Summary
Non-straatverbod EEG radiotelemetrie is een waardevolle methodologische benadering om in vivo langdurige electroencephalograms opnemen van vrij bewegende knaagdieren. Deze gedetailleerde protocol beschrijft stereotaxische epidurale en diepe intracerebrale elektroden plaatsing in verschillende hersengebieden om betrouwbare opnames van CNS ritmiek en CNS gedragsstoornissen stadia te verkrijgen.
Abstract
Implanteerbare EEG radiotelemetrie is van cruciaal belang in de neurologische kwalificatie van transgene muismodellen van neuropsychiatrische en neurodegeneratieve ziekten als epilepsie. Deze krachtige techniek niet alleen waardevol inzicht in de onderliggende pathofysiologische mechanismen, dwz., De etiopathogenese van CNS verwante ziekten, vergemakkelijkt ook de ontwikkeling van nieuwe translationeel, dwz., Therapeutische benaderingen. Overwegende concurrerende technieken die gebruik maken van de recorder systemen die worden gebruikt in jassen of tethered systemen last van hun niet-fysiologische straatverbod aan semi-straatverbod karakter, radiotelemetric EEG-registraties overwinnen van deze nadelen. Technisch, implanteerbare EEG radiotelemetrie zorgt voor nauwkeurige en zeer gevoelige meting van epidurale en diep, intracerebrale EEG's onder verschillende fysiologische en pathofysiologische omstandigheden. Eerst geven we een gedetailleerd protocol van een ongecompliceerde, succesvol,snelle en efficiënte techniek voor de epidurale (oppervlakte) EEG-registraties resulteert in een hoge-kwaliteit electrocorticograms. Ten tweede, laten we zien hoe diep, intracerebrale EEG-elektroden, zoals implantaten, in de hippocampus (electrohippocampogram). Voor beide benaderingen wordt een geautomatiseerd 3D stereotaxische elektrode implantatiesysteem gebruikt. De radiofrequentie zender zelf wordt geïmplanteerd in een subcutane zak bij muizen en ratten. Bijzondere aandacht moet ook worden besteed aan de pre-, peri- en postoperatieve behandeling van de proefdieren. Preoperatieve voorbereiding van muizen en ratten, geschikte anesthesie en postoperatieve behandeling en pijn worden beschreven.
Introduction
Radiotelemetrie is een zeer waardevolle methodologische aanpak voor het meten van een verscheidenheid aan gedrags- en fysiologische parameters bij bewustzijn, ongebreidelde dieren van verschillende grootte, met name in het kader van de EEG, ECG, EMG, bloeddruk, lichaamstemperatuur of activiteit metingen 1-7. Theoretisch kan elk species worden geanalyseerd met implanteerbare EEG radiotelemetrie van knaagdieren zoals muizen en ratten katten, honden, varkens en primaten 3,8. Zelfs vissen, reptielen en amfibieën zijn onderhevig aan radiotelemetric onderzoek 9. In de afgelopen twee decennia heeft implanteerbare EEG radiotelemetrie nuttig gebleken de karakterisering van verschillende transgene diermodellen van menselijke ziekten, zoals epilepsie, slaapstoornissen, neurodegeneratieve en neuropsychiatrische stoornissen 7,10-12 zijn. In het verleden zijn talrijke methodieken verzamelen van fysiologische gegevens waaronder biopotentialen van muizen en ratten desc geweestribed. Versleten in jasje recorder systemen, fysieke fixatie methoden, niet-geïmplanteerde radiotransmitters en tethered systemen zijn de belangrijkste aandacht in het verleden 13,14 ontvangen. Tegenwoordig verschillende systemen voor implantatie radiotelemetric zijn commercieel verkrijgbaar. Echter, een literatuur scherm bleek ook 29 publicaties die de ontwikkeling van de self-made radiotelemetric systemen 15-40 te beschrijven. Dat zelfgemaakte systemen zijn waarschijnlijk goedkoper en gebruiksvriendelijker aangepast om, in de handel beschikbare systemen zijn ongecompliceerd, relatief gemakkelijk te installeren is en snel kan worden ingesteld.
Implanteerbare EEG radiotelemetrie heeft een aantal voordelen ten opzichte van concurrerende technieken zoals fysieke fixatie methoden, gedragen jas systemen of vastgebonden benaderingen. Deze worden beperken per definitie, dwz., De dieren niet kunnen bewegen en zijn normale gedrag wordt verminderd. Het kan zelfs noodzakelijk zijn om het dier te verdoven voor verwerving reaansprakelijk data. Moderne vastgemaakte systemen zijn echter waarschijnlijk minder beperkende, maar dit moet wetenschappelijk worden gevalideerd. Radiotelemetrie anderzijds maakt dieren hun volledige repertoire van gedrag vertonen zonder spatiotemporele beperkingen en derhalve wordt verondersteld superieur benaderingen beperken en meer voorspellen de resultaten die bij mensen 1,3 kan worden verkregen. Het is bekend voor een tijdje dat straatverbod benaderingen dramatisch fundamentele fysiologische parameters, bijv., Voedselinname, lichaamstemperatuur, bloeddruk en hartslag en fysieke activiteit bijvoorbeeld 3 kan veranderen. Aangebonden systemen vormen een nog steeds veel gebruikt klassieke straatverbod aanpak 13,14. De elektroden die ofwel epidurale of diep elektroden worden meestal verbonden met een miniatuur mof is verankerd aan de schedel. De mof zelf is blootgesteld voor het bevestigen van een kabel die relatief vrij verkeer van het dier mogelijk maakt. Althdoorgedreven tegenwoordig tethered systemen zijn zeer filigraan en zeer flexibel worden, een van de belangrijkste nadelen is, dat het nog steeds semi-straatverbod. Daarnaast kan er een risico van infectie op de elektrode implantatie als de dieren de neiging om externe apparaten afkomstig van het lichaam (het hoofd) te manipuleren. Hoewel draadloze radiotelemetrie technologie in diverse soorten al in de late jaren '60 beschreven en is dus bestaat al tientallen jaren, het is pas onlangs betaalbaar, betrouwbaar, en relatief gemakkelijk te gebruiken 10,41,42 geworden, met name in kleine laboratorium knaagdieren zoals muizen en ratten. Kleine miniatuur implanteerbare EEG transmitters zijn nu commercieel verkrijgbaar en kunnen worden geïmplanteerd in muizen meer dan 20 g (~ 10 weken). Zo is de elektrofysiologische karakterisering van transgene muismodellen in het bijzonder is uitgegroeid tot een overheersende toepassingsgebied van implanteerbare EEG radiotelemetrie deze dagen. Grootte van het dier is niet langer een absolute experimentele beperkendetie terwijl de levensduur van de batterij van de zender 'inderdaad. Ondanks zijn beperkte levensduur, implanteerbare zender systemen zijn in staat om het minimaliseren van de meeste nadelen die verband houden met potentiële-opname geassocieerde stress door het beperken van systemen. Knaagdieren kunnen hun volledige arsenaal van fysiologische gedrag, onder meer rust, bewegingsactiviteit (exploratie) en slaap (REM, slow-wave sleep) 43,44 presenteren. Belangrijk is, kan implanteerbare radiotelemetrie sterk verminderen diergeneeskundig gebruik 3. Momenteel is er een intensieve discussie over hoe het aantal proefdieren in wetenschap en beperken hun lijden te verminderen. Duidelijk dierproeven en dierlijke modellen van menselijke en dierlijke ziekten essentieel voor het begrip van de onderste regel pathofysiologie en vervolg van de therapie. Verder dierproeven zijn van cruciaal belang in drug onderzoek en ontwikkeling. Ze hoeven dragen substantieel bij aan preklinische / toxicologisch onderzoek in drug licentiedus het plegen van zowel menselijke als dierlijke zorg. Het is opmerkelijk, dat nog geen alternatieven nog beschikbaar voor dierproeven de complexe pathofysiologische mechanismen die anders niet wordt opgewekt zou begrijpen. Op hetzelfde moment, de 3R, dwz., Vervanging, vermindering en verfijning strategie voor de EU en de VS moedigt onderzoek naar complementaire en alternatieve methoden. Radiotelemetrie is een belangrijk voorbeeld van een succesvolle 3R strategie omdat het aantal proefdieren en hun lijden te verminderen ten opzichte van andere technieken.
