Abstract
Brucella türleri doğal olarak ana hayvanları enfekte fakültatif hücre içi patojenlerdir. insanlara İletim en sık enfekte hayvanlarla doğrudan temas yoluyla veya kontamine gıda tüketilmesi neden olmaktadır ve şiddetli kronik enfeksiyonlara yol açabilir.
Brucella profesyonel ve profesyonel olmayan fagositik hücreleri istila ve endoplazmik retikulum (ER) türevi vakuollerde içinde çoğaltır olabilir. ER-benzeri bölmeye Brucella konakçı hücreler içine giriş lızozomal degradasyon kaçınma ve replikasyon için gereken ana faktörler büyük ölçüde bilinmemektedir. Burada HeLa hücrelerinde Brucella giriş ve replikasyonda rol oynayan konak faktörleri tanımlamak için iki analizler açıklanmaktadır. Alternatif tarama yöntemleri uygulanabilir ise protokolleri, RNA interferansı kullanımını tarif eder. deneyler, floresan etiketli bakterilerin saptanması otomatik kullanarak floresan etiketli konakçı hücreler dayanmaktadırgeniş alan mikroskobu. floresan görüntüler tek bir hücre bazlı enfeksiyonu puanlama sağlar CellProfiler standart bir görüntü analiz boru hattı kullanılarak analiz edilir.
uç nokta deneyi olarak, hücre içi çoğaltma enfeksiyondan iki gün sonra ölçülür. Bu çoğalma başarıyla böylece güçlü konak hücreler içinde çoğaldı olacak bir hücre içi niş kurduk bakteriyel giriş. Brucella sonra 12 saat civarında başlatılan onların replikatif niş trafik bakterileri sağlar. hücre içi bakteri büyük ölçüde bireysel hücre dışı ya da hücre içi replikatif olmayan bakteri sayıca bu yana, kurucu GFP eksprese eden bir suş kullanılabilir. Güçlü GFP sinyali daha sonra enfekte olmuş hücreleri tanımlamak için kullanılır.
Buna karşılık, giriş analizi için hücre içi ve hücre dışı bakteriler arasında ayırt etmek için gereklidir. Burada, bir tetrasiklin-indüklenebilir GFP için bir suş kodlaması kullanılır. indüksiyonGentamisin ile hücre dışı bakterilerin eşzamanlı inaktivasyonu ile GFP tek hücre içi bakteriler GFP ifade edememek ile, hücre içi ve GFP sinyaline dayalı dışı bakteriler arasındaki farklılaşma sağlar. hücre içi çoğalması başlamadan önce bu tek hücre içi bakteri sağlam algılanmasını sağlar.
Introduction
Brucella türleri α-proteobakteride sınıfına ait gram-negatif, fakültatif hücre içi patojenlerdir. Bunlar endemik bölgelerde ciddi ekonomik kayıplara neden sığır, keçi veya koyun gibi kendi doğal hosts kürtaj ve kısırlığa neden olur. Bruselloz tüm dünyada her yıl yarım milyon yeni insan enfeksiyonları üzerinde 1 yol açan en önemli zoonoz hastalıklardan biridir. insana İletim en yaygın pastörize olmamış süt gibi enfekte hayvanlarla doğrudan temas yoluyla veya kontamine gıda tüketilmesi neden olmaktadır. ateşli hastalık belirtileri bruselloz tanısında zorluklar neden olan belirsiz bulunmaktadır. Eğer tedavi edilmezse, hasta artrit, endokardit ve nöropati 2 gibi daha ciddi semptomları olan bir kronik enfeksiyon gelişebilir.
Hücresel düzeyde Brucella fagositik ve fagositik olmayan hücreleri istila edebilir ve bir hücre içi içinde çoğaltırBrucella içeren yeni vakuol (BCV) olarak bilinen bölme. Bakterilerin içselleştirilmesi Rac, Rho ve Cdc42 3 direkt aktivasyonu ile aktin hücre iskeletinin düzenlenmeleri gerekmektedir. Ökaryotik konak hücre içinde, BCV endositik yolu boyunca trafik işlemlerini ve lizozomlar ile etkileşim rağmen, bakteriler bozulmasını 4 önlemek için yönetmek. Veziküler ATPaz ile BCV asitleştirilmesi bakteriyel tip IV salgılama sistemine (T4SS) 5 ekspresyonunu indüklemek için gereklidir. Brucella onun replikatif niş kurmak için T4SS salgıladığı bakteriyel efektörler hücre içi niş 7 kurulması kusurlara T4SS 6 silinmesi veya vesiküler ATPaz kurşun inhibisyonu için, gerekli olan inanılmaktadır. Bakteriler onlar kadar insan ticareti aşamasında çoğaltmak yok bir ER-kaynaklı vakuoler bölmesini 8 ulaşır. Hücre içi çoğalması meydana geldiğinde, BCV cl bulunanBu calnexin ve glukoz-6-fosfataz 6 olarak ER işaretleri ile ose birliği.
Brucella bir ER-benzeri bölmeye, hücrelere girer lizozomal bozulması önler ve nihayet çoğaltır hangi moleküler mekanizmalar büyük ölçüde bilinmemektedir. Enfeksiyon farklı aşamalarında yer alan konak faktörleri esas hedeflenen yaklaşımlar veya Drosophila hücreleri 9 gerçekleştirilen küçük ölçekli bir küçük müdahale edici RNA (siRNA) ekran tarafından tespit edilmiştir. Bunlar, Brucella enfeksiyonu sırasında bireysel konak faktörleri katkısı ışık tutmuştur ama biz tüm sürecin kapsamlı bir anlayış uzak hala.
Burada, otomatik geniş alan, flüoresans mikroskopisi ve otomatik görüntü analizi ile kombinasyon halinde, büyük ölçekli RNA interferans (RNAi) tarama kullanılarak insan konakçı faktörlerin tanımlanmasını sağlar protokolleri sunulmaktadır. HeLa hücrelerinin ters siRNA transfeksiyon describ olarak gerçekleştirilired önce 10,11 küçük değişikliklerle. Son nokta tahlil çıkış ve komşu hücrelerin enfeksiyon dışında Brucella hücre içi yaşam döngüsünün büyük bir kısmını kapsamaktadır. daha uç nokta deneyi tanımlanan isabet karakterize etmek için, enfeksiyonun erken dönemlerinde yer faktörleri tanımlamak için değiştirilmiş bir protokol kullanılmıştır.
