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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Mikroskopie-basierte Assays für die Hochdurchsatz-Screening von Host beteiligten Faktoren in Published: August 5, 2016 doi: 10.3791/54263
Automatic Translation
*1, *1, *1,4, *1,3, 2, 2, 1
1Focal Area Infection Biology, Biozentrum, University of Basel, 2Centre d’Immunologie de Marseille-Luminy, Université de la Méditérannée UM2, INSERM U1104 CNRS UM7280, 3Departmento de Microbiologìa and Instituto de Salud Tropical, Universidad de Navarra, 4BioDataAnalysis GmbH
* These authors contributed equally

Abstract

Brucella - Arten sind fakultativ intrazelluläre Erreger, die Tiere als ihre natürlichen Wirte infizieren. Übertragung auf den Menschen wird am häufigsten durch direkten Kontakt mit infizierten Tieren verursacht oder durch die Einnahme von kontaminierten Lebensmitteln und kann zu schweren chronischen Infektionen führen.

Brucella können professionelle und nicht-professionelle Phagozyten eindringen und repliziert innerhalb endoplasmatischen Retikulum (ER) abgeleitetes Vakuolen. Die Wirtsfaktoren für Brucella Eintritt in Wirtszellen, die Vermeidung von lysosomalen Abbau erforderlich ist , und die Replikation in der ER-ähnlichen Fach bleiben weitgehend unbekannt. Hier beschreiben wir zwei Assays Wirtsfaktoren beteiligt in Brucella Eintrag und Replikation in HeLa - Zellen zu identifizieren. Die Protokolle beschreiben die Verwendung von RNA-Interferenz, während alternative Screening-Verfahren angewendet werden könnten. Die Assays basieren auf der Detektion von fluoreszenzmarkierten Bakterien in fluoreszenzmarkierte Wirtszellen unter Verwendung automatisierterWeitfeldmikroskopie. Die Fluoreszenzbilder werden analysiert, um eine standardisierte Bildanalyse-Pipeline in CellProfiler verwendet, die einzelnen zellbasierten Infektion Scoring ermöglicht.

Im Endpunkt-Assay wird die intrazelluläre Replikation zwei Tage nach der Infektion gemessen. Auf diese Weise können Bakterien Besucher auf ihre replikativen Nische , wo die Proliferation um 12 Stunden nach der bakteriellen Eintritt initiiert wird. Brucella , die erfolgreich eine intrazelluläre Nische etabliert haben so stark innerhalb von Wirtszellen vermehrt haben wird. Da intrazelluläre Bakterien stark einzelne extrazelluläre oder intrazelluläre nicht-replikativen Bakterien überwiegen werden, die konstitutiv ein Stamm GFP exprimieren, können verwendet werden. Das starke GFP-Signal wird dann verwendet, infizierte Zellen zu identifizieren.

Im Gegensatz dazu ist für den Eintrag Test ist es wichtig, zwischen intra- und extrazellulären Bakterien zu unterscheiden. Hier wird ein Stamm, kodierend für ein Tetracyclin-induzierbarer GFP verwendet. Induktionvon Gentamicin von GFP bei gleichzeitiger Inaktivierung von extrazellulären Bakterien ermöglicht die Unterscheidung zwischen intra- und extrazellulären auf dem GFP-Signal basierend Bakterien, mit nur intrazelluläre Bakterien in der Lage zu sein GFP zu exprimieren. Dies ermöglicht die robuste Detektion einzelner intrazellulären Bakterien, bevor die intrazelluläre Vermehrung initiiert wird.

Introduction

Brucella Spezies gram-negative, fakultativ intrazelluläre Pathogene zur Klasse der α-Proteo gehören. Sie verursachen Abtreibungen und Unfruchtbarkeit in ihren natürlichen Wirten wie Rinder, Ziegen oder Schafe was zu schweren wirtschaftlichen Verlusten in Endemiegebieten. Brucellose ist eine der wichtigsten Zoonosen weltweit verursacht mehr als eine halbe Million neue Infektionen beim Menschen jährlich 1. Die Übertragung auf menschliche wird am häufigsten durch direkten Kontakt mit infizierten Tieren verursacht oder durch die Einnahme von kontaminierten Lebensmitteln wie nicht pasteurisierte Milch. Symptome der fieberhafte Erkrankung sind unspezifisch, was Schwierigkeiten bei der Diagnose von Brucellose verursacht. Wenn unbehandelt, können Patienten eine chronische Infektion mit schwereren Symptomen entwickeln , wie Arthritis, Endocarditis und Neuropathie 2.

Auf zellulärer Ebene ist Brucella können phagozytische und nicht-Phagozyten und repliziert innerhalb eines intrazellulären einzufallenFach wie die Vakuole -haltigen Brucella bekannt (BCV). Internalisierung von Bakterien erfordert von Rac, Rho Aktinzytoskelett Umlagerungen und direkte Aktivierung von Cdc42 3. Innerhalb der eukaryotischen Wirtszelle, verkehre die BCV entlang der endocytischen und trotz der Interaktion mit Lysosomen, zu verwalten Bakterien Abbau 4 zu vermeiden. Ansäuern des BCV von der vesikulären ATPase erforderlich , um die Expression des bakteriellen Typ IV - Sekretionssystem (T4SS) 5 zu induzieren. Es wird angenommen , dass bakterielle Effektoren sekretiert durch die T4SS wesentlich sind für Brucella ihrer replikativen Nische zu etablieren, da Deletion des T4SS 6 oder Hemmung der vesikulären ATPase führen zu Fehlern in der Einrichtung der intrazellularen Nische 7. Bakterien während der Phase des Handels nicht, bis sie replizieren erreichen 8 ein ER-derived vacuolar Fach. Sobald die intrazelluläre Vermehrung auftritt, wird die BCV in cl gefundenose Assoziation mit ER Marker wie Calnexin und Glucose-6-Phosphatase - 6.

Die molekularen Mechanismen , durch die Brucella Zellen eintritt, vermeidet lysosomalen Abbau und repliziert schließlich in einem ER-ähnlichen Fach bleiben weitgehend unbekannt. Wirtsfaktoren in verschiedenen Schritten der Infektion beteiligt sind vor allem durch gezielte Ansätze oder kleinem Maßstab small interfering RNA (siRNA) Bildschirm ausgeführt in Drosophila - Zellen 9 identifiziert worden. Diese haben Aufschluss über den Beitrag der einzelnen Wirtsfaktoren bei Brucella - Infektion , aber wir sind noch weit von einem umfassenden Verständnis des gesamten Prozesses.

Hier Protokolle, die die Identifizierung der menschlichen Wirtsfaktoren unter Verwendung von großen RNA-Interferenz (RNAi) Screening in Verbindung mit automatisierten Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie und automatisierte Bildanalyse ermöglichen vorgestellt. Reverse siRNA-Transfektion von HeLa-Zellen durchgeführt wird als described früher 10,11 mit geringfügigen Modifikationen. Der Endpunkt - Assay deckt einen großen Teil des Brucella intrazellulären Lebenszyklus außer dem Austritt und die Infektion von benachbarten Zellen. Um die Treffer charakterisieren in den Endpunkt-Assay identifiziert, ein modifiziertes Protokoll Faktoren identifizieren, in frühen Schritte der Infektion beteiligt ist, verwendet.

