Summary

בידוד של אוכלוסיות תאי perivascular מולטיפוטנטיים המבשרים מרקמות אדם לב

Published: October 08, 2016
doi:

Summary

ברקמת לב אדם מטפחת אוכלוסיות תאי מבשר perivascular מולטיפוטנטיים שעשויה להיות מתאים התחדשות שריר לב. הטכניקה המתוארת כאן מאפשרת בידוד סימולטני וטיהור שתי אוכלוסיות תאי סטרומה מולטיפוטנטיים קשורות כלי דם מקומיים, כלומר CD146 + CD34 pericytes ו CD34 + CD146 תאי adventitial, מן שריר הלב האנושי.

Abstract

Multipotent mesenchymal stem/stromal cells (MSC) were conventionally isolated, through their plastic adherence, from primary tissue digests whilst their anatomical tissue location remained unclear. The recent discovery of defined perivascular and MSC cell marker expression by perivascular cells in multiple tissues by our group and other researchers has provided an opportunity to prospectively isolate and purify specific homogenous subpopulations of multipotent perivascular precursor cells. We have previously demonstrated the use of fluorescent activated cell sorting (FACS) to purify microvascular CD146+CD34 pericytes and vascular CD34+CD146 adventitial cells from human skeletal muscle. Herein we describe a method to simultaneously isolate these two perivascular cell subsets from human myocardium by FACS, based on the expression of a defined set of cell surface markers for positive and negative selections. This method thus makes available two specific subpopulations of multipotent cardiac MSC-like precursor cells for use in basic research and/or therapeutic investigations.

Introduction

הלב מזה זמן רב נחשב איבר שלאחר mitotic. עם זאת, מחקרים שנעשו לאחרונה הראו נוכחות של מחזור cardiomyocyte מוגבל בלבות בני האדם המבוגר 1. תאי גזע / אב Native עם פוטנציאל התמיינות cardiomyocyte גם זוהו בתוך שריר הלב ב מכרסמים מבוגרים בליבותיהם, כולל SCA-1 +, c-kit +, cardiosphere יוצרים, ולאחרונה, 2,3 תאי מבשר perivascular. תאים אלה מייצגים מועמדים אטרקטיביים עבור טיפולים שמטרתם הגברת תיקון / התחדשות לב באמצעות השתלה תאית או גירוי של התפשטות in-situ.

גזע mesenchymal / בתאי סטרומה (MSC) בודדו כמעט מכל רקמה אנושית 4,5 ניסויים קליניים של היישומים הרפואיים של MSC בוצעו עבור במצבים פתולוגיים רבים כגון תיקון לב וכלי דם 6, שתל נגד מאכסן מחלה 7 </sup>, וכבד שחם 8. השפעות מועילות יוחסו היכולת של MSCs ל: בית לאתרים של דלקת 9; להתמיין לסוגי תאים שונים 10; להפריש מולקולות פרו-מתקן 11; ולווסת תגובות מארח חיסון 12. בידודו של MSCs הסתמך באופן מסורתי על הדבקות המועדפת שלהם מצעי פלסטיק. עם זאת, האוכלוסייה של תאים והתוצאה היא בדרך כלל במידה ניכרת הטרוגניים 13. באמצעות תא פלורסנט מיון מופעל (FACS) עם שילוב של סמני תא מפתח perivascular, הצלחנו לבודד ולטהר אוכלוסייה מבשרת MSC הדמוי מולטיפוטנטיים (CD146 + / CD31 / CD34 / CD45 / CD56 -) מ ברקמות אנושיות מספר כולל שרירי שלד מבוגרים ו -14 שומן לבן.

