Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

מיקרוסקופי מבוססת מבחנים עבור הקרנת תפוקה גבוהה של גורמי מארח המעורבים Published: August 5, 2016 doi: 10.3791/54263
Automatic Translation
*1, *1, *1,4, *1,3, 2, 2, 1
1Focal Area Infection Biology, Biozentrum, University of Basel, 2Centre d’Immunologie de Marseille-Luminy, Université de la Méditérannée UM2, INSERM U1104 CNRS UM7280, 3Departmento de Microbiologìa and Instituto de Salud Tropical, Universidad de Navarra, 4BioDataAnalysis GmbH
* These authors contributed equally

Abstract

מיני Brucella הם פתוגנים תאיים פקולטטיבי מדביקי חיות כמארחים הטבעיים שלהם. הילוכים לבני האדם נגרמים לרוב על ידי מגע ישיר עם בעלי חיים נגועים או על ידי בליעה של מזון מזוהם והוא יכול לגרום לזיהומים כרוניים קשים.

Brucella יכול לפלוש תאים phagocytic המקצועיים והלא-מקצועיים משכפל בתוך reticulum endoplasmic (ER) vacuoles -derived. הגורמים המארחים הנדרשים לשם כניסת Brucella לתוך תאי מארחים, הימנעות שפלת lysosomal, ושכפולים בתא ER-כמו להישאר אלמונים למדי. כאן אנו מתארים שני מבחנים לזהות גורמי מארח מעורבים כניסת Brucella ושכפול בתאים הלה. הפרוטוקולים מתארים את השימוש של התערבות RNA, בעוד שיטות הקרנה חלופיות יכולות להיות מיושמות. המבחנים מבוסס על זיהוי של חיידקים שכותרתו fluorescently שכותרתו fluorescently תאי מארח באמצעות אוטומטימיקרוסקופיה רחב בתחום. התמונות פלורסנט מנותחות באמצעות צינור ניתוח תמונה סטנדרטי CellProfiler המאפשר ניקוד זיהום מבוסס תא בודד.

ב assay נקודות הקצה, שכפול תאיים נמדד ימים לאחר ההדבקה. זה מאפשר לחיידקי תנועת הנישה בשכפול הדנ"א שלהם שבו התפשטות הוא יזם כ -12 שעות לאחר כניסת חיידקים. Brucella אשר הקים בהצלחת נישה תאית יהיה וכך התרבו מאוד בתוך תאי מארחים. מאז חיידקים תאיים יהיה מאוד במספרם חיידקים תאיים או תאיים בודדים שאינם בשכפול הדנ"א, זן המבטאים constitutively GFP יכול לשמש. אות GFP החזקה לאחר מכן נעשתה שימוש כדי לזהות תאים נגועים.

לעומת זאת, עבור assay הכניסה חיוני להבדיל בין תאיים ובקטריות התאיות. הנה, קידוד זן עבור GFP טטרציקלין מושרה משמש. הַשׁרָאָהשל GFP עם איון סימולטני של חיידקים תאיים על ידי גנטמיצין מאפשרת הבחנה בין תאיים ובקטריות תאיים על פי האיתות GFP, עם חיידקים תאיים רק להיות מסוגל להביע GFP. זה מאפשר זיהוי החזק של חיידקים תאיים יחידים לפני התפשטות תאית היא יזמה.

Introduction

מיני Brucella הם גראם שליליים, פתוגנים תאיים פקולטטיבי השתייכות למעמד של α-פרוטאובקטריה. הם לגרום הפלות פוריות אצל מארחיהם טבעיים כגון בקר, עזים או כבשים וכתוצאה מכך הפסדים כלכליים חמורים באזורים אנדמיים. ברוצלוזיס היא אחת מחל zoonotic החשובות ביותר בעולם גורמים יותר מחצי מיליון זיהומי אדם חדשים מדי שנת 1. הילוכים לאדם נגרמים לרוב על ידי מגע ישיר עם בעלי חיים נגועים או על ידי בליעה של מזון מזוהם כמו חלב לא מפוסטר. הסימפטומים של המחלה חום הם נוקבים, הגורמת לקשיים באבחון של ברוצלוזיס. בהעדר טיפול, חולים יכולים לפתח דלקת כרונית עם תסמינים חמורים יותר כגון דלקת פרקים, דלקת פנים הלב, וכן נוירופתיה 2.

ברמה התאית Brucella הוא מסוגל לפלוש תאים phagocytic והלא phagocytic משכפל בתוך תאייםתא המכונה vacuole המכילים Brucella (BCV). הפנמה של חיידקים דורש rearrangements cytoskeleton אקטין ידי RAC, Rho, והפעלה ישירה של Cdc42 3. בתוך התא המארח איקריוטיים, את BCV traffics לאורך מסלול endocytic ולמרות אינטראקציה עם lysosomes, חיידקים מצליחים למנוע השפלה 4. החמצה של BCV ידי שלפוחי ATPase נדרש כדי לגרום הביטוי של מערכת הפרשת IV סוג בקטריאלי (T4SS) 5. הוא האמין כי effectors חיידקי מופרש T4SS חיוני Brucella להקים הנישה בשכפול הדנ"א שלו, מאז מחיקה של T4SS 6 או עיכוב של עופרת ATPase שלפוחי מפגמי הקמת הנישה התאית 7. חיידקים אינם משתכפלים במהלך שלב של סחר עד שהם להגיע תא vacuolar הנגזרות ER 8. לאחר התפשטות תאיים מתרחשת, BCV נמצא CLעמותת OSE עם סמני ER כגון calnexin וגלוקוז-6-phosphatase 6.

המנגנונים המולקולריים שבאמצעותו Brucella נכנס לתאים, נמנע שפלת lysosomal, ולבסוף משכפל ב תא ER-כמו להישאר אלמונים למדי. גורמי מארח מעורבים שלבים שונים של זיהום זוהו בעיקר על ידי גישות ממוקדות או מסך RNA התערבות קטן בקנה מידה קטנה (siRNA) בצע בתאים תסיסנית 9. אלה שפכו אור על תרומתם של גורמים ממארחים במהלך הדבקת Brucella אבל אנחנו עדיין רחוקים הבנה מקיפה של התהליך כולו.

הנה, פרוטוקולים המאפשרים זיהוי של גורמי מארח אנושיים באמצעות התערבות RNA בקנה מידה גדולה (RNAi) הקרנה בשילוב עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי רחב בתחום אוטומטי ניתוח תמונה אוטומטי מוצגים. transfection siRNA ההפוך של תאים הלה מבוצע described קודם לכן 10,11 עם שינויים קלים. את assay קצה מכסה חלק גדול של מחזור החיים התאיים Brucella למעט היציאה והזיהום של תאי שכנים. כדי להמשיך לאפיין את הנפילות ב assay נקודות הקצה, פרוטוקול שונה כדי לזהות גורמים הכרוכות בביצוע הפעולות הראשונות של הזיהום משמש.

