Abstract
브루셀라 종은 자연 호스트로 동물을 감염 통성 세포 내 병원균이다. 인간에게 전송은 가장 일반적으로 감염된 동물과 직접 접촉하거나 오염 된 음식의 섭취에 의해 발생되고 심한 만성 감염으로 이어질 수 있습니다.
브루셀라 전문 및 비 전문 식세포의 세포 침입과 소포체 (ER) 유래 액포 내에서 복제 할 수 있습니다. 응급실과 같은 구획 브루셀라 숙주 세포에 진입, 리소좀 분해 회피 및 복제에 필요한 숙주 요인은 거의 알려져 남아있다. 여기에서 우리는 HeLa 세포에서 브루셀라 항목 및 복제에 관련된 호스트 요인을 파악하기 위해이 분석에 대해 설명합니다. 다른 검사 방법을 적용 할 수 있지만 프로토콜은 RNA 간섭의 사용을 설명한다. 분석법은 형광 표지 된 세균의 검출에 사용 자동 형광 표지 된 숙주 세포에 기초와이드 필드 현미경. 형광 이미지는 단일 셀 기반 감염 득점을 허용 CellProfiler에서 표준 이미지 분석 파이프 라인을 이용하여 분석한다.
엔드 분석에서, 세포 내 복제 이틀 감염 후 측정한다. 이 확산 성공적으로 이렇게 강하게 숙주 세포 내에서 증식 할 것이다 세포 내 틈새를 설립 세균 항목입니다. 브루셀라 후 12 시간의 주위에 시작되는 자신의 복제 성 틈새 트래픽에 박테리아를 할 수 있습니다. 세포 내 박테리아가 크게 개별 세포 또는 세포 비 - 복제 성 박테리아를 능가하기 때문에, 구조적으로 GFP를 발현하는 균주를 사용할 수있다. 강한 GFP 신호는 감염된 세포를 식별하기 위해 사용된다.
대조적으로, 엔트리 분석을 위해 세포 내 및 세포 외 박테리아를 구별하는 것이 필수적이다. 여기에서, 테트라 사이클린 - 유도 GFP에 대한 변형 부호화가 사용된다. 유도겐타 마이신에 의한 세포 외 박테리아의 불 활성화와 동시에 GFP의 세포 내 박테리아 GFP를 발현 할 수있는 함께 세포 및 GFP 신호에 기초하여 박테리아 세포의 분화를 가능하게한다. 세포 내 증식이 시작되기 전에이 단일 세포 내 박테리아의 강력한 탐지 할 수 있습니다.
Introduction
브루셀라 종은 α-프로 테오 박테리아의 클래스에 속하는 그람 음성, 통성 세포 내 병원균이다. 그들은 이러한 풍토 지역에서 심각한 경제적 손실을 초래 소, 염소, 또는 양 등 자연 호스트에서 낙태와 불임의 원인. 브루셀라 병은 전 세계적으로 매년 50 만 새로운 인간 감염 1 위에 일으키는 가장 중요한 인수 공통 질병 중 하나입니다. 인간에 전송 가장 일반적으로 이러한 저온 살균하지 않은 우유로 감염된 동물과 직접 접촉하거나 오염 된 음식의 섭취에 의해 발생합니다. 열성 질환의 증상은 브루셀라 병의 진단에 어려움이 발생하는 불특정입니다. 처리되지 않은 경우, 환자는 관절염, 심내막염, 및 신경 병증이 같은 더 심각한 증상으로 만성 감염을 개발할 수 있습니다.
세포 수준에서 브루셀라 식세포는 비 식세포에 침입 할 수 있으며, 세포 내에서 복제브루셀라 함유 공포 (BCV)라고 함. 박테리아의 내면화는 라 세미,의 Rho와 Cdc42 3의 직접적인 활성화에 의해 액틴 세포 골격의 재 배열이 필요합니다. 진핵 숙주 세포 내부에서 BCV는 세포 내 이입 경로를 따라 트래 피킹과 리소좀과의 상호 작용에도 불구하고, 세균 분해 4 않도록 관리한다. 소낭 ATPase에 의해 BCV의 산성화가 박테리아 타입 IV 분비 시스템 (T4SS) (5)의 발현을 유도 할 필요가있다. 브루셀라는 복제 성 틈새 시장을 확립하기위한 T4SS 분비 세균 이펙터는 세포 내 틈새 시장 (7)의 설립의 결함에 T4SS 6의 삭제 또는 기공을 ATP 아제 리드의 억제 때문에, 필수적인 것으로 생각된다. 박테리아는 그들이 때까지 인신 매매의 단계에서 복제되지 않는다 응급실에서 파생 된 액포 실 (8)에 도달한다. 세포 증식이 발생되면, BCV는 CL에서 발견이러한 calnexin 및 글루코스 -6- 인산 (6)와 같은 ER 마커 OSE 협회.
브루셀라는 ER-같은 구획, 세포를 입력 리소좀 저하를 방지하고, 마지막으로 복제하는 분자 메커니즘은 크게 알려지지 않은 남아있다. 감염의 여러 단계에 관여하는 호스트 요소는 주로 대상으로 접근 또는 초파리 세포 (9)에서 수행되는 작은 규모의 작은 간섭 RNA (siRNA를) 스크린에 의해 확인되었다. 다음은 브루셀라 감염시 개별 호스트 요인의 기여에 광명을 비춰했지만 우리는 전체 과정의 포괄적 인 이해에서 멀리 아직도이다.
여기서, 자동 폭 필드 형광 현미경 및 자동화 된 이미지 분석과 함께 대규모 RNA 간섭 (RNAi의) 검사를 사용하여 인간 숙주 인자의 식별을 허용 프로토콜이 제시된다. HeLa 세포의 뒷면의 siRNA로 형질 describ 수행에드 이전 10, 11 약간의 수정과. 엔드 포인트 분석은 상기 출구와 인접 셀의 감염을 제외한 브루셀라 세포 수명의 많은 부분을 포함한다. 상기 엔드 분석에서 확인 된 히트를 특성화하기 위해, 감염의 초기 단계에 관여하는 인자들을 확인하는 변형 프로토콜이 사용된다.