Yapısal olarak GFP eksprese eden bir Brucella abortus suşu bakteri iki gün hücrelerini enfekte etmek için izin verilen nokta deneyi için kullanılmaktadır. Bu süre boyunca, bakteri ER-türevi replikatif niş hücreleri, trafik butonu ve peri-nükleer alanı içinde replike. GFP sinyali yüksek düzeyde daha sonra güvenli bir çoğaltma bakteriler içeren tek tek hücrelerin tespit etmek için kullanılabilir.
Bir yüksek verimli bir deney Brucella giriş incelemek için, hücre içi ve hücre dışı bakteriler ayırt edebilmek için önemlidir. yöntem, burada circumv sunulmaktadırhücre içi ve hücre dışı bakteri-oranları farklı antikor boyama. Bu DsRed yapısal ifadesi ile bir arada bir tetrasiklin indüklenebilir GFP eksprese eden bir Brucella suşunun dayanır. bir kurucu DsRed markör mevcudiyeti numunede mevcut olan tüm bakteri belirlenmesini sağlar. GFP tanımı gentamisin aynı anda hücre dışı bakteri inaktivasyonu ile toksik olmayan tetrasiklin analog anhydrotetracycline (ATC) ilave (GM) tarafından indüklenir. Hücre geçirmez antibiyotik Gm dışı bakterileri öldürür iken, ATC konak hücre içine girer ve hücre içi bakteriler seçici GFP ifade uyarabilir. Bu ikili raportör geniş alan mikroskopi kullanılarak hücre dışı bakteriler (sadece DsRed sinyali) ile ilgili bir hücre içi bakteri (GFP ve DsRed sinyali) sağlam ayrılmasını sağlar. Hücre içi Brucella ile tespit GFP ifade ulaşmak için biz ATC tarafından indüksiyon 4 saat bir dinleri sonuçlanır buldukmümkün sinyali. Seçici hücre içi bakteriler GFP ifade Benzer indüksiyon şemaları hücre içi Shigella 12 incelemek için önceden kullanılır olmuştur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Not: Canlı Brucella abortus suşları ile tüm çalışmalar gerekli tüm düzenlemeleri ve güvenlik önlemlerini göz önünde biyogüvenlik seviye 3 (BSL3) laboratuvar içinde yapılmalıdır.
1. Eleme Tabaklar hazırlanması ve Bakteri ve Hücre ekimi
- Brucella abortus Starter Kültürlerin Hazırlanması
- Şerit Brucella 50 ug / ml kanamisin (TSA / Km) ihtiva eden bir triptik soya agar (TSA) plaka üzerinde -80 ° C, süt stoktan 2308 (B. abortus) abortus. 37 ° C'de 3-4 gün süreyle inkübe levhasını. Giriş tahlil için 2308 pJC43 (aft :: GFP) abortus suşu Brucella uç nokta deneyi için 13 ve zorlanma Brucella abortus pAC042.08 (aft :: DsRed, TETO :: tetR-GFP) kullanın.
Not: Brucella abortus düzgün lipopolisakkarid (LPS) önemli bir virülans belirleyicisi olan ancak pürüzlü mutantlar nispeten yüksek frekanslarda 14 oluşabilir. WE böylece bu deneyle başlamadan önce kültür suşu durumunu test öneriyoruz. - tam plaka kapsayan dört TSA / Km tabakalarına Restreak bakteriler 37 ° C'de 2-3 gün süreyle inkübe edilir.
- 10 ml% 10 otoklava yağsız süt TSA / Km plakaları atılabilir plastik döngü, transferi ve tekrar süspansiyon bakteri kullanma. Bakteriler de tüm starter kültürler tutarlı bakteri konsantrasyonları sağlamak için yeniden süspanse emin olun.
- 2 ml bakteriyel süspansiyon kısım 250 ul -80 ° C de kap tüpleri ve donma vidalayın.
- kültürlü bir kısım çözülme ile kapak şişe 25 ul, 50 ul ve 250 ml ayırmak için bakteriyel başlangıç kültürü, 100 ul transfer vidası 50 mi Tryptic Soy Broth (TSB) içeren 50 | ig / ml kanamisin (TSB / Km) . Parafilm ile şişeleri mühür.
- 100 rpm'de ve 37 ° C'de bir orbital çalkalayıcı üzerinde gece boyunca şişe inkübe edin.
- 600 n optik yoğunluğu ölçmekm (OD 600) gece kültürden sonra bir OD 600 = 0,8-1,1 ulaşmak için gerekli olan starter kültür hacmini belirlemek.
- Şerit Brucella 50 ug / ml kanamisin (TSA / Km) ihtiva eden bir triptik soya agar (TSA) plaka üzerinde -80 ° C, süt stoktan 2308 (B. abortus) abortus. 37 ° C'de 3-4 gün süreyle inkübe levhasını. Giriş tahlil için 2308 pJC43 (aft :: GFP) abortus suşu Brucella uç nokta deneyi için 13 ve zorlanma Brucella abortus pAC042.08 (aft :: DsRed, TETO :: tetR-GFP) kullanın.
- HeLa hücrelerinin hazırlanması
- Dulbecco HeLa hücreleri büyümek 2.% 80 konfluansa kadar hücreler büyümek% 5 CO ile 37 ° C, nemli bir inkübatörde% 10 fetal buzağı serumu (FCS) (DMEM /% 10 FCS) ile takviye edilmiş Eagle ortamında (DMEM) değiştirildi.
- siRNA'lar ile Tarama Tabaklar hazırlayın.
- 0.32 uM'lik bir son konsantrasyona kadar, RNaz içermeyen su içinde siRNA'lar seyreltilir. Aktarım 5 ul / kuyucuktan Siyah temiz-gözlü düz dipli 384 oyuklu plakalar.
- sütun 1, 2, 23, ve standart kontroller için 24 kullanımı. Negatif kontroller için siRNA'lar (transfeksiyon reaktif sadece) olmadan siRNA (şifreli) olmayan hedefleme ve sahte kuyuları kullanın. Transfeksiyon kontrol için, bir hücre ölümüne neden olur siRNA (KIF11) yanı sıra, Brucella enfeksiyonu (ör ARPC3 dahil bilinen bir ev sahibi faktörlerinin pozitif kontrol kullanımıaktin polimerizasyonu katılan ARP2 / 3 kompleksinin) bir bileşeni. Kalan kuyulara siRNA kütüphaneleri veya özel siRNA'lar piyasadan temin aktarın.
- soyulabilir alüminyum folyo ile mühür plakalar. -20 ° C'de saklayın plakalar.
