Abstract
Brucella soorten zijn facultatief intracellulaire pathogenen dat dieren besmetten als hun natuurlijke gastheren. Overdracht op de mens wordt meestal veroorzaakt door direct contact met besmette dieren of door inname van besmet voedsel en kan leiden tot ernstige chronische infecties.
Brucella kunnen binnenvallen professionele en niet-professionele fagocytische cellen en repliceert binnen endoplasmatisch reticulum (ER) afgeleide vacuolen. De gastheer factoren die nodig zijn voor Brucella binnenkomst in gastheercellen, het vermijden van lysosomale degradatie en replicatie in de ER-achtige compartiment blijven grotendeels onbekend. Hier beschrijven we twee assays gastheerfactoren betrokken bij Brucella binnenkomst en replicatie in HeLa cellen te identificeren. De protocollen beschrijven het gebruik van RNA interferentie, terwijl alternatieve screeningmethoden worden toegepast. De assays zijn gebaseerd op de detectie van fluorescent gelabelde bacteriën fluorescent gelabelde gastheercellen middels geautomatiseerdewide-microscopie. De fluorescerende beelden worden geanalyseerd met behulp van een gestandaardiseerde beeldanalyse pijpleiding CellProfiler die eencellige gebaseerde infectie scoring mogelijk maakt.
In het eindpunt assay wordt intracellulaire replicatie gemeten twee dagen na infectie. Dit maakt het mogelijk bacteriën om verkeer naar hun replicatieve niche waar de proliferatie wordt geïnitieerd ongeveer 12 uur na bacteriële binnenkomst. Brucella die met succes hebben gevestigd een intracellulaire niche zal dus sterk hebben zich verspreid in gastheercellen. Sinds intracellulaire bacteriën sterk individuele extracellulaire of intracellulaire niet-replicatieve bacteriën overtreffen, kan een stam die constitutief GFP worden gebruikt. De sterke GFP signaal wordt vervolgens gebruikt om geïnfecteerde cellen te identificeren.
In tegenstelling, voor de toevoeging test is het belangrijk om onderscheid te maken tussen de intracellulaire en extracellulaire bacteriën. Hier wordt een stam codeert voor een tetracycline-induceerbare GFP gebruikt. Inductievan GFP met gelijktijdige inactivering van extracellulaire bacteriën door gentamicine maakt het onderscheid tussen intracellulaire en extracellulaire bacteriën op basis van het GFP-signaal, slechts intracellulaire bacteriën te kunnen GFP expressie. Hierdoor kan de robuuste detectie van enkele intracellulaire bacteriën voor intracellulaire proliferatie wordt geïnitieerd.
Introduction
Brucella species zijn gram-negatieve, facultatief intracellulaire pathogenen die behoren tot de klasse van α-Proteobacteria. Ze veroorzaken abortussen en onvruchtbaarheid in hun natuurlijke gastheren zoals koeien, geiten of schapen wat resulteert in ernstige economische verliezen in endemische gebieden. Brucellose is een van de belangrijkste zoönosen wereldwijd waardoor meer dan een half miljoen nieuwe infecties bij mensen per jaar 1. Toezending aan de mens wordt meestal veroorzaakt door direct contact met besmette dieren of door inname van besmet voedsel, zoals ongepasteuriseerde melk. Symptomen van febriele ziekte aspecifieke, die problemen veroorzaakt bij de diagnose van brucellose. Indien onbehandeld, kunnen de patiënten een chronische infectie te ontwikkelen met meer ernstige symptomen zoals artritis, endocarditis en neuropathie 2.
Op cellulair niveau Brucella kan fagocytische en niet-fagocytische cellen binnendringen en repliceert in een intracellulairecompartiment bekend als de Brucella-bevattende vacuole (BCV). Internalisering van bacteriën vereist actine cytoskelet herschikkingen door Rac, Rho, en directe activatie van Cdc42 3. Binnen de eukaryotische gastheercel, de BCV trafieken langs de endocytische route en ondanks de interactie met lysosomen, bacteriën erin slagen om degradatie te vermijden 4. Aanzuring van de BCV de vesiculaire ATPase moet de expressie van het bacteriële type IV secretie systeem (T4SS) 5 induceren. Men gelooft dat bacteriële effectoren afgescheiden door de T4SS essentieel zijn voor Brucella zijn replicatieve niche tonen, aangezien deletie van de T4SS 6 of remming van de vesiculaire ATPase leiden tot defecten in de inrichting van de intracellulaire niche 7. Bacteriën niet herhalen tijdens de fase van de handel tot ze bereiken een-ER afgeleid vacuolaire compartiment 8. Zodra intracellulaire proliferatie optreedt, wordt de BCV in close associatie met ER merkers zoals calnexin en glucose-6-fosfatase 6.
De moleculaire mechanismen die Brucella binnenkomt cellen, vermijdt lysosomale degradatie en tenslotte repliceert in een ER-achtige compartiment blijven grotendeels onbekend. Host factoren die betrokken zijn in verschillende stappen van de infectie zijn voornamelijk geïdentificeerd door een gerichte aanpak of een kleine schaal kleine interfererende RNA-scherm (siRNA) uitgevoerd in Drosophila cellen 9. Deze zijn licht werpen op de bijdrage van individuele gastheer factoren tijdens Brucella infectie, maar we zijn nog ver verwijderd van een beter begrip van het gehele proces.
Hier, protocollen die de identificatie van menselijke gastheer factoren met behulp van grootschalige RNA interferentie (RNAi) screening in combinatie met geautomatiseerde wide-field fluorescentie microscopie en geautomatiseerde beeldanalyse mogelijk worden gepresenteerd. Reverse siRNA transfectie van HeLa-cellen wordt uitgevoerd zoals described eerder 10,11 met kleine aanpassingen. Het eindpunt assay beslaat een groot deel van de levenscyclus Brucella intracellulaire behalve de uitgang en de infectie van naburige cellen. De treffers die in het eindpunt assay verder te karakteriseren, wordt een gemodificeerd protocol factoren betrokken bij vroege stappen van de infectie te identificeren gebruikt.