구조적 GFP를 발현하는 브루셀라 아 보르 투스 균주 박테리아 이틀 동안 세포를 감염시킬 수있는 엔드 포인트 분석에 사용된다. 이 기간 동안, 박테리아는 ER-파생 된 복제 성 틈새 시장 세포, 트래픽을 입력하고 요정 핵 공간에 복제합니다. GFP 신호의 하이 레벨은 안정적으로 복제 박테리아를 포함 개별 셀을 검출 할 수있다.
고 처리량 분석에 브루셀라 항목을 연구하기 위해, 세포 내 및 세포 외 박테리아를 구별 할 수있는 것이 중요하다. 이 방법은 여기 circumv 제시세포 내 및 세포 외 박테리아의 엔트 차 항체 염색. 그것은을 DsRed의 구성 성 발현과 함께 테트라 사이클린 - 유도 GFP를 발현하는 브루셀라 변형에 기초한다. 구성 적을 DsRed 마커의 존재는 샘플에 존재하는 모든 균을 식별 할 수있다. GFP 발현 젠타 의해 동시에 세포 외 박테리아의 불 활성화와 함께 무독성 테트라 사이클린 유사체 anhydrotetracycline (ATC)의 첨가 (GM)에 의해 유도된다. 셀 배리어 성 항생제 GM은 세포 외 박테리아를 죽이고 있지만, ATC는 숙주 세포를 선택하고 박테리아 세포 내에서 선택적으로 GFP 발현을 유도 할 수있다. 이 듀얼 기자는 넓은 필드 현미경을 사용하여 세포 외 박테리아 (만을 DsRed 신호)에서 단일 세포 내 세균 (GFP 및을 DsRed 신호)의 강력한 분리 할 수 있습니다. 세포 브루셀라 의해 검출 GFP 발현에 도달하기 위해 우리는 ATC에 의해 유도 4 시간이 RELI 초래한다는 발견수 신호. 선택적으로 세포 내 세균에 GFP를 표현하는 유사 유도 방식은 세포 내 시겔 (12)을 연구하기 위해 이전에 사용되었습니다.
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Protocol
참고 : 라이브 브루셀라 아 보르 투스 균주 모든 작업이 필요한 모든 규정 및 안전주의 사항을 고려 바이오 안전성 레벨 3 (BSL3) 실험실 내에서 수행해야합니다.
1. 심사 플레이트의 제조 및 박테리아와 세포의 배양
- 브루셀라 아 보르 투스 스타터 문화의 준비
- 킬 브루셀라 50 μg의 / ㎖ 카나마이신 (TSA / km)을 포함 트립신 콩 한천 (TSA) 접시에 -80 ° C 우유 재고 2308 (B. 보르 투스) 보르 투스. 37 ° C 3-4 일 동안 판을 품어. 항목 분석을 위해 2308 pJC43 (apHT :: GFP) 보르 투스 변형 브루셀라 엔드 포인트 분석 13 및 변형 브루셀라 아 보르 투스 pAC042.08 (apht ::을 DsRed, TETO :: tetR-GFP)를 사용합니다.
참고 : 브루셀라 아 보르 투스의 부드러운 리포 폴리 사카 라이드 (LPS)의 중요한 독성 결정하지만 거친 돌연변이가 상대적으로 높은 주파수 (14)에서 발생할 수 있습니다. W전자 따라서이 실험을 시작하기 전에 배양 균주의 상태를 테스트하는 것이 좋습니다. - 그리고 전체 판을 덮고 네 TSA / km의 접시에 Restreak 박테리아는 37 ° C에서 2-3 일 동안은 품어.
- 10 ml의 10 % 멸균 탈지 우유의 TSA / km 판에서 일회용 플라스틱 루프, 전송 및 재현 탁 박테리아를 사용하여. 박테리아가 잘 모든 스타터 문화 일관성있는 세균 농도를 확인하기 위해 재현 탁되어 있는지 확인합니다.
- 2 ml의에 세균 현탁액의 나누어지는 250 μL는 -80 ° C에서 캡 튜브 및 동결 나사.
- 스타터 문화의 나누어지는을 해동과 함께 모자 병을 25 μL, 50 μL, 250 ml의 분리 세균 스타터 문화의 100 μl를 전송하는 나사 50 ㎖ 트립신 간장 국물 (TSB)를 포함 50 μg의 / ㎖ 카나마이신 (TSB / km) . 파라 필름으로 병을 밀봉합니다.
- 100 rpm으로 37 ℃에서 궤도 통에 하룻밤 병을 품어.
- 600 N에서 광학 밀도를 측정m (OD 600) 하룻밤 배양 한 후 OD 600 = 0.8-1.1에 도달하는 데 필요한 스타터 문화의 볼륨을 결정합니다.
- 킬 브루셀라 50 μg의 / ㎖ 카나마이신 (TSA / km)을 포함 트립신 콩 한천 (TSA) 접시에 -80 ° C 우유 재고 2308 (B. 보르 투스) 보르 투스. 37 ° C 3-4 일 동안 판을 품어. 항목 분석을 위해 2308 pJC43 (apHT :: GFP) 보르 투스 변형 브루셀라 엔드 포인트 분석 13 및 변형 브루셀라 아 보르 투스 pAC042.08 (apht ::을 DsRed, TETO :: tetR-GFP)를 사용합니다.
- HeLa 세포의 제조
- 둘 베코에 HeLa 세포 성장은 2가 80 % 포화 상태에 셀을 성장 5 % CO와 함께 37 ° C 습한 인큐베이터에서 10 % 소 태아 혈청 (FCS) (DMEM / 10 % FCS)이 보충 된 이글 중간 (DMEM)을 수정.
- siRNA를 함께 상영 플레이트를 준비합니다.
- 0.32 μM의 최종 농도의 RNase가없는 물에 siRNA를 희석. 이전 5 μL / 웰에 검은 분명 웰 평면 바닥 384 웰 플레이트.