זן abortus Brucella כי constitutively מבטא GFP משמש עבור assay הסיום שבו חיידקים מותרים להדביק תאים במשך ימים. במהלך תקופה זו, חיידקים לחדור לתאים, תנועה לנישה בשכפול הדנ"א הנגזרות ER, לשכפל במרחב פרי-גרעיני. הרמות הגבוהות של אות ה- GFP לאחר מכן ניתן להשתמש כדי לזהות תאים בודדים מהימן אשר מכילים חיידקים משכפלים.

כדי ללמוד כניסת Brucella ב assay תפוקה גבוהה, חשוב להיות מסוגל להבחין בין חיידקים תאיים תאיים. השיטה המוצגת כאן circumvמכתים נוגדן הפרש המציג של חיידקים תאיים תאיים. היא מבוססת על זן Brucella להביע GFP טטרציקלין מושרה בשילוב עם ביטוי המכונן של dsRed. הנוכחות של סמן dsRed מכונן מאפשרת זיהוי של כל החיידקים שנמצאים במדגם. ביטוי של GFP הוא המושרה על ידי תוספת של anhydrotetracycline אנלוגי טטרציקלין רעיל (ATC) בו זמנית עם איון של חיידקים תאיים על ידי גנטמיצין (GM). בעוד תא-חדיר אנטיביוטי Gm הורג חיידקים תאיים, ATC יכול להיכנס לתא המארח להשרות ביטוי של GFP סלקטיבי חיידקים תאיים. כתב כפול זה מאפשר הפרדה החזקה של חיידקים תאיים יחידים (GFP אות dsRed) מחיידקים תאיים (אות DsRed בלבד) באמצעות מיקרוסקופ השדה רחב. כדי להגיע ביטוי GFP לזיהוי על ידי Brucella תאיים מצאנו כי 4 שעות של אינדוקציה ידי ATC התוצאה היא רליאות מסוגל. תוכניות אינדוקציה דומות להביע GFP סלקטיבי חיידקים תאיים כבר השתמשו בעבר כדי ללמוד Shigella התאי 12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: כל העבודה עם זני abortus חיים Brucella חייבת להתבצע בתוך מעבדת בטיחות ביולוגית ברמה 3 (BSL3) בהתחשב בכל התקנות הנדרשות אמצעי בטיחות.

1. הכנת צלחות הקרנת Culturing של חיידקים ותאים

  1. הכנת תרבויות Starter Brucella abortus
    1. Streak Brucella abortus 2308 (B. abortus) מ -80 ° C המניות חלב על אגר סויה tryptic (TSA) צלחת המכילה 50 מיקרוגרם / מ"ל kanamycin (TSA / ק"מ). דגירה הצליחו במשך 3-4 ימים ב 37 מעלות צלזיוס. השתמש זן Brucella abortus 2308 pJC43 (apHT :: GFP) 13 עבור assay הסיום ומתח Brucella abortus pAC042.08 (apht :: dsRed, TETO :: tetR-GFP) עבור assay הכניסה.
      ההערה: lipopolysaccharide החלק (LPS) של Brucella abortus הוא הקובע ארסיות חשובה אבל מוטציות מחוספסות יכולות להתרחש בתדרים גבוהים יחסית 14. Wדואר ובכך ממליץ לבחון את מעמדה של זן התרבות לפני שמתחיל עם ניסוי זה.
    2. חיידקים Restreak על ארבע צלחות TSA / ק"מ המכסה את צלחת מלאה דגירה של 2-3 ימים ב 37 מעלות צלזיוס.
    3. באמצעות לולאה פלסטיק חד פעמיות, העברת וחיידקים resuspend מהצלחות TSA / ק"מ ב 10 מ"ל 10% חלב רזה autoclaved. ודא כי החיידקים הם resuspended היטב על מנת להבטיח ריכוז חיידקים עקביים בכל התרבויות המתנע.
    4. Aliquot 250 μl של ההשעיה חיידקים לתוך 2 מ"ל בורג צינורות כובע ולהקפיא ב -80 ° C.
    5. להפשיר aliquot של תרבות המתנע ולהעביר 25 μl, 50 μl, ו 100 μl של תרבות המתנע חיידקי להפריד 250 מ"ל בורג בקבוקי כובע עם 50 מ"ל tryptic סויה מרק (TSB) המכיל 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​kanamycin (TSB / ק"מ) . חותם את הבקבוקים עם Parafilm.
    6. דגירת בקבוקי לילה על שייקר מסלולית ב 100 סל"ד ו -37 מעלות צלזיוס.
    7. מדוד את הצפיפות האופטית ב 600 nמ '(OD 600) כדי לקבוע את עוצמת הקול של תרבות המתנע נדרש להגיע OD 600 = 0.8-1.1 לאחר תרבות לילה.
  2. הכנת תאים הלה
    1. לגדל תאי הלה Dulbecco השתנה נשר בינוני (DMEM) בתוספת 10% נסיוב עגל עוברי (FCS) (DMEM / 10% FCS) בתוך חממה ולחה 37 ° C עם 5% CO 2. לגדל תאים 80% confluency.
  3. הכן את צלחות הקרנה עם siRNAs.
    1. לדלל siRNAs במים RNase ללא לריכוז סופי של 0.32 מיקרומטר. העברת 5 μl / היטב 384 גם צלחות שחורות ברור היטב שטוחות תחתונות.
      1. שימוש בעמודות 1, 2, 23, ו -24 עבור פקדים רגילים. עבור פקדים שליליים, להשתמש ללא מיקוד siRNA (מקושקש) ובארות מדומה ללא siRNAs (מגיב transfection בלבד). עבור פקדי transfection, השתמש siRNA שגורם מוות תאי (KIF11), כמו גם בקרות חיוביות של גורמי מארח ידועים המשתתפים בתהליך הדבקת Brucella (למשל, ARPC3,מרכיב של המתחם Arp2 / 3 מעורב פילמור אקטין). העבר זמין מסחרי ספריות siRNA או siRNAs המותאם אישית אל הבארות הנותרות.
      2. צלחות חותמות עם רדידי אלומיניום peelable. צלחות חנות ב -20 מעלות צלזיוס.
        הערה: ניתן לאחסן צלחות ב -20 מעלות צלזיוס במשך 6 חודשים לפחות ועד שנים בהתאם להמלצות היצרן.