Een Brucella abortus stam die constitutief tot expressie GFP wordt gebruikt voor het eindpunt assay waarin bacteriën mogen cellen te infecteren gedurende twee dagen. Gedurende deze tijd, bacteriën in cellen, verkeer naar de ER-afgeleide replicatieve niche en repliceren in de peri-nucleaire space. De hoge niveaus van GFP-signaal kan dan worden gebruikt op betrouwbare wijze vast afzonderlijke replicerende cellen die bacteriën bevatten.
Om Brucella invoer in een high-throughput assay bestuderen, is het belangrijk om onderscheid te kunnen maken tussen de intracellulaire en extracellulaire bacteriën. De methode die hier circumv gepresenteerdeents differentiële antilichaam kleuring van intracellulaire en extracellulaire bacteriën. Het is gebaseerd op een Brucella stam die een tetracycline-induceerbare GFP in combinatie met constitutieve expressie van DsRed. De aanwezigheid van een constitutieve DsRed merker maakt de identificatie van bacteriën die in het monster aanwezig zijn. GFP expressie wordt geïnduceerd door toevoeging van de niet-toxische tetracycline analoog anhydrotetracycline (ATC) gelijktijdig met inactivering van extracellulaire bacteriën door gentamicine (Gm). Terwijl de cel-ondoordringbare antibioticum Gm doodt extracellulaire bacteriën, kunnen ATC de gastheercel in te voeren en te induceren GFP expressie selectief in intracellulaire bacteriën. Deze dubbele verslaggever maakt de robuuste scheiding van enkele intracellulaire bacteriën (GFP en DsRed signaal) van de extracellulaire bacteriën (alleen DsRed signaal) met behulp van wide-field microscopie. Om detecteerbare GFP expressie bereikt door intracellulaire Brucella gebleken dat 4 uur van inductie door atc resulteert in een betrouw-staat signaal. Vertaald inductie schema selectief GFP expressie in intracellulaire bacteriën is eerder gebruikt om intracellulaire Shigella 12 bestuderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Let op: Alle werkzaamheden met live Brucella abortus stammen moeten worden uitgevoerd in een bioveiligheid 3 (BSL3) laboratorium overweegt alle vereiste voorschriften en veiligheidsvoorschriften.
1. Bereiding van Screening platen en het kweken van bacteriën en cellen
- Voorbereiding van de Brucella abortus Starter Cultures
- Streak Brucella abortus 2308 (B. abortus) van -80 ° C melk stock op een Tryptic Soy Agar (TSA) plaat met 50 ug / ml kanamycine (TSA / Km). Incubeer plaat gedurende 3-4 dagen bij 37 ° C. Gebruik stam Brucella abortus 2308 pJC43 (apHT :: GFP) 13 voor het eindpunt assay en stam Brucella abortus pAC042.08 (apht :: DsRed, tetO :: tetR-GFP) voor het item test.
Opmerking: De gladde lipopolysaccharide (LPS) van Brucella abortus een belangrijke virulentie determinant maar ruwe mutanten kunnen optreden bij relatief hoge frequenties 14. we dus aan het testen van de status van de kweek stam voordat dit experiment. - Restreak bacteriën op vier TSA / Km platen die de volledige plaat en incubeer gedurende 2-3 dagen bij 37 ° C.
- Met behulp van een wegwerp plastic lus, overdracht en resuspendeer bacteriën uit de TSA / Km platen in 10 ml 10% geautoclaveerd afgeroomde melk. Zorg ervoor dat de bacteriën goed geresuspendeerd te zorgen voor een consistente bacteriële concentraties in alle starter culturen.
- Aliquot 250 pi bacteriesuspensie in 2 ml schroefdop buizen en bevriezen bij -80 ° C.
- Dooi een hoeveelheid van de startercultuur en breng 25 pl, 50 pl en 100 pl van de bacteriële startercultuur 250 ml scheiden schroefdop flesjes met 50 ml Tryptic Soy Broth (TSB) bevattende 50 ug / ml kanamycine (TSB / Km) . Sluit de flessen met Parafilm.
- Incubeer de flessen gedurende de nacht op een orbitale schudder bij 100 rpm en 37 ° C.
- Meet de optische dichtheid bij 600 nm (OD 600) om het volume van zuursel nodig is om een OD 600 = 0,8-1,1 bereikt na overnacht cultuur bepalen.
- Streak Brucella abortus 2308 (B. abortus) van -80 ° C melk stock op een Tryptic Soy Agar (TSA) plaat met 50 ug / ml kanamycine (TSA / Km). Incubeer plaat gedurende 3-4 dagen bij 37 ° C. Gebruik stam Brucella abortus 2308 pJC43 (apHT :: GFP) 13 voor het eindpunt assay en stam Brucella abortus pAC042.08 (apht :: DsRed, tetO :: tetR-GFP) voor het item test.
- Bereiding van HeLa Cells
- HeLa-cellen groeien in Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal kalfsserum (FCS) (DMEM / 10% FCS) in een 37 ° C vochtige incubator met 5% CO 2. Kweek cellen 80% confluentie.
- Bereid de Screening Platen met siRNA.
- Verdun siRNA in RNase-vrij water tot een uiteindelijke concentratie van 0,32 uM. Breng 5 ul / putje zwart duidelijke putjes met vlakke bodem 384 putjes.
- Gebruik de kolommen 1, 2, 23, en 24 voor standaard controles. Voor negatieve controles, gebruik maken van niet-targeting siRNA (gebakken) en mock putten zonder siRNA (transfectie alleen reagens). Voor transfectie controles worden een siRNA dat celdood induceert (KIF11), als positieve controles van bekende gastheerfactoren betrokken bij Brucella infecties (bijv ARPC3,een onderdeel van de Arp2 / 3 complex betrokken bij actine polymerisatie). Transfer handel verkrijgbaar siRNA bibliotheken of aangepaste siRNAs de resterende putjes.
- Seal platen met afpelbare aluminium folie. WINKEL platen bij -20 ° C.
Opmerking: De platen kunnen ten minste 6 maanden worden bewaard bij -20 ° C tot jaren afhankelijk van de aanbevelingen van de fabrikant.