- 열 1, 2, 23, 및 표준 컨트롤 (24)를 사용합니다. 음성 대조군의 경우, siRNA를 (형질 전환 시약 전용)없이 siRNA를이 (스크램블) 비 대상 및 모의 우물을 사용합니다. 형질 컨트롤, 세포 사멸을 유도 된 siRNA (KIF11)뿐 아니라 브루셀라 감염 (예 ARPC3 관련된 공지 숙주 인자 양성 대조군을 사용액틴 중합에 관여 Arp2 / 3 착체)의 구성 요소. 나머지 우물에의 siRNA 라이브러리 또는 사용자 정의 된 siRNA 시판을 전송합니다.
- 박리 알루미늄 호일과 인감 플레이트. -20 ° C에서 보관 플레이트.
주 : 플레이트를 제조사의 권고에 따라 년에 적어도 6 개월까지 -20 ℃에서 저장 될 수있다.
- 0.32 μM의 최종 농도의 RNase가없는 물에 siRNA를 희석. 이전 5 μL / 웰에 검은 분명 웰 평면 바닥 384 웰 플레이트.
2. 역 siRNA를 형질
- 실온에서 20 분 동안 300 × g으로 원심 분리하여 검정 384- 웰 플레이트를 해동.
주 :이 뚜껑 또는 웰의 측면에 부착 할 수있는 모든 액체를 가져올 것이다. - 형질 감염 시약 1 희석하여 형질 감염 배지를 준비한다 (200) DMEM에서 FCS없이 실온에서 첨가 하였다. 더 이상 사용하기 전에 20 분보다 형질 매체를 준비합니다. 조심스럽게 사용하기 전에 솔루션을 섞는다.
- 물론 시약 디스펜서를 사용하여 각 형질 감염 배지 25 ㎕를 추가앞뒤로 판을 이동시켜 용액을 혼합한다.
- siRNA의 / 형질 전환 시약 복합체 형성을 허용하도록, 실온에서 1 시간 동안 플레이트를 인큐베이션.
- 한편, PBS 2.5 ml의 0.05 % 트립신 EDTA (트립신)로 한 번 75cm 2 플라스크의 하위 합류 세포를 세척하여 HeLa 세포를 준비합니다.
- 1.5 ml의에게 신선한 트립신을 추가하고 세포가 라운드까지 2 ~ 3 분 동안 37 ° C로 플라스크를 전송합니다.
- 10 ㎖의 예비 - 가온 된 DMEM / 16 % FCS에 세포를 재현 탁.
- 자동 세포 계수기를 사용하여 세포를 세어 DMEM / 16 % FCS에 10,000 세포 / ml의 세포 현탁액을 제조.
- 각 웰 / 웰 500 세포에서 생성 된 시약 디스펜서를 사용하여 50 ㎕의 세포 현탁액을 추가한다.
- 세포의 균일 한 분포를 달성하기 위해 앞뒤로 이동 판. 세포가 정착 있도록 50-10 분 동안 실온에서 플레이트를 떠난다.
- 파라 필름과 플레이트를 밀봉하고 미리 예열 알루미늄에 72 시간 동안 그것을 품어5 % CO 2와 37 °의 C 습한 인큐베이터에서 접시.
주 : 예열 알루미늄 판 전체 384- 웰 플레이트에 걸쳐 동일 온도 분포를 허용한다.
3. 감염 및 고정
- 어느 날 이전에 감염, B의 1.1.7에서 결정된 금액을 접종 250 ml를 50 ml의 TSB / km 매체에 아 보르 투스 스타터 문화 캡 병 나사. 파라 필름으로 병을 밀봉 = 0.8-1.1 (600) 중독 37 ° C와 궤도 통에 100 rpm으로 밤새 박테리아를 성장.
- 세균 배양 OD (600)을 측정 감염 원하는 다중성 (MOI)를 달성하는 DMEM / 10 % FCS에서 배양 박테리아 희석 감염 배지를 준비한다.
참고 : HeLa 세포에서 5 ~ 10 %의 감염률을 얻으려면, 10,000의 MOI가 사용됩니다. MOI 적정 곡선 최적 감염률을 얻기 각 세포 유형에 대해 수행되어야한다. - 384 웰 플레이트의 형질 감염 배지로 교환감염 매체의 50 μL와 함께 자동 접시 세척기를 사용.
- 400 XG에서 384 웰 플레이트를 원심 분리기 20 분 동안 4 ° C.
주 :이 악성 프로세스를 동기화하는 것을 돕는다. - 파라 필름으로 플레이트를 밀봉하고 4 시간 동안 5 % CO 2, 37 ℃, 습한 배양기에서 예열 된 알루미늄 판에 부화.
- 100 μg의 / ㎖ GM은 자동 접시 세척기를 사용하여 세포 외 박테리아를 불 활성화 함유 DMEM / 10 % FCS로 세포를 씻으 (200 μL / 웰 오버 플로우 세척을 사용).
참고 : 오버플로 세척하는 동안 자동 접시 세척기 동시에 분배와 매체를 흡인. - 항목의 분석을 위해, 세포를 자동 플레이트 세척기를 사용하여 100 μg의 / ㎖ GM과 100 NG / ㎖ ATC를 함유하는 DMEM / 10 % FCS를 갖는 제 2 시간 (200 μL / 웰 오버플로 세정을 사용) 세척 하였다.
- 파라 필름으로 플레이트를 밀봉하고 다른 5 % CO 2로 37 ° C 습한 인큐베이터에서 예열 된 알루미늄 접시에 반환40 시간 또는 각각 종점 분석법 엔트리 분석을 위해 4 시간.
- 고정의 경우, 자동 판 와셔 (200 μL / 웰 오버 플로우 세척을 사용)를 사용하여 PBS로 우물을 씻는다.
- pH가 7.4에서 0.2 M HEPES 50 μl의 3.7 % 파라 포름 알데히드 (PFA) 자동 접시 세척기를 사용하여 교류 PBS.
참고 :주의 : 삼키면 PFA는 피부 접촉, 흡입 독성합니다. - 실온에서 20 분 동안 인큐베이션.