Ein Brucella abortus Stamm, der konstitutiv GFP exprimiert wird für den Endpunkt - Assay verwendet , in denen Bakterien erlaubt werden Zellen für zwei Tage zu infizieren. Während dieser Zeit geben Bakterienzellen, Verkehr auf die ER-abgeleiteten replikativen Nische, und in der peri-Kernraum replizieren. Die hohen GFP-Signal kann dann verwendet werden, um zuverlässig einzelner Zellen nachzuweisen, die replizierende Bakterien enthalten.

Brucella Eintrag in einem Hochdurchsatz - Assay zu untersuchen, ist es wichtig , zwischen intra- und extrazellulären Bakterien zu unterscheiden zu können. Die hier vorgestellte Methode circumvents Differential-Antikörper-Färbung von intra- und extrazellulären Bakterien. Es basiert auf einem Brucella - Stamm zugrunde , ein Tetracyclin-induzierbaren GFP in Kombination mit konstitutiver Expression von dsRed auszudrücken. Das Vorhandensein eines konstitutiven dsRed Marker ermöglicht die Identifizierung aller Bakterien, die in der Probe vorhanden sind. GFP-Expression wird durch die Zugabe des nicht-toxischen Tetracyclin analog Anhydrotetracyclin (ATC) gleichzeitig mit der Inaktivierung von extrazellulären Bakterien durch Gentamicin (Gm) induziert. Während die Zelle undurchlässige Antibiotikum Gm extrazelluläre Bakterien tötet, kann AtC die Wirtszelle eindringen und die GFP-Expression selektiv in intrazellulären Bakterien induzieren. Dieser duale Reporter ermöglicht die robuste Trennung einzelner intrazelluläre Bakterien (GFP und dsRed Signal) von extrazellulären Bakterien (nur dsRed Signal) mit Weitfeldmikroskopie. Um nachweisbare GFP - Expression durch intrazelluläre Brucella zu erreichen haben wir festgestellt , dass 4 h Induktion durch atc führt zu einer ReliLage Signal. Ähnliche Induktionsschemata selektiv GFP in intrazellulären Bakterien exprimieren verwendet wurde zuvor intrazelluläre Shigella 12 zu studieren.

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Protocol

Hinweis: Alle Arbeiten mit Live - Brucella abortus - Stämme müssen in einem Biosicherheitsstufe 3 (BSL3) Labor durchgeführt werden , unter Berücksichtigung aller erforderlichen Vorschriften und Sicherheitsvorkehrungen.

1. Herstellung von Screening-Platten und Anzucht von Bakterien und Zellen

  1. Herstellung von Starterkulturen Brucella abortus
    1. Streak Brucella abortus 2308 (B. abortus) von -80 ° C Milch stock auf einem CASO - Agar (TSA) Platte , die 50 ug / ml Kanamycin (TSA / Km). Inkubieren Platte für 3-4 Tage bei 37 ° C. Verwenden Stamm Brucella abortus 2308 pJC43 (APHT :: GFP) 13 für den Endpunkt - Assay und Stamm Brucella abortus pAC042.08 (APHT :: dsRed, tetO :: tetR-GFP) für den Eintrag Test.
      Hinweis: Die glatte Lipopolysaccharide (LPS) von Brucella abortus ist ein wichtiger Virulenzdeterminante aber rauhen Mutanten bei relativ hohen Frequenzen 14 auftreten können. We so empfehlen den Status der Kulturstamm testen, bevor mit diesem Experiment zu starten.
    2. Restreak Bakterien auf vier TSA / Km-Platten die volle Platte Abdeckung und Inkubation für 2-3 Tage bei 37 ° C.
    3. Mit Hilfe einer Einweg-Kunststoff-Schleife, die Übertragung und resuspendieren Bakterien von den TSA / Km-Platten in 10 ml 10% autoklaviert Magermilch. Stellen Sie sicher, dass die Bakterien gut resuspendiert, um konsistente Bakterienkonzentrationen in allen Starterkulturen zu gewährleisten.
    4. Aliquot 250 ul der Bakteriensuspension in 2 ml Schraubdeckel Rohre und gefrier bei -80 ° C.
    5. Tauen Sie einen aliquoten Teil der Starterkultur und Transfer 25 ul, 50 ul und 100 ul der Bakterienstarterkultur 250 ml zu trennen Schraubverschlussflaschen mit 50 ml CASO-Bouillon (TSB), enthaltend 50 ug / ml Kanamycin (TSB / Km) . Verschließen Sie die Flaschen mit Parafilm.
    6. Inkubiere die Flaschen über Nacht auf einem Orbitalschüttler bei 100 Upm und 37 ° C.
    7. Messung der optischen Dichte bei 600 Nm (OD 600) , um das Volumen der Starterkultur zu bestimmen , die erforderlich eine OD 600 = 0,8-1,1 nach über Nacht Kultur zu erreichen.
  2. Herstellung von HeLa-Zellen
    1. Wachsen HeLa - Zellen in Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) mit 10% fötalem Kälberserum (FCS) (DMEM / 10% FCS) in einem 37 ° C feuchten Inkubator mit 5% CO 2 Zellen auf 80% Konfluenz wachsen.
  3. Bereiten Sie die Abschirmplatten mit siRNAs.
    1. Verdünnte siRNAs in RNase-freiem Wasser auf eine Endkonzentration von 0,32 uM. Jeweils 5 ul / Vertiefung zu schwarz klar Vertiefungen mit flachem Boden 384-Well-Platten.
      1. Verwenden Sie Spalten 1, 2, 23 und 24 für Standardkontrollen. Für Negativkontrollen verwenden nicht-Targeting-siRNA (Rührei) und Mock Brunnen ohne siRNAs (Transfektionsreagenz nur). Für die Transfektion steuert, verwenden Sie eine siRNA, die den Zelltod (KIF11) sowie positive Kontrollen bekannter Wirtsfaktoren beteiligt in Brucella - Infektion induziert (zB ARPC3,eine Komponente des Komplexes Arp2 / 3 in Aktin-Polymerisation beteiligt sind). Übertragen im Handel erhältlichen siRNA-Bibliotheken oder benutzerdefinierte siRNAs auf die restlichen Brunnen.
      2. Dichtungsplatten mit abziehbaren Aluminiumfolien. Store-Platten bei -20 ° C.
        Hinweis: Die Platten können für mindestens 6 Monate und bis Jahre bei -20 ° C gelagert werden, je nach den Empfehlungen des Herstellers.