Hier hebben we een gedetailleerd en aansluitende stap-voor-stap benadering een subcutane zak implantatie van een radiofrequente zender presteren in zowel muizen als ratten. Deze eerste sequentie gevolgd door een beschrijving van stereotaxische epidurale en diepe intracerebrale EEG electrode positionering. Speciale aandacht wordt besteed aan huisvesting, anesthesie, peri- en postoperatieve pijnbeheer en mogelijke anti-infectieuze behandeling. De focus ligt op het geautomatiseerde 3D stereotaxische aanpak om betrouwbaar te richten epidurale en diepe intracerebrale structuren. We hebben ook commentaar op frequente experimentele valkuilen in het EEG elektrode implantatie en strategieën voor vermindering van trauma's en optimalisatie van pijnbestrijding tijdens postoperatief herstel. Tenslotte voorbeelden van oppervlakte- en diepe EEG-registraties worden gepresenteerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ethiek Verklaring: Alle dierproeven werd uitgevoerd volgens de richtlijnen van de lokale en institutionele Raad over Animal Care (Universiteit van Bonn, BfArM, LANUV, Duitsland). Daarnaast werd alle dierproeven uitgevoerd in overeenstemming met superieure wetgeving, bijvoorbeeld uitgevoerd., De Europese Gemeenschappen richtlijn van de Raad van 24 november 1986 (86/609 / EEG) of individuele regionale of nationale wetgeving. Specifiek wordt alles aan gedaan om het aantal gebruikte dieren en hun lijden te minimaliseren.
1. Proefdieren
- Selectie van proefdieren en soorten
- Voer radiotelemetric studies bij knaagdieren, dwz., Muizen en ratten die aan de eisen van homologie, isomorfie en voorspelbaarheid met betrekking tot een specifiek menselijke ziekte 7,9,45,46 vervullen.
Opmerking: Diverse muis en rat stammen beschikbaar kan ernstige verschillen in de basis fysiologische en pathofysiologische characteristics 47-49. - Overweeg of voorafgaand aan het uitvoeren van de volgende elektrofysiologische experimenten, bijvoorbeeld, als reactie op toepasselijke doseringen van verdovingsmiddelen, slaap architectuur en inbeslagneming gevoeligheid 50,51 evalueren fysiologische en pathofysiologische kenmerken van de muis / rat stammen.
- Opmerking genderspecifieke kenmerken in onderzoeksopzet. De loopsheid kan sterk beïnvloeden centrale ritmiek, de circadiane afhankelijkheid, slaap en epileptische activiteit 52-54. Zo, het uitvoeren van genderspecifieke analyse.
Opmerking: als de financiële en experimentele capaciteit beperkt is, is de beperking van mannelijke muizen geadviseerd.
- Voer radiotelemetric studies bij knaagdieren, dwz., Muizen en ratten die aan de eisen van homologie, isomorfie en voorspelbaarheid met betrekking tot een specifiek menselijke ziekte 7,9,45,46 vervullen.
- Stalruimte en handling
- Huis muizen en ratten in filter-top kooien of zelfs beter in individueel geventileerde kooien.
- Transfer muizen uit het dier faciliteit geventileerde kasten geplaatst in speciale lab kamers uitsluitend gewijd aan geïmplanteerde dieren en hun daaropvolgende opname (Figuur1).
- Om te acclimatiseren na het vervoer over land, plaats dieren voor een week in een geventileerde kast onder normale omstandigheden, dat wil zeggen, 21 ± 2 ° C omgevingstemperatuur, 50 -. 60% relatieve vochtigheid, en een conventionele 12 uur licht / donker-cyclus.
- Voorafgaand aan de chirurgische implantatie huis muizen in groepen van 3-4 in duidelijke polycarbonaat kooien type II (26,7 cm x 20,7 cm x 14,0 cm, oppervlakte 410 cm2) met ad libitum toegang tot drinkbaar water en standaard eten pellets. Gebruik duidelijke polycarbonaat kooien type III (42,5 cm x 26,6 cm x 18,5 cm, oppervlakte 800 cm2) voor ratten.
- Niet gescheiden / isoleren dieren in dit stadium isolatie spanning beïnvloeden experimentele resultaten later kunnen veroorzaken. Echter, na chirurgische instrumenten, huis dieren afzonderlijk als de dieren hebben de neiging om de wond steken / hechtingen of metalen clips (zie hieronder) te manipuleren.
- Vermijd geopend woonomstandigheden omdat zij ongeschikt beoordeeld worden voor een verscheidenheid van sCientific vragen, bijv., slapen studies.
- Gebruik muis en rat speciale apparatuur zodat noch muizen of ratten aanwezigheid van elkaar kunnen voelen als deze een extra belasting vormt voor de dieren.
2. EEG radiotelemetrie System
Opmerking: De beschreven protocol is gebaseerd op een commercieel beschikbare telemetrie systemen voor oppervlakte- en diepe intracerebrale EEG-registraties (figuur 2).
- Gebruik een radiofrequentie telemetrie implantaat geschikt is voor implantatie in muizen of ratten, bijv., Één kanaalzender of tweekanaals zender.
Opmerking:. Beide zenders kunnen meten verschillende biopotentialen, dwz elektro-encefalogram (EEG), elektrocardiogram (ECG), elektromyogram (EMG), maar ook lichaamsbeweging en temperatuur. Ze hebben een magnetisch bediende aan-uit mechanisme. De zender en sensor leads steriel. Als de zenderopnieuw worden gebruikt volg de instructies van de fabrikant voor hersterilisatie. - Voor hoge-frequentie gamma-analyse (tot 500 Hz) bijvoorbeeld, kiezen voor zenders met een hogere nominale sampling rate (f, tot 5000 Hz) en de zender bandbreedte (B, tot 500 Hz). In het bijzonder rekening houden met de Nyquist-Shannon sampling limit, dwz., Kunt EEG-gegevens worden geanalyseerd om een absoluut maximum van f / 2, maar niet daarbuiten. Voor een betrouwbare frequentieanalyse, een frequentiebandbreedte (B) van f / 10 - F / 5 aanbevolen.
Opmerking: De wetenschappelijke vraag die moet worden aangepakt moeten voldoen aan de technische specificaties van de zender.
3. Anesthesie en Pijnbestrijding
- Gebruik isofluraan inademing narcose.
- Plaats het dier een "inductie kamer" gevuld met 4-5% isofluraan en 0,8-1% zuurstof of carbogen (5% CO2 en 95% O 2) l / min. Handhaving van de gewenste diepte van de anesthesie met een siliconen gezichtsmasker verschaffen van een stroom van 1,5- 3,0% isofluraan en 0,8 - 1% zuurstof of carbogen L / min (Figuur 3A).
Opmerking: De juiste isofluraan concentratie varieert afhankelijk van het lichaamsgewicht (volumeverhouding), leeftijd, geslacht en genetische achtergrond van het dier. Als gas anesthesie-apparatuur is niet beschikbaar, dat wil zeggen, "inductie kamer", carbogen of zuurstoftoevoer, flowmeter, isofluraan vaporizer, doorblazen systeem, zie paragraaf 3.2. Een ingetrokken aanzuigsysteem (scavenging systeem, figuur 3A) wordt geïnstalleerd om isofluraan blootstelling van de experimentator voorkomen (de slang niet in beeld document voor demonstratiedoeleinden).
- Plaats het dier een "inductie kamer" gevuld met 4-5% isofluraan en 0,8-1% zuurstof of carbogen (5% CO2 en 95% O 2) l / min. Handhaving van de gewenste diepte van de anesthesie met een siliconen gezichtsmasker verschaffen van een stroom van 1,5- 3,0% isofluraan en 0,8 - 1% zuurstof of carbogen L / min (Figuur 3A).
- Bij inademing aneesthetics zijn geen optie, uit te voeren anesthesie door injecteerbare anesthetica. Bereid een combinatie van esketamine hydrochloride (knaagdier dosering 100 mg / kg) en xylazine hydrochloride (knaagdier dosering 10 mg / kg) in 0,9% NaCl en injecteer het dier intraperitoneaal basis van het lichaamsgewicht.
- Observeer de dieren voorzichtigy voor de diepte van de anesthesie met behulp van de staart knijpen, voet knijpen en door het bewaken van de ademhaling rate (muizen 150-220 ademhalingen / min; ratten 70-115 ademhalingen / min). Controleer op mogelijke hijgen.
Opmerking: Verschillende muis en rat lijnen kunnen verschillende gevoeligheden vertonen de anesthesie. Hetzelfde geldt voor transgene muismodellen.
Opmerking: Endotracheale intubatie is geen must bij knaagdieren. In feite, intubatie verhoogt het risico op beschadiging van de luchtpijp.
4. Chirurgische Instrumentation - Algemene aspecten
- Solliciteer extra warmte tijdens en na de operatie met behulp van recirculerende warm water dekens, elektrische het verwarmen platen, warmtelampen, gedwongen warme lucht units of pocket warmers aan het lichaam kerntemperatuur te behouden. Handhaving van de laatste bij 36,5-38,0 ° C (98,6-100,4 ° F).
