS oferece a possibilidade de diferenciar algumas bactérias não só ao nível de espécies e subespécies, mas ainda abaixo, a nível da estirpe. isoformas alélicas dos íons de biomarcadores detectáveis resultar em deslocamentos de massa específica do isolados. phyloproteomics à base de espectrometria de massa (MSPP) é um nova técnica que combina as massas espectrometria de massa de biomarcadores detectáveis em um esquema que permite a dedução de relações phyloproteomic de deslocamentos de massa específicos do isolado em comparação com uma estirpe de referência do genoma sequenciado. As sequências de aminoácidos deduzidas são então usados para calcular dendrogramas baseados em MSPP.
Aqui nós descrevemos o fluxo de trabalho de MSPP digitando um ssp Campylobacter jejuni. Doylei coleção isolado de sete cepas. Todas as sete cepas eram de origem humana e multilocus digitação sequência (MLST) demonstraram a sua diversidade genética. MSPP-digitação resultou em sete tipos de seqüência MSPP diferentes, refletindo suficientemente sua phyrelações logenetic.
A C. jejuni ssp. doylei esquema MSPP inclui 14 diferentes íons de biomarcadores, proteínas principalmente ribossômicas na faixa de massa de 2 a 11 kDa. MSPP pode, em princípio, ser adaptado para outras plataformas de espectrometria de massa com uma faixa de massa estendida. Portanto, esta técnica tem o potencial para se tornar uma ferramenta útil para nível de tensão tipagem microbiana.
Introduction
Durante a última década, laser assistida por matriz dessorção ionização espectrometria de tempo-de-voo de massa (MALDI-TOF MS) tem avançado para ser um método padrão altamente valorizado por género microbiana e identificação de espécies em microbiologia clínica 1, 2. A identificação da espécie é baseada no registo de impressões digitais pequenas proteínas de células intactas ou de lisados celulares. A faixa de massa típica para um espectrómetro de massa usado em microbiologia clínica de rotina é 2-20 kDa. Além disso, o espectro resultante pode ser utilizado para discriminar estirpes com as espécies e abaixo-abaixo-subespécies de nível três. Estudos pioneiros iniciais identificaram iões de biomarcadores específicos para um subgrupo particular de estirpes de Campylobacter jejuni 4, 5 Clostridium difficile, Salmonella enterica ssp. enterica serovar Typhi 6, Staphylococcus aureus 7-9, e Escherichia coli 10-12.
A combinação de várias massas de biomarcadores para variáveis correspondentes isoformas alélicas oferece a opção de subtipagem mais profunda. Anteriormente, foi implementado com sucesso um método para converter essas variações nos perfis de massa em relações phyloproteomic significativos e reprodutíveis chamados massa phyloproteomics baseados espectrometria (MSPP) em um C. ssp jejuni. coleção isolado jejuni 13. MSPP pode ser usado uma espectrometria de massa equivalente a técnicas de subtipagem baseada na sequência de DNA como digitação sequência multilocus (MLST).
Espécies de Campylobacter são a principal causa de gastroenterite bacteriana em todo o mundo 14, 15. Como consequência da Campilobacteriose sequela pós-infecciosa, ou seja, síndrome de Guillain Barré, artrite reactiva e doença inflamatória intestinal pode surgir 16. As principais fontes de infecção sãocarne de gado contaminado de frango, peru, suínos, bovinos, ovinos e patos, leite e água de superfície 15, 17. Portanto, estudos de vigilância epidemiológica regulares no contexto da segurança alimentar são necessários. MLST é o "padrão ouro" na tipagem molecular de espécies Campylobacter 18. Uma vez que a sequenciação de Sanger-base MLST método é um trabalho intensivo, que consome tempo e relativamente cara, é restrito MLST tipagem de relativamente pequenas coortes isolados. Por conseguinte, existe uma necessidade de métodos de subtipagem barata e mais rápida. Essa necessidade pode ser satisfeita através de métodos de espectrometria de massa como MSPP.
Este artigo apresenta um protocolo detalhado para MSPP-digitação usando uma coleção de Campylobacter jejuni ssp. Doylei isolados e comparação de seu potencial com MLST.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Prepare um local de trabalho seguro, considerando condições de biossegurança
- Familiarize-se com os regulamentos de laboratório e de segurança que são de relevância para trabalhar com microorganismos. A maioria dos microorganismos patogênicos humanos devem ser tratados a nível de biossegurança 2 condições, mas alguns, como a Salmonella enterica sorotipo Typhi, exigem biossegurança nível 3. Informações sobre nível de tratamento de cada agente patogénico pode ser acessado no www.cdc.gov/biosafety.
- Independentemente da classificação de risco biológico do microorganismo específico, considerar todos os materiais que entraram em contato com o agente infeccioso como resíduos infecciosos que devem ser autoclavados antes do descarte. Respeitar as orientações de segurança regionais para materiais perigosos e substâncias biológicas. Assegurar que os recipientes adequados para eliminação imediata e adequada de materiais potencialmente contaminados (riscos biológicos) estão disponíveis.
- Garantir que os instrumentos esterilizados (loops de inoculação), soluções e meios de cultura (placas de agar) estão disponíveis antes de iniciar cultura bacteriana.
- Lavar as mãos com sabonete anti-séptico e água morna após manusear microorganismos infecciosos.
2. Selecione Referência e isola Coleção
- Selecionar e obter uma referência sequenciado o genoma padrão isolar juntamente com as sequências do proteoma codificado, de preferência em formato FASTA. Se mais estirpes sequenciadas-genoma estão disponíveis, incluem estes na análise.
Nota: Este isolado / estes isolados irão mais tarde ser usada para prever a identidade dos picos de massa observados em espectrometria de massa (ver Secção 7). - Seleccionar e obter uma variedade de potencialmente diversos isolados de tal maneira que eles cobrem a filogenia da espécie ou subespécie de interesse.
