Summary

Uygulanması Floresan Rezonans Enerji Transferi (FRET) tarafından Efektör Translokasyon Verimliliği incelemek için<em> Coxiella burnetii</em> SiRNA susturma sırasında

Published: July 06, 2016
doi:

Summary

bakteriyel patojenler ve ev sahipleri arasındaki etkileşimleri araştıran biyolojik araştırmaların önemli bir alandır. Burada, Blam substrat kullanılarak siRNA gen susturma sırasında Coxiella burnetii'nin efektör translokasyonu ölçmek için gerekli teknikleri tarif eder.

Abstract

Coxiella burnetii, Q humması etkeni bir yineleme niş kurmak Tip IV Dot / ICM Salgı Sistemi dayanan bir hücre içi patojen olduğunu. efektör kohort ana işlemleri değiştirmek ve replikasyon için benzersiz bir lizozom türetilmiş vakuol kurulmasına izin vermek için konakçı hücreye Bu sistem sayesinde transloke edilmiştir. özgü gen siRNA kullanarak susturma ve β-laktamaz aktivitesinin dayanan bir FRET tabanlı substrat kullanılarak efektör translokasyon ölçümü: Burada sunulan yöntem, iki köklü teknikleri kombinasyonunu içermektedir. Bu iki yaklaşım uygulamak, bakteriyel salgı sistemi fonksiyonu ve efektör translokasyon ev sahibi faktörlerin rolünü anlamaya başlayabiliriz. Bu çalışmada, Rab5A ve Rab7A hem endositik trafik yolunun düzenlenmesi açısından çok önemlidir rolü incelenmiştir. Bu efektör translocatio bir azalma ya da proteinleri de ekspresyonunu susturma göstermektedirn verimlilik. Bu yöntemler de kolayca salgı sistemlerini kullanan diğer hücre içi ve hücre dışı patojenlerin incelemek için modifiye edilebilir. Bu şekilde, bakteriyel efektör translokasyon katılan ana faktörler hakkında genel bir tablo ortaya çıkarılabilir.

Introduction

Coxiella burnetii zoonotik insan enfeksiyon Q ateşe neden benzersiz bir hücre içi patojen olduğunu. Bu hastalık asemptomatik serokonversiyon sıklıkla maruz sonra 1 endokardit yıl olarak tezahür hayatı tehdit kronik enfeksiyona uzanan klinik sunumlar geniş bir yelpazede ile ilişkilidir. İnsan enfeksiyon öncelikle geviş getiren, özellikle, süt inek, koyun ve keçilerde enfeksiyonu için önemli rezervuar, kirlenmiş aerosollerin solunması yoluyla gerçekleşir. Bu hayvanlarda Coxiella enfeksiyonu genellikle subklinik olmasına rağmen, enfeksiyon kürtaj tetikleyebilir ve doğum sıvısı ve plasentanın içinde hatırı sayılır bakteriyel yük yerel çevreyi 1 kirletebilir. Halk sağlığı ve tarım sektöründe hem son zamanlarda Hollanda'da 2 meydana gelen Q humması salgını gözlendi üzerinde büyük bir yük gibi bir kontaminasyon örneğidir olabilir. 2007 ve arasında2010 Q humması 4.000 'den fazla insan vakası teşhis edildi ve bu salgın keçi çiftlikleri 3 önemli kirlenme bağlıydı. Ayrıca, Coxiella şiddetli morbidite ve mortaliteye 4 neden bakteri ve gerekli düşük bulaşıcı dozun çevresel istikrara Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezleri tarafından sınıflandırılmış olarak, bir potansiyel biyolojik silahtır.

Coxiella iki aşamada vardır: doğal kaynaklardan izole Faz I organizmalar, son derece öldürücü ve Faz II organizmalar yüksek in vivo zayıflatılmaktadır. Örneğin, Coxiella burnetti dokuz Mile Faz I organizmaların çeşitli in vitro geçiş sonrası, Faz II bakteri kesik lipopolisakarit ile sonuçlanan geri dönüşü olmayan bir kromozom silme içeren üretildi (LPS) 5. Bu suş, C. burnetii NMII, doku kültürü modelleri I Faz fenotipik benzer ve daha güvenli bir modu sağlarAraştırmacılar laboratuvarlarda 5 Coxiella hastalık oluşumunun incelenmesinde l. Son yıllarda birçok atılımlar hızla Coxiella genetik alanında gelişmiş var. En önemlisi, aksenik ortam geliştirilmesi (sitrat sistein orta asitleştirildi – ACCM-2) hem sıvı ve katı ortam 6,7 ile Coxiella hücresiz büyüme sağlamıştır. Bu uyarılabilir gen sentezleme sistemi için, mekik vektörleri ve rasgele transpozon sistemleri 8-11 de dahil olmak üzere Coxiella için genetik araçlar doğrudan gelişmeler ile sonuçlandı. En son, hedeflenen gen inaktivasyonu için iki yöntem de belirli virülans gen adayları 12 incelenmesi için önünü geliştirilmiştir.