2. הפוך siRNA Transfection

  1. להפשיר צלחת 384 גם שחור על ידי צנטריפוגה XG ב 300 במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
    הערה: זה יפיל את כל הנוזלים אשר עלול לדבוק במכסה או בצד של הבארות.
  2. הכן את המדיום transfection ידי דילול מגיב transfection 1: 200 ב DMEM ללא FCS בטמפרטורת החדר. הכן את המדיום transfection לא יותר מ -20 דקות לפני השימוש. בזהירות ומערבבים את הפתרון לפני השימוש.
  3. הוסף 25 μl בינוני transfection לכל גם באמצעות מתקן מגיבומערבבים הפתרונות ידי הזזת צלחת הלוך ושוב.
  4. דגירה את הצלחת עבור שעה 1 בטמפרטורת חדר כדי לאפשר היווצרות מורכבת מגיבה siRNA / transfection.
  5. בינתיים, להכין תאים הלה על ידי שטיפת התאים תת ומחוברות של בקבוקון 75 ס"מ 2 פעם עם 2.5 מ"ל 0.05% טריפסין-EDTA ב PBS (טריפסין).
  6. הוסף 1.5 מ"ל טריפסין טרי ולהעביר את הבקבוק עד 37 מעלות צלזיוס במשך 2-3 דקות עד שהתאים לעגל כלפי מעלה.
  7. Resuspend התאים 10 מ"ל מראש חימם DMEM / 16% FCS.
  8. ספירת תאים באמצעות נגד תא אוטומטי להכין השעית תא של 10,000 תאים / מיליליטר DMEM / 16% FCS.
  9. הוסף 50 μl השעית תא היטב כל משתמש מנפק מגיב וכתוצאה מכך 500 תאים / היטב.
  10. הזז את הצלחת קדימה ואחורה כדי להשיג אפילו חלוקת התאים. השאירו את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך 5-10 דקות, כדי לאפשר לתאים להתיישב.
  11. חותם את הצלחת עם Parafilm ו דגירה אותו במשך 72 שעות על אלומיניום מחומם מראשצלחת בתוך חממה ולחה 37 ° C עם 5% CO 2.
    הערה: צלחת אלומיניום מחומם מראש מאפשר התפלגות הטמפרטורה שווה לאורך כל צלחת 384 גם כולה.

זיהום קיבוע 3.

  1. יום אחד לפני ההדבקה, לחסן לסכום הקבוע 1.1.7 של B. תרבות המתנע abortus ב 50 מ"ל בינוני TSB / ק"מ בתוך 250 מ"ל בורג בקבוק כובע. חותם את הבקבוק עם Parafilm ולגדול חיידקים לילה ב 37 מעלות צלזיוס, 100 סל"ד על שייקר מסלולית כדי OD 600 = 0.8-1.1.
  2. מדוד OD 600 של התרבות חיידקי ולהכין המדיום זיהום על ידי דילול התרבות חיידקים FCS DMEM / 10% כדי להשיג את ריבוי הרצוי של זיהום (משרד הפנים).
    הערה: כדי לקבל שיעור ההידבקות של 5-10% בתאים הלה, משרד הפנים של 10,000 משמש. עקומת טיטרציה משרד הפנים יש לבצע עבור כל סוג תא להשיג שיעורי זיהום אופטימלי.
  3. חילופי בינוני transfection של צלחת 384 גםעם 50 μl של מדיום הזיהום באמצעות מכונת כביסת צלחת אוטומטית.
  4. צנטריפוגה צלחת 384 גם ב 400 XG ו -4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
    הערה: זה עוזר לסנכרן את תהליך ההדבקה.
  5. חותם את הצלחת עם Parafilm ו דגירה אותו על צלחת אלומיניום מחוממת מראש בתוך חממה ולחה 37 ° C עם 5% CO 2 למשך 4 שעות.
  6. שוטף את התאים עם FCS DMEM / 10% המכיל 100 מיקרוגרם / מיליליטר Gm כדי להשבית חיידקים תאיים באמצעות מכונת כביסת הצלחת האוטומטית (השתמש 200 μl / טוב לשטוף הצפה).
    הערה: במהלך לשטוף הצפה, מכונת כביסת הצלחת האוטומטית מחלק בו זמנית aspirates בינוני.
  7. עבור assay כניסה, לשטוף תאים בשנית עם DMEM / 10% FCS המכיל Gm 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​ו 100 ng / ml ATC באמצעות מכונת כביסה צלחת אוטומטי (השתמש 200 μl / טוב לשטוף הצפת).
  8. חותם את הצלחת עם Parafilm ולהחזירו צלחת אלומיניום מחוממת מראש ב -37 החממה והלחה ° C עם 5% CO 2 עבור אחר40 שעות או 4 שעות, עבור assay הסיום ואת assay הכניסה, בהתאמה.
  9. עבור קיבעון, לשטוף את הבארות עם PBS באמצעות מכונת כביסת הצלחת האוטומטית (השתמש 200 μl / טוב לשטוף הצפה).
  10. המרת PBS עם 50 μl 3.7% paraformaldehyde ב 0.2 M HEPES ב- pH 7.4 (PFA) באמצעות מכונת כביסת הצלחת האוטומטית.
    הערה: שימו לב: PFA הוא רעיל על ידי שאיפה, במגע עם העור ואם נבלע.
  11. דגירה במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
  12. חילופי בינוני הקיבעון עם 50 PBS μl באמצעות מכונת כביסת הצלחת האוטומטית. הערה: הדגימות מוכנות כעת להילקח מתוך BSL3 במידת הצורך.
    זהירות: הסרת כל מדגם ממתקן BSL3 כפופה הערכת סיכונים ואימות של ההליך ותלוי והתקנות החלים על בטיחות ביולוגית.

4. מכתים

  1. שטפו תאים פעמיים עם 50 μl PBS.
  2. Permeabilize תאים 50 μl 0.1% Triton-X-100 ב PBS במשך 10 דקות.
  3. Wתאי אפר שלוש פעמים עם PBS. הוסף 20 μl של PBS המכיל DAPI 1 מיקרוגרם / מ"ל ​​(4 ', 6-diamidino-2-phenylindole) דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
  4. שטפו תאים שלוש פעמים PBS ולהגן על מכתים מן האור עם רדיד אלומיניום.

הדמיה 5.