Nota: Estes isolados, mais tarde, ser usado para demonstrar a variabilidade de biomarcadores na população (ver secção 8). - Certifique-se que a coleção inteira e isolado (s) de referência são proPerly digitado pelo respectivo padrão de ouro para este particular organismo 18-20.
Nota: Esta pode incluir uma variedade de métodos (sub) -typing, mas provavelmente irá recorrer a MLST, que ainda é o método padrão para demonstrar a diversidade genética da maioria das espécies microbianas. - Para inferir a filogenia dentro da coleção, calcular um filograma a partir dos dados de digitação, por exemplo, usando o método de grupo par não ponderada com média aritmética (UPGMA) em software MEGA6 para dados MLST 21. Para dados MLST, também consultar um banco de dados MLST e atribuir tipos de seqüência e respectivos complexos clonais 22.
Nota: Isto irá mais tarde ser usado para analisar a congruência de MSPP com o método de digitação padrão ouro anteriormente (ver secção 9).
3. Prepare uma placa MALDI-alvo
CUIDADO: TFA é um ácido forte. O uso inadequado de TFA assume o risco de queimaduras graves na pele, lesões oculares e irritação grave of do trato respiratório superior se for inalado. Portanto, as medidas de segurança rigorosas devem ser respeitados e é necessário equipamento adequado de proteção individual (EPI), incluindo óculos de segurança, protetores faciais, luvas adequadas, botas, ou mesmo um fato de protecção completa, durante o manuseio de TFA. Possível exposição ao TFA deve ser controlada por manipulação da substância sob ventilação adequada com um sistema de ventilação eficaz. Em caso de ventilação insuficiente, um respirador aprovado filtro deve ser utilizado. Além disso, TFA é prejudicial para a vida aquática, com efeitos prolongados. Qualquer liberação de TFA em águas residuais para o meio ambiente deve ser evitada.
Nota: Antes de manchar as amostras em um alvo MALDI, limpar a placa-alvo cuidadosamente se a placa foi usada anteriormente.
- Preparar uma solução aquosa de etanol a 100 ml de 70% usando 30 ml de água desionizada e 70 ml de etanol puro.
- Preparar 250 ul de um ácido trif luoroacético aquoso a 80% de solução (TFA) por mistura de 50ul de água desionizada e 200 ul de TFA a 100% em um tubo de reacção e o tubo de vortex durante 1 min.
- Limpar o alvo de MALDI, colocando-o em um prato de vidro e submergindo-o em etanol aquoso a 70% durante cerca de 5 min a temperatura ambiente.
- Lavar o alvo sob água quente.
- Usando um lenço de papel, limpe a placa-alvo intensamente com solução a 70% de etanol aquoso para remover todas as amostras anteriores e outros detritos potencial.
- Se uma limpeza adicional é necessária, lavar em água quente enquanto limpando com um lenço de papel.
- Remover contaminantes residuais, e potencialmente invisíveis,, cobrindo a superfície do alvo com uma camada fina de 80% de TFA aquoso (~ 100 ul por 96 pontos) e limpar todas as posições alvo limpa com um lenço de papel.
- Finalmente, lavar o alvo para remover o ácido, seque-o com um lenço de papel, e deixá-lo por pelo menos 15 minutos à temperatura ambiente para evaporar o líquido residual.
4. Preparação de um45; -ciano-4-hidroxi-cinâmico Ácido Matrix solução contendo um Calibrant interno
- Prepara-se uma solução saturada de matriz pela dissolução de 10 mg α-ciano-4-hidroxi-cinâmico ácido (HCCA) em 1 ml de uma mistura de 50% de acetonitrilo, 47,5% de água, e 2,5% de TFA. Residual não dissolvido HCCA permanecerá se a solução está saturada.
- Adicionar insulina humana recombinante como um calibrador interno. Por isso, se preparar uma solução-mãe a uma concentração final de 10 pg / mL em 50% de acetonitrilo aquoso, alíquota e armazenar a -20 ° C para posterior utilização.
5. MALDI-TOF Espectrometria de Massa
Nota: deve ser utilizado condições específicas de cultura para os organismos de interesse. As amostras de MALDI-TOF MS pode ser preparada quer por preparação de esfregaço ou extracção, dependendo do organismo (ver secção 8.4.1). Enquanto o método de extracção com ácido-etanol fórmico fornece suficiente inactivação dos agentes patogénicos, esfregaço tem de ser realizada sob suffcondições de biossegurança icient conforme necessário (ver secção 1). Normalmente, não há nenhum risco de infecção, após a aplicação da matriz, mas, para agentes patogénicos específicos são necessários protocolos de inactivação específicos. Assim, por exemplo, por MALDI-TOF MS de espécies Nocardia requer lise anterior das bactérias em água a ferver, seguida de precipitação com etanol de proteínas de 23. EI Khéchine et ai. desenvolveram um processo para a inactivação de micobactérias, aquecendo as colónias bacterianas a 95 ° C durante 1 h, em tubos com tampa de rosca contendo água e 0,5% de Tween 20, 24.
- smear Preparação
- Espalhe uma quantidade cabeça de alfinete-de tamanho de uma colônia de bactérias diretamente para uma posição da placa-alvo MALDI ( "spot").
- Overlay cada ponto com 1 ml de HCCA matriz regular ou matriz que contém a calibração interna e deixar a cristalizar à temperatura ambiente. Para a determinação da massa exacta do pico de calibração, sobrepor um controlo spOT com 1 ul de Teste Padrão e 1 ul de matriz HCCA contendo a calibração interna.
Nota: Aqui, como teste padrão um extrato de Escherichia coli DH5 alfa é usado que demonstra uma impressão digital proteína característica em MALDI-TOF MS. É enriquecida com duas proteínas que se estendem para o limite superior da gama de massa detectável.
- Método de extracção
- Colheita aproximadamente cinco colónias de uma cultura de placa de agar com uma ansa de inoculação e completamente suspender em 300 uL de água duplamente destilada em um tubo de 1,5 ml de reacção. Adicionar 900 mL de etanol absoluto e misture bem por pipetagem repetida até que as colónias de bactérias estão totalmente suspensas.