Opmerking: kleine knaagdieren aanleg voor onderkoeling vanwege hun hoge verhouding lichaamsoppervlak (muis, 10,5 x (in g) 2/3, ratten, 10,5 x (in g) 2/3)het lichaam volume. - Vermijd het hoornvlies verdroging en bedekken de ogen met op aardolie gebaseerde kunsttranen zalf of dexpanthenol (zie video document) gedurende het gehele proces implantatie en snel herstel totdat het knipperen reflex volledig is hersteld.
- Autoclaaf chirurgische instrumenten (zie tabel of Materials) voor sterilisatie of plaats ze in ontsmettingsmiddelen.
Opmerking: Een elegante en snelle manier is het gebruik van een warmte gebaseerde chirurgisch instrument sterilisator met glaskralen. - Heeft u een verrekijker chirurgische vergroting microscoop en een koude lichtbron beschikbaar voor intensieve verlichting via flexibel of zelfdragende, beweegbare lichtgeleiders.
- Draag een schone laboratorium jas, een gezichtsmasker, een hoofdbedekking en steriele handschoenen.
Let op: Optimale leveringen en instrumenten kunnen variëren van laboratorium tot laboratorium en moet voldoen aan lab-specifieke en institutionele vereisten.
5. Chirurgie - Zender Plaatsing
- Verwijder het lichaam hair van de hoofdhuid van volledig verdoofde muizen / ratten met behulp van een scheerapparaat. Reinig het geschoren gebied met behulp van een desinfecterend middel, bijvoorbeeld, 70% ethanol en een jodium gebaseerde scrub. Voorkom irritatie of ontsteking huid als gevolg van overmatige blootstelling. Plaats het dier buikligging op een verwarmings- deken lichaamstemperatuur tijdens anesthesie.
- Met behulp van een scalpel een incisie op de hoofdhuid van het voorhoofd (zodat de bregma craniometric landmark zichtbaar) aan de hals (zodat de trapezium spier zichtbaar). Vanaf de nuchal incisie en met behulp van een chirurgische schaar, opent een subcutane zak langs de laterale flank van het dier door stompe dissectie.
- Injecteer 1 ml 0,9% NaCl in de subcutane zak. Plaats de zender met de sensing leads craniaal georiënteerd in de subcutane pocket op de flank in de buurt van het ventrale buikstreek. Als de zender heeft een tab hechtdraad, bevestig de zender op de dorsale / laterale huid met behulp van één of meer stiches (over-en-over hechtingen).
Merk op dat fixatie van de zender is geen must. Besteed extra aandacht aan het voorkomen van besmetting van de operatiewond en zender implantaat. Gordijnen worden gebruikt om goed steriele uit niet-steriele gebieden te isoleren. - Voor de post-operatieve zorg en pijnbestrijding, zie paragraaf 8.
6. Stereotaxische oppervlakte-elektrode Implantatie
- Plaats het dier op het stereotaxisch frame onder verdoving en nauwkeurig positioneren van de kop met behulp van de staven en de neus klem zodat de bregma en lambda craniometrics bezienswaardigheden van de schedel op hetzelfde niveau (Figuur 3B). Mis het binnenoor niet beschadigen met behulp van oor bars. Bedek oor bars met katoenen ballen indien nodig. Deze voorzorgsmaatregelen zorgt voor strakke fixatie van het hoofd binnen de stereotactische frame.
- Reinig het periost met katoenen tips zonder beschadiging van de temporele en achterhoofd spieren. Pre-behandeling van de oppervlakkige dunne laagde schedel met 0,3% H 2 O 2 voor de muis schedel en 3% H 2 O 2 voor de rat schedel. Deze procedure duidelijk bloot craniale hechtdraad en craniometrics bezienswaardigheden, zoals bregma en lambda (figuur 4B, C).
- Gebruik een speciale, volledig uitgeruste stereotaxische setup voor muizen en ratten, waaronder stereotactische frame met oor bars en neus clamp-size aangepast voor muizen en ratten, respectievelijk. Zorg ervoor dat de stereotaxisch frame is voorzien van een gas verdoving masker met verbindingen naar de isofluraan verdamper en de isofluraan aaseter module.
Opmerking: Een geautomatiseerd 3D stereotactische setup met een specifiek muis en rat hersenen coördineren software met inbegrip van een gebruikersinterface voor navigatie en 3D-atlas, waardoor axiale, coronale en sagittale uitzicht is aan te bevelen. - Monteer een precisie-boor op de verticale arm van de stereotaxische frame. Gebruik een gemonteerde potlood of pen op de verticale arm verlaten van een klein merk op de coördinaten van de keuze op de top van de schedel alsgeen geautomatiseerde stereotaxische systeem beschikbaar is.
- Boorgaten zorgvuldig rekening houdend met dat muizen en ratten sterk verschillen in de neurocranial bot dikte. Bovendien, er rekening mee dat de dikte van de muizen schedelbotten sterk afhankelijk van de lokalisatie, bijvoorbeeld bij muizen, os frontale: middellijn sectie: 320-390 urn, laterale sectie: 300-430 pm; os parietale: middellijn sectie: 210 - 250 pm, laterale sectie: 200-210 micrometer; os occipitale: middellijn sectie: 600-730 urn, laterale sectie: 380-420 pm).
- Boorgaten druk bij maximale snelheid.
Opmerking: Dit voorkomt een tonicum afplattingslens van de schedel, wat kan leiden tot een plotselinge doorbraak van de boorkop en mogelijke schade voornamelijk in het corticale gebied. Voor craniotomy, is een neurochirurgische high-speed precisie motor boorsysteem zeer aan te bevelen. - Boor braam gaten op de coördinaten van de keuze met typische boorkop diametervan 0,3-0,5 mm.
Opmerking: De diameter van de gaten kan lager zijn, afhankelijk van de elektrode diameter. Als algemene regel, hoe kleiner de diameter, hoe minder schade ontstaat. - Buig de punt van detectielead de zenders "die dient als een epidurale elektrode en plaats het op de dura mater in het gat op de coördinaten van keuze. U kunt ook gebruik maken van corticale schroeven en mechanisch voeg ze toe aan de sensing kabels van de zender (Figuur 4A).
- . Voor de opnames van het oppervlak, bijvoorbeeld, het muizen motorische cortex M1 / M2, de positie van de elektrode, bijvoorbeeld bij: craniale 1 mm, zijdelings 1,5 mm (linker hersenhelft). Plaats de epidurale referentie-elektrode op de cerebellaire cortex: bregma -6 mm, lateraal van bregma 1 mm (linker hersenhelft) of bregma -6 mm, lateraal van bregma 1 mm (rechter hersenhelft) (Figuur 4D).
Noot: Het cerebellum dient als referentie als het is een electroencephalographically stil regio. Stereotaxic coördinaten worden afgeleid uit standaard stereotaxische atlassen muizen en ratten. - Fix elektroden met glasionomeer dental cement (watergedragen), die uiterst moeilijk en geeft sterke hechting aan de onderliggende neurocranium.
Opmerking: Als glasionomeer cement tandheelkundig gebruik, niet verankerd schroeven nodig om de elektroden vast te zetten. - Laat de cement drogen 5 min. Sluit de hoofdhuid met behulp van over-en-over hechtingen met niet-absorbeerbare 5-0 / 6-0 hechtmateriaal. Als alternatief kan de huid lijm worden gebruikt. Nauwlettend toezien op de kwaliteit van de EEG-registraties op basis van de elektrode implantatie. Opmerking: Botvorming van de boorgaten kan voorkomen dat het vermogen heeft te heffen de elektroden met de tijd. Dit kan leiden tot verminderd EEG kwaliteit door EMG en ECG besmetting en dus de optimale opnameduur beperken.
- Voor de post-operatieve zorg en pijnbestrijding, zie paragraaf 8.
- Valideren EEG elektrode positie post mortem.
- voor euthanasiePlaats het dier (s) in een incubatie kamer en de invoering van 100% kooldioxide. Gebruik een vulsnelheid van 10% - 30% van het kamervolume per minuut met kooldioxide om de bestaande lucht toegevoegd in de incubatiekamer. Dit is aangewezen om snelle bewusteloosheid met minimale nood om de dieren te bereiken.
Opmerking: Vermijd plotselinge blootstelling van dieren bij bewustzijn aan kooldioxide-concentraties van> 70%, aangezien dit is aangetoond onaangenaam te zijn. - Observeer elke muis / rat bij gebrek aan ademhaling en vervaagde oogkleur. Handhaving van CO 2 stroom voor een minimum van 1 minuut na ademstilstand. Verwachte tijd tot bewusteloosheid is meestal binnen 2 tot 3 minuten.