- Verdun siRNA in RNase-vrij water tot een uiteindelijke concentratie van 0,32 uM. Breng 5 ul / putje zwart duidelijke putjes met vlakke bodem 384 putjes.
2. Reverse siRNA Transfectie
- Ontdooi zwart 384 putjes door centrifugatie bij 300 xg gedurende 20 min bij kamertemperatuur.
Opmerking: Dit zal neer alle vloeistof die kunnen hechten aan het deksel of de zijkant van de putjes te brengen. - Bereid het transfectie medium door verdunning van het transfectiereagens 1: 200 in DMEM zonder FCS bij kamertemperatuur. Bereid het transfectie medium niet meer dan 20 minuten voor gebruik. Voorzichtig meng de oplossing voor gebruik.
- Voeg 25 ul transfectie medium aan elk putje met behulp van een reagens dispenseren meng de oplossingen die door de plaat heen en weer bewegen.
- Incubeer de plaat gedurende 1 uur bij kamertemperatuur siRNA / transfectiereagens complexvorming mogelijk maken.
- Ondertussen bereiden HeLa cellen door wassen van de sub-confluente cellen van een 75 cm2 kolf eenmaal met 2,5 ml 0,05% trypsine-EDTA in PBS (trypsine).
- Voeg 1,5 ml verse trypsine en breng de kolf tot 37 ° C gedurende 2-3 minuten totdat de cellen ronden.
- Resuspendeer de cellen in 10 ml voorverwarmde DMEM / 16% FCS.
- Aantal cellen met behulp van een geautomatiseerde celgetalmeter en stelt een celsuspensie van 10.000 cellen / ml in DMEM / 16% FCS.
- Voeg 50 ul celsuspensie aan elk putje zonder reagens dispenser resulteert in 500 cellen / putje.
- Beweeg de plaat heen en weer om een gelijkmatige verdeling van de cellen te bereiken. Laat de plaat bij kamertemperatuur gedurende 5-10 min mogelijk te maken voor de cellen om te settelen.
- Seal de plaat met Parafilm en incubeer het voor 72 uur op een voorverwarmde aluminiumplaat in een 37 ° C vochtige incubator met 5% CO2.
Opmerking: De voorverwarmde aluminiumplaat geeft een gelijke temperatuur door de gehele 384-wells plaat.
3. Infectie en Fixation
- Eén dag voor infectie, te enten de cijfers bepaald in 1.1.7 van B. bedrag abortus starter cultuur in 50 ml TSB / Km medium in een 250 ml schroefdop fles. Verzegel de fles met Parafilm en groeien bacteriën overnacht bij 37 ° C en 100 rpm op een orbitale schudinrichting bij OD 600 = 0,8-1,1.
- Meet OD 600 van de bacteriecultuur en bereiden infectiemedium door verdunning van de bacteriekweek in DMEM / 10% FCS tot de gewenste multipliciteit van infectie (MOI) te bereiken.
Opmerking: Als u een infectie tarief van 5-10% in HeLa-cellen te verkrijgen, een MOI van 10.000 wordt gebruikt. Een MOI titratie curve moet worden uitgevoerd voor elk type cel om een optimale infectie tarieven te verkrijgen. - Ruil het transfectie medium van de 384-wells plaatmet 50 ui van het infectiemedium toepassing van een geautomatiseerde plaatwasser.
- Centrifugeer de 384-well plaat bij 400 xg en 4 ° C gedurende 20 min.
Opmerking: Dit helpt om het infectieproces te synchroniseren. - Verzegel de plaat met Parafilm en incubeer het op een voorverwarmde aluminium plaat in een 37 ° C vochtige incubator met 5% CO2 gedurende 4 uur.
- Was de cellen met DMEM / 10% FCS bevattende 100 ug / ml GM extracellulaire bacteriën te inactiveren de geautomatiseerde plaatwasser (gebruik 200 ul / putje overloop was).
Opmerking: Tijdens een overloop wassen, de geautomatiseerde plaat wasmachine gelijktijdig verdeelt en zuigt medium. - Voor de invoer assay wassen cellen een tweede keer met DMEM / 10% FCS bevattende 100 ug / ml GM en 100 ng / ml ATC de geautomatiseerde plaatwasser (gebruik 200 ul / putje overloop was).
- Verzegel de plaat met Parafilm en terug naar een voorverwarmde aluminium plaat in de 37 ° C vochtige incubator met 5% CO2 gedurende een40 uur of 4 uur voor het eindpunt assay en de ingang assay, respectievelijk.
- Voor bevestiging, was de putjes met PBS met behulp van de geautomatiseerde plaat wasmachine (gebruik 200 ul / well overflow wasbeurt).
- Exchange PBS met 50 gl 3,7% paraformaldehyde in 0,2 M HEPES bij pH 7,4 (PFA) met de geautomatiseerde plaatwasser.
Let op: Let op: PFA is giftig bij inademing, aanraking met de huid en opname door de mond. - Incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
- Vervang de fixatie medium met 50 ul PBS met behulp van de geautomatiseerde plaat wasmachine. Opmerking: De monsters zijn nu klaar om te worden genomen van de BSL3 indien nodig.
Let op: Het verwijderen van een monster uit een BSL3 is onderworpen aan risico-evaluatie en validatie van de procedure en is afhankelijk van de geldende voorschriften voor de bioveiligheid.
4. kleuring
- Was de cellen tweemaal met 50 pl PBS.
- Doorlaatbaar cellen in 50 pl 0,1% Triton-X-100 in PBS gedurende 10 min.
- was cellen driemaal met PBS. Voeg 20 ul PBS dat 1 ug / ml DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenylindool) en incubeer 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Was de cellen drie keer in PBS en de kleuring tegen licht beschermd met een aluminiumfolie.
5. Imaging
- Stel de geautomatiseerde wide-field microscoop voor het overname.
Opmerking: De instellingen voor een Molecular Device ImageXpress microscoop met MetaXpress software worden hieronder beschreven. Alternatieve 2D wide-field microscopie apparaten met de juiste hardware specificaties en imaging software kan worden gebruikt (zie tabel van Material / Apparatuur voor details).- Selecteer 10X objectief, camera binning = 1, winst = 1.
