En effektiv metode til at opnå dedifferentierede fedtceller

Summary

We have modified the conditions for DFAT cell generation and provide herein information regarding the use of an improved growth medium for the production of these cells.

Abstract

Tissue engineering og celleterapi lover godt klinisk. I denne henseende kan multipotente celler, såsom mesenchymstamceller (MSC), anvendes terapeutisk, i den nærmeste fremtid, at genoprette funktionen af ​​beskadigede organer. Ikke desto mindre er flere tekniske spørgsmål, herunder den meget invasiv procedure isolere MSC og ineffektivitet omgiver deres forstærkning, i øjeblikket hæmmer den potentielle kliniske anvendelse af disse terapeutiske modaliteter. Heri, introducerer vi en meget effektiv fremgangsmåde til generering af dedifferentierede fedtceller (DFAT), MSC-lignende celler. Interessant nok kan DFAT celler differentieres i flere celletyper, herunder adipogenisk, osteogene, og chondrogene celler. Selv om andre grupper tidligere har præsenteret forskellige metoder til at generere DFAT celler fra modent fedtvæv, vores metode giver os mulighed for at producere DFAT celler mere effektivt. I denne henseende viser vi, at DFAT dyrkningsmedium (DCM), suppleret med 20% FBS,er mere effektiv til frembringelse DFAT celler end DMEM, suppleret med 20% FBS. Derudover kan de DFAT celler produceret af vores cellekultur metode redifferentiated i flere vævstyper. Som sådan er en meget interessant og nyttig model til undersøgelse af væv dedifferentiation præsenteret.

Introduction

Celleterapi og vævsmanipulering er varme emner inden for regenerativ medicin ^1-5. Mens disse terapeutiske modaliteter lover godt, flere tekniske spørgsmål i øjeblikket hæmmer deres kliniske anvendelse. I denne henseende som i genereringen af ​​iPS celler skal alle vævsteknologiske terapier producere celler fri for eksterne gen transduktioner for at opretholde patientens sikkerhed. Derfor var vi den første gruppe at kunne producere humane DFAT celler ^6. Flere andre forskergrupper har siden vedtaget vores metode til at generere DFAT celler i pattedyr ^7-9, yderligere fremhæver nytten af vores model.

I løbet af adskillige undersøgelser har vi fundet, at kvaliteten af ​​den celledyrkningsmiljøet kan modificeres ved at justere indholdet af cellen medium. Denne opdagelse har ført til en stigning i succesraten for DFAT celle produktion og forbedret cellernes kvalitet; både kritiske faktorer ieffektivt generere celler for fremtidige kliniske forsøg. I denne henseende en forbedret DFAT dyrkningsmedium (DCM, et medium, der ligner med mesenchymale stamceller medium, der indeholder rekombinant humant insulin, serum albumin, L-glutaminsyre, flere fedtsyrer og kolesterol) og en fremgangsmåde til DFAT celle generering og spredning blev udviklet (mere information om indholdet af DCM er til rådighed efter anmodning). Anvendelse af denne fremgangsmåde høj kvalitet DFAT celler blev genereret med evnen til at differentiere til flere celletyper, herunder adipogenisk, osteogene, og chondrogene celler. Tilsammen valideret cellekultur protokol øger kvaliteten af ​​DFAT celler og kan være ganske nyttig til forøgelse kliniske anvendelser af celleterapi og vævsmanipulering.

Protocol

Prøver af menneskelig subkutant fedt blev opnået fra patienter, der gennemgår kirurgi i departementerne plastikkirurgi, Urologi, Pediatric Surgery og Ortopædisk Kirurgi af Nihon University Itabashi Hospital (Tokyo, Japan). Patienterne gav skriftligt informeret samtykke, og den etiske komité i Nihon University School of Medicine godkendt undersøgelsen. 1. Vævspræparat Bring vævsprøve fra operationsstuen til laboratoriet. Vask 1-2 g fedtvæv med 5 ml PBS (-) ved …

Representative Results

I denne undersøgelse blev metoden og værktøjssæt til DFAT celle generation forbedret (figur 1). Vores metode giver os mulighed for at generere DFAT celler under anvendelse af både DCM og DMEM-medium indeholdende 20% FBS (figur 2A). Som sådan sammenlignede vi effektiviteten af ​​DCM og DMEM i generering DFAT celler. I denne henseende DCM forbedret DFAT celleproliferation med tre gange sammenlignet med DMEM, uanset antallet af adipocytter <…

Discussion

Modne adipocytter der gennemgår in vitro dedifferentiering, en proces kendt som loft kultur, kan vende tilbage til en mere primitiv fænotype og få proliferative evner. Disse celler benævnes dedifferentierede fedt (DFAT) celler. Den multilineage differentiering potentiale DFAT celler blev evalueret. Flowcytometrianalyse og genekspression analyse afslørede, at DFAT celler blev stærkt homogene i forhold til ASC'er ^6. Faktisk celleoverfladeantigen profil DFAT celler er meget lig dem, der findes…

Materials

CSTI303-MSC medium	CSTI	87-671	This medium is defined as DCM in the text
PBS(-)	Wako	166-23555	It does not contain Mg2+ and Ca2+
DMEM medium	Gibco	11965-092
Fetal Bovine Serum	Sigma	172012
Collagenase type II	Sigma	C-6885
Scissors	Takasago Medical Industry Co., Ltd	TKZ-F2194-1
Shaker	TAITEC	Bioshaker V.BR-36
Falcon Cell Strainer 100um Yellow	CORNING LIFE SCIENCES	DL 352360
Falcon 12.5cm² Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Blue Vented Screw Cap	CORNING LIFE SCIENCES	353107
18G needle	NIPRO	02-002
20ml Syringe	NIPRO	08-753
Z Series Coulter Counter	BECKMAN COULTER	383550