- Als beide tekens worden waargenomen, verwijder de knaagdieren uit de kooi; anders blijven ze bloot te stellen aan CO 2. Indien bewusteloosheid niet binnen 2 tot 3 minuten is opgetreden, controleer dan de kamer fill rate.
- Om de juiste plaatsing van de elektroden te controleren, roeien hersenen post mortem, bv., Na CO
- Achtervoegsel hersenen voor 2-4 uur in 4% PFA bij kamertemperatuur gevolgd door cryoprotection in 30% sucrose in PBS en opslag hersenen bij 4 ° C tot verdere verwerking.
- Met behulp van specimen matrix voor cryostaat snijden, te bevriezen hersenen op een stereotactische blok en snijd 60 pm coronale plakjes met behulp van een cryostaat. Mount plakken op glas dia's, drogen aan de lucht, en de vlek met Nissl blauw met behulp van standaard technieken om de branche kanaal en oud-elektrode positie te visualiseren.
Opmerking: Deze benadering blijkt ook of het oppervlak elektroden diep geplaatst ongeluk verlaten door een kleine inslag op de bovenkant van de cortex.
- voor euthanasiePlaats het dier (s) in een incubatie kamer en de invoering van 100% kooldioxide. Gebruik een vulsnelheid van 10% - 30% van het kamervolume per minuut met kooldioxide om de bestaande lucht toegevoegd in de incubatiekamer. Dit is aangewezen om snelle bewusteloosheid met minimale nood om de dieren te bereiken.
7. Stereotaxische Deep intracerebrale EEG elektrode Implantation
- Pre-behandeling van de hoofdhuid en de schedel van het dier, zoals beschreven in de secties 6,1-6,2. Selecteer het type diepe elektroden zorgvuldig, daarbij rekening houdend met de materiële kenmerken, bijv., De diameter en de impedantie en de mogelijke aansluiting op sensing leads van de zender.
Opmerking: Parylene gecoat staal en wolfraam elektroden worden vaak gebruikt. De elektrode kenmerken aan de individuele experimentele behoeften. Wanneer de elektroden niet steriel zijn aangebracht, moeten zij worden geïncubeerd in 70% ethanol voor gebruik. Aangezien de elektroden zijn voorzien voor deze experimentele doel een warmte gebaseerde sterilisatie niet van toepassing. - Boor gaten op de coördinaten van de keuze, zoals beschreven in hoofdstuk 6 met behulp van de stereotaxische systeem. Met het muize CA1 regio bijvoorbeeld, die dient als een intensief onderzoek hersengebied targeten plaatst het differentieel elektrode op de volgende coördinaten betrekking tot bregma: caudale 2 mm, 1,5 mm lateraal (rechter hemisfeer)en dorsoventral (diepte) 2 mm. Plaats een ruggenprik referentie-elektrode op de cerebellaire cortex, bijv., Bregma -6 mm, lateraal van bregma 1 mm (linker of rechter hemisfeer) (Figuur 4D, E).
Opmerking: Het cerebellum elektrode wordt een pseudo-referentie-elektrode op de stilte gedeelte van het cerebellum. Stereotaxische coördinaten worden afgeleid uit standaard stereotaxische atlassen muizen en ratten. - Verkorten diepe elektroden op de gewenste lengte, afhankelijk van hoe diep in de hersenen zullen worden ingevoegd. Sluit de extracraniële deel van de elektrode aan de roestvrij stalen spiraal van de zender geleid door beide secties 90 ° buiging ertussen.
- Klem de diepe elektrode naar de sensing leiding van de zender mechanisch. Niet solderen, waar mogelijk, omdat dit veel lawaai kunnen veroorzaken in het EEG-opname. Maak de roestvrij stalen spiraal van de zender geleid door het verwijderen van een kort gedeelte van de buitenste siliconen isolatie aan het uiteinde vande zender leiding met een steriele scalpel.
- Rewire de leiding van de zender naar de diepe hersenstimulatie elektrode. Zorg voor een geschikte en stabiele verbinding van beide componenten (Figuur 4F). Bevestig de geïmplanteerde elektrode (die mechanisch is verbonden met de zender lood) aan de verticale arm van het stereotaxische apparaat.
- Bevestig de elektrode met glasionomeer tandcement (watergedragen), die uiterst moeilijk en geeft sterke hechting aan de onderliggende neurocranium. Laat de cement drogen 5 min. Sluit de hoofdhuid met behulp van over-en-over hechtingen met niet-absorbeerbare 5-0 / 6-0 hechtmateriaal. Als alternatief kan de huid lijm worden gebruikt.
- Nauwlettend toezien op de kwaliteit van de EEG-registraties op basis van de elektrode implantatie kant.
Opmerking: Botvorming van de boorgaten kan voorkomen dat het vermogen heeft te heffen de elektroden met de tijd. Dit kan leiden tot verminderde kwaliteit door EEG en EMG ECG vervuiling en dus optimaal rec beperkenording duur. Dit is van bijzonder belang voor een diepe plaatsing van de elektroden. - Voor de post-operatieve zorg en pijnbestrijding, zie paragraaf 8.
- Valideren EEG plaatsing van elektroden Post Mortem zoals beschreven in paragraaf 6.13.
8. Post-operatieve zorg en postoperatieve pijn management
- Heeft een dier niet onbeheerd achter te laten tot het voldoende bewustzijn heeft herwonnen om borstligging handhaven.
- Heeft een dier dat een operatie heeft ondergaan om het gezelschap van andere dieren tot volledig hersteld niet meer terug.
- Voor postoperatieve pijnbestrijding, kies dan een drug van een van de volgende groepen: verdovend opioïden, opioïde agonisten / antagonisten, a2-agonisten, lokale verdoving en niet-steroïde anti-inflammatoire geneesmiddelen (NSAID) 55-60 Houd er rekening mee dat als gevolg van. de ernst van de operatie een 3 daagse analgetische behandeling bevelen.
- Bij gebruik van buprenorfine, beheren van de volgende dosis: muis: 0,05- 0,1 mg / kg, ip, sc, elke 6-12 uur; rat: 0,01-0,05 mg / kg, ip, sc, elke 8-12 uur.
- Bij gebruik van butorfanol, beheren van de volgende dosis: muis: 1,0-5,0 mg / kg, sc, elke 4 uur; rat: 2,0-2,5 mg / kg, sc, elke 4 uur.
- Bij gebruik van tramadol, beheren van de volgende dosis: muis, rat: 10 - 30 mg / kg, ip
- Bij gebruik van flunixine, beheren van de volgende dosis: muis: 2,5 mg / kg, sc, elke 12 uur; rat: 1,1 mg / kg, sc, elke 12 uur.
- Bij gebruik van ketoprofen, beheren van de volgende dosis: muis: 5 mg / kg, sc, elke 12-24 uur; rat: 5 mg / kg, sc, iedere 12-24 uur.
- Bij gebruik van metamizool, beheren van de volgende dosis: muis, rat: 100 mg / kg, ip, om de 8 uur.
- Bij gebruik van meloxicam, beheren van de volgende dosis: muis, rat: 1 mg / kg sc, elke 24 uur.
- Bij gebruik van carprofen, beheren van de volgende dosis: muis: 5-10 mg / kg, sc, elke 12-24 uur; rat: 2,5-5,0 mg / kg, sc, iedere 12-24 uur.
- Bij gebruik van acrylonitminophen, beheren van de volgende dosis: muis: 300 mg / kg, po, elke 4 uur; rat: 100 - 300 mg / kg elke 4 uur.
- Bij gebruik van lidocaïne (als adjunct pijnstiller), beheren van de volgende dosis: muis, rat: 1-4 mg / kg sc
- Bij gebruik carprofen (knaagdieren dosis 5-10 mg / kg sc, verdund in 0,9% NaCl) voor langdurige postoperatieve pijn, voeren de eerste injectie 10-15 minuten vóór het einde van de chirurgische instrumenten en herhaal voor twee opeenvolgende dagen eenmaal per dag.
- Postoperatief, voeden bevochtigde pellets om voedsel te vergemakkelijken. Let zorgvuldig voedsel (~ 15 g / 100 g / d; ~ 5 g / 24 uur) en water (~ 15 ml / 100 g / d; ~ 5 ml / 24 uur) consumptie.
- Monitor dieren nauw voor de terugkeer van hun normale houdingen en gedragingen.
Opmerking: systemische toediening van antibiotica zoals enrofloxacine of trimethoprim-sulfonamiden wordt vaak aanbevolen, maar geen absolute must, tenzij inflammatoire tekenen van meningitis of encefalitis bij The plaatsen implantaties worden gedetecteerd. - Geef muizen ten minste 10 tot 14 opeenvolgende dagen om volledig te herstellen voordat EEG-registraties voor verdere analyse.