Alveoler makrofajlar tarafından içselleştirilmesi ardından, Coxiella membrana bağlı bölme içinde yüksek sayılara çoğaltır vakuol (CCV) içeren Coxiella- adlandırılan. CCV konak endositik ticaretini inci gerektirirkaba erken ve geç endozomlar bir lizozom kökenli organel 13 içine olgunlaşır kadar. Bu süreç boyunca, CCV ya geçici görünür ya da dahil olmak üzere, vakuol ile ilişkili, ancak Rab5, Rab7, CD63 ve LAMP-13-15 Ocak, bunlarla sınırlı olmamak kalır konakçı faktörleri kazanır. Konak hücreleri içinde Coxiella çoğaltma tamamen işlevsel Dot / ICM Tipi IVB salgılanması Sistemi (T4SS) 8,16,17 tamamen bağlıdır. Bu salgı sistemi ancestrally konjugasyon sistemleri ile ilgili bir çok protein yapısı ve bakteriyel proteinler sunmak için hem bakteriyel ve vakuoler membranlar yayılan, ev sahibi sitoplazmada 18 içine, etkileyiciler olarak adlandırılan. Coxiella T4SS işlevsel Legionella pneumophila 19,20 iyi karakterize Tip IVB Nokta / ICM salgılama sistemine çok benzer. Coxiella asidik lizozom türetilmiş ulaşıncaya kadar İlginç bir şekilde, T4SS ve daha sonra efektör translokasyon aktivasyonu oluşmazorganel, yaklaşık 8 saat sonrası enfeksiyon 17,21. Bugüne kadar, 130 üzerinden Nokta / ICM efektörler 9,17,22-24 tespit edilmiştir. Bu etkileyiciler çoğu büyük olasılıkla konak hücreleri içinde Coxiella replikasyonu sırasında önemli rol oynamaktadır; Bununla birlikte, sadece bir kaç efektör işlevsel 25-29 karakterize edilmiştir.

Bu çalışmada, konakçı hücre sitoplazması içinde β-laktamaz aktivitesi ile (bundan sonra Bam alt-tabaka olarak da adlandırılır) CCF2-AM FRET alt-tabaka (Şekil 1) bölünmesi dayanan bir floresans bazlı translokasyon deneyi kullanmaktadır. ilgi konusu genin yapısal ekspresyonu sağlayan bir raportör plasmidi ile β-laktamaz (Bam)-1 TEM kaynaştırılır. Bam alt-tabaka, bir FRET çifti oluşturan iki florofor (kumarin ve floresein) oluşmaktadır. floresein ve efektör translokasyon yokluğunda yeşil floresan emisyon FRET içinde kumarin sonuçlarının Tahrik olma; Bununla birlikte, Bla halindeM-efektör füzyon proteini, konakçı sitoplazma içerisine doğru olan, elde edilen β-laktamaz aktivitesi böler uyarma aşağıdaki mavi floresan emisyon üretiminde FRET çifti ayırma Bam substratın β-laktam halkası. Bu translokasyon tahlil de C dahil olmak üzere farklı hücre içi ve hücre dışı bakterilerin bir dizi, efektör proteinleri tespit etmek bir yaklaşım olarak kanıtlanmıştır burnetti, L. pneumophila, L. longbeachae, Chlamydia trachomatis, enteropatojenik E. E. coli, Salmonella ve Brucella 17,30-35.