Not: Levhalar, üreticinin tavsiyelerine göre yıl en az 6 ay boyunca ve en fazla -20 ° C 'de muhafaza edilebilir.
- 0.32 uM'lik bir son konsantrasyona kadar, RNaz içermeyen su içinde siRNA'lar seyreltilir. Aktarım 5 ul / kuyucuktan Siyah temiz-gözlü düz dipli 384 oyuklu plakalar.
2. Ters siRNA Transfeksiyon
- Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile siyah 384 oyuklu plaka çözülme.
Not: Bu kapak veya kuyuların tarafına bağlı olabilecek tüm sıvıyı aşağı getirecek. - transfeksiyon reaktifi 1 seyreltilerek transfeksiyon ortamı hazırlayın: 200 DMEM FCS olmaksızın oda sıcaklığında karıştırılmıştır. artık kullanımdan önce 20 dakika daha transfeksiyon ortamı hazırlayın. Kullanmadan önce çözüm karıştırın.
- de reaktif dağıtıcı kullanarak her transfeksiyon ortamı ul 25 eklemeve ileri geri hareket ettirerek plakayı çözüm karıştırın.
- siRNA / transfeksiyon reaktif kompleksi oluşumuna imkan verecek, oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübasyona bırakılır.
- Bu süre içinde, PBS içinde 2.5 mi% 0.05 tripsin-EDTA (tripsin) ile bir kez 75 cm 2 şişenin alt konfluent hücreler yıkanarak HeLa hücreleri hazırlamak.
- 1.5 ml taze tripsin ekleyin ve hücreler yuvarlak kadar 2-3 dakika süreyle 37 ° C şişeyi aktarın.
- 10 ml önceden ısıtılmış DMEM /% 16 FCS hücrelerinin yeniden süspanse.
- otomatik bir hücre sayacı hücrelerin sayısı ve DMEM /% 16 FCS içinde 10,000 hücre / ml'lik bir hücre süspansiyonu.
- her bir / oyuk 500 hücre ile sonuçlanan bir reaktif dağıtıcı kullanılarak 50 ul hücre süspansiyonu ekleyin.
- Hücrelerin eşit dağılımını sağlamak için ileri ve geri plaka hareket ettirin. Hücreler yerleşmek için izin vermek için 5-10 dakika oda sıcaklığında plaka bırakın.
- Parafilm ile plaka kapatılır ve ısıtılmış bir alüminyum üzerinde 72 saat için inkübe% 5 CO 2 ile 37 ° C nemli inkübatör plaka.
Not: önceden ısıtılmış alüminyum levha, tüm 384 oyuklu plaka içinde eşit ısı dağılımı sağlar.
3. Enfeksiyon ve Fixation
- Bir gün önce, enfeksiyon, B. 1.1.7 belirlenen miktarda inoküle 250 ml lik bir 50 ml TSB / Km ortamı abortus başlatıcı kültür vida kapaklı şişeye. Parafilm ile şişe kapatılır ve = 0,8-1,1 OD 600, 37 ° C ve orbital bir karıştırıcı üzerinde 100 rpm'de bir gece boyunca bakteri büyür.
- Bakteri kültürü OD600 ölçün ve enfeksiyon istenen çokluğu (İB) elde etmek için, DMEM /% 10 FCS içinde bakteri kültürü seyreltilmesiyle enfeksiyon ortamı hazırlar.
Not: HeLa hücrelerinde% 5-10 arasında bir enfeksiyon oranını elde etmek için, 10.000 bir İçişleri Bakanlığı kullanılır. MOI titrasyon eğrisi uygun enfeksiyon oranı elde etmek için, her hücre türü için gerçekleştirilmelidir. - 384 plaka transfeksiyon ortam değişikliğiEnfeksiyon işlemi sıvının 50 ul bir otomatik plaka yıkayıcı kullanılarak.
- 400 x g'de 384 oyuklu plaka santrifüj ve 20 dakika boyunca 4 ° C.
Not: Bu enfeksiyon sürecini senkronize yardımcı olur. - Parafilm ile plaka kapatılır ve 4 saat% 5 CO2 içeren bir 37 ° C, nemli inkübatör içinde önceden ısıtılmış alüminyum plaka üzerinde inkübe.
- 100 ug / ml Gm otomatik plaka yıkayıcı kullanılarak hücre dışı bakteriler etkisiz hale getirmek için ihtiva eden DMEM /% 10 FCS ile yıkama hücreleri (200 ul / göz, taşma yıkama kullanımı).
Not: Bir taşma yıkama sırasında, otomatik plaka yıkayıcı aynı anda dağıtır ve orta aspire. - Giriş deneyi için, hücreler otomatik plaka yıkayıcı kullanılarak 100 ug / ml GM ve 100 ng / ml ATC ihtiva eden DMEM /% 10 FCS ile ikinci kez (200 ul / göz, taşma yıkama kullanın) yıkayın.
- Parafilm ile plaka kapatılır ve bir% 5 CO2 ile 37 ° C, nemli inkübatör içinde önceden ısıtılmış alüminyum plaka iade40 saat ya da sırasıyla son nokta deneyi ve giriş deneyi, 4 saat.
- tespit için, otomatik plaka yıkayıcı (200 ul / göz, taşma yıkama kullanımı) PBS ile yıkayın.
- pH 7.4 0.2 M HEPES 50 ul% 3.7 paraformaldehid (PFA) otomatik plaka yıkayıcı kullanılarak Exchange PBS.
Not: Dikkat: yutulduğunda PFA, cilt ile temasında, inhalasyon yoluyla toksik ve. - Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca inkübe edin.
- otomatik plaka yıkayıcı kullanılarak 50 ul PBS ile tespit orta değişimi. Not: Numuneler artık gerekirse BSL3 dışarı alınması için hazır.
Dikkat: BSL3 tesisi herhangi bir numunenin çıkarılması işleminin risk değerlendirmesi ve doğrulama tabidir ve biyogüvenlik için yürürlükteki kanunlara bağlıdır.
4. Boyama
- 50 ul PBS ile iki kez hücreleri yıkayın.
- 10 dakika boyunca 50 ul% 0.1 Triton-X-100 PBS içinde hücrelerin geçirgenliği.
- WKül hücreler PBS ile üç kez. 1 ug / ml DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol) içeren PBS ile 20 ul ilave edilir ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edilir.
- PBS içinde hücreleri üç kez yıkayın ve alüminyum folyo ile ışıktan boyama korur.
5. Görüntüleme
- görüntü elde etmek için otomatik geniş alan mikroskobu ayarlayın.