  1. הגדרת מיקרוסקופ רחב בתחום האוטומטי לרכישת תמונה.
    הערה: ההגדרות עבור מיקרוסקופ מולקולרית תקן ImageXpress באמצעות תוכנת MetaXpress מתוארות להלן. התקני 2D רחב בתחום מיקרוסקופיה אלטרנטיביים עם מפרט חומרה מתאים ותוכנות הדמיה ניתן להשתמש (ראה טבלה של חומר / ציוד לפרטים נוספים).
    1. בחר מטרת 10X, binning מצלמה = 1, רווח = 1.
    2. בחר את תבנית הצלחת מתאימה צלחת 384 גם.
    3. רוכש 9 אתרים בכל טוב.
    4. השתמש "אפשר להתמקד מבוסס לייזר" ו "התמקדות צלחת היטב לתחתית".
    5. גדר "באר הראשונה" כבאר הראשוניתמציאת מדגם "כל האתרים" עבור פוקוס אוטומטי באתר.
    6. השתמשו בערוץ DAPI להגדיר באופן ידני-אופסט Z עבור להתמקד.
    7. בחר ידני Z-אופסט מ DAPI עבור כל הערוצים האחרים.
    8. ידנית לתקן את זמן חשיפה לכל הערוצים מנת להבטיח טווח דינמי רחב עם חשיפה נמוכה.
      1. לרכוש תמונה של אתר נציג באמצעות פונקצית החשיפה האוטומטית. לנצל את הזמן לחשיפה זו תמונה 3-5 אתרים ברחבי צלחת ולהתאים את זמן החשיפה באופן ידני עד פיקסלים המבריקים להגיע ~ 80% של בהירות מקסימלית על כל האתרים.
    9. תמונת הצלחת המלאה באמצעות ערוצי DAPI ו- GFP עבור assay נקודות הקצה. עבור assay כניסה בחרו בערוץ RFP בנוסף.

6. ניתוח תמונה אוטומטי

הערה: CellProfiler 2 15 מועסק כמו תוכנת ניתוח תמונה למגזר הסלולר וחפץ חיידקים ולבצע אוטומטיות measurements בתוך אובייקטים מזוהים. התוכנה מספקת ניתוח אלגוריתמי תמונת מודולים בודדים, אשר ניתן לשלב לתוך צינור כי יבצע את המודולים ברצף על כל התמונות, כדי לבצע משימת ניתוח תמונה ספציפית באופן אוטומטי. כדי לעקוב אחר הפרוטוקול, להתקין CellProfiler 2.1.1 או גרסה חדשה יותר. ואז, טען את הצינור המצורף ופעל על פי ההוראות הבאות כדי להתאים את הפרמטרים הנדרשים בתוך מודולים. תיאור של מודולים הבודדים של כל הצינורות ניתן למצוא הקבצים המשלימים.

הערה: שני צינורות נפרדים משמשים עבור כל assay. הצינור הראשון מחשבת מודל הצללה, אשר משמש את צינור השני לתקן תמונות לפני ניתוח. תיקון הצללה מוחל על התמונות כדי להפחית את ההשפעות של נתיב אור הומוגניות מן מיקרוסקופ. מחשוב במודל ההצללה בצנרת הראשונה הוא תהליך ממושך, אך התוצאות תהיינה של דיוק גבוה יותר.