- Selecteer de plaatformaat overeenkomt met het 384-wells plaat.
- Verwerven 9 plaatsen per putje.
- Gebruik "Enable laser gebaseerde focus" en "Focus op plaat en goed bottom".
- Stel "Eerst goed" als de eerste goed voorhet vinden van het monster en "All sites" voor site-autofocus.
- Gebruik de DAPI kanaal handmatig in te stellen-Z Offset voor focus.
- Selecteer handmatig de-Z Offset van DAPI voor alle andere kanalen.
- Handmatig te corrigeren de belichtingstijd voor alle kanalen om een breed dynamisch bereik met lage overbelichting te garanderen.
- Verwerven van een afbeelding van een representatieve site met behulp van de functie automatische belichting. Gebruik deze belichtingstijd om de afbeelding 3-5 locaties in de plaat en handmatig de belichting tijd tot de helderste pixels bereiken ~ 80% van de maximale helderheid over alle sites.
- Het imago van de volledige plaat met behulp van de DAPI en GFP-kanalen voor het eindpunt assay. Voor de ingang test selecteert u de RFP kanaal naast.
6. Automated Image Analysis
Opmerking: CellProfiler 2 15 wordt toegepast als beeldanalyse software voor het segment cellulaire en bacteriële objecten en het uitvoeren van geautomatiseerde MEASURements binnen de geïdentificeerde objecten. De software zorgt beeldanalyse algoritmen in afzonderlijke modules, die kunnen worden gecombineerd in een pijpleiding die de modules achtereenvolgens uitvoeren van alle afbeeldingen, een specifieke beeldanalyse taak automatisch uit te voeren. Om het protocol te volgen, installeer CellProfiler 2.1.1 of een nieuwere versie. Vervolgens plaatst de meegeleverde leiding en volg de onderstaande instructies om de vereiste parameters in de modules aan te passen. Een beschrijving van de afzonderlijke modules van alle leidingen zijn te vinden in de Aanvullende Files.
Opmerking: Twee afzonderlijke leidingen worden gebruikt voor elke analyse. De eerste pijpleiding berekent een schaduw model, dat wordt gebruikt door de tweede leiding om beelden te corrigeren voorafgaand aan de analyse. Schaduwcorrectie toegepast op de afbeeldingen om de gevolgen van een inhomogene lichtpad van de microscoop te verminderen. Berekenen van de schaduw model in de eerste pijplijn is een langdurig proces, maar de resultaten zullen hogere nauwkeurigheid.
- <li> Endpoint Assay
- Bereken de shading model
- Ga naar het menu "Bestand", selecteer "Importeren" → "Pipeline uit bestand ...", en selecteer de voorwaarde pipeline "BrucellaShadingCorrectionPart1-Ver007". Op de vraag of de erfenis pijplijn te zetten, te beantwoorden "Niet bekeren".
- Ga naar "Output" → "Mening output-instellingen" en selecteer een ingang map met foto's en een output map voor het ontstane shading modellen.
- In Module (1) "LoadImages", stelt u de naam van de "Tekst dat deze beelden met elkaar gemeen hebben" om het beeld namen aan te passen.
- Zorg ervoor dat geen van de modules tonen hun scherm voorafgaand aan het uitvoeren van de volledige analyse door het vinkje alle ogen symbolen naast de modules. Opmerking: Dit aanzienlijk vermindert vereist computationele middelen tijdens het verwerken van de pijplijn.
- Druk op 'Analyze Images "om de berekening van de schaduw model te starten.
- Run Image Analysis
- Ga naar het menu "Bestand", selecteer "Importeren" → "Pipeline uit bestand ...", en selecteer de voorwaarde pipeline "BrucellaEndpointWithShadingCorrectionPart2-Ver007". Op de vraag of de erfenis pijplijn te zetten, te beantwoorden "Niet bekeren".
- Ga naar "Output" → "Mening output-instellingen" en selecteer een ingang map met foto's en een output map voor de resulterende spreadsheet.
- In module (1) "LoadImages", stelt u de naam van de "Tekst dat deze beelden met elkaar gemeen hebben" om het beeld namen aan te passen.
- In module (2) "LoadSingleImage", laadt de shading modellen berekend onder 6.1.1 door het selecteren van de locatie en de bestandsnamen van de twee shading modellen.
- In modules (4) - (5) "ImageMath", stel de parameter "Vermenigvuldig het eerste beeld door" het afstemmen van de bitdiepte van de microscoop camera. Voor 8 en 16 bitfoto's stelt u de parameter in op "1.0", voor 12 bit beelden zet de parameter op "16,0".
- In module (9) "ImageMath" stel de parameter "Vermenigvuldig het tweede beeld door" op een waarde (begin met 0,25), die de Brucella signaal in de DAPI kleuring onderdrukt zonder het onderdrukken van de kernen.
- Klik op "Start Test Mode", dan activeert u de pauze-symbool en het display-functie voor module (9) door te klikken op de bijbehorende iconen van de module.
Opmerking: Het pauzesymbool verschijnt in geel, terwijl de oogsymbool een open oog zal laten zien als deze is ingeschakeld. - Klik op "Run" om de analyse aanloop naar module (9) met de actieve pauze-symbool. Om de waarden te testen voor de module, druk op "Step".
- Klik rechts op de onlangs geopende afbeelding en stel "Image contrast" naar "Log genormaliseerd". Herhaaldelijk stap terug naar module (9), stel de parameter "Vermenigvuldig het tweede beeld door", en stap dan tHij module opnieuw, totdat de Brucella signaal volledig wordt onderdrukt, terwijl tegelijkertijd zwarte gebieden geven dat over-aftrekking geminimaliseerd beeld het resultaat.
- Klik op "Start Test Mode", dan activeert u de pauze-symbool en het display-functie voor module (9) door te klikken op de bijbehorende iconen van de module.