Not: Metaxpress yazılımı kullanılarak bir Molecular Devices Imagexpress mikroskop ayarları aşağıda tarif edilmiştir. uygun donanım özellikleri ve görüntüleme yazılımı ile alternatif 2D geniş alan mikroskopisi cihazları (detaylar için Malzeme / Ekipman Tablo) kullanılabilir.- 10X objektif, kamera binning = 1, kazanç = 1 seçin.
- 384 plaka karşılık gelen plaka formatı seçin.
- kuyu başına 9 siteleri kazanır.
- "Lazer bazlı odak Etkin" ve "plaka ve iyi alt odaklanın" kullanın.
- İlk kuyu gibi "Önce iyi" SetSite otofokus için "Tüm siteler" örnek bulma ve.
- DAPI kanal kullanın elle Z-Ofset odak için ayarlayın.
- El ile Z-Offset tüm diğer kanallar için DAPI seçin.
- El ile tüm kanallar düşük aşırı maruz geniş bir dinamik aralık sağlamak için pozlama süresini düzeltin.
- otomatik pozlama işlevini kullanarak bir temsilci sitenin bir görüntü kazanır. görüntü plaka boyunca 3-5 siteleri bu pozlama süresini kullanın ve parlak piksel ulaşana kadar tüm siteler üzerinde ~ elle maksimal parlaklık% 80 pozlama süresini ayarlayın.
- Görüntü uç nokta deneyi için DAPI ve GFP kanalları kullanarak tam plaka. giriş deneyi için ek RFP kanalı seçin.
6. Otomatik Görüntü Analizi
Not: CellProfiler 2 15 hücre segment ve bakteriyel nesnelere görüntü analiz yazılımı olarak kullanılır ve kuv otomatik gerçekleştirmekbelirlenen nesneler içinde EMENTS. Yazılım otomatik olarak belirli bir görüntü analizi görevi gerçekleştirmek için, tüm görüntüleri art arda modülleri çalıştırır bir boru hattına kombine edilebilir bireysel modülleri, görüntü analiz algoritmaları sağlar. protokolünü takip etmek, CellProfiler 2.1.1 veya daha yeni bir sürümünü yükleyin. Ardından, sağlanan boru hattı yüklemek ve modülleri içinde gerekli parametreleri ayarlamak için aşağıdaki talimatları izleyin. tüm boru hatlarının bireysel modüllerin açıklaması Yan Files bulunabilir.
Not: iki ayrı boru hatları, her tahlil için kullanılmıştır. İlk boru hattı analiz öncesi görüntüleri düzeltmek için ikinci boru hattı ile kullanılan bir gölgeleme modeli, hesaplar. Gölgeleme düzeltme mikroskop homojen olmayan bir ışık yolu etkilerini azaltmak için görüntülere uygulanır. İlk boru hattı gölgeleme modeli Computing uzun bir süreçtir, ancak sonuçlar daha yüksek doğruluk olacaktır.
- <li> Endpoint Deneyi
- gölgeleme modeli hesaplamak
- "Al" → "Dosyadan Boru Hattı ..." seçeneğini Menü "Dosya" gidin ve sağlanan boru hattı "BrucellaShadingCorrectionPart1-Ver007" seçeneğini seçin. , Eski boru hattı dönüştürmek cevap olmadığı sorulduğunda "dönüştürmek" Do not.
- "Çıkış" → "Görünüm çıkış ayarları" bölümüne gidin ve görüntüleri ile giriş klasörü ve elde edilen gölgeleme modelleri için bir çıkış klasörü seçin.
- Modülünde (1) "LoadImages", görüntü adlarını maç için "bu görüntüler ortak sahip olduğu Metin" adını ayarlayın.
- modüllerin hiçbiri önceki modüllerinin yanında tüm göz sembolleri işaretini kaldırarak tam analizini çalışan kendi ekran gösterdiğinden emin olun. Not: Bu önemli ölçüde gereklidir azaltır hesaplama kaynaklarını boru hattı işlenirken.
- Basın gölgeleme modeli hesaplamaya başlamak için "Görüntüleri Analiz".
- Run Görüntü Analizi
- "Al" → "Dosyadan Boru Hattı ..." seçeneğini Menü "Dosya" gidin ve sağlanan boru hattı "BrucellaEndpointWithShadingCorrectionPart2-Ver007" seçeneğini seçin. , Eski boru hattı dönüştürmek cevap olmadığı sorulduğunda "dönüştürmek" Do not.
- "Çıkış" → "Görünüm çıkış ayarları" bölümüne gidin ve görüntüleri ile giriş klasörü ve elde edilen e-tablo için bir çıkış klasörü seçin.
- modülde (1) "LoadImages", görüntü adlarını maç için "bu görüntüler ortak sahip olduğu Metin" adını ayarlayın.
- modül (2) "LoadSingleImage" in, konum ve iki gölgeleme modelleri dosya seçerek 6.1.1 altında hesaplanan gölgeleme modelleri yükleyin.
- modülleri (4) - (5) "ImageMath", parametreyi ayarlamak mikroskop kameranın bit derinliğini eşleşen "ilk görüntü çarpın". 8 ve 16 bit içingörüntüleri 12 bit görüntüleri parametresini ayarlamak için, "1.0" için "16.0" parametresini ayarlayın.
- Modülde (9) "ImageMath" parametreyi ayarlamak Çekirdeği bastırmak olmadan DAPI boyama Brucella sinyalini bastırır bir değere (0.25 ile başlar) için "ikinci görüntüyü çarpın".
- "Testi Başlat Modu" tıklayın, ardından modülün ilgili ikonları tıklayarak duraklama sembolü ve modül (9) için ekran işlevini etkinleştirmek.
Not: aktif edilirse göz sembolü, bir gözü açık gösterecektir ise duraklama sembol, sarı görünür. - Aktif duraklatma simgesi (9) Modül kadar analiz çalıştırmak için "Çalıştır" a tıklayın. modül, basın "Adım" değerlerini test etmek için.
- Yeni açılan görüntüyü sağ tıklayın ve "normalize Log" için "Görüntü kontrastını" olarak ayarlayın. Tekrar tekrar modüle adım (9), parametreyi ayarlamak "ikinci görüntüyü çarpın" ve t üzerinde adımaşırı çıkarma işaret aynı zamanda siyah alanlar sonuç görüntüde en aza indirilmiştir iken Brusella sinyali tamamen bastırılır dek, tekrar modül.