Opmerking: Specifieke experimentele taken kunnen langer herstel nodig hebben. - Follow-up postoperatief herstel na implantatie door het evalueren postoperatieve verloop van het lichaamsgewicht. Een maximale vermindering van het lichaamsgewicht wordt normaal gezien rond dag 4-5 na de operatie gevolgd door een lichte, maar gestage toename van het gewicht tijdens een 10-14 dagen herstelperiode.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deze sectie illustreert voorbeelden verkregen van het oppervlak en diep, intracerebrale EEG-registraties. In eerste instantie moet worden vastgesteld dat de baseline opnames onder fysiologische omstandigheden is verplicht voorafgaand aan de latere opnames na bijvoorbeeld farmacologische behandeling. Dergelijke basislijnregistratie kan waardevolle informatie over de functionele onderlinge afhankelijkheid van de hersenen ritmiek met verschillende gedrags-staten of slaap / circadiane ritmiek te bieden. Hier laten we voorbeelden van opgenomen epileptische activiteit na acute toediening van proconvulsieve / psychoenergetic drugs. Zoals hierboven uiteengezet, een gemeenschappelijke toepassingsgebied in het EEG radiotelemetrie epilepsie onderzoek. Epilepsie modellen omvatten acute en chronische farmacologische modellen evenals genetische (transgene) modellen van epilepsie. Hier laten we acute modellen van niet-convulsieve afwezigheid-achtige aanvallen geïnduceerd door intraperitoneale toediening van R / S-baclofen bij 20 mg / kg en bicucullinemethobromide bij 10 mg / kg. Farmacodynamisch, baclofen is een GABA (B) receptor agonist die K + efflux verhoogt uit de cel zowel pre- als postsynaptisch bicuculline dat een GABA (A) antagonist die remt Cl - influx in de cel. Activatie van GABA (A) receptor resulteert in de initiatie en handhaving van hyperoscillation en hypersynchronization binnen de thalamocorticale-corticothalamic schakeling. Figuur 5B, C geeft epidurale EEG-registraties na intraperitoneale toediening van R / S-baclofen (20 mg / kg) en bicucullinemethobromide (10 mg / kg). Systemische toediening van 4-aminopyridine (4-AP) bij een dosering van 10 mg / kg ip of pentyleentetrazol (PTZ) kan gegeneraliseerde tonisch-clonische aanvallen bij muizen en ratten veroorzaken. Na 4-AP of PTZ-injectie, dieren tonen een typisch tijdelijke opeenvolging van motorische acties die dosis-afhankelijk van de ernst, dwz., Intensiteit en duur. Aanvallen gewoonlijk beginnen met een hypoactive toestand, gevolgd door een mild gedeeltelijke myoclonus dat treft vooral het gezicht met vibrissal spiertrekkingen, de kop en / of de voorpoten. Deze gedeeltelijke inbeslagname staat kan dan generaliseren in een myoclonus gekenmerkt door het verlies van een rechte houding of een hele lichaam clonus waarbij alle vier de ledematen. Laatstgenoemde wordt gekenmerkt door het springen, wild rennen en tenslotte een tonische extensie van de achterpoten. Een typische epidurale EEG-registratie na 4-AP toediening (10 mg / kg) is in Figuur 5A. Dit epidurale type opname kan wekken de vroege stadia van ontwikkeling beslag, dwz., Myoclonische hoofdbeweging, schokken van het gezicht en voorpoten) met hoge precisie. Hoewel er een grote mate van motorische convulsies geassocieerd met hoge EMG, dwz., Spieractiviteit, wordt slechts minimale EMG contaminatie van EEG-registraties waargenomen. Zoals duidelijk wordt in Figuur 5A, wordt de sporadische spike activiteit (*) gevolgd door een algemene clonus met een typische piek / polyspike / spike-golfpatroon (1), gevolgd door een volgende episode van voortdurende spike activiteit. Merk op dat EMG verontreiniging nauwelijks detecteerbaar. Hoewel de opname segment wordt gekenmerkt door verhoogde spieractiviteit door het hele lichaam clonus, de piek-activiteit afkomstig van de hersenen prominente en EMG vervuiling is extreem laag. Dit voorbeeld toont aan dat de voorgestelde experimentele benadering is geschikt voor het opnemen EEG-signalen selectief zelfs onder gegeneraliseerde aanvallen omstandigheden, maar eer verwacht EEG-signalen worden gemaskeerd door EMG artefacten. Merk op dat het injecteren van drugs regimes zoals hier beschreven altijd nodig opnames voorafgaand aan de injectie, onder injectie en na farmacologische toediening. Controles dienen te bestaan sham-geïnjecteerde / voertuig geïnjecteerde dieren.
Een typische intracerebrale hersenen doel de hippocampus, bijvoorbeeld de regio CA1. Hippocampale epileptische activiteit kan worden opgewekt door kaïninezuur (KA) of N-methylD-aspartaat (NMDA). De niet-NMDA receptor agonist KA algemeen intraperitoneaal toegediend in een dosis van 10-30 mg / kg. Hippocampale aanvallen vormen een belangrijke subgroep aanval die acuut kan worden geïnduceerd door verschillende glutamaat receptoragonisten. Met de diepe elektrode implantatieprocedure hierboven beschreven, kunnen KA geïnduceerde convulsies hippocampus worden opgenomen met hoge precisie (Figuur 5D). Daarnaast KA kan hippocampale aanvallen worden geïnduceerd door intraperitoneale toediening van NMDA in een dosis van 150 mg / kg. Zoals in KA behandelde dieren, NMDA behandelde muizen, het ontwikkelen van epileptische aanvallen door middel van een opeenvolging van paroxysmale krassen, hypermotiliteit en cirkelen, tonisch-clonische convulsies, en soms de dood.
Figuur 6 illustreert voorbeelden van simultane corticale (ruggenprik) en de hippocampus (diep) EEGs op de meest populaire chronische hippocampus beslaglegging model, dwz., Het pilocarpine model van mesiale temporale kwab epi lepsy (mTLE) bij ratten. Opgemerkt zij dat EEG artefacten soms nabootsen ictiform ontladingen (Figuur 7). Zo speciale aandacht worden besteed aan ECG, EMG verminderen en extern geïnduceerde EEG-signaal verstoring. Opgemerkt wordt dat de implantatieprocedure beschreven zorgt voor maximale verlaging van EEG-signaal verontreiniging. Artefacten hetzij gevolg van externe elektrische inrichtingen die door kan worden afgeschermd, bijvoorbeeld een Faraday kooi of botontwikkelingsprocessen rond de gaten die de neiging hebben de elektroden uit de hersenen te heffen. De laatste is een tijdsafhankelijke proces dat een experimentele beperking van de techniek aangeeft. Opgemerkt zij dat beslag registratie en analyse niet alleen toepassingsgebied van de hier beschreven technieken. Oppervlak en diepe intracerebrale EEG-registraties kan worden gebruikt voor complexe tijd-frequentieanalyse, bijvoorbeeld in diermodellen van neuropsychiatrische ziekten en slaapstudies bijvoorbeeld.