2. Reverse-siRNA-Transfektion

  1. Auftauen einen schwarzen 384-Well-Platte durch Zentrifugation bei 300 xg für 20 min bei Raumtemperatur.
    Hinweis: Dies wird bringen die ganze Flüssigkeit, die mit dem Deckel oder an der Seite der Vertiefungen anhaften könnten.
  2. Bereiten Sie die Transfektionsmedium durch Verdünnen des Transfektionsreagenz 1: 200 in DMEM ohne FCS bei Raumtemperatur. Bereiten Sie die Transfektionsmediums nicht mehr als 20 Minuten vor der Verwendung. mischen Sie vorsichtig die Lösung vor dem Gebrauch.
  3. In 25 ul Transfektionsmediums zu jedem Well ein Reagens Dispenserund die Lösungen mischen, indem die Platte hin und her zu bewegen.
  4. Inkubieren der Platte für 1 Stunde bei Raumtemperatur siRNA / Transfektionsreagenz Komplexbildung zu ermöglichen.
  5. HeLa - Zellen In der Zwischenzeit bereiten , indem sie die subkonfluenten Zellen einer 75 cm 2 Kolben einmal mit 2,5 ml 0,05% Trypsin-EDTA in PBS waschen (Trypsin).
  6. 1,5 ml frisches Trypsin und übertragen den Kolben auf 37 ° C für 2-3 Minuten, bis die Zellen abrunden.
  7. Resuspendieren der Zellen in 10 ml vorgewärmten DMEM / 16% FCS.
  8. Zählen von Zellen unter Verwendung eines automatisierten Zellzähler und bereiten eine Zellsuspension von 10.000 Zellen / ml in DMEM / 16% FCS.
  9. In 50 ul Zellsuspension in jede Vertiefung ein Reagenz Dispenser / Vertiefung in 500 Zellen führt.
  10. Bewegen, um die Platte hin und her eine gleichmäßige Verteilung der Zellen zu erreichen. Lassen Sie die Platte bei Raumtemperatur für 5-10 min zu ermöglichen, dass die Zellen sich zu beruhigen.
  11. Verschließen Sie die Platte mit Parafilm und Inkubation für 72 Stunden auf einer vorgewärmten AluminiumPlatte in einem 37 ° C feuchten Inkubator mit 5% CO 2.
    Hinweis: Die vorgewärmten Aluminiumplatte ermöglicht gleichmäßige Temperaturverteilung über den gesamten 384-Well-Platte.

3. Infektion und Fixierung

  1. Einen Tag vor der Infektion, impfen die bestimmte Menge in 1.1.7 von B. abortus Starterkultur in 50 ml TSB / Km - Medium in einem 250 ml Schraubverschluss Flasche. Verschließen Sie die Flasche mit Parafilm und Bakterien wachsen über Nacht bei 37 ° C und 100 rpm auf einem Orbitalschüttler bis zu einer OD 600 = 0,8-1,1.
  2. Messung der OD 600 der Bakterienkultur und bereiten die Infektionsmedium durch die Bakterienkultur in DMEM / 10% FCS verdünnt das gewünschte Multiplizität der Infektion (MOI) zu erreichen.
    Hinweis: Um eine Infektionsrate von 5-10% in HeLa-Zellen zu erhalten, eine MOI von 10.000 verwendet. Eine MOI Titrationskurve sollte für jeden Zelltyp zu erhalten optimalen Infektionsraten durchgeführt werden.
  3. Tauschen Sie das Transfektionsmediums der 384-Well-Plattemit 50 ul des Infektionsmedium mit einem automatischen Plattenwäscher.
  4. Zentrifugieren Sie die 384-Well-Platte bei 400 × g und 4 ° C für 20 min.
    Anmerkung: Dies hilft, den Infektionsprozess zu synchronisieren.
  5. Verschließen Sie die Platte mit Parafilm und brüten sie auf einer vorgewärmten Aluminiumplatte in einem 37 ° C feuchten Inkubator mit 5% CO 2 für 4 Stunden.
  6. Waschen Sie die Zellen mit DMEM / 10% FCS, die 100 ug / ml Gm extrazellulären Bakterien zu inaktivieren die automatisierte Plattenwäscher mit (arbeiten mit 200 ul / Vertiefung Überlauf Wasch).
    Hinweis: Während einer Überlaufwäsche, die automatisierte Plattenwäscher verzichtet gleichzeitig und ansaugt Medium.
  7. Für den Eintrag Test waschen ein zweites Mal Zellen mit DMEM / 10% FCS, die 100 ug / ml Gm und 100 ng / ml AtC die automatisierte Plattenwäscher mit (arbeiten mit 200 ul / Vertiefung Überlauf Wasch).
  8. Verschließen Sie die Platte mit Parafilm und schicken Sie es an einem vorgewärmten Aluminiumplatte in der 37 ° C feuchten Inkubator mit 5% CO 2 für eine andere40 Stunden oder 4 Stunden, für den Endpunkt-Assay und den Eintrag Test sind.
  9. Zur Fixierung, waschen Sie die Vertiefungen mit PBS die automatisierte Plattenwäscher mit (arbeiten mit 200 ul / Vertiefung Überlauf Wasch).
  10. Exchange-PBS mit 50 & mgr; l 3,7% Paraformaldehyd in 0,2 M HEPES bei pH 7,4 (PFA) unter Verwendung der automatischen Plattenwäscher.
    Hinweis: Achtung: PFA durch Einatmen giftig ist, in Berührung mit der Haut und beim Verschlucken.
  11. Inkubieren für 20 min bei Raumtemperatur.
  12. Tauschen Sie das Fixierungsmedium mit 50 & mgr; l PBS mit dem automatischen Plattenwäscher. Anmerkung: Die Proben sind nun bereit, von der BSL3 herausgenommen werden, wenn nötig.
    Achtung: Die Entfernung von jeder Probe aus einer BSL3 Anlage unterliegt Risikobewertung und Validierung des Verfahrens und richtet sich nach den geltenden Vorschriften für die biologische Sicherheit.

4. Die Färbung

  1. Waschen Sie die Zellen zweimal mit 50 ul PBS.
  2. Permeabilisieren Zellen in 50 & mgr; l 0,1% Triton-X-100 in PBS für 10 min.
  3. Wash Zellen dreimal mit PBS. Geben Sie 20 & mgr; l PBS, enthaltend 1 & mgr; g / ml DAPI (4 ', 6-Diamidino-2-phenylindol) und Inkubation für 30 min bei Raumtemperatur.
  4. Wasche die Zellen dreimal in PBS und schützen die Anfärbung von Licht mit einer Aluminiumfolie.