- "Testi Başlat Modu" tıklayın, ardından modülün ilgili ikonları tıklayarak duraklama sembolü ve modül (9) için ekran işlevini etkinleştirmek.
- modülde (10) "IdentifyPrimaryObjects", çekirdekler segmente edilmiş ve arka plan göz ardı edilir, böylece yeterince yüksek parametresini "alt eşiğinde bağlı" (sıfır ile başlayan) ayarlayın.
- modülü üzerinden modül (10), adım için iyi bir değer belirlemek ve adım 6.1.2.6.1 ve 6.1.2.6.2 açıklandığı gibi giriş görüntüsünü görüntülemek için.
- giriş görüntüsünü sağ tıklayın ve histogram görüntüler.
Not: histogram zirve tipik arka gösterir. - çıkış görüntü görüntülenen çekirdeklerin iyi bir segmentasyon elde edilene kadar arka plan yoğunluğu başlayarak parametre artırmak.
Not: Arka plan yoğunluğu daha yüksek eşik boş siteler için özellikle önemlidir Ayar.
- modülde (15)4; çekirdeğinde açıkça görünür Brucella ile hücreler tutulur, ve tüm diğerleri uzak süzülür böylece FilterObjects "Asgari değer" parametresi ayarlamak "Bu aşamada, çekirdeğin dışında Brucella görmezden..
- modül üzerinde iyi bir değer, bir adım belirlemek ve adım 6.1.2.6.1 ve 6.1.2.6.2 açıklandığı gibi çıktı görüntüyü göstermek için. Enfekte olarak tüm hücreleri tanımlayan sıfır, başlayın, ve tutulur çekirdekte açıkça görünür Brucella ile sadece hücreleri kadar küçük adımlarla değerini artırın.
- Modülü (16) "FilterObjects" olarak perinucleus açıkça görülebilir Brucella ile hücrelerin tutulur, böylece parametresi "Asgari değer" ayarlamak, ve diğer tüm hücreleri uzak süzülür. Bir önceki modülde olduğu gibi benzer bir yaklaşım kullanın.
- Modül (17) "FilterObjects", parametre "Asgari değer" ayarlamak, böylece Vor açıkça görülebilir Brucella ile hücreleronoi hücre gövdesi tutulur, ve diğer tüm hücreler kaldı filtrelenir. Bir önceki modülde olduğu gibi benzer bir yaklaşım kullanın.
Not: Voronoi hücre gövdesi Voronoi hücre gövdeleri komşu ile hiçbir çakışma ile 25 piksel çekirdeğin radyal uzantısıdır. - Test modundan çıkmak ve modüllerin hiçbiri önceki modüllerinin yanında tüm göz sembolleri işaretini kaldırarak tam analizini çalışan kendi ekran göstermek emin olun.
Not: Bu önemli ölçüde gereklidir azaltır hesaplama kaynaklarını boru hattı işlenirken. - Basın analizine başlamak için "Görüntüleri Analiz".
- Analiz tamamlandığında, analiz plaka boyunca güvenilir çalıştı sağlamak için ortaya çıkan PNG görüntülerin yanı sıra CSV sayfasını inceleyin.
- giriş Testi
- gölgeleme modeli hesaplamak
- "Al" → "Dosyadan Boru Hattı ..." seçeneğini Menü "Dosya" gidin ve sağlamak seçind boru hattı "BrucellaShadingCorrectionPart1-Ver007". , Eski boru hattı dönüştürmek cevap olmadığı sorulduğunda "dönüştürmek" Do not.
- "Çıkış" → "Görünüm çıkış ayarları" bölümüne gidin ve görüntüleri ile giriş klasörü ve elde edilen gölgeleme modelleri için bir çıkış klasörü seçin.
- modülde (1) "LoadImages", görüntü adlarını maç için "bu görüntüler ortak sahip olduğu Metin" adını ayarlayın.
- modüllerin hiçbiri önceki modüllerinin yanında tüm göz sembolleri işaretini kaldırarak tam analizini çalışan kendi ekran gösterdiğinden emin olun.
Not: Bu önemli ölçüde gereklidir azaltır hesaplama kaynaklarını boru hattı işlenirken. - Basın gölgeleme modeli hesaplamaya başlamak için "Görüntüleri Analiz".
- Run Görüntü Analizi
- "Al" → "Dosyadan Boru Hattı ..." seçeneğini Menü "Dosya" gidin ve seçin.İkinciEd boru hattı "BrucellaEntryWithShadingCorrectionPart2-Ver007". , Eski boru hattı dönüştürmek cevap olmadığı sorulduğunda "dönüştürmek" Do not.
- "Çıkış" → "Görünüm çıkış ayarları" bölümüne gidin ve görüntüleri ile giriş klasörü ve elde edilen e-tablo için bir çıkış klasörü seçin.
- modülde (1) "LoadImages", görüntü adlarını maç için "bu görüntüler ortak sahip olduğu Metin" adını ayarlayın.
- modül (2) "LoadSingleImage" in, konum ve iki gölgeleme modelleri dosya seçerek 6.2.1 altında hesaplanan gölgeleme modelleri yükleyin.
- modülleri (4) - (5) "ImageMath", parametreyi ayarlamak mikroskop kameranın bit derinliğini eşleşen "ilk görüntü çarpın". 8 ve 16 bit görüntüleri 12 bit görüntü parametre için "1.0", set İçin "16.0" parametresini ayarlayın.
- modülde (6) "IdentifyPrimaryObjects", parametre "Lo setwer sadece çekirdekleri segmente edilmiş ve arka plan göz ardı edilir yeterince yüksek "eşiğinde bağlı.
- modülü (6), modül üzerinde adım için iyi bir değer belirlemek ve adım 6.1.2.6.1 ve 6.1.2.6.2 açıklandığı gibi giriş görüntüsünü görüntülemek için.
- giriş görüntüsünü sağ tıklayın ve histogram görüntüler.
Not: histogram zirve tipik arka gösterir. - çıkış görüntü görüntülenen çekirdeklerin iyi bir segmentasyon elde edilene kadar arka plan yoğunluğu başlayarak parametre artırmak.
Not: arka plan üzerinde eşik ayarı boş siteler için önemlidir.
- Modülde (8) "IdentifyPrimaryObjects", sadece Brucella segmente edilmiş ve arka plan göz ardı edilir yeterince yüksek parametresini "alt eşiğinde bağlı" olarak ayarlayın.
- modül (8), modül üzerinde adım için iyi bir değer belirlemek ve adım 6.1.2.6.1 ve 6.1.2.6.2 açıklandığı gibi giriş görüntüsünü görüntülemek için.