Nota: Neste passo é possível e bem estabelecida para armazenar as amostras à temperatura de -20 ° C. Além disso, a inactivação de agentes patogénicos pode ser testada por estrias 1-10 uL do extracto numa placa de agar apropriado a seguir à incubação em condições de crescimento óptimas. bem sucedido emactivação é indicado pela ausência de crescimento microbiano. - Centrifugar a amostra a 13000 x g durante 1 min, descartar o sobrenadante, o sedimento seco e à temperatura ambiente durante 10 minutos. Ressuspender o sedimento cuidadosamente, pipetando para cima e para baixo em 50 ul de ácido fórmico a 70%.
- Adicionar 50 ul de acetonitrilo e mistura-se. Remover os detritos por centrifugação a 13000 xg durante 2 min. Transferir 1 ml do sobrenadante para uma posição amostra numa placa alvo de MALDI e deixar secar ao ar durante 5 min à temperatura ambiente.
- Overlay cada ponto com 1 l de matriz HCCA contendo a calibração interna e deixar a cristalizar à temperatura ambiente.
- Colheita aproximadamente cinco colónias de uma cultura de placa de agar com uma ansa de inoculação e completamente suspender em 300 uL de água duplamente destilada em um tubo de 1,5 ml de reacção. Adicionar 900 mL de etanol absoluto e misture bem por pipetagem repetida até que as colónias de bactérias estão totalmente suspensas.
- Gravação de Espectros de Massa
Nota: Pico-colheita a partir de espectros de massa é feita usando os procedimentos padrão recomendado (algoritmo Centróide; relação S / R:. 2; rel limiar de intensidade: 2%; largura do pico de 3 m / z, a subtracção da linha de base: TopHat)- Calibrar o instrumento de acordo com PROTOC dos fabricantesol.
- Para cada ponto, recolher 600 espectros em 100-shots etapas.
- Vá até a aba "AutoXecute" do software de configuração do espectrômetro de massa. Abra o "Método" pela esquerda, clicando no botão "Método" e escolhendo o método por exemplo, "MBT_AutoX" no menu suspenso.
- À esquerda, clique no botão "Editar ..." direito do menu "Método" para abrir o "AutoXecute Method Editor". Vá até a aba "Acumulação". Defina o "Soma-se" valor para "600" e os "tiros satisfatórios em" _X_ "passos tiro" valor para "100".
- Espectro interna Procedimento de Calibração
Nota: os erros de medição Minuto são inerentes à espectrometria de massa. Dependendo da utilização do instrumento intermitente, temperatura do instrumento e re-calibração, os valores de medição obtidos podem variar entre experiências. Após a calibração instrumento de pré-medição e pós-medição de calibragem espectro a um calibrador interno é a maneira mais precisa para assegurar a comparabilidade inter-espectro.- Execute os seguintes procedimentos para cada lista de pico de calibração:
- Inicie o navegador espectro (por exemplo, flexAnalysis e espectro aberto:. Menu "File" → "Open ...")
- Criar lista de controle de massa, com pico de calibração: menu "Método" → "Open ...".
- Escolha forma: MBT_Standard.FAMSMethod → "Open".
- Editar Lista de Controle de Massa: Desmarque todos os calibradores.
- Adicionar Calibrant pico no fundo: Label Peak: "Insulin_HIStag [M + H] + _ avg"; m_z: "5808,29"; Tolerância [ppm]: "50"; Verifique caixa Calibrant.
- Salvar como, por exemplo, "lista de calibração MSPP".
- Para cada espectro, escolher o pico de calibração a partir da lista, clique em "Atribuir Automatic" e pressione "Ok".
- Execute os seguintes procedimentos para cada lista de pico de calibração:
- Experimentalmente determinar a massa exata do Pico calibração.
- Prepare duas manchas com 1 ml de Teste Padrão cada (passo 5.1.1). Sobrepor o primeiro com 1 ml da matriz regulares HCCA, o segundo com matriz cravado-calibração 1 ml.
- Obter espectros de massa de cada local (secção 5.3), e calibrar internamente para os picos de teste padrão (Seção 5.4).
- Overlay ambos espectros abrindo-os com o navegador do espectro (por exemplo, flexAnalysis e espectro aberto: menu "File" → "Open ...") e encontrar o pico na massa esperada (insulina m / z = 5,808.29), que deve estar presente em o espectro cravado-calibrante, mas não no espectro obtido com a matriz regular.
- Verifique se o Pico Calibrant não é dissimulados por quaisquer outras Biomarcadores do organismo de interesse.
- Prepare dois pontos (secção 5.1) com a estirpe de referência e overlay o primeiro com 1 ml de matriz regular, o segundo com matriz cravado-calibração 1 ml.
- Adquirir espectros de massa de ambos os pontos (secção 5.3) e sobrepor os espectros resultante por abri-los com o navegador do espectro (por exemplo, flexAnalysis e espectro aberto: menu "File" → "Open ..."). Certifique-se de que o pico de calibração é claramente visível no espectro obtido com a matriz cravada e não obscurecido por outro sinal adjacentes. Se este não for o caso, escolha outra calibração para este organismo em particular.
Nota: Usando um calibrador interno cravado aumenta significativamente a precisão de determinar variações de massas de biomarcadores. Usando este método, as diferenças de massa inferiores a 1 Da pode ser detectada. Em alternativa, também invariantes massas provenientes dos organismos podem ser utilizados como calibradores. No entanto, por definição, todas as massas derivados do organismo deve ser considerado potencialmente variável, a menos que se prove o contrário.
- Medir o espectro de massa da estirpe de referência, usando a matriz cravado com o Calibrant Interno.
- Espalhe uma quantidade cabeça de alfinete-de tamanho de uma colónia bacteriana (secção 5.1) ou 1 ml de extrato de proteína bacteriana (secção 5.2) diretamente em uma posição da placa-alvo MALDI ( "spot").