Coxiella efektör translokasyon belirli konak faktörlerinin rolünü belirlemek için biz özellikle küçük müdahale RNA (siRNA), RNA girişim olarak bilinen gen susturma için köklü bir yöntem kullanmaktadır. Başlangıçta Caenorhabditis elegans tespit RNA interferans doğal Defe için kullanılan korunmuş bir endojen hücresel süreçvirüslere karşı nse yanı sıra gen regülasyonu 36,37. Diziye özgü siRNA bağlanmasından sonra, mRNA degradasyonu özgü gen susturma ve demonte 38 elde (RNA-bağlı susturulması kompleksi) RISC yoluyla ortaya çıkar. Bu çalışmada, siRNA endositik yolunun düzenlenmesi açısından çok önemlidir, iki ana protein, Rab5A ve Rab7A, hedef için kullanılmıştır. Efektör TRANSLOKASYONA Rab5A ve Rab7A susturma etkisi C. kullanarak tespit edildi burnetti pBlaM-CBU0077. Bir önceki Coxiella 17 Nokta / ICM salgılama sistemi transloke gösterilmiştir gibi CBU0077 seçildi.

SiRNA gen susturulması ve burada açıklanan fluorescencebased translokasyon tahlil hem kullanarak, biz Coxiella tarafından efektör proteinlerin translokasyonu konak faktörlerinin rol kurmaya başlıyor. Bu yaklaşım, benzer secretio sahip hem hücre içi ve hücre dışı bakterilerin geniş bir aralığına uygulanabilmektedirefektör protein translokasyonu sorumlu n sistemleri.

Protocol

Not: Coxiella burnetii RSA439 NMII büyümesini veya manipülasyon içeren tüm prosedürleri Fiziksel Muhafaza Seviye 2 Laboratuvar ve yerel kurallara uygun bir biyolojik güvenlik kabini içinde yapılmalıdır. Aşağıda tarif ters transfeksiyon ve translokasyon tahlil iş akışı şematik diyagramı Şekil 2'de gösterilmiştir. C 1. Hazırlık burnetti Kültür ß-laktamaz için (pBlaM-CBU0077) CBU0077 sigortalı ifade (1. GÜN) <l…

Representative Results

Bu çalışma için, C. CBU0077 önce Coxiella Nokta / ICM salgılama sistemine 17 bir translokasyon efektör olduğu gösterilmiştir gibi burnetti pBlaM-CBU0077 soyu seçildi. Enfeksiyondan önce yedi günlük C. genomları / ml toplam sayısı burnetti pBlaM-CBU0077 kültür qPCR kullanılarak sayilmistir. 4 döngü eşiğinin bir örnek gösterir Şekil (Ct) değerleri qPCR izleyen hem standartl…

Discussion

Salgılama sistemleri ve bakteriyel efektör proteinler konakçı hücrelerin sitoplazmasına bu sistemler nakliye, bir çok patojen bakteriler özgü replikatif niş içinde bir enfeksiyona neden kullanan önemli hastalık oluşturma bileşenidir. Birçok araştırma grupları odağı bakteriyel etkileyiciler ve konak proteinler ve ana hücresel yollardaki bu etkileyiciler var etkisi arasındaki etkileşimi araştırmak olmuştur. Çok sınırlı bir araştırma, eğer varsa, ev sahibi proteinleri başarılı bakteriye…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by National Health and Medical Research Council (NHMRC) grants (Grant ID 1062383 and 1063646) awarded to HJN. EAL is supported by an Australian Postgraduate Award.