- giriş görüntüsünü sağ tıklayın ve histogram görüntüler.
Not: histogram zirve tipik arka gösterir. - Çıkış görüntü görüntülenen Brucella iyi segmentasyon elde edilene kadar arka plan yoğunluğu başlayarak parametre artırmak.
Not: arka plan üzerinde eşik ayarı boş siteler için önemlidir.
- Modülü (11) "FilterObjects", parametre "Asgari değer" o arka plan ve eserler uzakta süzülür ve sadece Brucella kolonileri tutulur şekilde ayarlayın.
- modül üzerinde iyi bir değer, bir adım belirlemek ve adım 6.1.2.6.1 ve 6.1.2.6.2 açıklandığı gibi çıktı görüntüyü göstermek için. Sadece Brucella nesneleri tutulur kadar artış 6.2.2.7 ve adım adım seçilen değer ile başlayın.
- Test modundan çıkmak ve önceki unche tam analiz çalıştıran modüllerin hiçbiri kendi görüntüsünü göstermek emin olunmodüllerin yanında tüm göz sembolleri cking.
Not: Bu önemli ölçüde gereklidir azaltır hesaplama kaynaklarını boru hattı işlenirken. - Basın analizine başlamak için "Görüntüleri Analiz".
- Analiz tamamlandığında, analiz plaka boyunca iyi çalıştı emin olmak için ortaya çıkan PNG görüntülerin yanı sıra CSV sayfasını inceleyin.
- gölgeleme modeli hesaplamak
- uç nokta deneyi
- Adım 6.1.2.12 oluşturulan CSV sayfasını açın ve enfekte hücrelerin sayısını (CellProfiler okuma: "Count_InfectedCells") bölünmesi ile de enfeksiyon oranı başına hesaplamak hücrelerin toplam sayısı (: "CountNuclei" CellProfiler okuma) tarafından. kuyu başına birden fazla site görüntülü varsa, ilk enfekte hücreleri başına kuyu sayısı ve hücrelerin başına iyi toplam sayısını inşa etmek, her iyi için tüm siteleri özetlemek.
- Plakalar yeterli olmayan hit siRNA'lar içeriyorsa plaka-plaka farklılıkları hesaba katmak Z puanlama normalleştirme gerçekleştirin. Tam kütüphanelerinin tarandığı durumunda plaka başına olmayan isabet siRNA'lar yeterli sayıda varsayalım.
- giriş Testi
- (CellProfiler okuma aşamasında 6.2.2.10 oluşturulan CSV sayfasını açın ve enfekte olmuş hücrelerin sayısına bölünmesiyle de enfeksiyon oranı başına hesaplamak: "Count_InfectedCeLLS "() toplam hücre sayısına göre CellProfiler okuma". oyuk başına birden fazla site görüntülenmiştir var CountNuclei "), ilk olarak bir başı da enfekte hücrelerin sayısını ve inşa etmek için, her bir seyahati sitesi özetler başına oyuklu Toplam hücre sayısı.
- enfekte hücrelerin bakteri yükünü ölçmek için, enfekte hücre başına hücre içi bakteriler tarafından işgal ortalama alanını tahmin ediyoruz. Bu sitedeki enfekte hücrelerin sayısına göre: Bu amaçla, hücre ile üst üste, tüm hücre içi bakteri entegre alanını ( "AreaOccupied_AreaOccupied_TrueIntPathogenInCells" CellProfiler saati) bölün. eserler hesaba katılması için, iyi okuma olarak bu okuma tüm sitelerin medyan kullanın.
Not: Bu deney Brucella enfeksiyonu ile ilişkili genlerin büyük bir sayısını içeren bir izleme deneyi olarak kullanılırsa, Z skoru normalleştirme geçerli değildir. Bunun yerine, plaka-plaka değişimi dikkate almak amacıyla bir referans olarak sahte kuyuları kullanarak normalleşme gerçekleştirin.
7. Enfeksiyon Puanlama
Not: hücre canlılığı üzerinde önemli bir etkiye sahip siRNA'lar dikkatle düşünülmesi gerekir, bu yanlış pozitif keşifler teşvik beri. Değiştirilmiş bir hücre sayısı, gerçek İçişleri Bakanlığı etkiler ve gerekli genlerin hedef patojen enfeksiyon pleiotropik etkileri olabilir. SiRNA'lar tarafından eksik tükenmesi temel genlerin çalışması için izin verirken, bu tür hedefler alternatif yöntemler (örneğin, ilaç parazit) ana faktörler olarak rollerini doğrulayacak tarafından onaylanmış olması varenfeksiyon sırasında.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1A, otomatik olarak uç nokta deneyi enfekte hücreleri tanımlamak için kullanılan görüntü analizinin bir örneği göstermektedir. DAPI ile boyanmış HeLa hücrelerin çekirdekleri tespit edildi, 25 piksel çekirdeğin uzantısı çekirdeğini çevreleyen 8 piksel genişliğinde bir peri-çekirdek ve bir Voronoi hücre gövdesi hesaplandı. bakteriler esas olarak peri-nükleer bir alanda prolifere için, hücrenin, bu alanda GFP yoğunluğu enfekte olan ve olmayan enfekte olmuş hücrelerde arasında ayrım yapmak için en güçlü ölçümdür. Bazı durumlarda, bakteri çekirdeği ile büyük ölçüde peri-çekirdek veya bindirme dışında prolifere bulunmuştur. Bu nedenle, bu iki ek amaçları, aynı zamanda enfekte hücrelerin tanımlanması için dikkate alınmıştır. Bölümleme olarak GFP yoğunluğu ölçümleri görüntü analiz yazılımı CellProfiler 2 ile yapıldı.
Brucella
Şekil 2A i göstermektedirBüyücü analizi enfekte hücreleri tanımlamak ve giriş tahlilinde hücre içi bakteri yükü ölçmek için kullanılan. uç nokta deneyi tersine, giriş deney bakteriyel bölümleme ve hücresel bir nesne olarak Voronoi hücre gövdesi kullanır. Sadece içi Brucella GFP sinyali segmentine bu görüntü analiz boru hattı patojen kullanıldı. Hücre içi bakteri 2 piksel minimum büyüklüğü ve hücre dışı bakterilerin loş GFP arka plan yoğunluğu aşan bir GFP yoğunluğu ile tanımlandı. En az bir hücre içi bakteri nesne Voronoi hücre gövdesi ile üst üste eğer bir hücre enfekte kabul edildi. Ayrıca, bakteriyel yük hücre içi bakteri ile kaplıdır enfekte olmuş hücrelerin ortalama alan hesaplanarak tahmin edilmiştir.