- In module (10) "IdentifyPrimaryObjects", stelt u de parameter "ondergrens van drempel" hoog genoeg is (start met nul), zodat kernen worden gesegmenteerd en de achtergrond wordt genegeerd.
- Om een goede waarde identificeren module (10), stap over de module en van het invoerbeeld weergeven als beschreven in stap 6.1.2.6.1 en 6.1.2.6.2.
- Klik met de rechtermuisknop het ingevoerde beeld en het histogram weer te geven.
Opmerking: De piek van het histogram geeft gewoonlijk achtergrond. - Vanaf achtergrond intensiteit te verhogen de parameter totdat een goede segmentatie van kernen wordt bereikt als weergegeven beeld van de output in.
Opmerking: Het instellen van de drempel hoger is dan de achtergrond intensiteit is vooral belangrijk voor lege sites.
- In module (15)4; FilterObjects ", stel de parameter" Minimale waarde ", zodat de cellen met duidelijk zichtbare Brucella in de kern worden gehouden, en alle anderen zijn weggefilterd In deze stap, negeer Brucella buiten de kern..
- Om een goede prijs, stap over de module te identificeren en het imago van de uitgang weer te geven zoals uitgelegd in stappen 6.1.2.6.1 en 6.1.2.6.2. Start vanaf nul, waarin alle cellen als geïnfecteerd geïdentificeerd, en verhoging van de waarde met kleine stappen totdat alleen cellen met duidelijk zichtbare Brucella in de kern worden gehouden.
- In module (16) "FilterObjects", stel de parameter "Minimale waarde", zodat de cellen met duidelijk zichtbare Brucella in het perinucleus worden gehouden, en alle andere cellen worden weggefilterd. Met een soortgelijke benadering als in de vorige module.
- In module (17) "FilterObjects", stel de parameter "Minimale waarde", zodat de cellen met duidelijk zichtbare Brucella op de Voronoi cellichaam worden gehouden en alle andere cellen worden weggefilterd. Met een soortgelijke benadering als in de vorige module.
Opmerking: de Voronoi-cel lichaam is een radiale uitbreiding van de kern met 25 pixels met geen overlapping met naburige Voronoi cellichamen. - Verlaat de test mode en zorg ervoor dat geen van de modules tonen hun scherm voorafgaand aan het uitvoeren van de volledige analyse door het vinkje alle ogen symbolen naast de modules.
Opmerking: Dit aanzienlijk vermindert vereist computationele middelen tijdens het verwerken van de pijplijn. - Druk op 'Analyze Images "om de analyse te starten.
- Wanneer de analyse is voltooid, controleert de resulterende PNG beelden en het CSV vel dat de analyse werkte betrouwbaar gehele plaat.
- Entry Assay
- Bereken de shading model
- Ga naar het menu "Bestand", selecteer "Importeren" → "Pipeline uit bestand ..." en selecteer de te verstrekkend pipeline "BrucellaShadingCorrectionPart1-Ver007". Op de vraag of de erfenis pijplijn te zetten, te beantwoorden "Niet bekeren".
- Ga naar "Output" → "Mening output-instellingen" en selecteer een ingang map met foto's en een output map voor het ontstane shading modellen.
- In module (1) "LoadImages", stelt u de naam van de "Tekst dat deze beelden met elkaar gemeen hebben" om het beeld namen aan te passen.
- Zorg ervoor dat geen van de modules tonen hun scherm voorafgaand aan het uitvoeren van de volledige analyse door het vinkje alle ogen symbolen naast de modules.
Opmerking: Dit aanzienlijk vermindert vereist computationele middelen tijdens het verwerken van de pijplijn. - Druk op 'Analyze Images "om de berekening van de schaduw model te starten.
- Run Image Analysis
- Ga naar het menu "Bestand", selecteer "Importeren" → "Pipeline uit bestand ...", en selecteer de provided pipeline "BrucellaEntryWithShadingCorrectionPart2-Ver007". Op de vraag of de erfenis pijplijn te zetten, te beantwoorden "Niet bekeren".
- Ga naar "Output" → "Mening output-instellingen" en selecteer een ingang map met foto's en een output map voor de resulterende spreadsheet.
- In module (1) "LoadImages", stelt u de naam van de "Tekst dat deze beelden met elkaar gemeen hebben" om het beeld namen aan te passen.
- In module (2) "LoadSingleImage", laadt de shading modellen berekend onder 6.2.1 door het selecteren van de locatie en de bestandsnamen van de twee shading modellen.
- In modules (4) - (5) "ImageMath", stel de parameter "Vermenigvuldig het eerste beeld door" het afstemmen van de bitdiepte van de microscoop camera. Voor 8 en 16 bit beelden zet de parameter op "1.0", voor 12 bit beelden zet de parameter op "16,0".
- In module (6) "IdentifyPrimaryObjects", stelt u de parameter "Lower gebonden op de drempel 'hoog genoeg dat alleen kernen worden gesegmenteerd en de achtergrond wordt genegeerd.
- Om een goede prijs-module (6), stap over de module te identificeren en het ingevoerde beeld weer te geven zoals uitgelegd in stappen 6.1.2.6.1 en 6.1.2.6.2.
- Klik met de rechtermuisknop het ingevoerde beeld en het histogram weer te geven.
Opmerking: De piek van het histogram geeft gewoonlijk achtergrond. - Vanaf achtergrond intensiteit te verhogen de parameter totdat een goede segmentatie van kernen wordt bereikt als weergegeven beeld van de output in.
Opmerking: Het instellen van de drempel waarboven de achtergrond is belangrijk voor lege sites.
- In module (8) "IdentifyPrimaryObjects", stelt u de parameter "ondergrens van drempel" hoog genoeg dat alleen Brucella worden gesegmenteerd en de achtergrond wordt genegeerd.
- Om een goede waarde voor de module (8), stap over de module te identificeren en het ingevoerde beeld weer te geven zoals uitgelegd in stappen 6.1.2.6.1 en 6.1.2.6.2.
- Klik met de rechtermuisknop het ingevoerde beeld en het histogram weer te geven.