- Overlay cada ponto com 1 l de matriz HCCA contendo a calibração interna e deixar a placa-alvo a cristalizar à temperatura ambiente (5.1.2 / 5.2.4).
- espectros registro massa da estirpe de referência (secção 5.3).
- Internamente calibrar o espectro de referência para a massa de calibração (aqui: insulina a m / z = 5,806.29), e subsequentemente pré-processo, por subtracção da linha de base (TopHat) e de alisamento (parâmetros: SavitzkyGolay; largura: 2 m / z, 10 ciclos).
- Inicie o navegador espectro (por exemplo, flexAnalysis e espectro aberto: menu "File" → "Open ...; ").
- Escolha forma: menu "Método" suspenso → "Open ...", Esquerda-clique no método de escolha, por exemplo, "MBT_Standard.FAMSMethod" → "Open".
- Calibrar espectro escolhendo "Internal ..." no menu suspenso "Calibrar". Uma janela é aberta listando o pico de calibração (s) (seção 5.4). À esquerda, clique o pico de calibração (Insulin) → Esquerda-clique em "OK". Escolha "espectros processo" no menu suspenso "Processo".
- Por subtracção da linha de base activar o espectro na lista espectro no lado direito. Escolha "Subtrair Espectro de Massa Linha de Base" no menu suspenso "Processo".
- Para suavizar o espectro, activar o espectro na lista espectro no lado direito. Escolha "Smooth Espectro de Massa Linha de Base" no menu suspenso "Processo".
- A partir dos dados de sequenciamento do genoma da estirpe de referência, calcular o theoretical monoisotópico peso molecular de cada uma das proteínas codificadas por traduzir a sequência de ADN para a sequência de aminoácidos correspondente, utilizando um editor de alinhamento de sequência. Copie e cole essa sequência de proteína na caixa de entrada no Portal ExPASy Bioinformatics Resource (http://web.expasy.org/compute_pi/). e pressione "Clique aqui" para calcular pi / Mw. No caso de C. jejuni ssp. doylei calcular a massa de 14 biomarcadores detectáveis.
- Copiar os resultados em uma planilha, com uma coluna contendo o identificador de gene e no próximo o peso molecular. Ordenar as linhas de peso molecular calculado para facilitar a pesquisa de mais fácil das massas. Nota: Outras colunas são opcionais; anotação funcional pode ser especialmente útil para a interpretação mais tarde.
- Inserir uma segunda coluna para a folha de cálculo para o peso molecular da forma methioninated-de, subtraindo 135 Da do peso molecular monoisotópica. Nota: Isto é porque algumas proteínas submeter póstranslacional por remoção proteolitica da metionina N-terminal.
- Atribuir cada grande massa biomarcadores medidos para as massas calculados a partir da estirpe de referência, observando-se a massa medida da tabela do genoma preparado anteriormente (Tabela 1).
- Se os íons de biomarcadores não pode ser atribuído a produtos de genes preditos, considere outras modificações pós-translacionais (metilação, acetilação, prenilação, etc., ver http://www.abrf.org/delta-mass para uma compilação das modificações e as mudanças em massa ligados ). Para qualquer outra modificação pós-translacional conhecido que é frequentemente observada em organismos de interesse adicionar outra coluna para a mesa e recalcular o peso molecular análogo ao do processo para a forma-de methioninated.
- Configurar outro guia planilha e gravar para cada biomarcador ion a massa e identificador em uma coluna de mesa separada.
8. Avaliar Biomarcador Variabilidadena População
- Calibrar espectros de massa obtidos da coleção isolados, como foi feito para a estirpe de referência (s) (secção 5.4.2).
- Identificar biomarcadores variantes no espectro de massa. Uma massa variante caracteriza-se pela ausência de uma massa conhecida a partir do espectro de referência e a aparência de uma nova massa não presentes na referência. A diferença de massa deve estar em conformidade com uma única troca de aminoácidos (Tabela 2), ou uma combinação dos mesmos.
- Em um isolado por linha, registrar a massa medida para cada biomarcador e a isoforma previsto nas respectivas colunas da tabela.
Nota: Raramente, alguns deslocamentos de massa possa ser atribuída a várias trocas de aminoácidos diferentes, por exemplo, ambos, N trocado por D e Q trocado por E, e vice-versa, resultar em um deslocamento de massa de 0,985 Da (Tabela 2). Este problema intrínseco não pode ser resolvido só por espectrometria de massa. Portanto, diferentes isoformas no nível da sequência de proteínas com a mesma massadeve ser tratado como um único tipo MSPP. Paralelamente sequenciamento Sanger dos genes de íon de biomarcadores específicos confirmou que este problema não ocorrer enquanto MSPP-digitando o C. jejuni ssp. doylei isolar recolha utilizado no presente estudo. - Confirmar novos tipos MSPP por PCR-amplificar e sequenciar os respectivos genes biomarcadores. Por sua vez, este também serve como uma confirmação de que a identidade biomarcador foi atribuído correctamente.
- Cultura bacteriana isolados sob condições de crescimento óptimas. Cultura C. jejuni ssp. doylei estirpes em agar Columbia suplementadas com 5% de sangue de ovelha a 37 ° C sob condições microaerofílicas (5% O2, 10% CO2, 85% N2). Incubar durante ca. 48 hr. Usar uma placa de agar em separado para cada isolado para evitar a contaminação cruzada.
- Extrair DNA genômico dos isolados bacterianos usando um / máquinas automatizadas kit de extração de DNA adequado de acordo com as instruções do fabricante. <li> amplificar as respectivos genes biomarcador utilizando os iniciadores listados na Tabela 3 Realizar todas as reacções de PCR sob as seguintes condições:. desnaturação a 94 ° C durante 30 seg; hibridação a 55 ° C durante 30 seg; alongamento a 72 ° C durante 30 seg.
- Determinar a sequência de DNA de cada fragmento amplificado por Sanger de sequenciação utilizando uma quantidade adequada de ADN genómico (normalmente 600-700 ng de ADN é suficiente para uma concentração de cerca de 100 ng / mL) e um dos iniciadores de amplificação (geralmente isto é feito pela uso de um provedor de serviços).