ove_content "fo: keep-together.within-page =" 1 ">
Figuur 1:. Huisvestingsomstandigheden in radiotelemetrie In vivo studies in verschillende muis of rat lijnen of farmacologische of transgene lijnen van ziekten bij de mens vereisen een hoge standaardisatie aan intra-individuele variabiliteit en mogelijke vertekening als gevolg van verstorende factoren te minimaliseren. Een goede woonomstandigheden zijn een voorwaarde voor hoge kwaliteit opnames en geldige telemetrische resultaten. Open huisvesting op lab planken zijn niet geschikt voor opname. Plaats opname moet worden uitgevoerd in een dierenverblijf of in geventileerde kasten (A). Idealiter worden geventileerd kasten niet alleen gebruikt voor pre-operatieve en postoperatieve huisvesting en herstel, maar ook voor EEG-registratie (B) deze waarborgt stabiele omgevingsomstandigheden en gebrek aan verstoring. Indien de opname niet kan worden uitgevoerd in een ventilatieilated kabinet, moeten ze worden gedaan in een kooi van Faraday binnen een milieuvriendelijke gecontroleerde dier kamer (C). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2:. Standard EEG radiotelemetrie System en radiofrequentie zenders Naast self-made systemen, een aantal commercieel beschikbare systemen op de markt. De basisopstelling van een dergelijk systeem is weergegeven in (A). Het systeem bestaat uit een radiofrequente zender, de ontvanger plaat, een uitwisseling van gegevens matrix die als een multiplexer, en de data-acquisitie, verwerking en analyse van de kern-eenheid. Voor frequentie-analyse, inbeslagneming detectie en slaap analyse specifieke software modules worden aangeboden. Meerdere soorten zenders zijn eenvailable afhankelijk van welke soort verondersteld te onderzoeken en afhankelijk van de wetenschappelijke vraag. B) geïmplanteerde muizen ontvanger platen en een multiplexer geplaatst in een geventileerde kast voor gestandaardiseerde opnameomstandigheden. C) Een volwassen C57BL / 6J muis en een 2-kanaals radiofrequente zender. D) Dorsal weergave van de schedel 4 weken na de elektrode implantatie en fixatie met behulp van glasionomeer cement (herdrukt van 61 en 62 met toestemming). klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Anesthesie en Stereotaxische Setup voor muizen en ratten. A) Gas anesthesie systeem met behulp van isofluraan. Een precisie high-speed tandheelkundige boor is mounted op een 3D stereotaxische inrichting voor respectievelijk muizen en ratten. Aanvullende warmte wordt gegeven met behulp van een verwarmingselement. B) Close-up van de boor, stereotaxische oor bars en neus klem (herdrukt van 62 met toestemming). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Stereotaxische Surface en Deep elektrode implantatie. A) Regeling van een epidurale plaatsing van de elektroden bij muizen en ratten. B) anatomische structuren en de bezienswaardigheden van de muizen schedel. Apicale oog op een C57BL / 6J muis schedel die bereid is in 0,3% H 2 O 2. Opmerking schedelbotten (os frontale (van), os parietale (op), os occipitale (oo)) en hechtingen (sutura frontalis (sf), sutura sagittalis (ss), sutura coronaria (sc), en sutura lambdoidea (sl)), die de belangrijkste anatomische oriëntatiepunten bregma (B) en lambda (L) te bepalen. C ) Zijaanzicht van een C57BL / 6J muizen schedel. D) een epidurale, differentiële elektrode wordt op de motorische cortex (M1), een extra intrahippocampale differentieel elektrode wordt in het CA1-gebied van de hippocampus. Beide pseudo-referentie-elektroden zijn gelokaliseerd op de kleine hersenen. E) coronale sectie (schema) ter illustratie van de lokalisatie van de diepe, intracraniële elektrode voor het opnemen van de electrohippocampogram. F) Close-up van de diepe EEG elektrode, de sensing leiding van de radiofrequentie zender en hun rangschikking op de top van de muizen schedel (herdrukt van 61 en 62 met toestemming). klikhier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5:. Farmacologische inductie van epileptische Lozingen A) Surface EEG-opname weergave ictal lozingen na ip toediening van 4-aminopyridine (4 AP, 10 mg / kg). Sporadische spikes (*) uitgroeien tot een voorbijgaande episode continue spiking (1), waardoor een EEG depressie (verminderde amplitude, 2-3). Kort daarna wordt een tweede piek-trein gelijktijdig aan de ontwikkeling van een gegeneraliseerde tonisch-clonische aanvallen met wild rennen en springen blijkt wat uiteindelijk resulteert in een tonische extensie van de achterpoten (4) en de dood. De overige kleine signaal na hersendood staat voor een ECG (R-spike) besmetting. B) Na het ip administrati een van bicucullinemethobromide (BMB, 10 mg / kg) muizen vertonen treinen karakteristieke pieken en piek golven. C) Toediening van baclofen (20 mg / kg) leidt tot sporadisch optreden van spiking activiteit. D) intrahippocampale elektro-encefalogram (EEG) registraties volgend op ip- toediening van KA (30 mg / kg). I: diepe CA1 opname van een C57BL / 6J muis gedurende 2 uur onmiddellijk na KA toediening. Bij 30 mg / kg KA aaneengesloten hippocampale aanvalsactiviteit waargenomen wordt soms onderbroken door postictale depressie (pijlen). Ictal ontladingen worden gekenmerkt door spike en / of spike-wave-activiteit (zie bijvoegsels) in de delta- en theta-golfgebied (08/04 Hz). II-IV: Op dagen 1, 3 en 5 na de injectie 1u CA1 EEG-registraties illustreren afnemende maar nog steeds voortdurende ictal lozing in verband met neuronale degeneratie excitotoxische (herdrukt van 61 en 62 met toestemming).jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6:. Radiotelemetric EEG opnemen in een Rat Model van Mesiale temporale kwab epilepsie Limbic aanvallen zijn farmacologisch opgewekt via een pilocarpine injectie regime. Deze figuur illustreert synchrone opname van de primaire motorische cortex (M1) en het hippocampale CA1 gebied van een rat op de leeftijd van 3 maanden. Stijgende en dalende spike / poly-spike treinen in beide doorbuigingen (herdrukt van 62 met toestemming) zijn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Implanteerbare EEG radiotelemetrie van cruciaal belang omdat het een niet-beperkende techniek waarbij proefdieren hun volledige gedragsrepertoire 1,3 voeren. Dit is van groot belang telemetrische aanpak maakt niet alleen spontane EEG-registraties ook opnamen onder cognitieve taken en circadiane analytische opstellingen, zoals T-doolhof, radiale doolhof, water maze, slaapgebrek taken of wanneer een EEG-registratie nodig of nuttig bij complexe cognitieve of motorische activiteit.
Dit protocol beschrijft epidurale oppervlak diep intracerebrale EEG elektrode implantatie in muizen en ratten en verbinding met een implanteerbare EEG radiofrequente zender. Kritische stappen in de procedure bestaat uit pre-operatieve problemen, dat wil zeggen, de selectie van soort en stam, woonomstandigheden, anesthesie en pijnbestrijding. Een kritische literatuur scherm blijkt dat de laatste als verstorende factoren die mede kan dienenntribute naar de resultaten in de verschillende aanpak van het onderzoek uiteen. Bijvoorbeeld kan de keuze van proefdieren, bijvoorbeeld muizen versus ratten en zelfs volledig stammen experimentele resultaten veranderen. Hetzelfde geldt voor mannen en vrouwen. In het algemeen wordt een genderspecifieke groepering en analyse sterk aanbevolen. Als dit niet mogelijk is, moet geslachten tenminste uitgebalanceerd zijn. Als experimentele omstandigheden zijn niet strikt geharmoniseerde of gecontroleerd, verkregen gegevens zijn ofwel niet vergelijkbaar of gewoon ongeldig.
De stereotaxische implantatie procedure die hier beschreven is, een betrouwbaar hulpmiddel om kwalitatief hoogwaardige EEGs opnemen van zowel het oppervlak en diepe intracerebrale structuren. Kritische stappen van de implantatieprocedure zijn het boorproces. Moet worden uitgevoerd op maximale snelheid (RPM) minimale druk. Hoewel hoge boorsnelheid warmte genereert, minimale druk garandeert dat subcorticale structuren worden niet thermisch beschadigd. Minimumdruk is essentieel om een ontwijkenplotselinge doorbraak van de schedel en daaropvolgende beschadiging van de onderliggende cortex. Daarnaast heeft speciale zorg moet worden genomen een meningeale slagader of een dural sinus niet te beschadigen. In muizen, de schedel is vrij transparant vanwege de kleine dikte. Daarom kunnen meningeale slagaders en sinussen worden geïdentificeerd om schade te voorkomen. In het geval van het ontluchten van de vroege en late prognose is slecht in het algemeen en het is de vraag of een dergelijk dier aan de criteria opgenomen voor een betrouwbare studie. We raden u aan op te offeren dergelijke dieren.
In onze ervaring, kan een hoge-kwaliteit EEG-registraties met behulp van de beschreven aanpak worden uitgevoerd tot 4 weken. Door botontwikkelingsprocessen uitgaande van de geboorde gaten in het schedeldak, elektroden vaak verhoogd worden waardoor ECG en EMG verontreiniging. Voorts moet worden bedacht dat gericht op een specifiek oppervlak of diepe, intracerebrale structuur voert stereotaxische coördinaten van hersenen atlassen. Deze stereotactische hersenen kaartenworden gewoonlijk verband met een specifieke muis of rat stam van een bepaalde leeftijd. Zij kritisch opgemerkt dat verschillende muis en rat stammen verschillen in leeftijd specifieke grootte van het lichaam en de schedel kunnen vertonen. Er zijn dus inter-stam en intra-stam verschillen in de basis craniometrics bezienswaardigheden bregma en lambda. Dit probleem vormt een specifieke uitdaging als men wil oppervlak en diepe elektrode opnames uit te voeren vanaf jonge muizen en ratten die nog aan het ontwikkelen, dat wil zeggen, vertoning schedel en de groei van de hersenen. In dit geval, een betrouwbare lange termijn opname vanuit de positie van keuze is nauwelijks mogelijk.