אוכלוסיות תאי perivascular ברקמות שאינן לב שונות הוכחו כבעלי תכונות של תאי גזע / אבnd נחקרים לשימוש קליני הגדרת הלב וכלי הדם. Pericytes, אחד תת תא perivascular הידוע ביותר, הם אוכלוסייה הטרוגנית ממלאות תפקידי pathophysiological מספר כולל בפיתוח הכלי החדש 15, ויסות לחץ דם 16, ותחזוקה של שלמות כלי דם 17,18. כפי שניתן לראות רקמות מרובות, תת-מערכות ספציפיות של pericytes המקורי להביע אנטיגנים MSC ולקיים פנוטיפים MSC הדמוי שלהם בתרבות העיקרית לאחר FACS טיהור 14. יתר על כן, תאים אלה ביציבות לשמור פנוטיפים שלהם לטווח הארוך בתוך התרבות להפגין פוטנציאל התמיינות רבה שושלת, בדומה MSCs 19,20. התוצאות מראות כי pericytes הוא אחד המקורות של MSC החמקמק 14. הפוטנציאל הטיפולי של pericytes הודגם עם ירידת הצטלקות שריר לב ומשופר תפקוד לב לאחר השתלה לתוך ischemically נפצעלבבות 21. לאחרונה, אנו מטוהרים בהצלחה pericytes מן שריר הלב האנושי והפגינו MSC דמוי פנוטיפים ו multipotency (adipogenesis, chondrogenesis ו osteogenesis) שלהם עם העדר myogenesis השלד 3. בנוסף, pericytes שריר הלב הציג יכולות פוטנציאליות ו angiogenic cardiomyogenic ההפרש בהשוואה לעמיתיהם מטוהרים מאיברים אחרים.

אוכלוסייה שנייה של ובתאים / גזע perivascular מולטיפוטנטיים, תא adventitial, מבודדת מייתר ורידי אדם saphenous על בסיס ביטוי CD34 החיובי 22. תאי adventitial ורידים הוכחו כבעלי פוטנציאל clonogenic, קיבולת בידול mesodermal ופוטנציאל proangiogenic במבחנה. השתלה של תאים אלה לתוך ליבם נפגע ischemically של עכברים הביא לירידה ב סיסטיק ביניים, גידול אנגיוגנזה זרימת הדם בשריר הלב, מופחת חדרית dilation, פליטת לב מוגברת חלק 23. מעניין לציין, כי תאי adventitial שומן הוכחו לאבד ביטוי CD34 ו upregulate ביטוי CD146 בתרבות בתגובה לטיפול angiopoietin השני, דבר המצביע על אימוץ פנוטיפ pericyte עם גירוי 24. בתוך הלב, לעומת זאת, אוכלוסיית תא adventitial טרם מטוהרת באופן פרוספקטיבי על ידי FACS ו / או גם מאופיין. ניצול הליכי בידוד תא המתוארות בסעיפים הבאים, אנו נמצאים כעת מאפיינת תאי adventitial שריר לב לחקור את הפוטנציאל שלהם ליישומים רגנרטיבית.

בזאת אנו מתארים שיטה לבודדת ולטהר שתי תת-אוכלוסיות של תאי גזע / אב perivascular מ שריר לב עוברי או אדם בוגר. שיטה פוטנציאלית לצינוק זה תאפשר לחוקרים לקבל גזע perivascular isogenic / אב תת תא ביופסיות לב אנושיות ללימודים השוואתיים further לחקור הפוטנציאל הטיפולי שלהם שונים במצבים פתולוגיים הלב.

Protocol

עיבוד 1. לדוגמא אדם לב ודא כי כל הנוזלים, מכולות, המכשירים, והשטח המבצעי הייעודי הם עקרים. מניחים את המדגם ברקמת הלב (רכש על ידי בנק רקמות או צוות המנתחים) במדיום אחסון מורכב בינוני הנשר שונה ש?…

Representative Results

תאים בודדים נבדלו פסולת כפילויות על בסיס חלוקות פיזור קדימה והצד. תאים חיים זוהו על ידי הכישלון שלהם לקחת את צבען DAPI. האסטרטגיה gating נבחר על בסיס תיוג אלוטיפ של חיה זו, דיסוציאציה התא כולו-לב (איור 1). מתוך תאי חיים, CD45 + תאים היו מגודרים ה?…

Discussion

ראיות הגדלת תומך יכולת התחדשות מוגבלת של הלב האנושי המבוגר לאחר פציעה. זיהוי ואפיון של תאי מבשר יליד אחראים תגובות התחדשות כאלה לבבות פגועים הם קריטיים עבור שני להבנת מנגנונים הקשורים מסלולי איתות ופיתוח הגישות לנצל תאים אלה טיפוליים.