- 자동 접시 세척기를 사용하여 50 μl의 PBS로 고정 매체를 교환하십시오. 주의 : 샘플은 이제 필요한 경우 BSL3 밖으로 배출 될 준비가되었다.
주의 : BSL3 시설에서 모든 샘플의 제거 프로 시저의 위험 평가 및 검증의 대상이며, 바이오 안전성에 대한 적용 규정에 따라 달라집니다.
4. 염색
- 50 μl의 PBS로 두 번 세포를 씻으십시오.
- 10 분 동안 50 ㎕를 0.1 % 트리톤 X-100의 PBS에서 세포를 Permeabilize 하시려면.
- W재 세포를 PBS로 3 회. 1 μg의 / ㎖의 DAPI (4 ', 6-diamidino -2- 페닐 인돌)을 함유하는 PBS 20 μL를 첨가하고 실온에서 30 분 동안 배양한다.
- PBS에 세포를 세 번 세척하고 알루미늄 호일로 빛의 얼룩을 보호합니다.
5. 이미지
- 이미지 획득을위한 자동화 된 넓은 필드 현미경을 설정합니다.
참고 : MetaXpress 소프트웨어를 사용하여 분자 장치 ImageXpress 현미경에 대한 설정은 아래에 설명되어 있습니다. 적절한 하드웨어 사양 및 이미징 소프트웨어를 대체 2D 넓은 필드 현미경 장치 (자세한 내용은 소재 / 장비의 표 참조)를 사용할 수 있습니다.- 10X 목표, 카메라 비닝 (binning) = 1, 이득 = 1을 선택합니다.
- 384 웰 플레이트에 해당하는 플레이트 형식을 선택합니다.
- 잘 당 9 사이트를 획득.
- "레이저 기반의 초점 활성화"와 "접시 잘 하단에 초점"를 사용합니다.
- 초기 잘에 관해서는 "첫 번째 아니라"설정사이트 자동 초점에 대해 "모든 사이트"샘플을 찾고.
- DAPI 채널을 사용하여 수동으로 Z-오프셋 초점에 대해 설정합니다.
- 수동으로 Z-오프셋 다른 모든 채널에 대한 DAPI에서를 선택합니다.
- 수동으로 모든 채널 낮은 과다와 넓은 동적 범위를 확보하기위한 노출 시간을 수정한다.
- 자동 노출 기능을 이용하여 대표 위치의 화상을 취득. 이미지에 판을 통해 3-5 사이트를이 노출 시간을 사용하고 밝은 픽셀에 도달 할 때까지 모든 사이트를 통해 ~ 수동으로 최대 밝기의 80 %를 노출 시간을 조정합니다.
- 이미지 포인트 분석 용 DAPI와 GFP 채널을 이용하여 전체 접시. 엔트리 역가 이외에 RFP 채널을 선택한다.
6. 자동 이미지 분석
참고 : CellProfiler 2 (15)는 휴대 세그먼트와 세균 개체에 이미지 분석 소프트웨어로 사용되며, 지표 성과를 자동으로 실시합니다확인 된 개체 내에서 ements. 소프트웨어는 자동적으로 특정 이미지 분석 작업을 수행하기 위해, 모든 이미지에서 연속적 모듈을 실행하는 파이프 라인에 결합 될 수있는 개별 모듈의 이미지 분석 알고리즘을 제공한다. 프로토콜을 수행하려면 CellProfiler 2.1.1 또는 최신 버전을 설치합니다. 그런 다음, 제공된 파이프 라인을로드하고 모듈 내에서 필요한 매개 변수를 조정하려면 아래의 지침을 따르십시오. 모든 파이프 라인의 각 모듈의 설명은 보조 파일에서 발견 될 수있다.
참고 : 두 개의 별도의 파이프 라인은 각각의 분석에 사용됩니다. 첫 번째 파이프 라인은 분석에 앞서 이미지를 수정하기위한 제 파이프에서 사용하는 쉐이딩 모델을 계산한다. 쉐이딩 보정 현미경에서 불균일 한 광 경로의 효과를 감소시키는 이미지에 적용된다. 첫 번째 파이프 라인 셰이딩 모델을 계산하는 긴 과정이지만,이 결과는보다 높은 정밀도로 할 것이다.
- <리> 엔드 포인트 분석
- 쉐이딩 모델 계산
- "가져 오기"→ "파일에서 파이프 라인을 ..."을 선택, 메뉴 "파일"로 이동하여 제공하는 파이프 라인 "BrucellaShadingCorrectionPart1-Ver007"를 선택합니다. , 기존 파이프 라인을 변환 대답할지 여부를 묻는 질문에 "변환하지 마십시오".
- "출력"→ "보기 출력 설정"으로 이동하여 이미지 입력 폴더 생성 된 쉐이딩 모델의 출력 폴더를 선택합니다.
- 모듈 (1) "LoadImages은"이미지 이름과 일치하도록 "이러한 이미지 공통점이 있음을 텍스트"의 이름을 조정합니다.
- 모듈 중 어느 것도 이전 모듈 옆에 모든 눈 심볼 선택을 취소하여 전체 분석을 실행하는 자신의 화면을 표시 없는지 확인합니다. 참고 :이 크게 필요한 감소 전산 자원을 파이프 라인을 처리하는 동안.
- 를 눌러 쉐이딩 모델의 계산을 시작합니다 "이미지 분석".
- 실행 이미지 분석
- "가져 오기"→ "파일에서 파이프 라인을 ..."을 선택, 메뉴 "파일"로 이동하여 제공하는 파이프 라인 "BrucellaEndpointWithShadingCorrectionPart2-Ver007"를 선택합니다. , 기존 파이프 라인을 변환 대답할지 여부를 묻는 질문에 "변환하지 마십시오".
- "출력"→ "보기 출력 설정"으로 이동하여 이미지 입력 폴더 생성 된 스프레드 시트에 대한 출력 폴더를 선택합니다.
- 모듈 (1) "LoadImages은"이미지 이름과 일치하도록 "이러한 이미지 공통점이 있음을 텍스트"의 이름을 조정합니다.