9. Calcule a filogenia baseada no MSPP e compare ao padrão-ouro
- Concatenar as sequências de aminoácidos particulares biomarcador para t pertencenteTipo, ele MSPP dos isolados em uma seqüência contínua usando um editor de alinhamento de sequências, como BioEdit (http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html) 26 ou a planilha biomarcador.
- Calcule filogenia pelo agrupamento como foi feito para os dados de digitação padrão-ouro, por exemplo, análise de agrupamento 21.
- Comparar a filogenia baseado no MSPP à obtida com o padrão de ouro 4, 13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Anteriormente, nós estabelecemos com sucesso um esquema MSPP para C. ssp jejuni. jejuni 13. Aqui, o objetivo foi estender o método para o irmão subespécie C. ssp jejuni. doylei. Neste cenário específico, sete C. jejuni ssp. doylei isolados foram adquiridos a partir da coleção belga de microorganismos / Laboratório de Microbiologia UGent BCCM / LMG Ghent, Bélgica. Todos os sete isolados utilizados para nossas análises eram de origem humana. A cepa sequenciado o genoma ATCC 49349 (LMG 8843), originalmente isolada de fezes de uma criança australiana de 2 anos de idade com diarreia serviu de referência. A partir da coleta, seis estirpes adicionais estavam disponíveis: LMG 9143, LMG 9243, e LMG 9255 isoladas de fezes de crianças que sofrem diarréia e que vivem em Bruxelas, Bélgica; LMG 7790 (ATCC 49350) isolada a partir de uma amostra de biópsia gástrica de um indivíduo da Alemanha; e LMG 8870 (NCTC A613 / 87), bem como 8 LMG871 (NCTC A603 / 87), ambas isoladas de diferentes amostras de sangue extraídas de crianças sul-Africano.
Todos C. jejuni ssp. doylei isolados foram armazenados a -80 ° C como stocks CRYOBANK, descongelado de fresco para cada análise e cultivadas utilizando base de agar Columbia suplementadas com 5% de sangue de carneiro e a incubação durante 48 horas a 37 ° C sob condições microaerofílicas (5% de O 2, 10% de CO2, 85% N2).
Em contraste com o estabelecimento da técnica MSPP para C. jejuni ssp. jejuni 13 não era possível basear o método em um banco de dados isoforma derivado de uma sequência maior recolha. Apenas um único C. jejuni ssp. doylei entrada estava presente na base de dados rMLST, e isto correspondeu à estirpe de referência C. jejuni ssp. doylei ATCC 49349 27. Portanto, cada biodeslocamento de massa marcador detectado em comparação a estirpe C. jejuni ssp. doylei ATCC 49349 foi uma nova entrada no banco de dados isoforma e precisava ser confirmada pelo sequenciamento Sanger.
Para analisar a diversidade da C. Obteve jejuni ssp. doylei isolados, MLST foi feita e um UPGMA-dendrograma baseado em MLST incluindo os sete analisados C. jejuni ssp. doylei isolados e C. jejuni ssp. estirpe jejuni 81-176 como o outgroup calculado (Figura 1). Cada C. jejuni ssp. doylei isolado pertencia a um tipo MLST-sequência diferente, caindo em dois subgrupos. Estirpe LMG7790 teve a maior distância filogenética, em comparação com o restante C. jejuni ssp. doylei isolados.
O espectro de massa de referência gravável MALDI-TOF de C. ssp jejuni. doylei (Figura 2).
Dentro da recolha, as isoformas diferentes foram detectados para L32-H, L33, a proteína codificada pelo hipotética gi | 152939117, S20-M, e S15-M (Figura 3). As massas restantes atribuídos aos iões de biomarcadores eram invariáveis na testado C. jejuni ssp. doylei isolados. A substituição de aminoácidos correspondente aos deslocamentos de massa foram identificados por amplificação por PCR e Sanger de sequenciação do gene particular utilizando os iniciadores listados na Tabela 3. Tabela 4 lista as sequências de aminoácidos de todos os iões de biomarcadores incluídos no regime MSPP, bem como as isoformas alélicas detectados.
Um UPGMA- phyloproteomic baseado no MSPPárvore (Figura 4) foi calculada para o mesmo sete C. jejuni ssp. doylei isolados e C. ssp jejuni. jejuni estirpe 81-176, como o grupo externo usando as sequências de aminoácidos concatenados de todos os iões 14 biomarcadores em função do seu peso molecular na estirpe de referência. Cada isolado representou um tipo MSPP-sequência individual. Embora as relações phyloproteomic obtidos não eram totalmente idênticos aos obtidos por MLST, o C. jejuni ssp. doylei isolados novamente dispostas em dois subgrupos. O primeiro subgrupo foi formada por LMG 8843, LMG 8870, e LMG 9243, o segundo por LMG 9255, LMG 9143, LMG 8871 e LMG 7790. Como pode ser visto com o MLST-análise, isolar LMG7790 mostrou a distância phyloproteomic mais longo no MSPP- análise.