Opmerking: De piek van het histogram geeft gewoonlijk achtergrond. - Vanaf achtergrond intensiteit te verhogen de parameter totdat goede segmentatie van Brucella zoals weergegeven beeld van de output in is bereikt.
Opmerking: Het instellen van de drempel waarboven de achtergrond is belangrijk voor lege sites.
- In module (11) "FilterObjects", stel de parameter "Minimale waarde", zodat de achtergrond en kunstvoorwerpen zijn weg gefilterd, en slechts Brucella kolonies worden gehouden.
- Om een goede prijs, stap over de module te identificeren en het imago van de uitgang weer te geven zoals uitgelegd in stappen 6.1.2.6.1 en 6.1.2.6.2. Begin met de geselecteerde in 6.2.2.7 en stapsgewijs te verhogen totdat alleen Brucella objecten worden bewaard.
- Verlaat de test mode en zorg ervoor dat geen van de modules tonen hun scherm voorafgaand aan het uitvoeren van de volledige analyse door unchecking alle eye symbolen naast de modules.
Opmerking: Dit aanzienlijk vermindert vereist computationele middelen tijdens het verwerken van de pijplijn. - Druk op 'Analyze Images "om de analyse te starten.
- Wanneer de analyse is voltooid, controleert de resulterende PNG beelden en het CSV plaat zodat de analyse werkte goed hele plaat.
- Bereken de shading model
- Endpoint Assay
- Open het CSV-sheet gegenereerd in stap 6.1.2.12 en het berekenen van een per putje infectie door het aantal geïnfecteerde cellen (CellProfiler uitlezing: "Count_InfectedCells") te delen door het totaal aantal cellen (CellProfiler uitlezing: "CountNuclei"). Als meerdere locaties per putje werden belicht, eerste vatten alle sites voor elke wel, een per putjes aantal geïnfecteerde cellen en per putjes totale aantal cellen te bouwen.
- Voer Z scoren normalisatie om rekening te houden plate-to-plate variaties als de platen bevatten voldoende non-hit siRNA. Neem aan dat een voldoende aantal niet-hit siRNA per plaat als vol bibliotheken worden gescreend.
- Entry Assay
- Open het CSV-sheet gegenereerd in stap 6.2.2.10 en het berekenen van een per putje infectiegraad door delen van het aantal geïnfecteerde cellen (CellProfiler uitlezing: "Count_InfectedCells ") van het totale aantal cellen (CellProfiler uitlezing". CountNuclei ") Indien verscheidene sites per putje werden belicht, eerste vatten alle sites voor elke wel, een per putjes aantal geïnfecteerde cellen en bouwen een per putjes totaal aantal cellen.
- Om de bacteriële verontreiniging van geïnfecteerde cellen te kwantificeren, een schatting van de gemiddelde oppervlakte ingenomen door intracellulaire bacteriën per geïnfecteerde cel. Hiertoe verdelen het geïntegreerde oppervlak van alle intracellulaire bacteriën overlapt cellen (CellProfiler uitlezing: "AreaOccupied_AreaOccupied_TrueIntPathogenInCells") van het aantal geïnfecteerde cellen in deze website. Om rekening te houden artefacten, gebruik dan de mediaan van alle sites van deze uitlezing als ook uitlezen.
Opmerking: Als deze test wordt gebruikt als een follow-up test met een groot aantal genen die betrokken zijn bij Brucella infecties, hoeft Z score normalisatie niet van toepassing. In plaats daarvan, het uitvoeren van normalisatie met behulp van mock putten als referentie om rekening te houden plate-to-plate variatie.
7. Infectie Scoring
Opmerking: siRNA's die een aanzienlijke invloed op de levensvatbaarheid van de cel moeten rekening moet worden gehouden met de nodige voorzichtigheid, omdat deze valse positieve ontdekkingen kan bevorderen. Een veranderd aantal cellen beïnvloedt de eigenlijke MOI en targeting van essentiële genen pleiotrope effecten op pathogene infectie. Terwijl de onvolledige depletie van siRNA maakt de studie van essentiële genen zijn dergelijke doelstellingen worden bevestigd door alternatieve werkwijzen (bijvoorbeeld farmaceutische storing) een rol te bevestigen gastheerfactorentijdens infectie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1A toont een voorbeeld van beeldanalyse gebruikt om geïnfecteerde cellen automatisch te identificeren op het eindpunt assay. Kernen van HeLa cellen gekleurd met DAPI geïdentificeerd, een peri-kern van 8 pixels breed rondom de kern, en een Voronoi cellichaam door verlenging van de kern van 25 pixels berekend. Omdat bacteriën voornamelijk prolifereren in de peri-nucleaire ruimte, de GFP intensiteit in dit gebied van de cel is de meest robuuste meting te maken tussen geïnfecteerde en niet-geïnfecteerde cellen. In sommige gevallen worden bacteriën buiten de peri-kern of overlay prolifereren grotendeels met de kern. Daarom werden deze twee extra objecten ook overwogen voor de identificatie van geïnfecteerde cellen. Segmentatie en GFP intensiteit metingen werden uitgevoerd met de beeldanalyse software CellProfiler 2.
Brucella
Figuur 2A illustreert de image analyse gebruikt om geïnfecteerde cellen te identificeren en meten van de intracellulaire bacteriële lading in de ingang test. In tegenstelling tot de eindpunt assay wordt de vermelding assay gebruikt bacteriële segmentatie en een Voronoi cellichaam cellulaire object. Alleen het GFP-signaal van intracellulaire Brucella werd gebruikt om het segment van de ziekteverwekker in deze beeldanalyse pijplijn. Intracellulaire bacteriën werden bepaald door een minimale grootte van 2 pixels en een GFP intensiteit die de dim GFP achtergrond intensiteit van de extracellulaire bacteriën overschrijdt. Een cel werd als geïnfecteerde indien een of intracellulaire bacteriële object overlapt met Voronoi cellichaam. Daarnaast werd de bacteriële verontreiniging geschat door het berekenen van de gemiddelde oppervlakte van geïnfecteerde cellen die onder intracellulaire bacteriën.