    <li> Assay Endpoint
    1. חשבתי את מודל ההצללה
      1. עבור אל תפריט "קובץ", בחר "יבוא" → "צינור מקובץ ...", ובחר את צינור סיפק "BrucellaShadingCorrectionPart1-Ver007". כשנשאל אם להמיר בצנרת מורשת, לענות "אין להמיר".
      2. יש להקליק על "פלט" → "הגדרות פלט תצוגה" ובחר תיקייה קלט עם תמונות ספריית פלט עבור דגמי הצללה שהתקבל.
      3. במודול (1) "LoadImages", לשנות את השם של "טקסט שיש תמונות אלה במשותף" כדי להתאים את שמות התמונה.
      4. ודא שאף אחד המודולים להראות התצוגה שלהם לפני הפעלת הניתוח המלא על ידי ביטול סימון כל סמלי העין ליד מודולים. הערה: באופן משמעותי זה מקטין משאבים החישוביים דרושים בעת עיבוד הצינור.
      5. לחץ על "נתח תמונות" כדי להתחיל את החישוב של מודל ההצללה.
      6. ניתוח תמונה הפעל
        1. עבור אל תפריט "קובץ", בחר "יבוא" → "צינור מקובץ ...", ובחר את צינור סיפק "BrucellaEndpointWithShadingCorrectionPart2-Ver007". כשנשאל אם להמיר בצנרת מורשת, לענות "אין להמיר".
        2. יש להקליק על "פלט" → "הגדרות פלט תצוגה" ובחר תיקייה קלט עם תמונות ספריית פלט עבור גיליון אלקטרוני שהתקבל.
        3. במודול (1) "LoadImages", לשנות את השם של "טקסט שיש תמונות אלה במשותף" כדי להתאים את שמות התמונה.
        4. במודול (2) "LoadSingleImage", טען את דגמי ההצללה שמחושבים לפי 6.1.1 על ידי בחירת המיקום שמות הקבצים של שני מודלי ההצללה.
        5. מודולים (4) - (5) "ImageMath", להתאים את הפרמטר "הכפל את התמונה הראשונה על ידי" התאמת העומק הסיבי של מצלמת מיקרוסקופ. במשך 8 ו 16 ביטתמונות להגדיר את הפרמטר "1.0", עבור 12 bit תמונות להגדיר את הפרמטר "16.0".
        6. במודול (9) "ImageMath" להתאים את הפרמטר "הכפל את התמונה השנייה על ידי" לערך (להתחיל עם 0.25) כי ימנע את האות Brucella ב מכתים DAPI מבלי לדכא את הגרעינים.
          1. לחץ על "התחל בדיקת מצב", ואז הפעל את סמל ההשהיה ופונקצית התצוגה עבור מודול (9) על ידי לחיצה על הסמלים המקבילים מודול.
            הערה: סמל ההשהיה יופיע בצהוב, בעוד סמל העין נראה עין פקוחה אם מופעל.
          2. לחץ על "הפעל" כדי להפעיל את הניתוח עד מודול (9) עם סמל ההשהיה הפעיל. כדי לבדוק את הערכים של מודול, לחצו על "שלב".
          3. לחץ לחיצה ימנית על התמונה שזה עתה נפתח ולהגדיר "בניגוד תמונה" כדי "התחבר מנורמל". שוב ושוב צעד אחורה כדי מודול (9), להתאים את הפרמטר "הכפל את התמונה השנייה על ידי", וצעד על tהוא מודול שוב, עד אות Brucella מדוכאת לחלוטין בעוד באותו האזורים השחורים הזמן מציין יתר החיסור הם מזעריים בתמונת התוצאה.
        7. במודול (10) "IdentifyPrimaryObjects", להגדיר את הפרמטר "חסם תחתון על הסף" מספיק גבוה (להתחיל עם אפס) כך גרעינים מפולחים והרקע הוא התעלם.
          1. כדי לזהות טוב מודול (10), צעד מעל למסוף ולהציג תמונת הקלט כמוסבר בצעדים 6.1.2.6.1 ו 6.1.2.6.2.
          2. לחץ לחיצה ימנית על תמונת הקלט להציג את ההיסטוגרמה.
            הערה: השיא של ההיסטוגרמה מציין בדרך כלל ברקע.
          3. החל מ עוצם רקע להגדיל את הפרמטר עד פילוח הגרעינים טוב מושגת כמובאת בתמונת הפלט.
            הערה: קביעת הסף הגבוה יותר מאשר עוצם רקע חשוב במיוחד עבור אתרים ריקים.
        8. במודול (15)4; FilterObjects ", להתאים את הפרמטר" ערך מינימלי "כך התאים עם Brucella נראה בבירור בגרעין נשמרים, וכל האחרים מסוננים משם בשלב זה, להתעלם Brucella שמחוץ לגרעין..
          1. כדי לזהות ערך מדלג מעל מודול ולהציג את התמונה פלט כמוסבר בצעדים 6.1.2.6.1 ו 6.1.2.6.2. מתחיל מאפס, אשר מזהה את כל התאים נגועים, ולהגדיל את הערך על ידי צעדים קטנים עד תאים רק עם Brucella הבולט למראה הגרעין נשמרים.
        9. במודול (16) "FilterObjects", להתאים את הפרמטר "ערך מינימלי" כך התאים עם Brucella בולט למראה perinucleus נשמרים, וכל שאר התאים מסוננים משם. השתמש בגישה דומה כמו במודול הקודם.
        10. במודול (17) "FilterObjects", להתאים את "ערך מינימלי" פרמטר כך התאים עם Brucella בולט למראה וורגוף תא onoi נשמר, וכל שאר התאים מסוננים משם. השתמש בגישה דומה כמו במודול הקודם.
          הערה: גוף התא Voronoi הינו תוסף רדיאלי של הגרעין על ידי 25 פיקסלים ללא חפיפה עם השכנה גופי התא Voronoi.
        11. לצאת ממצב מבחן ולוודא שאף אחד המודולים להראות התצוגה שלהם לפני הפעלת ניתוח מלא על ידי ביטול הסימון כל הסמלים העין ליד מודולים.
          הערה: באופן משמעותי זה מקטין משאבים החישוביים דרושים בעת עיבוד הצינור.
        12. לחצו על "נתח תמונות" כדי להתחיל את הניתוח.
        13. כאשר הניתוח סיים, לבדוק את תמונות PNG וכתוצאה מכך, כמו גם את גיליון CSV כדי להבטיח כי הניתוח עבד בצורה אמינה לאורך כל הצלחת.
    2. Assay כניסה
      1. חשבתי את מודל ההצללה
        1. עבור אל תפריט "קובץ", בחר "יבוא" → "צינור מקובץ ...", ובחר את לספקצינור ד "BrucellaShadingCorrectionPart1-Ver007". כשנשאל אם להמיר בצנרת מורשת, לענות "אין להמיר".
        2. יש להקליק על "פלט" → "הגדרות פלט תצוגה" ובחר תיקייה קלט עם תמונות ספריית פלט עבור דגמי הצללה שהתקבל.
        3. במודול (1) "LoadImages", לשנות את השם של "טקסט שיש תמונות אלה במשותף" כדי להתאים את שמות התמונה.
        4. ודא שאף אחד המודולים להראות התצוגה שלהם לפני הפעלת הניתוח המלא על ידי ביטול סימון כל סמלי העין ליד מודולים.
          הערה: באופן משמעותי זה מקטין משאבים החישוביים דרושים בעת עיבוד הצינור.
        5. לחץ על "נתח תמונות" כדי להתחיל את החישוב של מודל ההצללה.
      2. ניתוח תמונה הפעל
        1. עבור אל תפריט "קובץ", בחר "יבוא" → "צינור מקובץ ...", ובחר את providצינור ed "BrucellaEntryWithShadingCorrectionPart2-Ver007". כשנשאל אם להמיר בצנרת מורשת, לענות "אין להמיר".
        2. יש להקליק על "פלט" → "הגדרות פלט תצוגה" ובחר תיקייה קלט עם תמונות ספריית פלט עבור גיליון אלקטרוני שהתקבל.
        3. במודול (1) "LoadImages", לשנות את השם של "טקסט שיש תמונות אלה במשותף" כדי להתאים את שמות התמונה.
        4. במודול (2) "LoadSingleImage", טען את דגמי ההצללה שמחושבים לפי 6.2.1 על ידי בחירת המיקום שמות הקבצים של שני מודלי ההצללה.
        5. מודולים (4) - (5) "ImageMath", להתאים את הפרמטר "הכפל את התמונה הראשונה על ידי" התאמת העומק הסיבי של מצלמת מיקרוסקופ. במשך 8 ו -16 bit תמונות להגדיר את הפרמטר "1.0", במשך 12 bit תמונות להגדיר את הפרמטר "16.0".
        6. במודול (6) "IdentifyPrimaryObjects", להגדיר את הפרמטר "Lower כבול על הסף "גבוה מספיק כי גרעינים רק מפולחים והרקע הוא התעלם.
          1. כדי לזהות טוב מודול (6) מדלגים מעל מודול ולהציג תמונת הקלט כמוסבר בצעדים 6.1.2.6.1 ו 6.1.2.6.2.
          2. לחץ לחיצה ימנית על תמונת הקלט להציג את ההיסטוגרמה.
            הערה: השיא של ההיסטוגרמה מציין בדרך כלל ברקע.
          3. החל מ עוצם רקע להגדיל את הפרמטר עד פילוח הגרעינים טוב מושגת כמובאת בתמונת הפלט.
            הערה: הגדרת הסף מעל הרקע חשוב עבור אתרים ריקים.
        7. במודול (8) "IdentifyPrimaryObjects", להגדיר את הפרמטר "חסם תחתון על סף" מספיק גבוה שרק Brucella מפולח ורקע הוא התעלם.
          1. כדי לזהות טוב מודול (8), צעד מעל למסוף ולהציג תמונת הקלט כמוסבר בצעדים 6.1.2.6.1 ו 6.1.2.6.2.
          2. לחץ לחיצה ימנית על תמונת הקלט להציג את ההיסטוגרמה.
            הערה: השיא של ההיסטוגרמה מציין בדרך כלל ברקע.
          3. החל מ עוצם רקע להגדיל את הפרמטר עד פילוח טוב של Brucella כמובא בתמונת פלט מושגת.
            הערה: הגדרת הסף מעל הרקע חשוב עבור אתרים ריקים.
        8. במודול (11) "FilterObjects", להתאים את "הערך המינימאלי" הפרמטר כך רקע וכלים מסוננים משם, ורק מושבות Brucella נשמרות.
          1. כדי לזהות ערך מדלג מעל מודול ולהציג את התמונה פלט כמוסבר בצעדים 6.1.2.6.1 ו 6.1.2.6.2. התחל עם הערך שנבחר 6.2.2.7 ו בשלבים להגדילו עד אובייקטים Brucella רק נשמרים.
        9. לצאת ממצב מבחן ולוודא שאף אחד המודולים להראות התצוגה שלהם לפני הפעלת ניתוח מלא על ידי unchecking כל סמלי העין ליד מודולים.
          הערה: באופן משמעותי זה מקטין משאבים החישוביים דרושים בעת עיבוד הצינור.
        10. לחצו על "נתח תמונות" כדי להתחיל את הניתוח.
        11. כאשר הניתוח סיים, לבדוק את תמונות PNG וכתוצאה מכך, כמו גם את גיליון CSV כדי להבטיח כי הניתוח עבד היטב ברחבי הצלחת.