Figura 1: MLST-based filogenética UPGMA-árvore. Equilibrado UPGMA-dendrograma baseado em MLST construído a partir de sete C. jejuni ssp. doylei isolados e C. ssp jejuni. estirpe jejuni 81-176. código de cor Strain: LMG 8843 (preto), LMG 8870 (cinza), LMG 9243 (azul), LMG 9255 (turquesa), LMG 9143 (verde), e LMG 8871 (rosa), LMG 7790 (amarelo) e 81- 176 (branco). O tipo MLST-sequência é dada por trás do nome de cada isolado. Cada C. jejuni ssp. doylei isolar pertence a um tipo MLST-sequência diferente. Eixo dos X indica as distâncias de ligação. Estirpe LMG 7790 mostra a maior distância filogenética em comparação com os seis isolados restantes. Estirpes LMG 8843, LMG 8870, e LMG 9243, bem como LMG 9255, LMG 9143, e LMG 8871 formam dois subgrupos diferentes dentro da C. jejuni ssp. doylei cluster. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: atribuição provisória de correlatos genômicos de C. jejuni ssp. doylei ATCC 49349 (LMG 8843) para massas biomarcadores observados. Com base nas massas calculadas (composição isotópica média) de ORFs previstas de toda a sequência do genoma do C. jejuni ssp. doylei estirpe ATCC 49349, massas de biomarcadores foram designados para a proteína correspondente sequências de codificação. No entanto, dentro do alcance de medição, as massas biomarcador para as L31 subunidades ribossomais (MW = 7315 Da), S17 (PM = 9.549 Da), e S18 (PM = 10285 Da), bem como as suas isoformas methioninated-des (inset m / z = 7,000-7,200 Da) não poderia ser inequivocamente atribuído. Portanto, L31, S17, S18 e não foram incluídos no C. jejuni ssp. doylei esquema MSPP. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: específicas picos de massa biomarcador da C. jejuni ssp. doylei esquema MSPP. Em cada painel de espectros de massa de todos os sete testado C. . jejuni ssp doylei isolados (código de cor como na Figura 1) correspondentes aos tipos particulares MSPP foram sobrepostos aos deslocamentos de massa indicam biomarcador devido a isoformas alélicas: (A) L36 + H +; (B) L34 + H +; (C) L32-M + H +; (D +; (E) S14-M + H +; (F) L29 + H +, L28-M + H +, e L35-M + H +; (L) L24-M + H +; (H) gi | 152939117 + H +; (I) L27-M + H +; (J) S20-M + H +; (K) S15-M + H +; (G) S19-M + H +; (M) uma massa intensa obscurecendo variável potencial de pico biomarcador de proteína ribossômica S18; (N) S20-M + 2H +; (S) L15-M + 2H +; X-Eixos: massa [Da] · Taxa de 1-ratio, escala de 200 Da. Eixos Y: Intensidade [unidades arbitrárias], os espectros foram ajustados individualmente para um nível de ruído equivalente, para melhor visualização dos picos de baixa intensidade. "-M" Após o nome de uma subunidade ribossômica indica a isoforma methioninated-de. Por favor, clique delae para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4:. Baseado no MSPP phyloproteomic UPGMA-árvore A UPGMA-árvore phyloproteomic representado inclui os mesmos sete C. jejuni ssp. doylei isolados e C. jejuni ssp. estirpe jejuni 81-176 como na Figura 1. A (código de cor como na Figura 1) ponto colorido indica cada estirpe. Para melhor comparação, os isolados são dispostas por ordem de entrada, o qual foi obtido o fim da árvore baseado no MLST. O eixo abaixo da dendrograma indica as distâncias de ligação. Embora as relações phyloproteomic obtidos não são completamente idênticas à árvore baseada em MLST filogenética, o quadro global é comparável. A população se divide em dois grupos: os três isola LMG 8843, LMG 8870, e LMG 9243 formam um cluster, enquanto LMG 9255, LMG 9143, LMG 8871 e LMG 7790 forma um segundo cluster. Dentro deste agrupamento LMG 7790 mostra a maior distância phyloproteomic em comparação com o subgrupo formado por LMG 9255, LMG 9143, e LMG 8871. Dentro deste subgrupo LMG 9143 muda de posição em relação à LMG 9255. No entanto, mesmo utilizando-MSPP método representa cada isolado um tipo de MSSP-sequência individual. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1: Calculada massas de todos os ORFs anotada da C. jejuni ssp. doylei ATCC 49349 estirpe. Lista de todos os pesos moleculares calculados monoisotópica de cada uma das proteínas codificadas no C. ssp jejuni. doylei ATCC 49349 genoma. O Expasy Bioinformatics Resource Portal foi utilizado para o cálculo das massas moleculares específicos. Coluna B lista as isoformas methioninated passo que a coluna C lista as isoformas methioninated-DE. Massas de biomarcadores incluídos no C. jejuni ssp. doylei esquema MSPP são destacadas em vermelho. Nota: A L36 proteína biomarcador não é anotada na sequência do genoma do C. jejuni ssp. doylei ATCC49349. Por favor clique aqui para baixar esse arquivo.
Tabela 2:. A variação de massa induzidas por mudanças de aminoácidos devido a SNPs individuais Todos os potenciais polimorfismos de nucleotídeo único foram verificadas para a troca de aminoácido resultante utilizando o código genético padrão. Todas as mutações silenciosas foram descartados, e mutações nonsynonymous compilado em conjunto com o resulting modificação em massa. Por favor clique aqui para baixar esse arquivo.
Tabela 3: Os iniciadores oligonucleotídicos utilizados para a sequenciação de C. jejuni ssp. doylei genes incluídos no MSPP-scheme Por favor clique aqui para baixar esse arquivo.
Tabela 4: Visão de todas as isoformas incluído no C. jejuni ssp. doylei MSPP-regime. Esta tabela lista todos os íons de biomarcadores incluídos no C. ssp jejuni. doylei MSPP scheme. A sequência de aminoácidos da estirpe de referência ATCC 49349 é dada completamente. Para mais isoformas detectáveis, substituições de aminoácidos única específicas estão listadas. A numeração de aminoácidos inclui sempre a start-metionina; se a espectrometria de massa indica a sua ausência, está escrito entre parênteses (M). Para cada massa molecular isoforma, diferença de massa das estirpes de referência ATCC 49349 isoformas e frequência dentro do conjunto de dados isoforma é indicado. Por favor clique aqui para baixar esse arquivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
O passo mais crítico no estabelecimento de um regime de MSPP é a determinação genética inequívoca de identidades biomarcador íon. Se não for possível identificar um biomarcador, sem dúvida, então ele deve ser excluído do regime 13.