- 모듈 (2) "LoadSingleImage"에서, 위치 및 두 쉐이딩 모델의 파일 이름을 선택하여 6.1.1에서 구한 쉐이딩 모델을로드.
- 모듈 (4) - (5) "ImageMath"파라미터를 조정 현미경 카메라의 비트 깊이 일치 "가 첫 번째 이미지를 곱". 8 및 16 비트이미지는 12 비트 이미지가 매개 변수를 설정하기위한, "1.0"에에 "16.0"매개 변수를 설정합니다.
- 모듈 (9) "ImageMath는"매개 변수를 조정 핵을 억제하지 않고 DAPI 염색에서 브루셀라 신호를 억제하는 값 (0.25부터 시작)에 "에 의해 제 2 이미지를 곱".
- "시작 테스트 모드"를 클릭 한 후 모듈의 해당 아이콘을 클릭하여 일시 정지 기호와 모듈 (9)의 표시 기능을 활성화합니다.
참고 :이 활성화되면 눈 모양 열린 눈이 표시됩니다 동안 일시 정지 기호가 노란색으로 표시됩니다. - 활성 일시 정지 기호 (9) 모듈까지 분석을 실행하려면 "실행"을 클릭합니다. 모듈을 눌러 "단계"의 값을 테스트합니다.
- 새롭게 문을 연 이미지를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 "정규화 로그온"하는 "이미지 대비를"로 설정하십시오. 반복적으로 모듈 단계 (9), 매개 변수를 조정 "에 의해 제 2 이미지를 곱", 및 t 이상의 단계차감 나타내는 동시에 검은 부분은 결과 이미지에서 최소화하면서 브루셀라 신호가 충분히 억제 될 때까지 그 다시 모듈을 포함한다.
- "시작 테스트 모드"를 클릭 한 후 모듈의 해당 아이콘을 클릭하여 일시 정지 기호와 모듈 (9)의 표시 기능을 활성화합니다.
- 모듈 (10) "IdentifyPrimaryObjects는"핵이 분할되고 배경은 무시 될 수 있도록 충분히 높은 매개 변수 "낮은 임계 값에 바인딩을"(0으로 시작)을 설정합니다.
- 모듈을 통해 모듈 (10) 단계에서 좋은 값을 확인하고 단계 6.1.2.6.1 및 6.1.2.6.2에서 설명한 바와 같이, 입력 화상을 표시한다.
- 입력 이미지를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 히스토그램을 표시합니다.
참고 : 히스토그램의 피크는 일반적으로 배경을 나타냅니다. - 출력 화상에 표시되는 핵이 좋은 분할이 달성 될 때까지 배경 강도부터 출발하는 매개 변수를 증가시킨다.
참고 : 배경 강도보다 더 높은 임계 값이 빈 사이트에 특히 중요 설정.
- 모듈 (15)(4) 상기 핵에 명확하게 보이는 브루셀라로 세포를 유지하고, 모든 사람이 얻어 여과되도록 FilterObjects "은 최소값"파라미터를 조정 "이 단계에서, 핵 바깥 브루셀라 무시..
- 모듈을 통해 좋은 가치, 단계를 확인하고 단계 6.1.2.6.1 및 6.1.2.6.2에 설명 된대로 출력 이미지를 표시합니다. 감염된 모든 세포를 식별 제로에서 시작하고 유지 핵에서 명확하게 볼 브루셀라 만 셀 때까지 작은 단계로 값을 늘립니다.
- 모듈 (16) "FilterObjects"에서 perinucleus에서 명확하게 볼 브루셀라와 세포가 유지되도록 매개 변수를 "최소 값"을 조정하고, 다른 모든 세포는 떨어져 필터링됩니다. 이전 모듈과 유사한 접근 방식을 사용합니다.
- 모듈 (17) "FilterObjects"에서 파라미터 "최소 값을"조정되도록 보르에서 명확하게 볼 브루셀라와 세포onoi 세포체는 유지되고, 모든 다른 셀 멀리 필터링된다. 이전 모듈과 유사한 접근 방식을 사용합니다.
주 : 보로 노이 셀 본체 보로 노이 균체 이웃과 오버랩 25 픽셀 핵의 반경 확장이다. - 테스트 모드를 종료하고 모듈 중 어느 것도 이전 모듈 옆에 모든 눈 심볼 선택을 취소하여 전체 분석을 실행하는 자신의 화면을 표시하지 있는지 확인하십시오.
참고 :이 크게 필요한 감소 전산 자원을 파이프 라인을 처리하는 동안. - 를 눌러 분석을 시작합니다 "이미지 분석".
- 분석이 완료되면, 분석 플레이트에 걸쳐 안정적으로 작동되도록하여 얻어진 PNG 이미지뿐만 아니라 CSV 시트를 검사한다.
- 항목 분석
- 쉐이딩 모델 계산
- "가져 오기"→ "파일에서 파이프 라인을 ..."을 선택, 메뉴 "파일"로 이동하여 제공하는 선택D 파이프 라인 "BrucellaShadingCorrectionPart1-Ver007". , 기존 파이프 라인을 변환 대답할지 여부를 묻는 질문에 "변환하지 마십시오".
- "출력"→ "보기 출력 설정"으로 이동하여 이미지 입력 폴더 생성 된 쉐이딩 모델의 출력 폴더를 선택합니다.
- 모듈 (1) "LoadImages은"이미지 이름과 일치하도록 "이러한 이미지 공통점이 있음을 텍스트"의 이름을 조정합니다.
- 모듈 중 어느 것도 이전 모듈 옆에 모든 눈 심볼 선택을 취소하여 전체 분석을 실행하는 자신의 화면을 표시 없는지 확인합니다.
참고 :이 크게 필요한 감소 전산 자원을 파이프 라인을 처리하는 동안. - 를 눌러 쉐이딩 모델의 계산을 시작합니다 "이미지 분석".