<p class="jove_content" style=";text-align:right;dir…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors wish to thank Shonna Johnston, Claire Cryer, Fiona Rossi and Will Ramsay at the University of Edinburgh and Alison Logar and Megan Blanchard at the University of Pittsburgh for their expert assistance with flow cytometry. We also wish to thank Anne Saunderson and Lindsay Mock for their help with obtaining human tissues. Human adult and fetal heart tissue samples were procured with full ethics permission of the NHS Scotland Tayside Committee on Medical Research Ethics and the NHS Lothian Research Ethics Committee (REC08/S1101/1) respectively. This work was supported by grants from the Medical Research Council (BP), British Heart Foundation (BP), Commonwealth of Pennsylvania (BP), Children’s Hospital of Pittsburgh (BP), National Institute of Health R01AR49684 (JH) and R21HL083057 (BP), and the Henry J. Mankin Endowed Chair at University of Pittsburgh (JH). JEB was supported by a British Heart Foundation Centre of Research Excellence doctoral training award (RE/08/001/23904). WC was supported in part by an American Heart Association predoctoral fellowship (11PRE7490001).

Materials

AbC Anti-mouse Bead Kit Molecular Probes A-10344
Collagenase I Gibco 17100-017 Reconstitute powder as required and filter sterilise
Collagenase II Gibco 17101-015
Collagenase IV Gibco 17104-019
anti-human CD34-PE BD Pharmingen 555822 Keep sterile
anti-human CD45-APC-Cy7 BD Pharmingen 557833 Keep sterile
anti-human CD56-PE-Cy7 BD Pharmingen 557747 Keep sterile
anti-human CD144-PerCP-Cy5.5 BD Pharmingen 561566 Keep sterile
anti-human CD146-AF647 AbD Serotec MCA2141A647 Keep sterile
EGM2-BulletKit Lonza CC-3162 For collection of cells and culture until adhered
DMEM, high glucose, GlutaMAX without sodium pyruvate ThermoFischer Scientific 10566-016
Fetal Bovine Serum ThermoFischer Scientific 10500-064 Freeze in aliquots and keep sterile
Gelatin Sigma Aldrich G1393 Dilute with sterile water
IgG1k-PE BD Pharmingen 559320 Keep sterile
IgG1k-APC-Cy7 BD Pharmingen 557873 Keep sterile
IgG1k-PE-Cy7 BD Pharmingen 557872 Keep sterile
IgG1k-PerCP-Cy5.5 BD Pharmingen 561566 Keep sterile
IgG1k-647 AbD Serotec MCA1209A647 Keep sterile
Mouse serum Sigma Aldrich M5905 Keep sterile
Paraffin Film – Parafilm M Sigma Aldrich P7793
Penicillin-Streptomycin Gibco 15979-063 Freeze in aliquots and keep sterile
Phosphate buffered saline pH 7.4 ThermoFischer Scientific 10010-023 Keep sterile
Red Blood Cell Lysing Buffer Hybri-Max Sigma Aldrich R7757 Keep sterile
Trypan Blue Solution Sigma Aldrich T8154
Trypsin-EDTA 0.5%(10X) Invitrogen 15400-054
 FACSARIA FUSION BD Pharmingen Fluorescence Activated Cell Sorter