    7. זיהום ניקוד

    הערה: siRNAs אשר יש השפעה משמעותית על כדאיויות תא צריך להיחשב בזהירות, שכן זה יכול לקדם תגליות חיוביות כוזבות. מספר תאים שינה משפיע על משרד הפנים בפועל ומיקוד של גנים חיוניים יכול להיות השפעת pleiotropic על זיהום הפתוגן. בעוד הדלדול השלם ידי siRNAs מאפשר לחקר גנים חיוניים, צריכים שמישהו ינתנו תוקפות מטרות כאלה על ידי שיטות חלופיות (למשל, הפרעת תרופות) כדי לאשש את תפקידם כגורמים מארחיםבמהלך ההדבקה.

    1. Assay Endpoint
      1. פתח את גיליון CSV שנוצר בשלב 6.1.2.12 ולחשב לכל שיעור זיהום היטב על ידי חלוקת מספר תאים נגועים (ההודעה CellProfiler: "Count_InfectedCells") במספר הכולל של תאים (ההודעה CellProfiler: "CountNuclei"). אם מספר אתרים לכל טוב כבר צלמו, ראשון לסכם את כל האתרים עבור כל טוב, לבנות מספר שידורים הטוב של תאים נגועים ומספר הכולל שידורים גם של תאים.
      2. בצע נורמליזציה הניקוד Z לתת דין וחשבון על וריאציות צלחת אל צלחת אם צלחות המכילות-התאמה ללא מספיק siRNAs. תניח מספר מספיק של siRNAs הלא להיט לכל צלחת אם ספריות מלאות מוקרנים.
        משוואה 1
    2. Assay כניסה
      1. פתח את גיליון CSV שנוצר בשלב 6.2.2.10 ולחשב לכל שיעור זיהום היטב על ידי חלוקת מספר תאים נגועים (ההודעה CellProfiler: "Count_InfectedCeLLS ") במספר הכולל של תאים (הודעת CellProfiler:". CountNuclei ") אם מספר אתרים לכל טוב כבר צלם, ראשון לסכם את כל האתרים עבור כל טוב, לבנות מספר שידורים הטובים של תאים נגועים וכן שידורים היטב מספר כולל של תאים.
      2. כדי לכמת את עומס החיידקים של תאים נגועים, להעריך את השטח הממוצע שנכבש על ידי חיידקים תאיים לכל תא נגוע. לשם כך, מחלק את האזור המשולב של כל החיידקים התאיים חופפים עם תאים (הודעת CellProfiler: "AreaOccupied_AreaOccupied_TrueIntPathogenInCells") במספר התאים הנגועים באתר זה. כדי להסביר את חפצי אמנות, השתמש החציוני של כל האתרים של ההודעה הזו כמו את ההודעה גם.
        הערה: אם assay זה משמש assay מעקב המכיל מספר רב של גנים המעורבים זיהום Brucella, אינן חלות נורמליזציה ציון Z. במקום זאת, בצע נורמליזציה באמצעות בארות מדומה כהפניה לתת דין וחשבון על וריאציה צלחת אל צלחת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

איור 1 א מציג דוגמה של ניתוח התמונה המשמש לזיהוי תאים נגועים באופן אוטומטי ב assay נקודות קצה. גרעינים של תאים הלה מגואלות DAPI זוהו, א-גרעין פרי של רוחב 8 פיקסלים סביב הגרעין, וגוף התא Voronoi ובהרחבה של הגרעין על ידי 25 פיקסלים חושבו. מאז חיידקים בעיקר להתרבות בחלל פרי-גרעינית, עוצמת GFP בתחום זה של התא היא מדידת החזקה ביותר להפלות בין תאים נגועים ולא נגועים. במקרים מסוימים, ניתן למצוא חיידקים להתרבות מחוץ פרי-גרעין או כיסוי במידה רבה עם הגרעין. לכן, אובייקטים נוספים שני אלה נחשבו גם לזיהוי תאים נגועים. פילוח וכן מדידות עוצמת GFP בוצעו עם תוכנת ניתוח התמונה CellProfiler 2.

Brucella 3. לפיכך, דלדול של רכיבי שיפוץ יקטינו הוא פקד חיובי מתאים להקרנת siRNA. מצאנו כי דלדול siRNA בתיווך של Arp2 / 3 רכיבים מורכבים, אשר מעורבים פילמור אקטין, בתוקף מעכב זיהום Brucella של תאים הלה (נתונים שלא פורסמו). לפיכך, מציאה של ARPC3 שימש כביקורת חיובית. כפי שניתן לראות באיור 1B, דלדול של ARPC3 הקטין את מספר תאי מציגים מתרבים חיידקים יומיים לאחר הדבקה. החלת צינור ניתוח התמונה אוטומטית לתמונות אלה אפשרו כימות של האפקט שנצפה (תרשים 1C). הנתונים המוצגים כאן מקורם בארות השליטה של ​​מסך siRNA הגנום כולו. ניקוד Z יושם לתת דין וחשבון על וריאציות צלחת אל צלחת.

איור 2 א ממחיש את iניתוח קוסם המשמש לזיהוי תאים נגועים ולמדוד את עומס חיידקי תאיים ב assay הכניסה. בניגוד assay נקודות הקצה, assay הכניסה משתמש פילוח חיידקי גוף תא Voronoi כאובייקט הסלולר. רק אות ה- GFP של Brucella התאי שמשה לפלח את הפתוגן בצנרת ניתוח התמונה הזו. חיידקים תאיים הוגדרו על ידי גודל מינימלי של 2 פיקסלים בעוצמה GFP אשר עולה על עוצמת רקע GFP העמום של חיידקים תאיים. תא נחשב נגוע אם לפחות אובייקט חיידקי תאיים אחד בחפיפה גוף התא Voronoi שלה. יתר על כן, את עומס החיידקים נאמד על ידי חישוב השטח הממוצע של תאים נגועים כי הוא מכוסה על ידי חיידקים תאיים.