- 실행 이미지 분석
- "가져 오기"→ "파일에서 파이프 라인을 ..."을 선택, 메뉴 "파일"로 이동하여 제공하기를 선택에드 파이프 라인 "BrucellaEntryWithShadingCorrectionPart2-Ver007". , 기존 파이프 라인을 변환 대답할지 여부를 묻는 질문에 "변환하지 마십시오".
- "출력"→ "보기 출력 설정"으로 이동하여 이미지 입력 폴더 생성 된 스프레드 시트에 대한 출력 폴더를 선택합니다.
- 모듈 (1) "LoadImages은"이미지 이름과 일치하도록 "이러한 이미지 공통점이 있음을 텍스트"의 이름을 조정합니다.
- 모듈 (2) "LoadSingleImage"에서, 위치 및 두 쉐이딩 모델의 파일 이름을 선택하여 6.2.1에서 구한 쉐이딩 모델을로드.
- 모듈 (4) - (5) "ImageMath"파라미터를 조정 현미경 카메라의 비트 깊이 일치 "가 첫 번째 이미지를 곱". 8 및 16 비트 이미지가 12 비트 이미지에 대한 매개 변수를 "1.0"을 설정을 위해에 "16.0"매개 변수를 설정합니다.
- 모듈 (6) "IdentifyPrimaryObjects"파라미터 "를 설정 소호WER은 핵이 분할되고 배경은 무시 충분히 높은 "임계 값에 바인딩됩니다.
- 모듈 (6)의 모듈을 통해 단계 좋은 값 식별 단계 6.1.2.6.1 및 6.1.2.6.2에서 설명한 바와 같이, 입력 화상을 표시한다.
- 입력 이미지를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 히스토그램을 표시합니다.
참고 : 히스토그램의 피크는 일반적으로 배경을 나타냅니다. - 출력 화상에 표시되는 핵이 좋은 분할이 달성 될 때까지 배경 강도부터 출발하는 매개 변수를 증가시킨다.
참고 : 배경 위의 임계 값을 설정하면 빈 사이트에 대한 중요하다.
- 모듈 (8) "IdentifyPrimaryObjects은"만 브루셀라가 분할되고 배경은 무시 충분히 높은 매개 변수 "낮은 임계 값에 바인딩"을 설정합니다.
- 모듈 (8)은 모듈 위에 단계 좋은 값 식별 단계 6.1.2.6.1 및 6.1.2.6.2에서 설명한 바와 같이, 입력 화상을 표시한다.
- 입력 이미지를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 히스토그램을 표시합니다.
참고 : 히스토그램의 피크는 일반적으로 배경을 나타냅니다. - 출력 이미지에 표시되는 브루셀라의 좋은 분할이 달성 될 때까지 배경 강도에서 시작하면 매개 변수를 증가.
참고 : 배경 위의 임계 값을 설정하면 빈 사이트에 대한 중요하다.
- 모듈 (11) "FilterObjects"에서 파라미터 "최소값"그 배경과 유물 멀리 필터링, 만 브루셀라 식민지가 유지 될 수 있도록 조정합니다.
- 모듈을 통해 좋은 가치, 단계를 확인하고 단계 6.1.2.6.1 및 6.1.2.6.2에 설명 된대로 출력 이미지를 표시합니다. 만 브루셀라 개체가 유지 될 때까지 증가 6.2.2.7 단계적에서 선택한 값으로 시작합니다.
- 테스트 모드를 종료하고 이전 unche에 의해 전체 분석을 실행하기 모듈 중 어느 것도 자신의 화면을 표시 없는지 확인모듈 옆 모든 안과 심볼을 요리하는.
참고 :이 크게 필요한 감소 전산 자원을 파이프 라인을 처리하는 동안. - 를 눌러 분석을 시작합니다 "이미지 분석".
- 분석이 완료되면, 분석 플레이트에 걸쳐 잘 작동되도록하여 얻어진 PNG 이미지뿐만 아니라 CSV 시트를 검사한다.
- 쉐이딩 모델 계산
- 엔드 포인트 분석
- 단계 6.1.2.12에서 생성 된 CSV 시트를 열고 감염된 세포의 수 (CellProfiler 판독 : "Count_InfectedCells")을 나누어 잘 감염률 당을 계산 세포의 총 수 ( "CountNuclei"CellProfiler 판독)에 의해. 물론 당 여러 사이트가 몇 군데 된 경우, 먼저 감염된 세포의 당 잘 수와 세포의 당 잘 수를 구축, 각 웰에 대한 모든 사이트를 요약한다.
- 판 충분한 비 히트 siRNA를 포함하는 경우 판 - 투 - 플레이트 변동을 고려하기 위해 Z 점수 정규화를 수행합니다. 전체 라이브러리가 상영되는 경우 접시 당 비 히트 siRNA를 충분한 수를 가정합니다.
- 항목 분석
- (CellProfiler 판독을 단계 6.2.2.10에서 생성 된 CSV 시트를 열고 감염된 세포의 수를 나누어 잘 감염률 당을 계산 : "Count_InfectedCeLLS "() 세포의 총 수에 의해 CellProfiler 판독 값은 :". 물론 당 여러 사이트가 몇 군데 된 경우 CountNuclei ")는, 먼저 당 웰 감염된 세포의 수와 구축, 각 웰에 대한 모든 사이트를 요약 당 잘 세포의 총 수입니다.
- 감염된 세포의 박테리아 하중을 정량화하기 위해, 감염된 세포 당 박테리아 세포가 차지하는 평균 면적을 측정. 이 사이트에 감염된 세포의 수에 의해이 목적을 위해 셀들과 겹치는 모든 세포 내 박테리아 집적 영역 ( "AreaOccupied_AreaOccupied_TrueIntPathogenInCells"CellProfiler 판독)을 나눈다. 유물을 설명하기 위해, 잘 판독 등이 판독의 모든 사이트의 중앙값을 사용합니다.
주 :이 분석은 브루셀라 감염에 관여하는 유전자의 다수를 포함하는 후속 분석으로 사용되는 경우, Z 스코어 정규화를 적용하지 않는다. 대신, 판 - 투 - 플레이트 변화를 설명하기 위해 참조로 모의 우물을 사용하여 정규화를 수행합니다.