Materials

Reagents
Citric acid Sigma C0759 ACCM-2 medium component
Sodium citrate Sigma S4641 ACCM-2 medium component
Potassium phosphate Sigma 60218 ACCM-2 medium component
Magnesium chloride Calbiochem 442611 ACCM-2 medium component
Calcium chloride Sigma C5080 ACCM-2 medium component
Iron sulfate Fisher S93248 ACCM-2 medium component
Sodium chloride Sigma S9625 ACCM-2 medium component
L-cysteine Sigma C6852 ACCM-2 medium component
Bacto-neopeptone BD 211681 ACCM-2 medium component
Casamino acids Fisher BP1424 ACCM-2 medium component
Methyl beta cyclodextrin Sigma C4555 ACCM-2 medium component
RPMI + Glutamax ThermoFisher Scientific 61870-036 ACCM-2 medium component
Chloramphenicol Sigma C0378 For bacterial culture
ON-TARGETplus Non-targeting Control Pool (OTP) Dharmacon D-001810-10-05 Non-targeting control
siGENOME Human PLK1 (5347) siRNA – SMARTpool Dharmacon M-003290-01-005 Causes cell death; measure of transfection efficiency
siGENOME Human RAB5A (5968) siRNA – SMARTpool Dharmacon M-004009-00-0005
siGENOME Human RAB7A (7879) siRNA – SMARTpool Dharmacon M-010388-00-0005
5X siRNA buffer Dharmacon B-002000-UB-100 Use sterile RNase-free water to dilute 5X siRNA buffer to 1X siRNA buffer
DharmaFECT-1 Transfection Reagent Dharmacon T-2001-01 For transfection
Opti-MEM + GlutaMAX ThermoFisher Scientific 51985-034 Reduced-serum medium used for transfection
DMEM + GlutaMAX ThermoFisher Scientific 10567-014 For cell culture and infection
Heat-inactivated fetal calf serum (FCS) Thermo Scientific SH30071.03 Can use alternate equivalent product
DMSO Sigma D8418 For storage of Coxiella strain
PBS For cell culture
0.05% Trypsin + EDTA ThermoFisher Scientific 25300-054 For cell culture
dH2O For dilution of samples and standards for qPCR
Quick-gDNA Mini Prep ZYMO Research D3007 Can use alternate equivalent product to extract gDNA
SensiFAST SYBR No-ROX Kit Bioline BIO-98020 Can use alternate equivalent qPCR master mix product for qPCR reaction
LiveBLAzer FRET-B/G Loading kit with CCF2-AM Invitrogen K1032 For measurement of translocation using fluorescence and generation of the 6X loading solution (contains Solution A, B, C and DMSO)
Sodium hydroxide Merck 106469 Probenicid solution component
Sodium phosphate monobasic Sigma 71505 Probenicid solution component
di-Sodium hydrogen orthophosphate Merck 106586 Probenicid solution component
Probenicid Sigma P8761 Probenicid solution component
DRAQ5 Fluorescent Probe Solution (5 mM) ThermoFisher Scientific 62251 Nuclei stain to determine cell viablity. Use 1:4000 diluted in PBS. 
4% PFA (paraformaldehyde) solution in PBS Sigma P6148 Fixing solution for HeLa 229 cells
25cm2 tissue culture flask with vented cap Corning 430639 For growth of bacterial strain
96 Well Flat Clear bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates, Individually wrapped, with Lid, Sterile Corning 3603
75cm2 tissue culture flask with vented cap Corning 430641 For growth of HeLa 229 cells
175cm2 tissue culture flask with vented cap Corning 431080 For growth of HeLa 229 cells
Haemocytometer For quantification of HeLa 229 cells
Tear-A-Way 96 Well PCR plates 4titude 4ti-0750/TA For qPCR reaction
8-Lid chain, flat Sarstedt 65.989.002 For qPCR reaction
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Bench top microfuge
Bench top vortex
Orbital mixer
Centrifuge Eppendorf 5810 R For pelleting bacterial culture
Nanodrop For gDNA quantification
Mx3005P QPCR machine Aligent Technologies 401456 For quantification of Coxiella genomes in 7 day culture
ClarioSTAR microplate reader BMG LabTech For measurement of fluorescence