5. Imaging

  1. Stellen Sie die automatische Weitfeldmikroskop für die Bildaufnahme auf.
    Hinweis: Die Einstellungen für ein Molecular Device Imagexpress Mikroskop MetaXpress Software werden nachfolgend beschrieben. Alternative 2D-Weitfeldmikroskopie Geräte mit den entsprechenden Hardware-Spezifikationen und Imaging-Software (siehe Tabelle von Material / Ausrüstung für weitere Details) verwendet werden.
    1. Wählen 10X-Objektiv, Kamera Binning = 1, Verstärkung = 1.
    2. Wählen Sie das Plattenformat entsprechend dem 384-Well-Platte.
    3. Erwerben 9 Standorte pro Vertiefung.
    4. Verwenden Sie "Enable laserbasierten Fokus" und "Fokus auf Platte und gut Boden".
    5. Set "Zuerst gut" als Anfangs gut fürSuche nach der Probe und "Alle Standorte" für Website-Autofokus.
    6. Verwenden Sie den DAPI-Kanal manuell einstellen Z-Offset für Fokus.
    7. wählen Sie manuell die Z-Offset von DAPI für alle anderen Kanäle.
    8. Zur manuellen Korrektur für alle Kanäle, die Belichtungszeit einen weiten Dynamikbereich mit geringer Überbelichtung zu gewährleisten.
      1. Erwerben Sie ein Bild von einem repräsentativen Standort mit dem Auto-Belichtungsfunktion. Verwenden Sie diese Belichtungszeit Bild 3-5 Standorten in der Platte und eine manuelle Einstellung der Belichtungszeit, bis die hellsten Pixel erreichen ~ 80% der maximalen Helligkeit über alle Standorte.
    9. Bild die volle Platte die DAPI und GFP-Kanäle für den Endpunkt-Assay verwendet wird. Für den Eintrag Test des RFP-Kanal zusätzlich wählen.

6. Automatische Bildanalyse

Hinweis: CellProfiler 2 15 als Bildanalyse - Software zur Segmentierung zellulären und Bakterien Objekte eingesetzt und measur automatisierte performements innerhalb der identifizierten Objekte. Die Software liefert die Bildanalyse-Algorithmen in einzelnen Modulen, die in eine Rohrleitung verbunden werden können, die die Module nacheinander auf alle Bilder ausgeführt wird, um automatisch eine spezifische Bildanalyseaufgabe auszuführen. Um das Protokoll zu folgen, installieren CellProfiler 2.1.1 oder eine neuere Version. Dann laden Sie die bereitgestellte Pipeline und folgen Sie den nachstehenden Anweisungen die erforderlichen Parameter innerhalb der Module anzupassen. Eine Beschreibung der einzelnen Module aller Rohrleitungen können in der Zusatzdateien zu finden.

Anmerkung: Zwei separate Rohrleitungen werden für jeden Test verwendet. Die erste Pipeline berechnet eine Schattierungsmodell, das von der zweiten Pipeline verwendet wird, um Bilder vor der Analyse zu korrigieren. Shading-Korrektur wird auf die Bilder angewendet, um die Effekte eines inhomogenen Lichtpfad von dem Mikroskop zu reduzieren. Die Berechnung der Schattierungsmodell in der ersten Pipeline ist ein langwieriger Prozess, aber die Ergebnisse werden mit höherer Genauigkeit sein.