Om de craniometric oriëntatiepunten toegankelijk bleek- procedure te raden. Zorg moet worden genomen om de incubatietijd van H 2 O 2 beperken omdat anders de schedel kan doordringen en doen oxidatieve beschadiging van de cortex.
Ten slotte is het belangrijk op te merken dat de commerciële EEG radiotelemetriesystemen kunnen worden gecombineerd met andere elektrofysiologische opstellingen ook. We hebben onlangs vestigde de combinatie van radiotelemetric EEG opname met een auditieve evoked potential setup in muizen. Deze verfijnde aanpak maakt het mogelijk, bijvoorbeeld om endophenotyping uit te voeren en te identificeren en te karakteriseren transgene muismodellen van schizofrenie, bijvoorbeeld door toepassing van het dubbelklikken paradigma en analyse van P50 / N100 potentials. In het algemeen, de technische verbinding tussen EEG radiotelemetrie en evoked potentials waarschijnlijk een veelbelovende benadering in de toekomst.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Carprofen (Rimadyl VET - InjektionA2:D43slösung) | Pfizer | PZN 0110208 | 20 ml |
| Binocular surgical magnification microscope | Zeiss Stemi 2000 | 0000001003877, 4355400000000, 0000001063306, 4170530000000, 4170959255000, 4551820000000, 4170959040000, 4170959050000 | |
| Bulldog serrefine | F.S.T. | 18051-28 | 28 mm |
| Cages (Macrolon) | Techniplast | 1264C, 1290D | |
| Cold light source | Schott KL2500 LCD | 9.705 202 | ordered at Th.Geyer |
| Cotton tip applicators (sterile) | Carl Roth | EH12.1 | |
| Dexpanthenole (Bepanthen Wund- und Heilsalbe) | Bayer | PZN: 1578818 | |
| Drapes (sterile) | Hartmann | PZN 0366787 | |
| 70% ethanol | Carl Roth | 9065.5 | |
| 0.3%/3% hydrogene peroxide solution | Sigma | 95321 | 30% stock solution |
| Gloves (sterile) | Unigloves | 1570 | |
| Dental glas ionomer cement | KentDental /NORDENTA | 957 321 | |
| 2% glutaraldehyde solution | Sigma | G6257 | |
| Graefe Forceps-curved, serrated | F.S.T. | 11052-10 | |
| Halsey Micro Needle Holder-Tungsten Carbide | F.S.T. | 12500-12 | 12.5 cm |
| Heat-based surgical instrument sterilizer | F.S.T. | 18000-50 | |
| Heating pad | AEG HK5510 | 520010 | ordered at myToolStore |
| High-speed dental drill | Adeor | SI-1708 | |
| Iris scissors extra thin | F.S.T. | 14058-09 | 9 cm |
| Inhalation narcotic system (isoflurane) | Harvard Apparatus GmbH | 34-1352, 10-1340, 34-0422, 34-1041, 34-0401, 34-1067, 72-3044, 34-0426, 34-0387, 34-0415, 69-0230 | |
| Isoflurane | Baxter 250 ml | PZN 6497131 | |
| Ketamine | Pfizer | PZN 07506004 | |
| Lactated Ringer’s solution (sterile) | Braun | L7502 | |
| Lexar-Baby Scissors-straight, 10 cm | F.S.T. | 14078-10 | 10 cm |
| Nissl staining solution | Armin Baack | BAA31712159 | |
| Non-absorbable suture material 5-0/6-0 (sterile) | SABANA (Sabafil) | N-63123-45 | |
| Covidien (Sofsilk) | S1172, S1173 | ||
| Halsey Needle Holder | F.S.T. | 12001-13 | 13 cm |
| Pads (sterile) | ReWa Krankenhausbedarf | 2003/01 | |
| 0.9% saline (NaCl, sterile) | Braun | PZN:8609255 | |
| Scalpel blades with handle (sterile) | propraxis | 2029/10 | |
| Standard Pattern Forceps | F.S.T. | 11000-12, 11000-14 | 12 cm and 14.5 cm length |
| Steel and tungsten electrodes parylene coated | FHC Inc., USA) | UEWLGESEANND | |
| Stereotaxic frame | Neurostar | 51730M | ordered at Stoelting |
| (Stereo Drive-New Motorized Stereotaxic) | |||
| Tapes (sterile) | BSN medical GmbH & Co. KG | 626225 | |
| TA10ETA-F20 | DSI | 270-0042-001X | Radiofrequency transmitter 3.9 g, 3.9 g, 1.9 ml, input voltage range ± 2.5 mV, channel bandwidth (B) 1 - 200 Hz, nominal sampling rate (f) 1,000 Hz (f = 5B) temperature operating range 34 - 41 °C warranted battery life 4 months |
| TL11M2-F20EET | DSI | 270-0124-001X | Radiofrequency transmitter 3.9 g, 1.9 ml, input voltage range ± 1.25 mV, channel bandwidth (B) 1 - 50 Hz, nominal sampling rate (f) 250 Hz (f = 5B) temperature operating range 34 - 41 °C warranted battery life 1.5 months |
| Tissue Forceps- 1x2 Teeth 12 cm | F.S.T. | 11021-12 | 12 cm length |
| Tungsten carbide iris scissors | F.S.T. | 14558-11 | 11.5 cm |
| Vibroslicer 5000 MZ | Electron Microscopy Sciences | 5000-005 | |
| Xylazine (Rompun) | Bayer | PZN: 1320422 |
References
- Kramer, K., et al. The use of radiotelemetry in small laboratory animals: recent advances. Contemp Top Lab Anim Sci. 40, 8-16 (2001).
- Kramer, K., et al. The use of telemetry to record electrocardiogram and heart rate in freely swimming rats. Methods Find Exp Clin Pharmacol. 17, 107-112 (1995).
- Kramer, K., Kinter, L. B. Evaluation and applications of radiotelemetry in small laboratory animals. Physiol Genomics. 13, 197-205 (2003).
- Kramer, K., Remie, R. Measuring blood pressure in small laboratory animals. Methods Mol Med. 108, 51-62 (2005).
- Kramer, K., et al. Use of telemetry to record electrocardiogram and heart rate in freely moving mice. J Pharmacol Toxicol Methods. 30, 209-215 (1993).
- Kramer, K., et al. Telemetric monitoring of blood pressure in freely moving mice: a preliminary study. Lab Anim. 34, 272-280 (2000).
- Guler, N. F., Ubeyli, E. D.
- Aylott, M., Bate, S., Collins, S., Jarvis, P., Saul, J. Review of the statistical analysis of the dog telemetry study. Pharm Stat. 10, 236-249 (2011).
- Rub, A. M., Jepsen, N., Liedtke, T. L., Moser, M. L., Weber, E. P., 3rd, Surgical insertion of transmitters and telemetry methods in fisheries research. Am J Vet Res. 75, 402-416 (2014).
- Bastlund, J. F., Jennum, P., Mohapel, P., Vogel, V., Watson, W. P. Measurement of cortical and hippocampal epileptiform activity in freely moving rats by means of implantable radiotelemetry. J Neurosci Methods. 138, 65-72 (2004).
- Jeutter, D. C.
- Williams, P., et al. The use of radiotelemetry to evaluate electrographic seizures in rats with kainate-induced epilepsy. J Neurosci Methods. 155, 39-48 (2006).
- Bertram, E. H., Lothman, E. W. Ambulatory EEG cassette recorders for prolonged electroencephalographic monitoring in animals. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 79, 510-512 (1991).
- Bertram, E. H., Williamson, J. M., Cornett, J. F., Spradlin, S., Chen, Z. F. Design and construction of a long-term continuous video-EEG monitoring unit for simultaneous recording of multiple small animals. Brain Res Brain Res Protoc. 2, 85-97 (1997).
- Russell, D. M., McCormick, D., Taberner, A. J., Malpas, S. C., Budgett, D. M. A high bandwidth fully implantable mouse telemetry system for chronic ECG measurement. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. , 7666-7669 (2011).
- Lin, D. C., Bucher, B. P., Davis, H. P., Sprunger, L. K. A low-cost telemetry system suitable for measuring mouse biopotentials. Med Eng Phys. 30, 199-205 (2008).
- Aghagolzadeh, M., Zhang, F., Oweiss, K. An implantable VLSI architecture for real time spike sorting in cortically controlled Brain Machine Interfaces. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. , 1569-1572 (2010).
- Bonfanti, A., et al. A multi-channel low-power system-on-chip for single-unit recording and narrowband wireless transmission of neural signal. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. , (2010).
- Chang, P., Hashemi, K. S., Walker, M. C. A novel telemetry system for recording EEG in small animals. J Neurosci Methods. 201, 106-115 (2011).