References

  1. Delsing, C. E., Warris, A., Bleeker-Rovers, C. P. Q fever: still more queries than answers. Adv Exp Med Biol. 719, 133-143 (2011).
  2. Delsing, C. E., Kullberg, B. J., Bleeker-Rovers, C. P. Q fever in the Netherlands from 2007 to. Neth J Med. 68, 382-387 (2010).
  3. van der Hoek, W., et al. Epidemic Q fever in humans in the Netherlands. Adv Exp Med Biol. 984, 329-364 (2012).
  4. Madariaga, M. G., Rezai, K., Trenholme, G. M., Weinstein, R. A. Q fever: a biological weapon in your backyard. Lancet Infect Dis. 3, 709-721 (2003).
  5. Hoover, T. A., Culp, D. W., Vodkin, M. H., Williams, J. C., Thompson, H. A. Chromosomal DNA deletions explain phenotypic characteristics of two antigenic variants, phase II and RSA 514 (crazy), of the Coxiella burnetii nine mile strain. Infect Immun. 70, 6726-6733 (2002).
  6. Omsland, A., et al. Isolation from animal tissue and genetic transformation of Coxiella burnetii are facilitated by an improved axenic growth medium. Appl Environ Microbiol. 77, 3720-3725 (2011).
  7. Omsland, A., et al. Host cell-free growth of the Q fever bacterium Coxiella burnetii. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 4430-4434 (2009).
  8. Beare, P. A., et al. Dot/Icm type IVB secretion system requirements for Coxiella burnetii growth in human macrophages. MBio. 2, e00175-e00111 (2011).
  9. Chen, C., et al. Large-scale identification and translocation of type IV secretion substrates by Coxiella burnetii. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 21755-21760 (2010).
  10. Voth, D. E., et al. The Coxiella burnetii cryptic plasmid is enriched in genes encoding type IV secretion system substrates. J Bacteriol. 193, 1493-1503 (2011).
  11. Beare, P. A., Sandoz, K. M., Omsland, A., Rockey, D. D., Heinzen, R. A. Advances in genetic manipulation of obligate intracellular bacterial pathogens. Front Microbiol. 2, 97 (2011).
  12. Beare, P. A., Larson, C. L., Gilk, S. D., Heinzen, R. A. Two systems for targeted gene deletion in Coxiella burnetii. Appl Environ Microbiol. 78, 4580-4589 (2012).
  13. Howe, D., Shannon, J. G., Winfree, S., Dorward, D. W., Heinzen, R. A. Coxiella burnetii phase I and II variants replicate with similar kinetics in degradative phagolysosome-like compartments of human macrophages. Infect Immun. 78, 3465-3474 (2010).
  14. Heinzen, R. A., Scidmore, M. A., Rockey, D. D., Hackstadt, T. Differential interaction with endocytic and exocytic pathways distinguish parasitophorous vacuoles of Coxiella burnetii and Chlamydia trachomatis. Infect Immun. 64, 796-809 (1996).
  15. Romano, P. S., Gutierrez, M. G., Beron, W., Rabinovitch, M., Colombo, M. I. The autophagic pathway is actively modulated by phase II Coxiella burnetii to efficiently replicate in the host cell. Cell Microbiol. 9, 891-909 (2007).
  16. Beare, P. A. Genetic manipulation of Coxiella burnetii. Adv Exp Med Biol. 984, 249-271 (2012).
  17. Carey, K. L., Newton, H. J., Luhrmann, A., Roy, C. R. The Coxiella burnetii Dot/Icm system delivers a unique repertoire of type IV effectors into host cells and is required for intracellular replication. PLoS Pathog. 7, e1002056 (2011).
  18. Segal, G., Shuman, H. A. Possible origin of the Legionella pneumophila virulence genes and their relation to Coxiella burnetii. Mol Microbiol. 33, 669-670 (1999).
  19. Zamboni, D. S., McGrath, S., Rabinovitch, M., Roy, C. R. Coxiella burnetii express type IV secretion system proteins that function similarly to components of the Legionella pneumophila Dot/Icm system. Mol Microbiol. 49, 965-976 (2003).
  20. Zusman, T., Yerushalmi, G., Segal, G. Functional similarities between the icm/dot pathogenesis systems of Coxiella’burnetii and Legionella pneumophila. Infect Immun. 71, 3714-3723 (2003).
  21. Newton, H. J., McDonough, J. A., Roy, C. R. Effector Protein Translocation by the Coxiella burnetii Dot/Icm Type IV Secretion System Requires Endocytic Maturation of the Pathogen-Occupied Vacuole. PLoS One. 8, e54566 (2013).
  22. Lifshitz, Z., et al. Computational modeling and experimental validation of the Legionella and Coxiella virulence-related type-IVB secretion signal. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, E707-E715 (2013).
  23. Voth, D. E., et al. The Coxiella burnetii ankyrin repeat domain-containing protein family is heterogeneous, with C-terminal truncations that influence Dot/Icm-mediated secretion. J Bacteriol. 191, 4232-4242 (2009).
  24. Weber, M. M., et al. Identification of C. burnetii type IV secretion substrates required for intracellular replication and Coxiella-containing vacuole formation. J Bacteriol. , (2013).