    <li> Endpunkttest
    1. Berechnen Sie die Schattierungsmodell
      1. Rufen Sie das Menü "Datei", wählen Sie "Import" → "Pipeline aus Datei ...", und wählen Sie die bereitgestellte Pipeline "BrucellaShadingCorrectionPart1-Ver007". Auf die Frage, ob die Legacy-Pipeline zu konvertieren, zu beantworten "konvertieren Sie nicht".
      2. Gehen Sie auf "Output" → "Ansicht Ausgabeeinstellungen" und wählen Sie einen Eingangsordner mit den Bildern und einen Ausgabeordner für die daraus resultierenden Verschattungs Modelle.
      3. In Modul (1) "Loadimages", stellen Sie den Namen des "Text, dass diese Bilder gemeinsam haben", um die Bildnamen übereinstimmen.
      4. Stellen Sie sicher, dass keines der Module deren Display vor der vollständigen Analyse läuft durch unchecking alle Augen Symbole neben den Modulen. Hinweis: Dies verringert erheblich Rechenressourcen erforderlich ist, während die Pipeline verarbeitet.
      5. Drücken Sie auf "Analysieren von Bildern" die Berechnung des Schattierungsmodell zu starten.
      6. Führen Sie Bildanalyse
        1. Rufen Sie das Menü "Datei", wählen Sie "Import" → "Pipeline aus Datei ...", und wählen Sie die bereitgestellte Pipeline "BrucellaEndpointWithShadingCorrectionPart2-Ver007". Auf die Frage, ob die Legacy-Pipeline zu konvertieren, zu beantworten "konvertieren Sie nicht".
        2. Gehen Sie auf "Output" → "Ansicht Ausgabeeinstellungen" und wählen Sie einen Eingangsordner mit den Bildern und einen Ausgabeordner für die resultierende Tabelle.
        3. In Modul (1) "Loadimages", stellen Sie den Namen des "Text, dass diese Bilder gemeinsam haben", um die Bildnamen übereinstimmen.
        4. In Modul (2) "LoadSingleImage", legen Sie die Abschattung Modelle unter 6.1.1 berechnet, indem die Standortwahl und die Dateinamen der beiden Schattierungsmodelle.
        5. In Module (4) - (5) "ImageMath", stellen Sie den Parameter "das erste Bild Multiplizieren von" die Bit-Tiefe der Mikroskopkamera entspricht. Für 8 und 16 bitBilder den Parameter auf "1.0", für 12-Bit-Bilder den Parameter auf "16.0" gesetzt.
        6. In Modul (9) "ImageMath" stellen Sie den Parameter "das zweite Bild Multiplizieren von" auf einen Wert (Start mit 0,25), die die Brucella - Signal in der DAPI - Färbung unterdrücken , ohne die Nuclei zu unterdrücken.
          1. Klicken Sie auf "Start Testmodus", aktivieren Sie dann das Pausensymbol und die Anzeigefunktion für das Modul (9), indem Sie auf den entsprechenden Symbolen des Moduls klicken.
            Hinweis: Die Pause-Symbol in gelb erscheint, während das Auge Symbol ein offenes Auge zeigen, wenn aktiviert.
          2. Klicken Sie auf "Ausführen", um die Analyse zu laufen bis zum Modul (9) mit dem aktiven Pausensymbol. Um zu testen, die Werte für das Modul, drücken Sie "Step".
          3. Rechtsklick auf das neu geöffnete Bild und stellen Sie "Bildkontrast" auf "Log normalisiert". Schritt zurück wiederholt zu Modul (9), stellen Sie den Parameter "Multiplizieren Sie das zweite Bild durch", und Schritt über ter Modul wieder, bis die Brucella Signal vollständig , während unterdrückt wird , an die gleichzeitig schwarzen Flächen , die über Subtraktion zeigen werden im Ergebnisbild minimiert.
        7. In Modul (10) "IdentifyPrimaryObjects", den Parameter "Untere Grenze auf Schwelle" hoch genug (Start bei Null), so dass Keime segmentiert und Hintergrund ignoriert.
          1. Um ein gutes Preis-Leistungs-Modul (10), Schritt über das Modul identifizieren und das Eingangsbild anzuzeigen, wie in den Schritten 6.1.2.6.1 und 6.1.2.6.2 erläutert.
          2. Rechtsklick auf das Eingangsbild und das Histogramm angezeigt werden soll.
            Hinweis: Der Peak des Histogramms typischerweise Hintergrund angibt.
          3. Ausgehend von der Hintergrundintensität erhöhen, um die Parameter, bis eine gute Segmentierung von Zellkernen erreicht wird als in dem Ausgabebild angezeigt.
            Hinweis: Die Einstellung der Schwelle höher als Hintergrundintensität für Baulücken besonders wichtig ist.
        8. In-Modul (15)4; FILTERMinimalWert "", die Parameter einstellen " , so dass Zellen mit deutlich sichtbaren Brucella im Kern gehalten werden, und alle anderen werden herausgefiltert In diesem Schritt ignorieren Brucella außerhalb des Zellkerns..
          1. Um einen guten Wert, Schritt über das Modul identifizieren und das Ausgangsbild angezeigt werden wie in den Schritten 6.1.2.6.1 und 6.1.2.6.2 erläutert. Beginnen bei Null, die alle Zellen identifiziert als infiziert und erhöhen den Wert von kleinen Schritten , bis nur Zellen mit deutlich sichtbaren Brucella am Kern gehalten werden.
        9. In Modul (16) "FILTER", stellen Sie den Parameter "Minimalwert" , so dass die Zellen mit deutlich sichtbaren Brucella bei Perinucleus gehalten werden, und alle anderen Zellen werden herausgefiltert. Verwenden Sie einen ähnlichen Ansatz wie im vorherigen Modul.
        10. In Modul (17) "FILTER", stellen Sie den Parameter "Minimalwert" , so dass die Zellen mit deutlich sichtbaren Brucella an der Voronoi Zellkörper gehalten werden, und alle anderen Zellen werden abfiltriert. Verwenden Sie einen ähnlichen Ansatz wie im vorherigen Modul.
          Hinweis: Der Voronoi Zellkörper eine radiale Ausdehnung des Kerns ohne Überlappung von 25 Pixeln Voronoi Zellkörper mit benachbarten.
        11. Verlassen Sie den Testmodus und stellen Sie sicher, dass keines der Module zeigen ihre Anzeige vor der vollständigen Analyse läuft durch unchecking alle Augen Symbole neben den Modulen.
          Hinweis: Dies verringert erheblich Rechenressourcen erforderlich ist, während die Pipeline verarbeitet.
        12. Drücken Sie auf "Analysieren Bilder", um die Analyse zu starten.
        13. Wenn die Analyse abgeschlossen ist, überprüfen Sie die resultierende PNG-Bilder sowie das Blatt CSV, um sicherzustellen, dass die Analyse zuverlässig in die ganze Platte gearbeitet.
    2. Eintrag Assay
      1. Berechnen Sie die Schattierungsmodell
        1. Rufen Sie das Menü "Datei", wählen Sie "Import" → "Pipeline aus Datei ...", und wählen Sie die zur Verfügung stellend Pipeline "BrucellaShadingCorrectionPart1-Ver007". Auf die Frage, ob die Legacy-Pipeline zu konvertieren, zu beantworten "konvertieren Sie nicht".
        2. Gehen Sie auf "Output" → "Ansicht Ausgabeeinstellungen" und wählen Sie einen Eingangsordner mit den Bildern und einen Ausgabeordner für die daraus resultierenden Verschattungs Modelle.
        3. In Modul (1) "Loadimages", stellen Sie den Namen des "Text, dass diese Bilder gemeinsam haben", um die Bildnamen übereinstimmen.
        4. Stellen Sie sicher, dass keines der Module deren Display vor der vollständigen Analyse läuft durch unchecking alle Augen Symbole neben den Modulen.
          Hinweis: Dies verringert erheblich Rechenressourcen erforderlich ist, während die Pipeline verarbeitet.
        5. Drücken Sie auf "Analysieren von Bildern" die Berechnung des Schattierungsmodell zu starten.
      2. Führen Sie Bildanalyse
        1. Rufen Sie das Menü "Datei", wählen Sie "Import" → "Pipeline aus Datei ...", und wählen Sie die provided Pipeline "BrucellaEntryWithShadingCorrectionPart2-Ver007". Auf die Frage, ob die Legacy-Pipeline zu konvertieren, zu beantworten "konvertieren Sie nicht".
        2. Gehen Sie auf "Output" → "Ansicht Ausgabeeinstellungen" und wählen Sie einen Eingangsordner mit den Bildern und einen Ausgabeordner für die resultierende Tabelle.
        3. In Modul (1) "Loadimages", stellen Sie den Namen des "Text, dass diese Bilder gemeinsam haben", um die Bildnamen übereinstimmen.
        4. In Modul (2) "LoadSingleImage", legen Sie die Abschattung Modelle unter 6.2.1 berechnet, indem die Standortwahl und die Dateinamen der beiden Schattierungsmodelle.
        5. In Module (4) - (5) "ImageMath", stellen Sie den Parameter "das erste Bild Multiplizieren von" die Bit-Tiefe der Mikroskopkamera entspricht. Für 8 und 16-Bit-Bilder den Parameter auf "1.0" für 12-Bit-Bilder den Parameter auf "16.0" gesetzt.
        6. In Modul (6) "IdentifyPrimaryObjects", den Parameter "Lower auf Schwelle "hoch genug gebunden, dass nur Kerne segmentiert und Hintergrund ignoriert.
          1. Um ein gutes Preis-Leistungs-Modul (6), Schritt über das Modul identifizieren und das Eingangsbild anzuzeigen, wie in den Schritten 6.1.2.6.1 und 6.1.2.6.2 erläutert.
          2. Rechtsklick auf das Eingangsbild und das Histogramm angezeigt werden soll.
            Hinweis: Der Peak des Histogramms typischerweise Hintergrund angibt.
          3. Ausgehend von der Hintergrundintensität erhöhen, um die Parameter, bis eine gute Segmentierung von Zellkernen erreicht wird als in dem Ausgabebild angezeigt.
            Hinweis: Die Einstellung der Schwellenwerte Hintergrund für Baulücken wichtig ist.
        7. In Modul (8) "IdentifyPrimaryObjects", den Parameter hoch genug "Untere Schwelle gebunden" , dass nur Brucella segmentiert und Hintergrund ignoriert.
          1. Um ein gutes Preis-Leistungs-Modul (8), Schritt über das Modul identifizieren und das Eingangsbild anzuzeigen, wie in den Schritten 6.1.2.6.1 und 6.1.2.6.2 erläutert.
          2. Rechtsklick auf das Eingangsbild und das Histogramm angezeigt werden soll.
            Hinweis: Der Peak des Histogramms typischerweise Hintergrund angibt.
          3. Ausgehend von der Hintergrundintensität erhöhen , um die Parameter , bis eine gute Segmentierung von Brucella wie im Ausgangsbild angezeigt erreicht wird.
            Hinweis: Die Einstellung der Schwellenwerte Hintergrund für Baulücken wichtig ist.
        8. In Modul (11) "FILTER", stellen Sie den Parameter "Minimalwert" , so dass Hintergrund und Artefakte werden herausgefiltert und nur sind Brucella Kolonien gehalten.
          1. Um einen guten Wert, Schritt über das Modul identifizieren und das Ausgangsbild angezeigt werden wie in den Schritten 6.1.2.6.1 und 6.1.2.6.2 erläutert. Beginnen Sie mit dem ausgewählten Wert in 6.2.2.7 und schrittweise erhöhen, bis nur Brucella Objekte gehalten werden.
        9. Verlassen Sie den Testmodus und stellen Sie sicher, dass keines der Module zeigen ihre Anzeige vor der vollständigen Analyse von unche läuftcking alle Augen Symbole neben den Modulen.
          Hinweis: Dies verringert erheblich Rechenressourcen erforderlich ist, während die Pipeline verarbeitet.
        10. Drücken Sie auf "Analysieren Bilder", um die Analyse zu starten.
        11. Wenn die Analyse abgeschlossen ist, überprüfen Sie die resultierende PNG-Bilder sowie das Blatt CSV, um sicherzustellen, dass die Analyse hat gut funktioniert auf der ganzen Platte.