Wat betreft het eindpunt assay uitputting van ARPC3 bleken de Brucella infectie bij de ingang assay vergeleken met cellen behandeld met een control siRNA (Figuur 2B). Kwantificering van de infectiegraad bevestigd dat het aantal geïnfecteerde cellen (Figuur 2C) en het aantal intracellulaire bacteriën in geïnfecteerde cellen (Figuur 2D) gereduceerd door uitputting van ARPC3.
Figuur 1: Analyse van HeLa-cellen geïnfecteerd met B. abortus die GFP in het eindpunt assay (A) Eindpunt assay. Fluorescentie beeld dat een voorbeeld van het eindpunt assay (groen = B. abortus GFP, blauw = kernen gekleurd met DAPI, schaal bar = 50 pm). GFP expressie B. abortus mochten HeLa-cellen te voeren voor 4 uur gevolgd door het doden van de extracellulaire bacteriën door GM. Aanvullende incubatie gedurende 40 uur liet bacteriën repliceren in HeLa-cellen. Geautomatiseerde image analysi B: Een CellProfiler pijpleiding werd gebruikt om segment DAPI gekleurde kernen gevolgd door berekening van de peri-kern (niet-overlappende ring van 8 pixels rondom de kern) en Voronoi cellichaam (niet-overlappende radiale verlenging van de kern van 25 pixels), zowel in het rood weergegeven. Een cel werd als geïnfecteerde als de geïntegreerde GFP intensiteit in ten minste één cellulair compartiment (kern, peri-kern, Voronoi cellichaam) als drempel overschreden. (B) Representatieve beelden van HeLa-cellen geïnfecteerd met B. abortus die GFP 44 uur na de infectie. De cellen werden ofwel getransfecteerd met een gecodeerde (non-targeting) siRNA controle of een siRNA gericht ARPC3. Schaal bar = 50 micrometer. (C) Kwantificering van infectie van HeLa-cellen die is uitgeput ARPC3. De gegevens worden weergegeven als staafdiagrammen (bar = gemiddelde; Z scoren normalisatie; foutbalken = standaardfout van het gemiddelde; *** p <0,001; Mann-Whitney-test; n = 7).es / ftp_upload / 54263 / 54263fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Kwantificering van infectie van HeLa-cellen door B. . abortus uitdrukken TetR-GFP in de vermelding assay (A) Entry-test: het Fluorescence toont een voorbeeld van binnenkomst assay (geel = intracellulaire B. abortus tonen DsRed en GFP-signaal, rood = extracellulair B. abortus tonen DsRed signaal, blauw = kernen gekleurd met DAPI, Schaal bar = 50 pm). B. abortus expressie DsRed en TetR-GFP mochten HeLa cellen binnen 4 uren, gevolgd door het doden van extracellulaire bacteriën en gelijktijdige inductie van GFP in intracellulaire bacteriën ATc 4h Geautomatiseerde beeldanalyse. CellProfiler een pijplijn gebruikt DAPI detecterenlood kernen gevolgd door berekening van een Voronoi-cel lichaam door radiale uitbreiding van de kern met 25 pixels (in het wit). Bacteriën werden gesegmenteerd op basis van het GFP-signaal. Een cel werd beschouwd als de geïnfecteerde Voronoi cellichaam met ten minste één gesegmenteerde bacteriële object zodanige omvang en intensiteit GFP overlapt. De bacteriële verontreiniging in geïnfecteerde cellen wordt geïllustreerd door de integratie van het gebied van gesegmenteerde bacteriële objecten met Voronoi cellichaam (eenheid = pixels, NaN = geen aantal wordt berekend in niet-geïnfecteerde cellen). (B) Voorbeeld beelden ter illustratie van een daling van de intracellulaire B. abortus (getoond door het aantal gele bacteriën) in cellen getransfecteerd met siRNA gericht ARPC3 vergelijking met cellen behandeld met scrambled siRNA controle. Het aantal geïnfecteerde cellen en het gemiddelde aantal intracellulaire bacteriën in geïnfecteerde cellen verminderd bij ARPC3 neerslaan. (C) Kwantificering van de besmettingsgraad in HeLa-cellen uitgeputvoor ARPC3. De gegevens worden weergegeven als staafdiagrammen (bar = gemiddelde; normalisatie om mock; foutbalken = standaardfout van het gemiddelde; * p <0,05; Mann-Whitney-test; n = 4). (D) Kwantificering van de bacteriële verontreiniging van geïnfecteerde HeLa-cellen uitgeput voor ARPC3. De gegevens worden weergegeven als staafdiagrammen (bar = gemiddelde; normalisatie om mock; foutbalken = standaardfout van het gemiddelde; * p <0,05; Mann-Whitney-test; n = 4). Klik hier om een grotere versie van deze foto figuur.