Son nokta analizi için de, ARPC3 azalması bir con ile muamele edilen hücreler ile karşılaştırıldığında giriş tahlilinde Brucella enfeksiyonunda bir azalma gösterdikumanda siRNA (Şekil 2B). Enfeksiyon oranı miktarının belirlenmesi, enfekte olmuş hücreleri (Şekil 2C) ve enfekte edilmiş hücrelerde (Şekil 2B) 'de, hücre içi bakteri sayısı sayısı ARPC3 tükenmesi indirgenerek doğruladı.
Şekil 1: HeLa hücrelerinin analizi B ile enfekte uç nokta deneyi GFP ifade eden abortus (A) uç nokta deneyi. Floresan görüntüsü (DAPI, ölçek çubuğu = 50 um ile lekelenmiş GFP mavi = çekirdek ifade abortus yeşil = B) uç nokta deneyi bir örneğini gösteren. GFP B. ifade abortus Gm tarafından hücre dışı bakterilerin öldürülmesi ardından 4 saat süreyle HeLa hücrelerine girmek için izin verildi. 40 saat izin bakteriler için daha fazla inkübasyon HeLa hücrelerin içinde çoğaltmak için. Otomatik görüntü analysi s: Bir CellProfiler boru hattı peri-çekirdeğin hesaplama ardından bölüm DAPI lekeli çekirdeklere kullanıldı (örtüşmeyen 8 çekirdeğini çevreleyen piksellerin halka) ve Voronoi hücre gövdesinin (örtüşmeyen 25 piksel çekirdeğin radyal uzantısı), hem kırmızı gösterilir. En az bir hücre bölme (nükleus, peri-çekirdek, Voronoi hücre gövdesi) entegre GFP yoğunluğu karşılık gelen eşiği aşıldığında bir hücre enfekte kabul edildi. (B) B ile enfekte olmuş HeLa hücrelerinde Örnek Çıkan abortus enfeksiyondan sonra GFP 44 saat sentezleyen. Hücreler bir karıştırılmış (non-hedefleme) siRNA kontrol veya ARPC3 hedef alan bir siRNA ile transfekte edilmiştir. Ölçek çubuğu 50 mikron =. ARPC3 için tükenmiş HeLa hücrelerinin enfeksiyon (C) miktarının belirlenmesi. veri çubuk grafikler olarak temsil edilir (Z normalleştirme puan; ortalama hata çubukları = standart hata, bar = ortalama *** p <0.001; Mann-Whitney testi; n = 7).es / ftp_upload / 54263 / 54263fig1large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: B. HeLa hücrelerin enfeksiyonu ölçümü . abortus giriş deneyinde TetR-GFP ifade (A) Giriş deneyi: Floresan görüntü DsRed sinyali gösteren abortus DsRed ve GFP sinyali, kırmızı = dışı B. gösteren abortus giriş testinin bir örnek (= sarı hücre içi B. gösteren mavi = çekirdekler DAPI, Ölçek çubuğu = 50 um) ile boyandı. B. DsRed ve TetR-GFP ifade abortus hücre dışı bakteriler ve 4 saat ATC ile hücre içi bakterilerin GFP eşzamanlı indüksiyon öldürme ve ardından 4 saat HeLa hücrelerini girmelerine izin verilmiştir Otomatik görüntü analizi. A CellProfiler boru DAPI tespit etmek için kullanıldı25 piksel çekirdeğin radyal uzantı ile Voronoi hücre gövdesi hesaplanması ve ardından lekeli çekirdeklere (beyaz gösterilmiştir). Bakteriler GFP sinyale göre sınıflandırılmıştır. Bunu Voronoi hücre gövdesi yeterli büyüklükte ve GFP yoğunluğunun en az bir bölümlenmiş bakteriyel nesne ile üst üste, eğer bir hücre, enfekte olarak kabul edildi. Enfekte hücrelerde bakteri yükü kendi Voronoi hücre gövdesi Tüm segmentli bakteriyel nesnelerin alan entegrasyonu ile gösterilmiştir (Birimi = piksel; NaN Resim numarası enfekte olmayan hücrelerde hesaplanan =). (B) Örnek görüntüleri hücre içi B'nin bir azalma gösteren siRNA hedef ARPC3 ile transfekte hücrelerde (sarı bakteri sayısı ile gösterilir) abortus karıştırılmış siRNA ile muamele edilmiş kontrol hücreleri ile kıyaslanır. Enfeksiyonlu hücre sayısı, hem de enfekte olmuş hücrelerde hücre içi bakteri sayısı ortalama yıkmak ARPC3 üzerine düşürülür. HeLa hücrelerinde enfeksiyon oranı (C) Niceleme tükenmişARPC3 için. veri çubuk grafikler olarak temsil edilir (; mock için normalleşme, hata çubukları = ortalama standart hata, bar = ortalama * p <0.05; Mann-Whitney testi; n = 4). ARPC3 için tükenmiş enfekte HeLa hücrelerinin bakteri yükü (D) miktarının belirlenmesi. Veri çubuk grafikler olarak temsil edilir (; normalleştirme sahte için; hata çubukları = ortalama standart hata; * p <0.05; Mann-Whitney testi, bar = ortalama n = 4). Bu daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız rakam.
Yan Dosya 1:. CP2 boru hattı - gölgeleme düzeltme bu dosyayı indirmek için tıklayınız.
Yan Dosya 2: CP2 boru hattı- Son nokta deneyi. Bu dosyayı indirmek için tıklayınız.
Yan Dosya 3:. CP2 boru hattı - Giriş tahlil bu dosyayı indirmek için tıklayınız.