    7. Infektion Scoring

    Hinweis: siRNAs, die einen erheblichen Einfluss auf die Lebensfähigkeit der Zellen haben müssen mit Vorsicht betrachtet werden, da diese falsch positiven Entdeckungen fördern können. Eine veränderte Zellzahl wirkt sich auf die tatsächliche MOI und von essentiellen Genen Targeting können pleiotrope Effekte auf Erreger-Infektion haben. Während die unvollständige Abreicherung von siRNAs zur Untersuchung essentieller Gene ermöglicht, müssen solche Ziele durch alternative Methoden validiert werden (beispielsweise pharmazeutische Interferenz) ihrer Rolle als Wirtsfaktoren zu erhärtenwährend der Infektion.

    1. Endpunkttest
      1. Öffnen Sie die CSV-Blatt erzeugt in Schritt 6.1.2.12 und berechnen eine pro Well Infektionsrate durch die Anzahl der infizierten Zellen Teilen (CellProfiler Anzeige: "Count_InfectedCells") durch die Gesamtzahl der Zellen (CellProfiler Anzeige: "CountNuclei"). Wenn mehrere Standorte pro Vertiefung abgebildet wurden, zusammenfassen zunächst alle Standorte für jede Vertiefung, um eine pro-gut Anzahl der infizierten Zellen aufzubauen und eine pro-gut Gesamtzahl der Zellen.
      2. Führen Z Scoring Normalisierung zur Berücksichtigung von Platte zu Platte Variationen, wenn die Platten ausreichend nicht getroffen siRNAs enthalten. Angenommen, eine ausreichende Anzahl von Nicht-Treffer siRNAs pro Platte, wenn die volle Bibliotheken gescreent werden.
        Gleichung 1
    2. Eintrag Assay
      1. Öffnen Sie die CSV-Blatt erzeugt in Schritt 6.2.2.10 und berechnen eine pro Well Infektionsrate durch die Anzahl der infizierten Zellen Teilen (CellProfiler Anzeige: "Count_InfectedCells ") durch die Gesamtzahl der Zellen (CellProfiler Anzeige:". CountNuclei ") Wenn mehrere Standorte pro Vertiefung abgebildet wurden, zusammenfassen zunächst alle Standorte für jede Vertiefung, eine pro-gut Anzahl der infizierten Zellen zu bauen und eine pro-Well Gesamtzahl der Zellen.
      2. Um die bakterielle Belastung von infizierten Zellen zu quantifizieren, schätzen die durchschnittliche Fläche durch intrazelluläre Bakterien pro infizierten Zelle besetzt. Zu diesem Zweck teilen die integrierte Fläche aller intrazellulären Bakterien Überlappung mit Zellen (CellProfiler Anzeige: "AreaOccupied_AreaOccupied_TrueIntPathogenInCells") durch die Anzahl der infizierten Zellen auf dieser Seite. Um Artefakte Konto, verwenden Sie den Median aller Seiten dieser Anzeige als auch Auslese.
        Hinweis: Wenn dieser Test als Follow - up - Test verwendet wird , eine große Anzahl von Genen , die in Brucella - Infektion enthält, nicht Z - Score Normalisierung anwenden. Stattdessen führen die Normalisierung mit mock Brunnen als Referenz für die zu berücksichtigen Platte zu Platte Variation.

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Representative Results

1A zeigt ein Beispiel für die Bildanalyse verwendet , um automatisch infizierten Zellen in dem Endpunkt - Assay zu identifizieren. Kerne von HeLa-Zellen mit DAPI gefärbt wurden identifiziert, eine peri-Kern von 8 Pixeln Breite den Kern umgibt, und ein Voronoi Zellkörper durch Erweiterung des Kerns von 25 Pixeln berechnet. Da vor allem in der peri-Kernraum proliferieren Bakterien, ist die GFP Intensität in diesem Bereich der Zelle die stabilste Messung zwischen infizierten und nicht-infizierten Zellen zu unterscheiden. In einigen Fällen werden die Bakterien außerhalb des peri-Kern oder Overlay zu einem großen Teil mit dem Kern zu vermehren. Daher wurden diese zwei weitere Objekte auch für die Identifizierung von infizierten Zellen betrachtet. Segmentation als auch GFP Intensitätsmessungen wurden mit der Bildanalysesoftware CellProfiler 2 durchgeführt.

Brucella 3 Aktin - Umlagerungen für eine erfolgreiche Invasion von Wirtszellen. So Erschöpfung der Aktin-Umbildung Komponenten ist eine geeignete Positivkontrolle für die siRNA-Screening. Wir haben herausgefunden , dass siRNA - vermittelte Abreicherung von Arp2 / 3 - Komplex - Komponenten, die in einer Aktin - Polymerisation beteiligt sind, stark hemmt Brucella Infektion von HeLa - Zellen (nicht veröffentlichte Daten). Somit Zuschlags von ARPC3 wurde als positive Kontrolle verwendet. Wie in 1B zu sehen ist , Abreicherung von ARPC3 reduziert die Anzahl von Zellen, Bakterien , zwei Tage nach der Infektion zeigen proliferierenden. Anwendung des automatisierten Bildanalyse Pipeline auf diese Bilder erlaubt die Quantifizierung der beobachteten Effekt (Abbildung 1C). Die Daten, die hier gezeigt werden, stammen aus den Kontrollvertiefungen einer genomweiten siRNA-Bildschirm. Z Scoring wurde von Platte zu Platte Variationen zu berücksichtigen, angewandt.

2A veranschaulicht die iMage-Analyse verwendet infizierten Zellen zu identifizieren und die intrazelluläre Bakterienbelastung in der Eintritts Assay messen. Im Gegensatz zu dem Endpunkt-Assay verwendet der Eintrag Assay Bakterien Segmentierung und eine Voronoi Zellkörper als zelluläre Objekt. Nur wurde das GFP - Signal der intrazellulären Brucella zu Segment verwendet , um die Erreger in dieser Bildanalyse - Pipeline. Die intrazelluläre Bakterien wurden durch eine minimale Größe von 2 Pixeln und einer GFP Intensität definiert, die die dim GFP Hintergrund Intensität der extrazellulären Bakterien übersteigt. Es wurde eine Zelle infiziert angesehen, wenn mindestens ein intrazelluläres bakterielles Objekt mit seinen Voronoi Zellkörper überlappt. Weiterhin wurde die Bakterienlast geschätzt, indem die durchschnittliche Fläche von infizierten Zellen Berechnung, die durch intrazelluläre Bakterien bedeckt ist.