A C. ssp. doylei esquema jejuni inclui 14 diferentes íons de biomarcadores. Estes são menos 5 em comparação com o C. jejuni ssp. esquema jejuni MSPP 13 .A diferença mais significativa entre o detectável C. jejuni ssp. jejuni e C. jejuni ssp. doylei biomarcadores foi a remoção pós-tradução da metionina amino-terminal no caso de L31 (-M) e L35 (-M) 13.
Como mostrado na testado C. jejuni ssp. doylei isolar coleção, MSPP foi capaz de discriminar todos os sete tipos de seqüência MLST diferentes. Isto significa que cada isolado testado pertencia a uma sequ MSPP específicaTipo cia. Além disso, permite MSPP subespécie diferenciação entre C. jejuni ssp. jejuni e C. ssp jejuni. doylei.
Em geral, o potencial de discriminar isolados a nível abaixo da estirpe por MSPP é menor em comparação com métodos baseada na sequência de DNA como MLST. Assumindo uma base de dados isoforma bem estabelecida, a subtipagem de isolados de bactérias é muito mais rápido e muito mais barato em comparação com métodos de sequenciação de DNA 4, 13.
A maior vantagem do MSPP em comparação com métodos de agrupamentos hierárquicos de ICMS-espectros como o uso da análise de componentes principais (PCA) 4, 10, 28 ou análise UPGMA da matriz matemática que resulta da comparação de correspondência de pico de binário perfis 29, 30 é a sua elevada reprodutibilidade intrínseca. Embora diferentes condições culturais, como cultur diferentee meios de comunicação, diferentes taxas de ágar, temperatura de incubação diferente, e períodos de incubação diferentes afetar significativamente as relações phyloproteomic calculados pelo PCA, eles não afetam as relações MSPP deduzidas 6, 13. A principal razão para esta alta reprodutibilidade é a independência do pico de intensidade e qualidade espectro de massa em geral 13. Se um pico correspondente MSPP no espectro de massa de um isolado não pode ser identificada sem dúvida, que é necessário para registar o espectro de massa do isolado de novo indivíduo.
O método MSPP pode ser adaptado, em princípio, a todas as espécies microbianas. Especialmente, a subtipagem de espécies microbianas clínicas relevantes, como Clostridium difficile, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella enterica e ssp. Entérica são potenciais futuras aplicações. Se a expressão de factores de virulência ou os genes de resistência correlaciona-se com o Phylrelacionamento oproteomic, MSPP pode se tornar uma ferramenta inovadora em diagnósticos clínicos de rotina. O número de picos detectáveis e assim o número de iões de biomarcadores incluídos no regime MSPP poderia potencialmente ser aumentada através da utilização específica de extracção e / ou protocolos de lise, especialmente no caso dos fungos 31.
As técnicas de MALDI-TOF recentemente utilizados principalmente pode detectar apenas as proteínas ribossomais altamente abundantes. Estas proteínas altamente abundantes interferir com quase todas as outras proteínas mais pequenas, tais como factores de virulência no espectro de massa. Proteínas mais pequenas pode ser detectada ligando ESI-TOF-MS (Electropulverização tempo de ionização de voo de espectrometria de massa) e por HPLC (cromatografia líquida de alta eficiência) 32. No entanto, atualmente este método é muito trabalho e dispendiosa para caracterizar maiores coortes isolados.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| acetonitrile | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | 34967 | |
| Autoflex III TOF/TOF 200 system | Bruker Daltonics, Bremen, Germany | GT02554 G201 | Mass spectrometer |
| bacterial test standard BTS | Bruker Daltonics, Bremen, Germany | 604537 | |
| BioTools 3.2 SR1 | Bruker Daltonics, Bremen, Germany | 263564 | Software Package |
| Bruker IVD Bakterial Test Standard | Bruker Daltonics, Bremen, Germany | 8290190 | 5 tubes |
| Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate | Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium | LMG8843 | ATCC 49349;IMVS 1141;NCTC 11951;strain 093 |
| Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate | Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium | LMG9143 | Goossens Z90 |
| Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate | Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium | LMG7790 | ATCC 49350;CCUG 18265;Kasper 71;LMG 8219;NCTC 11847 |
| Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate | Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium | LMG9243 | Goossens N130 |
| Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate | Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium | LMG8871 | NCTC A603/87 |
| Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate | Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium | LMG9255 | Goossens B538 |
| Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate | Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium | LMG8870 | NCTC A613/87 |
| Columbia agar base | Merck, Darmstadt, Germany | 1.10455 .0500 | 500 g |
| Compass for FlexSeries 1.2 SR1 | Bruker Daltonics, Bremen, Germany | 251419 | Software Package |
| defibrinated sheep blood | Oxoid Deutschland GmbH, Wesel, Germany | SR0051 | |
| ethanol | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | 02854 Fluka | |
| formic acid | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | F0507 | |
| HCCA matrix | Bruker Daltonics, Bremen, Germany | 604531 | |
| Kimwipes paper tissue | Kimtech Science via Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | Z188956 | |
| MALDI Biotyper 2.0 | Bruker Daltonics, Bremen, Germany | 259935 | Software Package |
| Mast Cryobank vials | Mast Diagnostica, Reinfeld, Germany | CRYO/B | |
| MSP 96 polished steel target | Bruker Daltonics, Bremen, Germany | 224989 | |
| QIAamp DNA Mini Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 51304 | |
| recombinant human insulin | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | I2643 | |
| trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | T6508 | |
| water, molecular biology-grade | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | W4502 |
References
- Seng, P., et al. Ongoing revolution in bacteriology: routine identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Clin Infect Dis. 49 (4), 543-551 (2009).
- Bader, O. MALDI-TOF-MS-based species identification and typing approaches in medical mycology. Proteomics. 13 (5), 788-799 (2013).
- Sandrin, T. R., Goldstein, J. E., Schumaker, S. MALDI TOF MS profiling of bacteria at the strain level: a review. Mass Spectrom Rev. 32 (3), 188-217 (2013).