7. 감염 점수
주 : 세포 생존에 중요한 영향을 미칠 된 siRNA는 신중하게 고려되어야 이것은 가양 발견을 촉진시킬 수 있기 때문이다. 변형 된 세포 수는 실제 MOI 영향을 필수 유전자 타겟팅은 병원균 감염에 대한다면 발현 성 효과를 가질 수있다. siRNA를하여 완전 고갈 필수 유전자의 연구를 위해 수 있지만, 이러한 대상은 다른 방법 (예를 들어, 제약 간섭) 호스트 요소로서의 역할을 확증하기에 의해 검증되어야한다감염시.
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Representative Results
도 1a는 자동으로 엔드 분석에서 감염된 세포를 식별하는 데 사용되는 이미지 분석의 일례를 나타낸다. DAPI 염색 HeLa 세포의 핵이 확인되었고, 25 픽셀 핵 연장하여 핵 주위 8 화소의 폭 조갑 핵 및 보로 노이 셀 바디를 산출 하였다. 박테리아가 주로 조갑 핵 공간 확산 때문에, 셀이 영역에서 강도 GFP 감염 및 비감염 세포를 구별 할 수있는 가장 강력한 측정이다. 일부 경우에 세균이 핵으로 큰 정도에 조갑 핵 또는 오버레이 외부 증식 발견된다. 따라서, 두 개의 추가 오브젝트는 감염된 세포의 식별을 고려 하였다. 분할뿐만 아니라 GFP 강도 측정은 화상 해석 소프트웨어 CellProfiler이 수행되었다.
브루셀라
도 2a는 I를 도시마법사 분석은 감염된 세포를 식별하고, 엔트리 분석에서 세포 내 세균 부하를 측정하기 위해 사용된다. 엔드 분석과는 대조적으로, 엔트리 분석은 박테리아 세포 분할 및 객체로서 보로 노이 셀 체를 사용한다. 브루셀라 만 세포의 GFP 신호는 세그먼트 이미지 분석 파이프 라인 병원균을 사용 하였다. 세포 내 박테리아는 2 픽셀의 최소 크기 및 세포 외 박테리아의 희미 GFP 배경 강도를 초과하는 GFP 강도로 정의 하였다. 적어도 하나의 세포 내 박테리아의 객체가 보로 노이 셀 체와 중첩하는 경우 셀 감염된 여겨졌다. 또한, 세균 부하는 세포 내 세균에 의해 덮여 감염된 세포의 평균 면적을 계산에 의해 추정 하였다.
종점 분석법으로서, ARPC3 고갈은 콘으로 처리 된 세포와 비교하여, 엔트리의 분석 브루셀라 감염의 감소를 보였다트롤의 siRNA (그림 2B). 감염률 정량 감염된 세포 (도 2C)과 감염된 세포 (도 2D)에 세포 내 균수의 수가 고갈 ARPC3 감소되었음을 확인 하였다.
도 1 : HeLa 세포 분석 B. 감염 엔드 분석에서 GFP 발현 보르 투스 (a)는 엔드 포인트 분석 :. 형광 이미지 (DAPI 스케일 바 = 50㎛의 염색 GFP 블루 = 핵 발현 보르 투스 녹색 = B.) 엔드 포인트 분석의 일례를 도시. GFP B. 표현 보르 투스는 GM의에 의해 세포 외 박테리아 죽이는 다음 4 시간 동안 헬라 세포를 입력하는 것이 허용되었다. 40 시간 허용 박테리아 또한 배양는 HeLa 세포 내에서 복제합니다. 자동 이미지 analysi S가하십시오 CellProfiler 파이프 라인은 조갑 핵 계산 하였다 세그먼트 DAPI 염색 핵으로 사용되었다 (비 중첩 (8) 핵을 둘러싸는 픽셀 링) 및 보로 노이 셀 본체 (겹치지 25 픽셀 핵의 직경 확장) 모두 빨간색으로 표시. 적어도 하나의 세포 구획 (핵, 조갑 핵 보로 노이 셀 본체)에 통합 GFP 강도가 해당 임계 값을 초과하는 경우 전지 감염된 여겨졌다. (B) (B)에 감염된 HeLa 세포의 대표적인 이미지 보르 투스는 감염 후 GFP 44 시간을 표현. 세포 하나 스크램블 (비 대상) siRNA를 제어 또는 ARPC3을 대상으로 siRNA를 형질 감염시켰다. 스케일 바는 50 μm의 =. ARPC3 고갈 HeLa 세포의 감염 (C) 부량. 데이터는 막대 그래프로 표시됩니다 (Z는 정규화 점수, 평균의 오차 막대를 = 표준 오차, 바 = 평균 *** p <0.001, 맨 - 휘트니 시험, N = 7).에스 / ftp_upload / 54263 / 54263fig1large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : B.에 의해 헬라 세포의 감염의 정량 . 아 보르 투스 항목 분석에 TetR-GFP를 표현 (A) 항목 분석 : 형광 영상을 DsRed 신호를 보여주는 아 보르 투스을 DsRed와 GFP 신호, 빨간색 = 세포 외 B를 보여주는 아 보르 투스 항목 분석의 예 (= 노란색 세포 내 B를 보여주는, 파란색 = 핵 DAPI, 스케일 바 = 50 μm의)로 염색. B.를 을 DsRed 그리고 TetR-GFP를 발현 보르 투스는 세포 외 박테리아 및 4 시간 동안 ATC와 세포 내 박테리아 GFP 동시에 유도 죽인 다음 4 시간 동안 HeLa 세포에 들어갈 수 있었다 자동화 이미지 분석 :. CellProfiler 파이프 라인은 DAPI를 검출하기 위해 사용 된25 픽셀 핵의 직경 확장하여 보로 노이 셀 몸체의 계산 하였다 핵 염색 (화이트 표시). 세균은 GFP 신호에 기초하여 분할 하였다. 그 보로 노이 셀 본체 충분한 크기 및 GFP 강도 중 적어도 하나의 세그먼트 세균 객체 중첩 경우 셀 감염된 여겨졌다. 감염된 세포에서 세균 부하는 보로 노이 셀 본체 모든 세그먼트 세균 오브젝트의 영역의 적분에 의해 설명된다 (단위 = 픽셀; NaN이 더 수가 비감염 세포에서 산출되지 =). (B) 실시 예 이미지 세포 (B)의 저하를 나타내는 siRNA를 표적 ARPC3 형질 세포 (노란색 균수로 표시) 보르 투스 스크램블 siRNA를 처리 한 세포를 대조군에 비해. 감염된 세포의 수뿐만 아니라 감염된 세포의 세포 내 박테리아의 평균 개수가 노크 ARPC3 따라 감소된다. 헬라 세포에 감염 속도 (C) 정량은 고갈ARPC3합니다. 데이터는 막대 그래프로 표시됩니다 (; 모의에 정상화, 오차 막대 = 평균의 표준 오차, 바 = 평균 * P <0.05, 맨 - 휘트니 시험, N = 4). ARPC3에 대한 고갈에 감염된 HeLa 세포의 세균 부하의 (D) 부량. 데이터는 막대 그래프로 표시됩니다 (; 정상화 모의에, 오차 막대 = 평균의 표준 오차 * P <0.05, 맨 - 휘트니 시험, 바 = 평균 N = 4). 이의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 그림.