References

  1. Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science (New York, N.Y.). 324 (5923), 98-102 (2009).
  2. Laflamme, A., Murry, C. E. Heart regeneration. Nature. 473 (7347), 326-335 (2011).
  3. Chen, W. C. W., et al. Human myocardial pericytes: multipotent mesodermal precursors exhibiting cardiac specificity. Stem cells (Dayton, Ohio). 33 (2), 557-573 (2015).
  4. Campagnoli, C., Roberts, I. A., Kumar, S., Bennett, P. R., Bellantuono, I., Fisk, N. M. Identification of mesenchymal stem/progenitor cells in human first-trimester fetal. Blood. 98 (8), 2396-2402 (2001).
  5. Zuk, P. A., et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Molecular biology of the cell. 13 (12), 4279-4295 (2002).
  6. Chen, S., et al. Effect on left ventricular function of intracoronary transplantation of autologous bone marrow mesenchymal stem cell in patients with acute myocardial infarction. The American journal of cardiology. 94 (1), 92-95 (2004).
  7. Ringdén, O., et al. Mesenchymal stem cells for treatment of therapy-resistant graft-versus-host disease. Transplantation. 81 (10), 1390-1397 (2006).
  8. Kharaziha, P., et al. Improvement of liver function in liver cirrhosis patients after autologous mesenchymal stem cell injection: a phase I-II clinical trial. European journal of gastroenterology & hepatology. 21 (10), 1199-1205 (2009).
  9. Spaeth, E., Klopp, A., Dembinski, J., Andreeff, M., Marini, F. Inflammation and tumor microenvironments: defining the migratory itinerary of mesenchymal stem cells. Gene therapy. 15 (10), 730-738 (2008).
  10. Yan, X., et al. Injured microenvironment directly guides the differentiation of engrafted Flk-1(+) mesenchymal stem cell in lung. Experimental hematology. 35 (9), 1466-1475 (2007).
  11. Van Poll, D., et al. Mesenchymal stem cell-derived molecules directly modulate hepatocellular death and regeneration in vitro and in vivo. Hepatology (Baltimore, Md.). 47 (5), 1634-1643 (2008).
  12. Popp, F. C., et al. Mesenchymal stem cells can induce long-term acceptance of solid organ allografts in synergy with low-dose mycophenolate. Transplant immunology. 20 (1-2), 55-60 (2008).
  13. Li, Z., Zhang, C., Weiner, L. P., Zhang, Y., Zhong, J. F. Molecular characterization of heterogeneous mesenchymal stem cells with single-cell transcriptomes. Biotechnology advances. 31 (2), 312-317 (2013).
  14. Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell stem cell. 3 (3), 301-313 (2008).
  15. Ozerdem, U., Stallcup, W. B. Early contribution of pericytes to angiogenic sprouting and tube formation. Angiogenesis. 6 (3), 241-249 (2003).
  16. Rucker, H. K., Wynder, H. J., Thomas, W. E. Cellular mechanisms of CNS pericytes. Brain research bulletin. 51 (5), 363-369 (2000).
  17. Betsholtz, C. Insight into the physiological functions of PDGF through genetic studies in mice. Cytokine & Growth Factor Reviews. 15 (4), 215-228 (2004).
  18. Gerhardt, H., Betsholtz, C. Endothelial-pericyte interactions in angiogenesis. Cell and tissue research. 314 (1), 15-23 (2003).
  19. Crisan, M., Chen, C. W., Corselli, M., Andriolo, G., Lazzari, L., Péault, B. Perivascular multipotent progenitor cells in human organs. Annals of the New York Academy of Sciences. 1176, 118-123 (2009).
  20. Kang, S. G., et al. Isolation and perivascular localization of mesenchymal stem cells from mouse brain. Neurosurgery. 67 (3), 711-720 (2010).
  21. Chen, C. W., et al. Human pericytes for ischemic heart repair. Stem cells (Dayton, Ohio). 31 (2), 305-316 (2013).
  22. Campagnolo, P., et al. Human adult vena saphena contains perivascular progenitor cells endowed with clonogenic and proangiogenic potential. Circulation. 121 (15), 1735-1745 (2010).
  23. Katare, R., et al. Transplantation of human pericyte progenitor cells improves the repair of infarcted heart through activation of an angiogenic program involving micro-RNA-132. Circulation research. 109 (8), 894-906 (2011).
  24. Corselli, M., Chen, C. W., Sun, B., Yap, S., Rubin, J. P., Péault, B. The Tunica Adventitia of Human Arteries and Veins As a Source of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells and Development. 21 (8), 1299-1308 (2012).
  25. Crisan, M., et al. Purification and long-term culture of multipotent progenitor cells affiliated with the walls of human blood vessels: myoendothelial cells and pericytes. Methods in cell biology. 86, 295-309 (2008).

Play Video

Cite This Article
Baily, J. E., Chen, W. C., Khan, N., Murray, I. R., González Galofre, Z. N., Huard, J., Péault, B. Isolation of Perivascular Multipotent Precursor Cell Populations from Human Cardiac Tissue. J. Vis. Exp. (116), e54252, doi:10.3791/54252 (2016).

View Video