- Zautner, A. E., et al. Discrimination of multilocus sequence typing-based Campylobacter jejuni subgroups by MALDI-TOF mass spectrometry. BMC Microbiol. 13, 247 (2013).
- Reil, M., et al. Recognition of Clostridium difficile PCR-ribotypes 001, 027 and 126/078 using an extended MALDI-TOF MS system. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 30 (11), 1431-1436 (2011).
- Kuhns, M., Zautner, A. E., et al. Rapid discrimination of Salmonella enterica serovar Typhi from other serovars by MALDI-TOF mass spectrometry. PLoS One. 7 (6), e40004 (2012).
- Wolters, M., et al. MALDI-TOF MS fingerprinting allows for discrimination of major methicillin-resistant Staphylococcus aureus lineages. Int J Med Microbiol. 301 (1), 64-68 (2011).
- Josten, M., et al. Analysis of the matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrum of Staphylococcus aureus identifies mutations that allow differentiation of the main clonal lineages. J Clin Microbiol. 51 (6), 1809-1817 (2013).
- Lu, J. J., Tsai, F. J., Ho, C. M., Liu, Y. C., Chen, C. J. Peptide biomarker discovery for identification of methicillin-resistant and vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus strains by MALDI-TOF. Anal Chem. 84 (13), 5685-5692 (2012).
- Novais, A., et al. MALDI-TOF mass spectrometry as a tool for the discrimination of high-risk Escherichia coli clones from phylogenetic groups B2 (ST131) and D (ST69, ST405, ST393). Eur J Clin Microbiol Infect Dis. , (2014).
- Matsumura, Y., et al. Detection of extended-spectrum-beta-lactamase-producing Escherichia coli ST131 and ST405 clonal groups by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry. J Clin Microbiol. 52 (4), 1034-1040 (2014).
- Christner, M., et al. Rapid MALDI-TOF Mass Spectrometry Strain Typing during a Large Outbreak of Shiga-Toxigenic Escherichia coli. PLoS One. 9 (7), e101924 (2014).
- Zautner, A. E., Masanta, W. O., Weig, M., Groß, U., Bader, O. Mass Spectrometry-based PhyloProteomics (MSPP): A novel microbial typing Method. Scientific Reports. 5, (2015).
- The global view of campylobacteriosis. WHO. World Health Organisation (WHO), , Available from: http://www.who.int/foodsafety/publications/campylobacteriosis/en/ (2013).
- Dasti, J. I., Tareen, A. M., Lugert, R., Zautner, A. E., Gross, U. Campylobacter jejuni: a brief overview on pathogenicity-associated factors and disease-mediating mechanisms. Int J Med Microbiol. 300 (4), 205-211 (2010).
- Zautner, A. E., et al. Seroprevalence of campylobacteriosis and relevant post-infectious sequelae. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 33 (6), 1019-1027 (2014).
- Zautner, A. E., Herrmann, S., Groß, U. Campylobacter jejuni - The Search for virulence-associated factors. Archiv Fur Lebensmittelhygiene. 61 (3), 91-101 (2010).
- Dingle, K. E., et al. Multilocus sequence typing system for Campylobacter jejuni. J Clin Microbiol. 39 (1), 14-23 (2001).
- Dingle, K. E., et al. Molecular characterization of Campylobacter jejuni clones: a basis for epidemiologic investigation. Emerg Infect Dis. 8 (9), 949-955 (2002).
- Cody, A. J., et al. Real-time genomic epidemiological evaluation of human Campylobacter isolates by use of whole-genome multilocus sequence typing. J Clin Microbiol. 51 (8), 2526-2534 (2013).
- Tamura, K., Stecher, G., Peterson, D., Filipski, A., Kumar, S. MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0. Mol Biol Evol. 30 (12), 2725-2729 (2013).
- Jolley, K. A., Chan, M. S., Maiden, M. C. mlstdbNet - distributed multi-locus sequence typing (MLST) databases. BMC Bioinformatics. 5, 86 (2004).
- Verroken, A., et al. Evaluation of Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry for Identification of Nocardia Species. J Clinl Microbiol. 48 (11), 4015-4021 (2010).
- El Khéchine, A., Couderc, C., Flaudrops, C., Raoult, D., Drancourt, M. Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry Identification of Mycobacteria in Routine Clinical Practice. PLoS ONE. 6 (9), e24720 (2011).
- Goujon, M., et al. A new bioinformatics analysis tools framework at EMBL-EBI. Nucleic Acids Research. 38, Web Server issue 695-699 (2010).
- Hall, T. A. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucleic Acids Symposium Series. 41, 95-98 (1999).
- Jolley, K. A., et al. Ribosomal multilocus sequence typing: universal characterization of bacteria from domain to strain. Microbiology. 158, 1005-1015 (2012).
- Suarez, S., et al. Ribosomal proteins as biomarkers for bacterial identification by mass spectrometry in the clinical microbiology laboratory. J Microbiol Methods. 94 (3), 390-396 (2013).
- Teramoto, K., et al. Phylogenetic classification of Pseudomonas putida strains by MALDI-MS using ribosomal subunit proteins as biomarkers. Anal Chem. 79 (22), 8712-8719 (2007).
- Teramoto, K., Kitagawa, W., Sato, H., Torimura, M., Tamura, T., Tao, H. Phylogenetic analysis of Rhodococcus erythropolis based on the variation of ribosomal proteins as observed by matrix-assisted laser desorption ionization-mass spectrometry without using genome information. J Biosci Bioeng. 108 (4), 348-353 (2009).
- Bernhard, M., Weig, M., Zautner, A. E., Gross, U., Bader, O. Yeast on-target lysis (YOTL), a procedure for making auxiliary mass spectrum data sets for clinical routine identification of yeasts. J Clin Microbiol. 52 (12), 4163-4167 (2014).
- Stark, T., et al. Mass spectrometric profiling of Bacillus cereus strains and quantitation of the emetic toxin cereulide by means of stable isotope dilution analysis and HEp-2 bioassay. Anal Bioanal Chem. 405 (1), 191-201 (2012).
