Summary

En effektiv metode til at opnå dedifferentierede fedtceller

Published: July 15, 2016
doi:

Summary

We have modified the conditions for DFAT cell generation and provide herein information regarding the use of an improved growth medium for the production of these cells.

Abstract

Tissue engineering og celleterapi lover godt klinisk. I denne henseende kan multipotente celler, såsom mesenchymstamceller (MSC), anvendes terapeutisk, i den nærmeste fremtid, at genoprette funktionen af ​​beskadigede organer. Ikke desto mindre er flere tekniske spørgsmål, herunder den meget invasiv procedure isolere MSC og ineffektivitet omgiver deres forstærkning, i øjeblikket hæmmer den potentielle kliniske anvendelse af disse terapeutiske modaliteter. Heri, introducerer vi en meget effektiv fremgangsmåde til generering af dedifferentierede fedtceller (DFAT), MSC-lignende celler. Interessant nok kan DFAT celler differentieres i flere celletyper, herunder adipogenisk, osteogene, og chondrogene celler. Selv om andre grupper tidligere har præsenteret forskellige metoder til at generere DFAT celler fra modent fedtvæv, vores metode giver os mulighed for at producere DFAT celler mere effektivt. I denne henseende viser vi, at DFAT dyrkningsmedium (DCM), suppleret med 20% FBS,er mere effektiv til frembringelse DFAT celler end DMEM, suppleret med 20% FBS. Derudover kan de DFAT celler produceret af vores cellekultur metode redifferentiated i flere vævstyper. Som sådan er en meget interessant og nyttig model til undersøgelse af væv dedifferentiation præsenteret.

Introduction

Celleterapi og vævsmanipulering er varme emner inden for regenerativ medicin 1-5. Mens disse terapeutiske modaliteter lover godt, flere tekniske spørgsmål i øjeblikket hæmmer deres kliniske anvendelse. I denne henseende som i genereringen af ​​iPS celler skal alle vævsteknologiske terapier producere celler fri for eksterne gen transduktioner for at opretholde patientens sikkerhed. Derfor var vi den første gruppe at kunne producere humane DFAT celler 6. Flere andre forskergrupper har siden vedtaget vores metode til at generere DFAT celler i pattedyr 7-9, yderligere fremhæver nytten af vores model.

I løbet af adskillige undersøgelser har vi fundet, at kvaliteten af ​​den celledyrkningsmiljøet kan modificeres ved at justere indholdet af cellen medium. Denne opdagelse har ført til en stigning i succesraten for DFAT celle produktion og forbedret cellernes kvalitet; både kritiske faktorer ieffektivt generere celler for fremtidige kliniske forsøg. I denne henseende en forbedret DFAT dyrkningsmedium (DCM, et medium, der ligner med mesenchymale stamceller medium, der indeholder rekombinant humant insulin, serum albumin, L-glutaminsyre, flere fedtsyrer og kolesterol) og en fremgangsmåde til DFAT celle generering og spredning blev udviklet (mere information om indholdet af DCM er til rådighed efter anmodning). Anvendelse af denne fremgangsmåde høj kvalitet DFAT celler blev genereret med evnen til at differentiere til flere celletyper, herunder adipogenisk, osteogene, og chondrogene celler. Tilsammen valideret cellekultur protokol øger kvaliteten af ​​DFAT celler og kan være ganske nyttig til forøgelse kliniske anvendelser af celleterapi og vævsmanipulering.

Protocol

Prøver af menneskelig subkutant fedt blev opnået fra patienter, der gennemgår kirurgi i departementerne plastikkirurgi, Urologi, Pediatric Surgery og Ortopædisk Kirurgi af Nihon University Itabashi Hospital (Tokyo, Japan). Patienterne gav skriftligt informeret samtykke, og den etiske komité i Nihon University School of Medicine godkendt undersøgelsen. 1. Vævspræparat Bring vævsprøve fra operationsstuen til laboratoriet. Vask 1-2 g fedtvæv med 5 ml PBS (-) ved …

Representative Results

I denne undersøgelse blev metoden og værktøjssæt til DFAT celle generation forbedret (figur 1). Vores metode giver os mulighed for at generere DFAT celler under anvendelse af både DCM og DMEM-medium indeholdende 20% FBS (figur 2A). Som sådan sammenlignede vi effektiviteten af ​​DCM og DMEM i generering DFAT celler. I denne henseende DCM forbedret DFAT celleproliferation med tre gange sammenlignet med DMEM, uanset antallet af adipocytter <…