Wie für den Endpunkt - Assay zeigte Erschöpfung der ARPC3 eine Verringerung der Brucella - Infektion im Eingangstest im Vergleich zu mit einem con behandelten Zellentrol siRNA (2B). Quantifizierung des Infektionsrate bestätigt , dass die Anzahl der infizierten Zellen (2C) sowie die Anzahl der intrazellulären Bakterien in infizierten Zellen (2D) durch Depletion von ARPC3 reduziert wurde.

Abbildung 1
Abbildung 1: Analyse von HeLa - Zellen von B. infiziert abortus, die GFP in den Endpunkt - Assays (A) Endpunkt - Test:. Fluoreszenzbild zeigt ein Beispiel für den Endpunkt - Assays (grün = B. abortus, die GFP, blau = Kerne mit DAPI gefärbt, Maßstabsbalken = 50 & mgr; m). GFP B. exprimieren abortus durften HeLa - Zellen für 4 Stunden durch das Töten von extrazellulären Bakterien , die durch Gm gefolgt eingeben. Weitere Inkubation für 40 Stunden erlaubt Bakterien innerhalb HeLa-Zellen replizieren. Automatische Bild analysi s: A CellProfiler Pipeline-Segment DAPI gefärbt Kerne durch Berechnung des peri-Nukleus (nicht-überlappenden Ring aus 8 Pixeln umgibt den Kern) und Voronoi Zellkörper (nicht überlappenden radialen Ausdehnung des Kerns von 25 Pixel), gefolgt verwendet wurde, beide in rot dargestellt. Es wurde eine Zelle infiziert angesehen, wenn die integrierte GFP Intensität in mindestens einem Zellkompartiment (nucleus, peri-Kern, Voronoi Zellkörper), um den entsprechenden Schwellenwert überschritten hat. (B) Repräsentative Bilder von HeLa - Zellen mit B infiziert abortus, die GFP 44 Stunden nach der Infektion. Die Zellen wurden entweder transfiziert mit einem verschlüsselten (Nicht-Targeting) siRNA - Steuerung oder eine siRNA Targeting ARPC3. Maßstabsbalken = 50 & mgr; m. (C) Quantifizierung der Infektion von HeLa Zellen für ARPC3 abgereichert. Die Daten werden als Balkendiagramme dargestellt (bar = Mittelwert; Fehlerbalken = Standardfehler des Mittelwerts;; *** p <0,001; Mann-Whitney-Test; Z Normierung Score n = 7).es / ftp_upload / 54263 / 54263fig1large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2: Quantifizierung der Infektion von HeLa - Zellen von B. . abortus exprimieren TetR-GFP im Eingangstest (A) Eintrag Test: Fluoreszenzbild ein Beispiel für Eintrittstest (gelb = intrazelluläre B. abortus zeigt dsRed und GFP - Signal, rot = extrazelluläre B. abortus zeigt dsRed Signal, blau zeigt = Kerne mit DAPI gefärbt, Maßstabsbalken = 50 & mgr; m). B. abortus exprimierenden dsRed und TetR-GFP wurden erlaubt HeLa - Zellen für 4 Stunden durch das Töten von extrazellulären Bakterien und gleichzeitige Induktion von GFP in intrazellulären Bakterien mit ATc 4 h Automatische Bildanalyse folgt eingeben: a . CellProfiler Pipeline wurde verwendet , DAPI zu erkennenstained Kerne durch Berechnung eines Voronoi Zellkörpers, gefolgt von radialen Ausdehnung des Kerns um 25 Pixel (in weiß dargestellt). Bakterien wurden auf der Basis der GFP-Signal segmentiert. Es wurde eine Zelle infiziert angesehen, wenn seine Voronoi Zellkörper mit mindestens einem segmentierten Bakterien Objekt von ausreichender Größe und GFP Intensität überlappen. Die bakterielle Belastung in infizierten Zellen wird durch die Integration der Fläche aller segmentierten Bakterien Objekte mit ihren Voronoi Zellkörper dargestellt (Einheit = Pixel; NaN = keine Zahl in nicht-infizierten Zellen berechnet wird). (B) Beispielbilder zeigt , eine Abnahme der intrazellulären B. abortus in Zellen , transfiziert mit einer siRNA Targeting ARPC3 (durch die Anzahl der gelben Bakterien gezeigt) im Vergleich mit Zellen verwürfelten siRNA behandelt zu steuern. Die Anzahl der infizierten Zellen sowie die durchschnittliche Anzahl der intrazellulären Bakterien in infizierten Zellen wird auf ARPC3 reduziert niederschlagen. (C) Quantifizierung der Infektionsrate in HeLa - Zellen verarmtfür ARPC3. Die Daten sind dargestellt als Balkendiagramme (bar = Mittelwert; Normalisierung zu mock; Fehlerbalken = Standardfehler des Mittelwerts; * p <0,05; Mann-Whitney-Test; n = 4). (D) Quantifizierung der Bakterienlast von infizierten HeLa - Zellen für ARPC3 erschöpft. Die Daten werden als Balkendiagramme dargestellt (bar = Mittelwert; Normalisierung zu mock; Fehlerbalken = Standardfehler des Mittelwerts; * p <0,05; Mann-Whitney - Test; n = 4). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version davon zu sehen Zahl.

Supplemental Datei . 1: CP2 Pipeline - Shading - Korrektur Bitte hier klicken , um diese Datei herunterzuladen.

Supplemental File 2: CP2 Pipeline- Endpoint - Test. Bitte hier klicken , um diese Datei herunterzuladen.

Supplemental Datei . 3: CP2 Pipeline - Dieser Test Bitte hier klicken , um diese Datei herunterzuladen.