추가 파일 1 :. CP2 파이프 라인 - 음영 보정 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보조 파일 2 : CP2 파이프 라인- 엔드 포인트 분석. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
기업 파일 3 :. CP2 파이프 라인 - 항목 분석 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
기업 파일 4. 모듈의 설명 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tryptic Soy Agar (TSA) | BD | 236950 | |
| Tryptic Soy Broth (TSB) | Fluka | 22092 | |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 60615 | |
| Skim milk | |||
| 250 ml screw cap bottle | Corning | 8396 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Gibco | 10270 | Heat-inactivated |
| Trypsin-EDTA (0.5%) | Gibco | 15400-054 | 10x stock solution, dilute 1:10 in PBS |
| Scepte 2.0 Cell Counter | Merck Milipore | PHCC20060 | Alternative cell counting devices can be used |
| Greiner CELLSTAR 384-well plate | Sigma-Aldrich | M2062 | |
| Peelable aluminum foil | Costar | 6570 | |
| Reagent dispenser: "Multidrop 384 Reagent Dispenser" | Thermo Scientific | 5840150 | Alternative reagent dispenser can be used. |
| Transfection reagent: "Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen | 13778-150 | |
| Automated plate washer: "Plate washer ELx50-16" | BioTek | ELX5016 | This plate washer contains a 16-channel manifold suitable for 384-well plates. It fits into a biosafety cabinet and has a lid covering the plate during washing which reduces the risk of aerosol production. Alternative plate washers with similar features could be used. |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | |
| Anhydrotetracycline hydrochloride | Sigma-Aldrich | 37919 | 100 μg/ml solution in 100% ethanol is kept at -20 °C protected from light in aluminum-foil |
| PBS | Gibco | 20012 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Dissolve in 0.2 M HEPES buffer, pH 7.4. Store at -20 °C and thaw freshly the day before use. Caution, PFA is toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| DAPI | Roche | 10236276001 | |
| Scrambled siRNA | Dharmacon | D-001810-10 | |
| Kif11 siRNA | Dharmacon | L-003317-00 | |
| ARPC3 siRNA | Dharmacon | L-005284-00 | |
| Brucella abortus 2308 | |||
| pJC43 (apHT::GFP) | Celli et al.12 | ||
| pAC042.08 (apht::dsRed, tetO::tetR-GFP) | Construction: pJC44 4 was digested with EcoRI followed by generation of blunt ends with Klenov enzyme and subsequent digestion with SalI. TetR-GFP was amplified from pNF106 using primer prAC090 and prAC092. Following digestion with SalI, the TetR-GFP product was ligated to the digested pJC44 vector. | ||
| Primer prAC090 | Sigma-Aldrich | TTT TTG AAT TCT GGC AAT TCC GAC GTC TAA GAA ACC | |
| Primer prAC092 | Sigma-Aldrich | TTT TTG TCG ACT TTG TCC TAC TCA GGA GAG CGT TC | |
| HeLa CCL-2 | ATCC | CCL-2 | |
| ImageXpress Micro | Molecular Devices | IXM IMAGING MSCOPE | Automated cellular imaging microscope equipped with a precision motorized Z-stage. Alternative systems for automated microscopy and alternative components for hard- and software specified below can be employed. |
| High-Speed Laser Auto-Focus | Molecular Devices | 1-2300-1037 | |
| CFI Super Fluor 10X objective | Nikon | MRF00100 | N.A 0.50, W.D 1.20 mm, DIC Prism: 10X, Spring loaded |
| Photometrics CoolSNAP HQ Monochrome CCD Camera | Molecular Devices | 1-2300-1060 | 1,392 x 1,040 imaging pixels, 6.45 x 6.45 µm pixels, 12 bits digitization |
| MetaXpress software | Molecular Devices | 9500-0100 | |
| LUI-Spectra-X-7 | Lumencor | SPECTRA X V-XXX-YZ | Light engine. The following light sources are used: violet (DAPI), cyan (GFP), green/yellow (RFP) |
| Single Band Exciter for DAPI | Semrock | FF01-377/50-25 | |
| Single Band Emitter for DAPI | Semrock | FF02-447/60-25 | |
| Single Band Dichroic for DAPI | Semrock | FF409-Di03-25x36 | |
| Single Band Exciter for GFP | Semrock | FF02-472/30-25 | |
| Single Band Emitter for GFP | Semrock | FF01-520/35-25 | |
| Single Band Dichroic for GFP | Semrock | FF495-Di03-25x36 | |
| Single Band Exciter for RFP | Semrock | FF01-562/40-25 | |
| Single Band Emitter for RFP | Semrock | FF01-624/40-25 | |
| Single Band Dichroic for RFP | Semrock | FF593-Di03-25x36 |
References
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