Discussion

Modne adipocytter der gennemgår in vitro dedifferentiering, en proces kendt som loft kultur, kan vende tilbage til en mere primitiv fænotype og få proliferative evner. Disse celler benævnes dedifferentierede fedt (DFAT) celler. Den multilineage differentiering potentiale DFAT celler blev evalueret. Flowcytometrianalyse og genekspression analyse afslørede, at DFAT celler blev stærkt homogene i forhold til ASC'er 6. Faktisk celleoverfladeantigen profil DFAT celler er meget lig dem, der findes…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This research was supported in part by Program for Creating Start-ups from Advanced Research and Technology (START Program) from the Japan Society for the Promotion of Science (ST261006IP, TM) and by Program for the Strategic Research Foundation at Private Universities (2014-2019) (S1411018, TM) from the Ministry of Education, Sports, Science and Technology.

Materials

CSTI303-MSC medium  CSTI 87-671 This medium is defined as DCM in the text
PBS(-) Wako 166-23555 It does not contain Mg2+ and Ca2+
DMEM medium Gibco 11965-092
Fetal Bovine Serum Sigma 172012
Collagenase type II Sigma C-6885
Scissors Takasago Medical Industry Co., Ltd TKZ-F2194-1
Shaker TAITEC Bioshaker V.BR-36
Falcon Cell Strainer 100um Yellow CORNING LIFE SCIENCES  DL 352360
Falcon 12.5cm² Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Blue Vented Screw Cap CORNING LIFE SCIENCES  353107
18G needle NIPRO 02-002
20ml Syringe  NIPRO 08-753
Z Series Coulter Counter BECKMAN COULTER 383550

References

  1. Lanzoni, G., et al. Concise review: clinical programs of stem cell therapies for liver and pancreas. Stem Cells. 31 (10), 2047-2060 (2013).
  2. de Girolamo, L., et al. Mesenchymal stem/stromal cells: a new “cells as drugs” paradigm. Efficacy and critical aspects in cell therapy. Curr. Pharm. Des. 19 (13), 2459-2473 (2013).
  3. Lindroos, B., Suuronen, R., Miettinen, S. The potential of adipose stem cells in regenerative medicine. Stem Cell. Rev. 7 (2), 269-291 (2011).
  4. Yan, J., Tie, G., Xu, T. Y., Cecchini, K., Messina, L. M. Mesenchymal stem cells as a treatment for peripheral arterial disease: current status and potential impact of type II diabetes on their therapeutic efficacy. Stem Cell. Rev. 9 (3), 360-372 (2013).
  5. Ringden, O., Keating, A. Mesenchymal stromal cells as treatment for chronic GVHD. Bone Marrow Transplant. 46 (2), 163-164 (2011).
  6. Matsumoto, T., et al. Mature adipocyte-derived dedifferentiated fat cells exhibit multilineage potential. J. Cell. Physiol. 215 (1), 210-222 (2008).
  7. Lessard, J., et al. Generation of human adipose stem cells through dedifferentiation of mature adipocytes in ceiling cultures. J. Vis. Exp. (97), (2015).
  8. Lessard, J., et al. Characterization of dedifferentiating human mature adipocytes from the visceral and subcutaneous fat compartments: fibroblast-activation protein alpha and dipeptidyl peptidase 4 as major components of matrix remodeling. PLoS One. 10 (3), 0122065 (2015).
  9. Peng, X., et al. Phenotypic and Functional Properties of Porcine Dedifferentiated Fat Cells during the Long-Term Culture In Vitro. Biomed. Res. Int. 2015, 673651 (2015).
  10. Kono, S., Kazama, T., Kano, K., Harada, K., Uechi, M., Matsumoto, T. Phenotypic and functional properties of feline dedifferentiated fat cells and adipose-derived stem cells. Vet. J. 199 (1), 88-96 (2014).
  11. Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. Induced pluripotent stem cells: the new patient. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13 (11), 713-726 (2012).

Play Video

Cite This Article
Taniguchi, H., Kazama, T., Hagikura, K., Yamamoto, C., Kazama, M., Nagaoka, Y., Matsumoto, T. An Efficient Method to Obtain Dedifferentiated Fat Cells. J. Vis. Exp. (113), e54177, doi:10.3791/54177 (2016).

View Video