Yan Dosya 4:. Modüller açıklaması bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tryptic Soy Agar (TSA) | BD | 236950 | |
| Tryptic Soy Broth (TSB) | Fluka | 22092 | |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 60615 | |
| Skim milk | |||
| 250 ml screw cap bottle | Corning | 8396 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Gibco | 10270 | Heat-inactivated |
| Trypsin-EDTA (0.5%) | Gibco | 15400-054 | 10x stock solution, dilute 1:10 in PBS |
| Scepte 2.0 Cell Counter | Merck Milipore | PHCC20060 | Alternative cell counting devices can be used |
| Greiner CELLSTAR 384-well plate | Sigma-Aldrich | M2062 | |
| Peelable aluminum foil | Costar | 6570 | |
| Reagent dispenser: "Multidrop 384 Reagent Dispenser" | Thermo Scientific | 5840150 | Alternative reagent dispenser can be used. |
| Transfection reagent: "Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen | 13778-150 | |
| Automated plate washer: "Plate washer ELx50-16" | BioTek | ELX5016 | This plate washer contains a 16-channel manifold suitable for 384-well plates. It fits into a biosafety cabinet and has a lid covering the plate during washing which reduces the risk of aerosol production. Alternative plate washers with similar features could be used. |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | |
| Anhydrotetracycline hydrochloride | Sigma-Aldrich | 37919 | 100 μg/ml solution in 100% ethanol is kept at -20 °C protected from light in aluminum-foil |
| PBS | Gibco | 20012 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Dissolve in 0.2 M HEPES buffer, pH 7.4. Store at -20 °C and thaw freshly the day before use. Caution, PFA is toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| DAPI | Roche | 10236276001 | |
| Scrambled siRNA | Dharmacon | D-001810-10 | |
| Kif11 siRNA | Dharmacon | L-003317-00 | |
| ARPC3 siRNA | Dharmacon | L-005284-00 | |
| Brucella abortus 2308 | |||
| pJC43 (apHT::GFP) | Celli et al.12 | ||
| pAC042.08 (apht::dsRed, tetO::tetR-GFP) | Construction: pJC44 4 was digested with EcoRI followed by generation of blunt ends with Klenov enzyme and subsequent digestion with SalI. TetR-GFP was amplified from pNF106 using primer prAC090 and prAC092. Following digestion with SalI, the TetR-GFP product was ligated to the digested pJC44 vector. | ||
| Primer prAC090 | Sigma-Aldrich | TTT TTG AAT TCT GGC AAT TCC GAC GTC TAA GAA ACC | |
| Primer prAC092 | Sigma-Aldrich | TTT TTG TCG ACT TTG TCC TAC TCA GGA GAG CGT TC | |
| HeLa CCL-2 | ATCC | CCL-2 | |
| ImageXpress Micro | Molecular Devices | IXM IMAGING MSCOPE | Automated cellular imaging microscope equipped with a precision motorized Z-stage. Alternative systems for automated microscopy and alternative components for hard- and software specified below can be employed. |
| High-Speed Laser Auto-Focus | Molecular Devices | 1-2300-1037 | |
| CFI Super Fluor 10X objective | Nikon | MRF00100 | N.A 0.50, W.D 1.20 mm, DIC Prism: 10X, Spring loaded |
| Photometrics CoolSNAP HQ Monochrome CCD Camera | Molecular Devices | 1-2300-1060 | 1,392 x 1,040 imaging pixels, 6.45 x 6.45 µm pixels, 12 bits digitization |
| MetaXpress software | Molecular Devices | 9500-0100 | |
| LUI-Spectra-X-7 | Lumencor | SPECTRA X V-XXX-YZ | Light engine. The following light sources are used: violet (DAPI), cyan (GFP), green/yellow (RFP) |
| Single Band Exciter for DAPI | Semrock | FF01-377/50-25 | |
| Single Band Emitter for DAPI | Semrock | FF02-447/60-25 | |
| Single Band Dichroic for DAPI | Semrock | FF409-Di03-25x36 | |
| Single Band Exciter for GFP | Semrock | FF02-472/30-25 | |
| Single Band Emitter for GFP | Semrock | FF01-520/35-25 | |
| Single Band Dichroic for GFP | Semrock | FF495-Di03-25x36 | |
| Single Band Exciter for RFP | Semrock | FF01-562/40-25 | |
| Single Band Emitter for RFP | Semrock | FF01-624/40-25 | |
| Single Band Dichroic for RFP | Semrock | FF593-Di03-25x36 |
References
- Pappas, G., Papadimitriou, P., Akritidis, N., Christou, L., Tsianos, E. V. The new global map of human brucellosis. Lancet Infect Dis. 6, 91-99 (2006).
- Atluri, V. L., Xavier, M. N., de Jong, M. F., den Hartigh, A. B., Tsolis, R. E. Interactions of the human pathogenic Brucella species with their hosts. Annu Rev Microbiol. 65, 523-541 (2011).
- Guzman-Verri, C., et al. GTPases of the Rho subfamily are required for Brucella abortus internalization in nonprofessional phagocytes: direct activation of Cdc42. J Biol Chem. 276, 44435-44443 (2001).
- Starr, T., Ng, T. W., Wehrly, T. D., Knodler, L. A., Celli, J. Brucella intracellular replication requires trafficking through the late endosomal/lysosomal compartment. Traffic. 9, 678-694 (2008).
- Boschiroli, M. L., et al. The Brucella suis virB operon is induced intracellularly in macrophages. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 1544-1549 (2002).
- Celli, J., et al. Brucella evades macrophage killing via VirB-dependent sustained interactions with the endoplasmic reticulum. J Exp Med. 198, 545-556 (2003).
- Porte, F., Liautard, J. P., Kohler, S. Early acidification of phagosomes containing Brucella suis is essential for intracellular survival in murine macrophages. Infect Immun. 67, 4041-4047 (1999).
- Anderson, T. D., Cheville, N. F. Ultrastructural morphometric analysis of Brucella abortus-infected trophoblasts in experimental placentitis. Bacterial replication occurs in rough endoplasmic reticulum. Am J Pathol. 124, 226-237 (1986).
- Qin, Q. M., et al. RNAi screen of endoplasmic reticulum-associated host factors reveals a role for IRE1alpha in supporting Brucella replication. PLoS Pathog. 4, e1000110 (2008).
- Ramo, P., et al. Simultaneous analysis of large-scale RNAi screens for pathogen entry. BMC genomics. 15, 1162 (2014).
- Kuhbacher, A., Gouin, E., Cossart, P., Pizarro-Cerda, J. Imaging InlC secretion to investigate cellular infection by the bacterial pathogen Listeria monocytogenes. J Vis Exp. , e51043 (2013).
- Kentner, D., et al. Shigella reroutes host cell central metabolism to obtain high-flux nutrient supply for vigorous intracellular growth. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 9929-9934 (2014).
- Celli, J., Salcedo, S. P., Gorvel, J. P. Brucella coopts the small GTPase Sar1 for intracellular replication. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 1673-1678 (2005).
- von Bargen, K., Gorvel, J. P., Salcedo, S. P. Internal affairs: investigating the Brucella intracellular lifestyle. FEMS microbiology reviews. 36, 533-562 (2012).
- Kamentsky, L., et al. Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software. Bioinformatics. 27, 1179-1180 (2011).