  25. Klingenbeck, L., Eckart, R. A., Berens, C., Luhrmann, A. The Coxiella burnetii type IV secretion system substrate CaeB inhibits intrinsic apoptosis at the mitochondrial level. Cell Microbiol. 15 (4), 675-678 (2013).
  26. Larson, C. L., Beare, P. A., Howe, D., Heinzen, R. A. Coxiella burnetii effector protein subverts clathrin-mediated vesicular trafficking for pathogen vacuole biogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, E4770-E4779 (2013).
  27. Luhrmann, A., Nogueira, C. V., Carey, K. L., Roy, C. R. Inhibition of pathogen-induced apoptosis by a Coxiella burnetii type IV effector protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 18997-19001 (2010).
  28. Newton, H. J., et al. A screen of Coxiella burnetii mutants reveals important roles for Dot/Icm effectors and host autophagy in vacuole biogenesis. PLoS Pathog. 10, (2014).
  29. Pan, X., Luhrmann, A., Satoh, A., Laskowski-Arce, M. A., Roy, C. R. Ankyrin repeat proteins comprise a diverse family of bacterial type IV effectors. Science. 320, 1651-1654 (2008).
  30. Charpentier, X., Oswald, E. Identification of the secretion and translocation domain of the enteropathogenic and enterohemorrhagic Escherichia coli effector Cif, using TEM-1 beta-lactamase as a new fluorescence-based reporter. J Bacteriol. 186, 5486-5495 (2004).
  31. de Felipe, K. S., et al. Legionella eukaryotic-like type IV substrates interfere with organelle trafficking. PLoS Pathog. 4, e1000117 (2008).
  32. de Jong, M. F., Sun, Y. H., den Hartigh, A. B., van Dijl, J. M., Tsolis, R. M. Identification of VceA and VceC, two members of the VjbR regulon that are translocated into macrophages by the Brucella type IV secretion system. Mol Microbiol. 70, 1378-1396 (2008).
  33. Raffatellu, M., et al. Host restriction of Salmonella enterica serotype Typhi is not caused by functional alteration of SipA, SopB, or SopD. Infect Immun. 73, 7817-7826 (2005).
  34. Wood, R. E., Newton, P., Latomanski, E. A., Newton, H. J. Dot/Icm Effector Translocation by Legionella longbeachae Creates a Replicative Vacuole Similar to That of Legionella pneumophila despite Translocation of Distinct Effector Repertoires. Infect Immun. 83, 4081-4092 (2015).
  35. Mueller, K. E., Fields, K. A. Application of beta-lactamase reporter fusions as an indicator of effector protein secretion during infections with the obligate intracellular pathogen Chlamydia trachomatis. PLoS One. 10, (2015).
  36. Agrawal, N., et al. RNA interference: biology, mechanism, and applications. Microbiol Mol Biol Rev. 67, 657-685 (2003).
  37. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
  38. Lam, J. K., Chow, M. Y., Zhang, Y., Leung, S. W. siRNA Versus miRNA as Therapeutics for Gene Silencing. Mol Ther Nucleic Acids. 4, e252 (2015).
  39. Martinez, E., Cantet, F., Fava, L., Norville, I., Bonazzi, M. Identification of OmpA, a Coxiella burnetii protein involved in host cell invasion, by multi-phenotypic high-content screening. PLoS Pathog. 10, e1004013 (2014).
  40. Jaton, K., Peter, O., Raoult, D., Tissot, J. D., Greub, G. Development of a high throughput PCR to detect Coxiella burnetii and its application in a diagnostic laboratory over a 7-year period. New Microbes New Infect. 1, 6-12 (2013).
  41. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, 671-675 (2012).
  42. Prashar, A., Terebiznik, M. R. Legionella pneumophila: homeward bound away from the phagosome. Curr Opin Microbiol. 23C, 86-93 (2014).
  43. McDonough, J. A., et al. Host Pathways Important for Coxiella burnetii Infection Revealed by Genome-Wide RNA Interference Screening. MBio. 4 (1), e00606-e00612 (2013).
  44. Farfan, M. J., Toro, C. S., Barry, E. M., Nataro, J. P. Shigella enterotoxin-2 is a type III effector that participates in Shigella-induced interleukin 8 secretion by epithelial cells. FEMS Immunol Med Microbiol. 61, 332-339 (2011).
  45. Al-Khodor, S., Price, C. T., Habyarimana, F., Kalia, A., Abu Kwaik, Y. A Dot/Icm-translocated ankyrin protein of Legionella pneumophila is required for intracellular proliferation within human macrophages and protozoa. Mol Microbiol. 70, 908-923 (2008).
  46. Geddes, K., Worley, M., Niemann, G., Heffron, F. Identification of new secreted effectors in Salmonella enterica serovar Typhimurium. Infect Immun. 73, 6260-6271 (2005).
  47. Sory, M. P., Boland, A., Lambermont, I., Cornelis, G. R. Identification of the YopE and YopH domains required for secretion and internalization into the cytosol of macrophages, using the cyaA gene fusion approach. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 11998-12002 (1995).

Play Video

Cite This Article
Newton, P., Latomanski, E. A., Newton, H. J. Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing. J. Vis. Exp. (113), e54210, doi:10.3791/54210 (2016).

View Video