Supplemental Datei . 4: Beschreibung der Module Bitte hier klicken , um diese Datei herunterzuladen.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tryptic Soy Agar (TSA) BD 236950
Tryptic Soy Broth (TSB) Fluka 22092
Kanamycin sulfate Sigma-Aldrich 60615
Skim milk
250 ml screw cap bottle Corning 8396
DMEM Sigma-Aldrich D5796
Fetal Calf Serum (FCS) Gibco 10270 Heat-inactivated
Trypsin-EDTA (0.5%) Gibco 15400-054 10x stock solution, dilute 1:10 in PBS
Scepte 2.0 Cell Counter Merck Milipore PHCC20060 Alternative cell counting devices can be used
Greiner CELLSTAR 384-well plate Sigma-Aldrich M2062
Peelable aluminum foil Costar 6570
Reagent dispenser: "Multidrop 384 Reagent Dispenser" Thermo Scientific 5840150 Alternative reagent dispenser can be used.
Transfection reagent: "Lipofectamine RNAiMAX Invitrogen 13778-150
Automated plate washer: "Plate washer ELx50-16" BioTek ELX5016 This plate washer contains a 16-channel manifold suitable for 384-well plates. It fits into a biosafety cabinet and has a lid covering the plate during washing which reduces the risk of aerosol production. Alternative plate washers with similar features could be used.
Gentamicin Sigma-Aldrich G1397
Anhydrotetracycline hydrochloride Sigma-Aldrich 37919 100 μg/ml solution in 100% ethanol is kept at -20 °C protected from light in aluminum-foil
PBS Gibco 20012
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148 Dissolve in 0.2 M HEPES buffer, pH 7.4. Store at -20 °C and thaw freshly the day before use. Caution, PFA is toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed.
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Triton X-100 Sigma-Aldrich T9284
DAPI Roche 10236276001
Scrambled siRNA Dharmacon D-001810-10
Kif11 siRNA Dharmacon L-003317-00
ARPC3 siRNA Dharmacon L-005284-00
Brucella abortus 2308
pJC43 (apHT::GFP) Celli et al.12
pAC042.08 (apht::dsRed, tetO::tetR-GFP) Construction: pJC44 4 was digested with EcoRI followed by generation of blunt ends with Klenov enzyme and subsequent digestion with SalI. TetR-GFP was amplified from pNF106 using primer prAC090 and prAC092. Following digestion with SalI, the TetR-GFP product was ligated to the digested pJC44 vector.
Primer prAC090 Sigma-Aldrich TTT TTG AAT TCT GGC AAT TCC GAC GTC TAA GAA ACC
Primer prAC092 Sigma-Aldrich TTT TTG TCG ACT TTG TCC TAC TCA GGA GAG CGT TC
HeLa CCL-2 ATCC CCL-2
ImageXpress Micro Molecular Devices  IXM IMAGING MSCOPE Automated cellular imaging microscope equipped with a precision motorized Z-stage. Alternative systems for automated microscopy and alternative components for hard- and software specified below can be employed.
High-Speed Laser Auto-Focus Molecular Devices  1-2300-1037
CFI Super Fluor 10X objective Nikon  MRF00100 N.A 0.50, W.D 1.20 mm, DIC Prism: 10X, Spring loaded
Photometrics CoolSNAP HQ Monochrome CCD Camera Molecular Devices  1-2300-1060 1,392 x 1,040 imaging pixels, 6.45 x 6.45 µm pixels, 12 bits digitization
MetaXpress software Molecular Devices  9500-0100
LUI-Spectra-X-7 Lumencor SPECTRA X V-XXX-YZ Light engine. The following light sources are used: violet (DAPI), cyan (GFP), green/yellow (RFP)
Single Band Exciter for DAPI Semrock FF01-377/50-25
Single Band Emitter for DAPI Semrock FF02-447/60-25
Single Band Dichroic for DAPI Semrock FF409-Di03-25x36
Single Band Exciter for GFP Semrock FF02-472/30-25
Single Band Emitter for GFP Semrock FF01-520/35-25
Single Band Dichroic for GFP Semrock FF495-Di03-25x36
Single Band Exciter for RFP Semrock FF01-562/40-25
Single Band Emitter for RFP Semrock FF01-624/40-25
Single Band Dichroic for RFP Semrock FF593-Di03-25x36

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References

  1. Pappas, G., Papadimitriou, P., Akritidis, N., Christou, L., Tsianos, E. V. The new global map of human brucellosis. Lancet Infect Dis. 6, 91-99 (2006).
  2. Atluri, V. L., Xavier, M. N., de Jong, M. F., den Hartigh, A. B., Tsolis, R. E. Interactions of the human pathogenic Brucella species with their hosts. Annu Rev Microbiol. 65, 523-541 (2011).
  3. Guzman-Verri, C., et al. GTPases of the Rho subfamily are required for Brucella abortus internalization in nonprofessional phagocytes: direct activation of Cdc42. J Biol Chem. 276, 44435-44443 (2001).
  4. Starr, T., Ng, T. W., Wehrly, T. D., Knodler, L. A., Celli, J. Brucella intracellular replication requires trafficking through the late endosomal/lysosomal compartment. Traffic. 9, 678-694 (2008).
  5. Boschiroli, M. L., et al. The Brucella suis virB operon is induced intracellularly in macrophages. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 1544-1549 (2002).
  6. Celli, J., et al. Brucella evades macrophage killing via VirB-dependent sustained interactions with the endoplasmic reticulum. J Exp Med. 198, 545-556 (2003).
  7. Porte, F., Liautard, J. P., Kohler, S. Early acidification of phagosomes containing Brucella suis is essential for intracellular survival in murine macrophages. Infect Immun. 67, 4041-4047 (1999).
  8. Anderson, T. D., Cheville, N. F. Ultrastructural morphometric analysis of Brucella abortus-infected trophoblasts in experimental placentitis. Bacterial replication occurs in rough endoplasmic reticulum. Am J Pathol. 124, 226-237 (1986).
  9. Qin, Q. M., et al. RNAi screen of endoplasmic reticulum-associated host factors reveals a role for IRE1alpha in supporting Brucella replication. PLoS Pathog. 4, e1000110 (2008).
  10. Ramo, P., et al. Simultaneous analysis of large-scale RNAi screens for pathogen entry. BMC genomics. 15, 1162 (2014).
  11. Kuhbacher, A., Gouin, E., Cossart, P., Pizarro-Cerda, J. Imaging InlC secretion to investigate cellular infection by the bacterial pathogen Listeria monocytogenes. J Vis Exp. , e51043 (2013).
  12. Kentner, D., et al. Shigella reroutes host cell central metabolism to obtain high-flux nutrient supply for vigorous intracellular growth. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 9929-9934 (2014).
  13. Celli, J., Salcedo, S. P., Gorvel, J. P. Brucella coopts the small GTPase Sar1 for intracellular replication. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 1673-1678 (2005).
  14. von Bargen, K., Gorvel, J. P., Salcedo, S. P. Internal affairs: investigating the Brucella intracellular lifestyle. FEMS microbiology reviews. 36, 533-562 (2012).
  15. Kamentsky, L., et al. Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software. Bioinformatics. 27, 1179-1180 (2011).

Tags

Die Infektion Ausgabe 114 siRNA (small interfering RNA) RNAi (RNA-Interferenz) High-Content / Hochdurchsatz-Screening-Test automatisierte Bildanalyse Fluoreszenzmikroskopie Infektionsbiologie Zellbiologie, Intrazelluläre Erreger HeLa-Zellen Zellinvasion
Mikroskopie-basierte Assays für die Hochdurchsatz-Screening von Host beteiligten Faktoren in<em&gt; Brucella</em&gt; Die Infektion von HeLa-Zellen
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Casanova, A., Low, S. H.,… More

Casanova, A., Low, S. H., Emmenlauer, M., Conde-Alvarez, R., Salcedo, S. P., Gorvel, J. P., Dehio, C. Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells. J. Vis. Exp. (114), e54263, doi:10.3791/54263 (2016).

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