באשר assay נקודות הקצה, דלדול של ARPC3 הראה ירידת זיהום Brucella ב assay הכניסה לעומת תאים שטופלו control siRNA (איור 2 ב). כימות של שיעור זיהום אישר כי מספר תאים נגועים (איור 2 ג), כמו גם את מספר החיידקים תאיים בתאים נגועים (איור 2 ד) הופחת דלדול ARPC3.

איור 1
איור 1: ניתוח של תאים הלה נגוע ב abortus להביע GFP ב assay נקודות קצה (א) assay Endpoint:. תמונה פלואורסצנטי מראה דוגמה של assay נקודות קצה (ירוק = B. abortus להביע GFP, כחול = גרעינים מגואלות DAPI, בר סולם = 50 מיקרומטר). GFP להביע B. abortus הורשו להיכנס תאים הלה במשך 4 שעות ואחריו הרג של חיידקים תאיים על ידי GM. דגירה נוספת עבור 40 חיידקי hr מותר לשכפל בתוך תאי הלה. לניתוח תמונה אוטומטי s: צינור CellProfiler שמש גרעיני DAPI מוכתם קטע ואחריו חישוב הפרי-הגרעין (שאינו חופף טבעת של 8 פיקסלים סביב הגרעין) ואת גוף תא Voronoi (סיומת רדיאלי שאינו חופפת של הגרעין על ידי 25 פיקסלים), הוא באדום. תא נחשב נגוע אם עוצמת GFP משולב לפחות תא סלולרי אחד (גרעין, פרי-גרעין, גוף התא Voronoi) חרגו מסף המקביל. (ב) נציג תמונות של תאים הלה נגוע ב abortus להביע GFP 44 שעות לאחר ההדבקה. התאים היו transfected גם עם שלט siRNA מקושקשות (ללא מיקוד) או siRNA מיקוד ARPC3. בר סולם = 50 מיקרומטר. (C) כימות של הידבקות של תאי הלה מדולדלים עבור ARPC3. הנתונים מיוצגים גרפים ברים (בר = ממוצע; Z להבקיע נורמליזציה; ברי שגיאה = סטיית התקן של הממוצע; *** p <0.001; מאן-וויטני בדיקה; n = 7).es / ftp_upload / 54,263 / 54263fig1large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2: כימות של הידבקות של תאים הלה על ידי ב ' . abortus להביע TetR-GFP ב assay כניסה (א) assay כניסה: תמונה פלואורסצנטי מראה דוגמה של assay כניסה (צהוב = תאיים ב abortus מראה dsRed ו אות ה- GFP, אדום = B. תאיים abortus מראה אות dsRed, כחול = גרעינים מגואלות DAPI, סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר). ב abortus להביע dsRed ו TetR-GFP הורשו להיכנס תאים הלה במשך 4 שעות ואחריו הרג של חיידקים תאיים ואינדוקציה סימולטני של ה- GFP חיידקים תאיים עם ATC עבור 4 שעות ניתוח התמונה אוטומטית:. צינור CellProfiler שימש לזהות DAPIגרעינים צבעוניים ואחריו חישוב של גוף תא Voronoi ובהרחבה רדיאלי של הגרעין על ידי 25 פיקסלים (מוצג לבן). חיידקים היו מפולחים על פי איתות GFP. תא נחשב נגוע אם גוף תא Voronoi שלה בחפיפה לפחות אובייקט אחד חיידקים מפולחים בגודל מספיק ועוצמת GFP. את עומס החיידקים בתאים נגועים מודגם על ידי השילוב של האזור של כל אובייקטי החיידקים המפולחים עם גוף תא Voronoi שלה (יחידה = פיקסלים; NaN = אף מספר מחושב בתאים שאינם נגוע). (ב) תמונות דוגמה הממחישה ירידה של ב תאיים abortus (שמוצג על ידי מספר החיידקים הצהובים) בתאים transfected עם ARPC3 מיקוד siRNA לעומת שליטה בתאים שטופלו siRNA המקושקשת. מספר תאים נגועים וכן את המספר הממוצע של חיידקים תאיים בתאים נגועים מצטמצם על ARPC3 להפיל. (C) כימות שיעור זיהום בתאים הלה מדולדלעבור ARPC3. הנתונים מיוצגים גרפים ברים (בר = ממוצע; נורמליזציה מדומה; ברי שגיאה = סטיית התקן של הממוצע; * p <0.05; מאן-וויטני בדיקה; n = 4). (ד) כימות של עומס חיידקים של תאים הלה נגוע מדולדל עבור ARPC3. הנתונים מיוצגים גרפים ברים (בר = ממוצע; נורמליזציה מדומה; ברי שגיאה = סטיית התקן של הממוצע; * p <0.05; מאן-וויטני בדיקה; n = 4). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של זה דמות.

משלימה קובץ 1:. צינור CP2 - תיקון הצללה אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

קובץ נוסף 2: צינור CP2- Endpoint assay. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

משלימה קובץ 3:. צינור CP2 - assay הכניסה אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