- Chen, H. Y., Wu, J. S., Hyland, B., Lu, X. D., Chen, J. J. A low noise remotely controllable wireless telemetry system for single-unit recording in rats navigating in a vertical maze. Med Biol Eng Comput. 46, 833-839 (2008).
- De Simoni, M. G., De Luigi, A., Imeri, L., Algeri, S. Miniaturized optoelectronic system for telemetry of in vivo voltammetric signals. J Neurosci Methods. 33, 233-240 (1990).
- Farshchi, S., Nuyujukian, P. H., Pesterev, A., Mody, I., Judy, J. W. A TinyOS-enabled MICA2-based wireless neural interface. IEEE Trans Biomed Eng. 53, 1416-1424 (2006).
- Gottesmann, C., Rodi, M., Rebelle, J., Maillet, B. Polygraphic recording of the rat using miniaturised telemetry equipment. Physiol Behav. 18, 337-340 (1977).
- Gottesmann, C., Rebelle, J., Maillet, B., Rodi, M., Rallo, J. L. Polygraphic recording in the rat by a miniaturized radiotelemetric technic. C R Seances Soc Biol Fil. 169, 1584-1589 (1975).
- Handoko, M. L., et al. A refined radio-telemetry technique to monitor right ventricle or pulmonary artery pressures in rats: a useful tool in pulmonary hypertension research. Pflugers Arch. 455, 951-959 (2008).
- Hanley, J., Zweizig, J. R., Kado, R. T., Adey, W. R., Rovner, L. D. Combined telephone and radiotelemetry of the EEG. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 26, 323-324 (1969).
- Irazoqui, P. P., Mody, I., Judy, J. W. Recording brain activity wirelessly. Inductive powering in miniature implantable neural recording devices. IEEE Eng Med Biol Mag. 24, 48-54 (2005).
- Lapray, D., Bergeler, J., Dupont, E., Thews, O., Luhmann, H. J. A novel miniature telemetric system for recording EEG activity in freely moving rats. J Neurosci Methods. 168, 119-126 (2008).
- Lee, S. B., Yin, M., Manns, J. R., Ghovanloo, M. A wideband dual-antenna receiver for wireless recording from animals behaving in large arenas. IEEE Trans Biomed Eng. 60, 1993-2004 (2013).
- Morrison, T., Nagaraju, M., Winslow, B., Bernard, A., Otis, B. P. A 0.5 cm(3) four-channel 1.1 mW wireless biosignal interface with 20 m range. IEEE Trans Biomed Circuits Syst. 8 (3), 138-147 (2014).
- Moscardo, E., Rostello, C. An integrated system for video and telemetric electroencephalographic recording to measure behavioural and physiological parameters. J Pharmacol Toxicol Methods. 62, 64-71 (2010).
- Mumford, H., Wetherell, J. R. A simple method for measuring EEG in freely moving guinea pigs. J Neurosci Methods. 107, 125-130 (2001).
- Nagasaki, H., Asaki, Y., Iriki, M., Katayama, S. Simple and stable techniques for recording slow-wave sleep. Pflugers Arch. 366, 265-267 (1976).
- Podgurniak, P. A simple, PC-dedicated, implanted digital PIM-radiotelemetric system. Part 2: The multichannel system. Biomed Tech (Berl). 46, 273-279 (2001).
- Ruedin, P., Bisang, J., Waser, P. G., Borbely, A. A. Sleep telemetry in the rat: I. a miniaturized FM--AM transmitter for EEG and EMG). Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 44, 112-114 (1978).
- Ruther, P., et al. Compact wireless neural recording system for small animals using silicon-based probe arrays. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. , 2284-2287 (2011).
- Saito, T., Watanabe, Y., Nemoto, T., Kasuya, E., Sakumoto, R. Radiotelemetry recording of electroencephalogram in piglets during rest. Physiol Behav. 84, 725-731 (2005).
- Sumiyoshi, A., Riera, J. J., Ogawa, T., Kawashima, R. A mini-cap for simultaneous EEG and fMRI recording in rodents. Neuroimage. 54, 1951-1965 (2011).
- Sundstrom, L. E., Sundstrom, K. E., Mellanby, J. H. A new protocol for the transmission of physiological signals by digital telemetry. J Neurosci Methods. 77, 55-60 (1997).
- Wang, M., et al. A telemetery system for neural signal acquiring and processing. Sheng Wu Yi Xue Gong Cheng Xue Za Zhi. 28, 49-53 (2011).
- Cotugno, M., Mandile, P., D'Angiolillo, D., Montagnese, P., Giuditta, A. Implantation of an EEG telemetric transmitter in the rat. Ital J Neurol Sci. 17, 131-134 (1996).
- Vogel, V., Sanchez, C., Jennum, P. EEG measurements by means of radiotelemetry after intracerebroventricular (ICV) cannulation in rodents. J Neurosci Methods. 118, 89-96 (2002).
- Louis, R. P., Lee, J., Stephenson, R. Design and validation of a computer-based sleep-scoring algorithm. J Neurosci Methods. 133, 71-80 (2004).
- Tang, X., Sanford, L. D. Telemetric recording of sleep and home cage activity in mice. Sleep. 25, 691-699 (2002).
- Bassett, L., et al. Telemetry video-electroencephalography (EEG) in rats, dogs and non-human primates: methods in follow-up safety pharmacology seizure liability assessments. J Pharmacol Toxicol Methods. 70, 230-240 (2014).
- Authier, S., et al. Video-electroencephalography in conscious non human primate using radiotelemetry and computerized analysis: refinement of a safety pharmacology model. J Pharmacol Toxicol Methods. 60, 88-93 (2009).
- Yee, B. K., Singer, P. A conceptual and practical guide to the behavioural evaluation of animal models of the symptomatology and therapy of schizophrenia. Cell Tissue Res. 354, 221-246 (2013).
- Fahey, J. R., Katoh, H., Malcolm, R., Perez, A. V. The case for genetic monitoring of mice and rats used in biomedical research. Mamm Genome. 24, 89-94 (2013).
- Hunsaker, M. R. Comprehensive neurocognitive endophenotyping strategies for mouse models of genetic disorders. Prog Neurobiol. 96, 220-241 (2012).
- Majewski-Tiedeken, C. R., Rabin, C. R., Siegel, S. J. Ketamine exposure in adult mice leads to increased cell death in C3H, DBA2 and FVB inbred mouse strains. Drug Alcohol Depend. 92, 217-227 (2008).
- Meier, S., Groeben, H., Mitzner, W., Brown, R. H. Genetic variability of induction and emergence times for inhalational anaesthetics. Eur J Anaesthesiol. 25, 113-117 (2008).
- Bonthuis, P. J., et al. Of mice and rats: key species variations in the sexual differentiation of brain and behavior. Front Neuroendocrinol. 31, 341-358 (2010).
- Buckmaster, P. S., Haney, M. M. Factors affecting outcomes of pilocarpine treatment in a mouse model of temporal lobe epilepsy. Epilepsy Res. , 102-153 (2012).
- Jonasson, Z. Meta-analysis of sex differences in rodent models of learning and memory: a review of behavioral and biological data. Neurosci Biobehav Rev. 28, 811-825 (2005).
- Richardson, C. A., Flecknell, P. A. Anaesthesia and post-operative analgesia following experimental surgery in laboratory rodents: are we making progress. Altern Lab Anim. 33, 119-127 (2005).
- Liles, J. H., Flecknell, P. A., Roughan, J., Cruz-Madorran, I. Influence of oral buprenorphine, oral naltrexone or morphine on the effects of laparotomy in the rat. Lab Anim. 32, 149-161 (1998).
- Liles, J. H., Flecknell, P. A. The effects of buprenorphine, nalbuphine and butorphanol alone or following halothane anaesthesia on food and water consumption and locomotor movement in rats. Lab Anim. 26, 180-189 (1992).
- Flecknell, P. A. Anaesthesia of animals for biomedical research. Br J Anaesth. 71, 885-894 (1993).
- Davis, J. A. Mouse and rat anesthesia and analgesia. Curr Protoc Neurosci. , Appendix 4, Appendix 4B (2008).
- Gargiulo, S., et al. Mice anesthesia, analgesia, and care, Part I: anesthetic considerations in preclinical research. ILAR J. 53, 55-69 (2012).
- Weiergraber, M., Henry, M., Hescheler, J., Smyth, N., Schneider, T. Electrocorticographic and deep intracerebral EEG recording in mice using a telemetry system. Brain Res Brain Res Protoc. 14, 154-164 (2005).
- Lundt, A., et al. EEG radiotelemetry in small laboratory rodents: a powerful state-of-the art approach in neuropsychiatric, neurodegenerative, and epilepsy research. Neural Plast. , (2016).