Aanvullende File 1:. CP2 pipeline - shading correctie Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende File 2: CP2 pipeline- Endpoint assay. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende File 3:. CP2 pipeline - Entry-test Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende File. 4: Beschrijving van de Modules Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tryptic Soy Agar (TSA) | BD | 236950 | |
| Tryptic Soy Broth (TSB) | Fluka | 22092 | |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 60615 | |
| Skim milk | |||
| 250 ml screw cap bottle | Corning | 8396 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Gibco | 10270 | Heat-inactivated |
| Trypsin-EDTA (0.5%) | Gibco | 15400-054 | 10x stock solution, dilute 1:10 in PBS |
| Scepte 2.0 Cell Counter | Merck Milipore | PHCC20060 | Alternative cell counting devices can be used |
| Greiner CELLSTAR 384-well plate | Sigma-Aldrich | M2062 | |
| Peelable aluminum foil | Costar | 6570 | |
| Reagent dispenser: "Multidrop 384 Reagent Dispenser" | Thermo Scientific | 5840150 | Alternative reagent dispenser can be used. |
| Transfection reagent: "Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen | 13778-150 | |
| Automated plate washer: "Plate washer ELx50-16" | BioTek | ELX5016 | This plate washer contains a 16-channel manifold suitable for 384-well plates. It fits into a biosafety cabinet and has a lid covering the plate during washing which reduces the risk of aerosol production. Alternative plate washers with similar features could be used. |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | |
| Anhydrotetracycline hydrochloride | Sigma-Aldrich | 37919 | 100 μg/ml solution in 100% ethanol is kept at -20 °C protected from light in aluminum-foil |
| PBS | Gibco | 20012 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Dissolve in 0.2 M HEPES buffer, pH 7.4. Store at -20 °C and thaw freshly the day before use. Caution, PFA is toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| DAPI | Roche | 10236276001 | |
| Scrambled siRNA | Dharmacon | D-001810-10 | |
| Kif11 siRNA | Dharmacon | L-003317-00 | |
| ARPC3 siRNA | Dharmacon | L-005284-00 | |
| Brucella abortus 2308 | |||
| pJC43 (apHT::GFP) | Celli et al.12 | ||
| pAC042.08 (apht::dsRed, tetO::tetR-GFP) | Construction: pJC44 4 was digested with EcoRI followed by generation of blunt ends with Klenov enzyme and subsequent digestion with SalI. TetR-GFP was amplified from pNF106 using primer prAC090 and prAC092. Following digestion with SalI, the TetR-GFP product was ligated to the digested pJC44 vector. | ||
| Primer prAC090 | Sigma-Aldrich | TTT TTG AAT TCT GGC AAT TCC GAC GTC TAA GAA ACC | |
| Primer prAC092 | Sigma-Aldrich | TTT TTG TCG ACT TTG TCC TAC TCA GGA GAG CGT TC | |
| HeLa CCL-2 | ATCC | CCL-2 | |
| ImageXpress Micro | Molecular Devices | IXM IMAGING MSCOPE | Automated cellular imaging microscope equipped with a precision motorized Z-stage. Alternative systems for automated microscopy and alternative components for hard- and software specified below can be employed. |
| High-Speed Laser Auto-Focus | Molecular Devices | 1-2300-1037 | |
| CFI Super Fluor 10X objective | Nikon | MRF00100 | N.A 0.50, W.D 1.20 mm, DIC Prism: 10X, Spring loaded |
| Photometrics CoolSNAP HQ Monochrome CCD Camera | Molecular Devices | 1-2300-1060 | 1,392 x 1,040 imaging pixels, 6.45 x 6.45 µm pixels, 12 bits digitization |
| MetaXpress software | Molecular Devices | 9500-0100 | |
| LUI-Spectra-X-7 | Lumencor | SPECTRA X V-XXX-YZ | Light engine. The following light sources are used: violet (DAPI), cyan (GFP), green/yellow (RFP) |
| Single Band Exciter for DAPI | Semrock | FF01-377/50-25 | |
| Single Band Emitter for DAPI | Semrock | FF02-447/60-25 | |
| Single Band Dichroic for DAPI | Semrock | FF409-Di03-25x36 | |
| Single Band Exciter for GFP | Semrock | FF02-472/30-25 | |
| Single Band Emitter for GFP | Semrock | FF01-520/35-25 | |
| Single Band Dichroic for GFP | Semrock | FF495-Di03-25x36 | |
| Single Band Exciter for RFP | Semrock | FF01-562/40-25 | |
| Single Band Emitter for RFP | Semrock | FF01-624/40-25 | |
| Single Band Dichroic for RFP | Semrock | FF593-Di03-25x36 |
References
- Pappas, G., Papadimitriou, P., Akritidis, N., Christou, L., Tsianos, E. V. The new global map of human brucellosis. Lancet Infect Dis. 6, 91-99 (2006).
- Atluri, V. L., Xavier, M. N., de Jong, M. F., den Hartigh, A. B., Tsolis, R. E. Interactions of the human pathogenic Brucella species with their hosts. Annu Rev Microbiol. 65, 523-541 (2011).
- Guzman-Verri, C., et al. GTPases of the Rho subfamily are required for Brucella abortus internalization in nonprofessional phagocytes: direct activation of Cdc42. J Biol Chem. 276, 44435-44443 (2001).
- Starr, T., Ng, T. W., Wehrly, T. D., Knodler, L. A., Celli, J. Brucella intracellular replication requires trafficking through the late endosomal/lysosomal compartment. Traffic. 9, 678-694 (2008).
- Boschiroli, M. L., et al. The Brucella suis virB operon is induced intracellularly in macrophages. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 1544-1549 (2002).
- Celli, J., et al. Brucella evades macrophage killing via VirB-dependent sustained interactions with the endoplasmic reticulum. J Exp Med. 198, 545-556 (2003).
- Porte, F., Liautard, J. P., Kohler, S. Early acidification of phagosomes containing Brucella suis is essential for intracellular survival in murine macrophages. Infect Immun. 67, 4041-4047 (1999).
- Anderson, T. D., Cheville, N. F. Ultrastructural morphometric analysis of Brucella abortus-infected trophoblasts in experimental placentitis. Bacterial replication occurs in rough endoplasmic reticulum. Am J Pathol. 124, 226-237 (1986).
- Qin, Q. M., et al. RNAi screen of endoplasmic reticulum-associated host factors reveals a role for IRE1alpha in supporting Brucella replication. PLoS Pathog. 4, e1000110 (2008).
- Ramo, P., et al. Simultaneous analysis of large-scale RNAi screens for pathogen entry. BMC genomics. 15, 1162 (2014).
- Kuhbacher, A., Gouin, E., Cossart, P., Pizarro-Cerda, J. Imaging InlC secretion to investigate cellular infection by the bacterial pathogen Listeria monocytogenes. J Vis Exp. , e51043 (2013).
- Kentner, D., et al. Shigella reroutes host cell central metabolism to obtain high-flux nutrient supply for vigorous intracellular growth. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 9929-9934 (2014).
- Celli, J., Salcedo, S. P., Gorvel, J. P. Brucella coopts the small GTPase Sar1 for intracellular replication. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 1673-1678 (2005).
- von Bargen, K., Gorvel, J. P., Salcedo, S. P. Internal affairs: investigating the Brucella intracellular lifestyle. FEMS microbiology reviews. 36, 533-562 (2012).
- Kamentsky, L., et al. Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software. Bioinformatics. 27, 1179-1180 (2011).