משלימה קובץ 4:. תיאור של מודולים אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tryptic Soy Agar (TSA) BD 236950
Tryptic Soy Broth (TSB) Fluka 22092
Kanamycin sulfate Sigma-Aldrich 60615
Skim milk
250 ml screw cap bottle Corning 8396
DMEM Sigma-Aldrich D5796
Fetal Calf Serum (FCS) Gibco 10270 Heat-inactivated
Trypsin-EDTA (0.5%) Gibco 15400-054 10x stock solution, dilute 1:10 in PBS
Scepte 2.0 Cell Counter Merck Milipore PHCC20060 Alternative cell counting devices can be used
Greiner CELLSTAR 384-well plate Sigma-Aldrich M2062
Peelable aluminum foil Costar 6570
Reagent dispenser: "Multidrop 384 Reagent Dispenser" Thermo Scientific 5840150 Alternative reagent dispenser can be used.
Transfection reagent: "Lipofectamine RNAiMAX Invitrogen 13778-150
Automated plate washer: "Plate washer ELx50-16" BioTek ELX5016 This plate washer contains a 16-channel manifold suitable for 384-well plates. It fits into a biosafety cabinet and has a lid covering the plate during washing which reduces the risk of aerosol production. Alternative plate washers with similar features could be used.
Gentamicin Sigma-Aldrich G1397
Anhydrotetracycline hydrochloride Sigma-Aldrich 37919 100 μg/ml solution in 100% ethanol is kept at -20 °C protected from light in aluminum-foil
PBS Gibco 20012
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148 Dissolve in 0.2 M HEPES buffer, pH 7.4. Store at -20 °C and thaw freshly the day before use. Caution, PFA is toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed.
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Triton X-100 Sigma-Aldrich T9284
DAPI Roche 10236276001
Scrambled siRNA Dharmacon D-001810-10
Kif11 siRNA Dharmacon L-003317-00
ARPC3 siRNA Dharmacon L-005284-00
Brucella abortus 2308
pJC43 (apHT::GFP) Celli et al.12
pAC042.08 (apht::dsRed, tetO::tetR-GFP) Construction: pJC44 4 was digested with EcoRI followed by generation of blunt ends with Klenov enzyme and subsequent digestion with SalI. TetR-GFP was amplified from pNF106 using primer prAC090 and prAC092. Following digestion with SalI, the TetR-GFP product was ligated to the digested pJC44 vector.
Primer prAC090 Sigma-Aldrich TTT TTG AAT TCT GGC AAT TCC GAC GTC TAA GAA ACC
Primer prAC092 Sigma-Aldrich TTT TTG TCG ACT TTG TCC TAC TCA GGA GAG CGT TC
HeLa CCL-2 ATCC CCL-2
ImageXpress Micro Molecular Devices  IXM IMAGING MSCOPE Automated cellular imaging microscope equipped with a precision motorized Z-stage. Alternative systems for automated microscopy and alternative components for hard- and software specified below can be employed.
High-Speed Laser Auto-Focus Molecular Devices  1-2300-1037
CFI Super Fluor 10X objective Nikon  MRF00100 N.A 0.50, W.D 1.20 mm, DIC Prism: 10X, Spring loaded
Photometrics CoolSNAP HQ Monochrome CCD Camera Molecular Devices  1-2300-1060 1,392 x 1,040 imaging pixels, 6.45 x 6.45 µm pixels, 12 bits digitization
MetaXpress software Molecular Devices  9500-0100
LUI-Spectra-X-7 Lumencor SPECTRA X V-XXX-YZ Light engine. The following light sources are used: violet (DAPI), cyan (GFP), green/yellow (RFP)
Single Band Exciter for DAPI Semrock FF01-377/50-25
Single Band Emitter for DAPI Semrock FF02-447/60-25
Single Band Dichroic for DAPI Semrock FF409-Di03-25x36
Single Band Exciter for GFP Semrock FF02-472/30-25
Single Band Emitter for GFP Semrock FF01-520/35-25
Single Band Dichroic for GFP Semrock FF495-Di03-25x36
Single Band Exciter for RFP Semrock FF01-562/40-25
Single Band Emitter for RFP Semrock FF01-624/40-25
Single Band Dichroic for RFP Semrock FF593-Di03-25x36

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pappas, G., Papadimitriou, P., Akritidis, N., Christou, L., Tsianos, E. V. The new global map of human brucellosis. Lancet Infect Dis. 6, 91-99 (2006).
  2. Atluri, V. L., Xavier, M. N., de Jong, M. F., den Hartigh, A. B., Tsolis, R. E. Interactions of the human pathogenic Brucella species with their hosts. Annu Rev Microbiol. 65, 523-541 (2011).
  3. Guzman-Verri, C., et al. GTPases of the Rho subfamily are required for Brucella abortus internalization in nonprofessional phagocytes: direct activation of Cdc42. J Biol Chem. 276, 44435-44443 (2001).
  4. Starr, T., Ng, T. W., Wehrly, T. D., Knodler, L. A., Celli, J. Brucella intracellular replication requires trafficking through the late endosomal/lysosomal compartment. Traffic. 9, 678-694 (2008).
  5. Boschiroli, M. L., et al. The Brucella suis virB operon is induced intracellularly in macrophages. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 1544-1549 (2002).
  6. Celli, J., et al. Brucella evades macrophage killing via VirB-dependent sustained interactions with the endoplasmic reticulum. J Exp Med. 198, 545-556 (2003).
  7. Porte, F., Liautard, J. P., Kohler, S. Early acidification of phagosomes containing Brucella suis is essential for intracellular survival in murine macrophages. Infect Immun. 67, 4041-4047 (1999).
  8. Anderson, T. D., Cheville, N. F. Ultrastructural morphometric analysis of Brucella abortus-infected trophoblasts in experimental placentitis. Bacterial replication occurs in rough endoplasmic reticulum. Am J Pathol. 124, 226-237 (1986).
  9. Qin, Q. M., et al. RNAi screen of endoplasmic reticulum-associated host factors reveals a role for IRE1alpha in supporting Brucella replication. PLoS Pathog. 4, e1000110 (2008).
  10. Ramo, P., et al. Simultaneous analysis of large-scale RNAi screens for pathogen entry. BMC genomics. 15, 1162 (2014).
  11. Kuhbacher, A., Gouin, E., Cossart, P., Pizarro-Cerda, J. Imaging InlC secretion to investigate cellular infection by the bacterial pathogen Listeria monocytogenes. J Vis Exp. , e51043 (2013).
  12. Kentner, D., et al. Shigella reroutes host cell central metabolism to obtain high-flux nutrient supply for vigorous intracellular growth. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 9929-9934 (2014).
  13. Celli, J., Salcedo, S. P., Gorvel, J. P. Brucella coopts the small GTPase Sar1 for intracellular replication. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 1673-1678 (2005).
  14. von Bargen, K., Gorvel, J. P., Salcedo, S. P. Internal affairs: investigating the Brucella intracellular lifestyle. FEMS microbiology reviews. 36, 533-562 (2012).
  15. Kamentsky, L., et al. Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software. Bioinformatics. 27, 1179-1180 (2011).

Tags

זיהום גיליון 114 siRNA (קטן מפריע RNA) RNAi (התערבות RNA) assay גבוה הקרנת תוכן / תפוקה גבוהה ניתוח תמונה אוטומטי מיקרוסקופ פלואורסצנטי ביולוגית זיהום ביולוגיה של תא, הפתוגן התאי תאי הלה פלישת תא
מיקרוסקופי מבוססת מבחנים עבור הקרנת תפוקה גבוהה של גורמי מארח המעורבים<em&gt; Brucella</em&gt; זיהום של תאים הלה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Casanova, A., Low, S. H.,… More

Casanova, A., Low, S. H., Emmenlauer, M., Conde-Alvarez, R., Salcedo, S. P., Gorvel, J. P., Dehio, C. Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells. J. Vis. Exp. (114), e54263, doi:10.3791/54263 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter