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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

होस्ट में शामिल कारक के उच्च throughput स्क्रीनिंग के लिए माइक्रोस्कोपी आधारित assays Published: August 5, 2016 doi: 10.3791/54263
Automatic Translation
*1, *1, *1,4, *1,3, 2, 2, 1
1Focal Area Infection Biology, Biozentrum, University of Basel, 2Centre d’Immunologie de Marseille-Luminy, Université de la Méditérannée UM2, INSERM U1104 CNRS UM7280, 3Departmento de Microbiologìa and Instituto de Salud Tropical, Universidad de Navarra, 4BioDataAnalysis GmbH
* These authors contributed equally

Abstract

ब्रूसिला प्रजातियों ऐच्छिक intracellular रोगज़नक़ों कि उनके प्राकृतिक मेजबान के रूप में जानवरों को संक्रमित कर रहे हैं। मनुष्य के लिए ट्रांसमिशन सबसे अधिक संक्रमित जानवरों के साथ सीधे संपर्क से या दूषित भोजन की घूस के कारण होता है और गंभीर क्रोनिक संक्रमण के लिए नेतृत्व कर सकते हैं।

ब्रूसिला पेशेवर और गैर-पेशेवर phagocytic कोशिकाओं पर आक्रमण और जालिका (ईआर) व्युत्पन्न रिक्तिकाएं भीतर प्रतिकृति कर सकते हैं। मेजबान ईआर-तरह के डिब्बे में मेजबान कोशिकाओं में प्रवेश ब्रूसिला, लाइसोसोमल गिरावट के परिहार, और नकल के लिए आवश्यक कारकों को काफी हद तक अनजान रहते हैं। यहाँ हम ब्रूसिला प्रवेश और हेला कोशिकाओं में प्रतिकृति में शामिल मेजबान कारकों की पहचान करने के लिए दो assays का वर्णन है। प्रोटोकॉल, शाही सेना के हस्तक्षेप के उपयोग का वर्णन करते हुए वैकल्पिक स्क्रीनिंग तरीकों से लागू किया जा सकता है। assays fluorescently लेबल बैक्टीरिया का पता लगाने में fluorescently लेबल मेजबान स्वचालित का उपयोग कोशिकाओं के आधार पर कर रहे हैंव्यापक क्षेत्र माइक्रोस्कोपी। फ्लोरोसेंट छवियों CellProfiler में एक मानकीकृत छवि विश्लेषण पाइपलाइन जो एकल कोशिका आधारित संक्रमण स्कोरिंग की अनुमति देता का उपयोग विश्लेषण कर रहे हैं।

समापन बिंदु परख में, intracellular प्रतिकृति दो दिनों के संक्रमण के बाद मापा जाता है। यह उनकी replicative आला जहां प्रसार जीवाणु प्रवेश। ब्रूसिला जो सफलतापूर्वक एक intracellular आला की स्थापना की है, इस प्रकार दृढ़ता से मेजबान कोशिकाओं के अंदर proliferated है जाएगा के बाद 12 घंटा के आसपास शुरू की है करने के लिए यातायात के लिए बैक्टीरिया की अनुमति देता है। चूंकि intracellular बैक्टीरिया बहुत व्यक्ति बाह्य या intracellular गैर replicative बैक्टीरिया की संख्या से बढ़ना होगा, एक तनाव अनिवार्यता से व्यक्त GFP इस्तेमाल किया जा सकता है। मजबूत GFP संकेत तो संक्रमित कोशिकाओं की पहचान करने के लिए प्रयोग किया जाता है।

इसके विपरीत, प्रवेश परख के लिए यह intracellular और बाह्य बैक्टीरिया के बीच अंतर करने के लिए आवश्यक है। इधर, एक टेट्रासाइक्लिन inducible GFP के लिए एक तनाव एन्कोडिंग प्रयोग किया जाता है। अधिष्ठापनजेंटामाइसिन द्वारा बाह्य बैक्टीरिया के एक साथ निष्क्रियता के साथ GFP के intracellular और बाह्य बैक्टीरिया GFP संकेत के आधार पर भेदभाव के बीच में सक्षम बनाता है, केवल intracellular बैक्टीरिया GFP व्यक्त करने के लिए सक्षम होने के साथ। यह एकल intracellular बैक्टीरिया का पता लगाने से पहले मजबूत intracellular प्रसार शुरू की है की अनुमति देता है।

Introduction

ब्रूसिला प्रजातियों ग्राम नकारात्मक, ऐच्छिक intracellular α-Proteobacteria के वर्ग से संबंधित रोगजनक हैं। वे इस तरह के मवेशी, बकरी, भेड़ या स्थानिक क्षेत्रों में गंभीर आर्थिक नुकसान में जिसके परिणामस्वरूप के रूप में गर्भपात और उनके प्राकृतिक मेजबान टीम में बांझपन का कारण है। ब्रूसिलोसिस सबसे महत्वपूर्ण जूनोटिक रोगों दुनिया भर में आधे से एक लाख नए मानव में संक्रमण प्रतिवर्ष 1 से अधिक के कारण से एक है। मानव के लिए ट्रांसमिशन सबसे अधिक ऐसे क्रीम दूध के रूप में संक्रमित जानवरों के साथ सीधे संपर्क से या दूषित भोजन की घूस के कारण होता है। ज्वर की बीमारी के लक्षण unspecific कर रहे हैं, जो ब्रूसीलोसिस का निदान करने में कठिनाइयों का कारण बनता है। अगर इलाज, रोगियों गठिया, अन्तर्हृद्शोथ, और न्यूरोपैथी 2 के रूप में और अधिक गंभीर लक्षणों के साथ एक पुराने संक्रमण विकसित कर सकते हैं।

सेलुलर स्तर पर ब्रूसिला phagocytic और गैर-phagocytic कोशिकाओं पर आक्रमण करने में सक्षम है और एक intracellular भीतर प्रतिकृतिब्रूसिला युक्त रिक्तिका (BCV) के रूप में जाना जाता डिब्बे। बैक्टीरिया के internalization आरएसी, रो, और Cdc42 3 के प्रत्यक्ष सक्रियण द्वारा actin cytoskeleton rearrangements की आवश्यकता है। यूकेरियोटिक मेजबान कोशिका के अंदर, BCV endocytic मार्ग के साथ traffics और लाइसोसोम के साथ बातचीत के बावजूद, बैक्टीरिया गिरावट 4 से बचने के लिए लेते हैं। Vesicular ATPase द्वारा BCV के अम्लीकरण बैक्टीरियल प्रकार चतुर्थ स्राव प्रणाली (T4SS) 5 की अभिव्यक्ति के लिए प्रेरित करने की आवश्यकता है। यह माना जाता है कि बैक्टीरियल T4SS द्वारा स्रावित प्रभावोत्पादक आवश्यक ब्रूसिला अपनी replicative आला स्थापित करने के लिए कर रहे हैं, T4SS 6 का विलोपन या vesicular ATPase नेतृत्व के निषेध intracellular आला 7 की स्थापना में दोष के बाद से। जीवाणु तक वे तस्करी के चरण के दौरान नहीं दोहराने एक ईआर व्युत्पन्न vacuolar डिब्बे 8 तक पहुँचने। एक बार जब intracellular प्रसार होता है, BCV सीएल में पाया जाता हैऐसे calnexin और ग्लूकोज-6-फॉस्फेट के रूप में 6 ईआर मार्कर के साथ OSE एसोसिएशन।

आणविक तंत्र है जिसके द्वारा ब्रूसिला में प्रवेश करती है कोशिकाओं, लाइसोसोमल गिरावट से बचा जाता है, और अंत में replicates एक ईआर-तरह के डिब्बे में काफी हद तक अनजान रहते हैं। संक्रमण के विभिन्न चरणों को होस्ट में शामिल कारक मुख्य रूप से लक्षित दृष्टिकोण या एक छोटे पैमाने पर छोटे दखल शाही सेना (siRNA) ड्रोसोफिला कोशिकाओं 9 में प्रदर्शन स्क्रीन के द्वारा पहचान की गई है। ये ब्रूसिला संक्रमण के दौरान अलग-अलग मेजबान कारकों के योगदान पर प्रकाश डाला है, लेकिन हम अभी भी पूरी प्रक्रिया के लिए एक व्यापक समझ से दूर हैं।

इधर, प्रोटोकॉल है कि बड़े पैमाने पर शाही सेना हस्तक्षेप (आरएनएआई) स्वचालित व्यापक क्षेत्र प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी और स्वचालित छवि विश्लेषण के साथ संयोजन में स्क्रीनिंग का उपयोग मानव मेजबान कारकों की पहचान की अनुमति प्रस्तुत कर रहे हैं। हेला कोशिकाओं की रिवर्स siRNA अभिकर्मक describ के रूप में किया जाता हैएड पहले 10,11 मामूली संशोधनों के साथ। समापन बिंदु परख निकास और पड़ोसी कोशिकाओं के संक्रमण को छोड़कर ब्रूसिला intracellular जीवन चक्र का एक बड़ा हिस्सा शामिल किया गया है। आगे हिट समापन बिंदु परख में पहचान की विशेषताएँ करने के लिए, संक्रमण के शुरुआती चरणों में शामिल कारकों की पहचान के लिए एक संशोधित प्रोटोकॉल प्रयोग किया जाता है।

एक ब्रूसिला abortus तनाव है कि अनिवार्यता से GFP व्यक्त समापन बिंदु परख जहां बैक्टीरिया दो दिनों के लिए कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए अनुमति दी जाती है के लिए प्रयोग किया जाता है। इस समय के दौरान, बैक्टीरिया ईआर व्युत्पन्न replicative आला करने के लिए कोशिकाओं, यातायात दर्ज करें, और पेरी परमाणु अंतरिक्ष में पेश करता है। GFP संकेत के उच्च स्तर पर तो मज़बूती से व्यक्ति की कोशिकाओं पर जो नकल बैक्टीरिया होते हैं पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

एक उच्च throughput परख में ब्रूसिला प्रविष्टि का अध्ययन करने के लिए, यह intracellular और बाह्य बैक्टीरिया के बीच भेद करने में सक्षम होना करने के लिए महत्वपूर्ण है। विधि यहाँ प्रस्तुत circumvintracellular और बाह्य बैक्टीरिया के दस्तावेजों अंतर एंटीबॉडी धुंधला। यह एक ब्रूसिला तनाव dsRed के विधान अभिव्यक्ति के साथ संयोजन में एक टेट्रासाइक्लिन inducible व्यक्त GFP पर आधारित है। एक विधान dsRed मार्कर की उपस्थिति सभी बैक्टीरिया है कि नमूने में मौजूद हैं की पहचान के लिए अनुमति देता है। GFP अभिव्यक्ति जेंटामाइसिन द्वारा गैर विषैले टेट्रासाइक्लिन अनुरूप anhydrotetracycline (एटीसी) एक साथ बाह्य बैक्टीरिया की निष्क्रियता के साथ के अलावा (जीएम) से प्रेरित है। जबकि सेल अभेद्य एंटीबायोटिक ग्राम कोशिकी जीवाणुओं को मारता है, एटीसी मेजबान कोशिका में प्रवेश और intracellular बैक्टीरिया में चुनिंदा GFP अभिव्यक्ति के लिए प्रेरित कर सकते हैं। इस दोहरी संवाददाता कोशिकी बैक्टीरिया (केवल DsRed संकेत) से एकल intracellular बैक्टीरिया (GFP और dsRed संकेत) के मजबूत जुदाई व्यापक क्षेत्र माइक्रोस्कोपी का उपयोग की अनुमति देता है। आदेश intracellular ब्रूसिला द्वारा detectable GFP अभिव्यक्ति तक पहुंचने के लिए हमने पाया है कि एटीसी से प्रेरण के 4 घंटा एक धर्म में यह परिणामसक्षम संकेत। इसी प्रेरण योजनाओं चुनिंदा intracellular बैक्टीरिया में GFP व्यक्त करने के लिए पहले से इस्तेमाल किया गया है intracellular शिगेला 12 अध्ययन करने के लिए।

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Protocol

नोट: लाइव ब्रूसिला abortus उपभेदों के साथ सभी काम एक जैव सुरक्षा स्तर 3 (BSL3) प्रयोगशाला सभी आवश्यक नियमों और सुरक्षा सावधानियों पर विचार के अंदर किया जाना चाहिए।

1. स्क्रीनिंग प्लेट्स की तैयारी और बैक्टीरिया और प्रकोष्ठों के संवर्धन

  1. ब्रूसिला abortus स्टार्टर संस्कृति की तैयारी
    1. स्ट्रीक ब्रूसिला abortus -80 डिग्री सेल्सियस दूध स्टॉक से 2308 (बी abortus) एक tryptic सोया अग्रवाल (टीएसए) 50 माइक्रोग्राम / एमएल केनामाइसिन (टीएसए / किमी) युक्त थाली पर। 37 डिग्री सेल्सियस पर 3-4 दिनों के लिए थाली सेते हैं। प्रवेश परख के लिए abortus 2308 pJC43 (apHT :: GFP) तनाव ब्रूसिला समापन बिंदु परख के लिए 13 और तनाव ब्रूसिला abortus pAC042.08 (apht :: dsRed, teto :: tetr GFP) का प्रयोग करें।
      नोट: ब्रूसिला abortus की चिकनी lipopolysaccharide (LPS) एक महत्वपूर्ण डाह निर्धारक है, लेकिन किसी न किसी म्यूटेंट अपेक्षाकृत उच्च आवृत्तियों 14 में हो सकता है। डब्ल्यूई इस प्रकार इस प्रयोग के साथ शुरू करने से पहले संस्कृति तनाव की स्थिति का परीक्षण सलाह देते हैं।
    2. चार टीएसए / किमी प्लेटों पर Restreak बैक्टीरिया पूरी थाली को कवर और 37 डिग्री सेल्सियस पर 2-3 दिनों के लिए सेते हैं।
    3. एक डिस्पोजेबल प्लास्टिक पाश, 10 मिलीलीटर 10% autoclaved स्किम दूध में हस्तांतरण और टीएसए / किमी प्लेटों से resuspend बैक्टीरिया का उपयोग करना। सुनिश्चित करें कि बैक्टीरिया अच्छी तरह से सभी स्टार्टर संस्कृतियों में लगातार बैक्टीरियल सांद्रता सुनिश्चित करने के लिए resuspended कर रहे हैं।
    4. अशेष 250 2 मिलीलीटर में जीवाणु निलंबन की μl -80 डिग्री सेल्सियस पर टोपी ट्यूब और फ्रीज पेंच।
    5. स्टार्टर संस्कृति के एक विभाज्य पिघलना और के साथ 25 μl, 50 μl, और बैक्टीरियल स्टार्टर संस्कृति 250 मिलीलीटर को अलग करने के लिए 100 μl हस्तांतरण टोपी बोतलें स्क्रू 50 मिलीलीटर tryptic सोया शोरबा (टीएसबी) युक्त 50 माइक्रोग्राम / एमएल केनामाइसिन (टीएसबी / किमी) । Parafilm के साथ बोतलें सील।
    6. 100 आरपीएम और 37 डिग्री सेल्सियस पर एक कक्षीय प्रकार के बरतन पर रात भर बोतलें सेते हैं।
    7. उपाय: 600 N पर ऑप्टिकल घनत्वमीटर (600 आयुध डिपो) स्टार्टर संस्कृति रातोंरात संस्कृति के बाद एक आयुध डिपो के 600 = 0.8-1.1 तक पहुंचने की आवश्यकता की मात्रा निर्धारित करने के लिए।
  2. हेला कक्ष की तैयारी
    1. Dulbecco में हेला कोशिकाओं को विकसित संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) 5% सीओ 2. 80% confluency करने के लिए कोशिकाओं को विकसित के साथ एक 37 डिग्री सेल्सियस नम इनक्यूबेटर में 10% भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस) (DMEM / 10% एफसीएस) के साथ पूरक।
  3. siRNAs के साथ स्क्रीनिंग प्लेटें तैयार।
    1. 0.32 सुक्ष्ममापी के अंतिम एकाग्रता के लिए RNase मुक्त पानी में siRNAs पतला। स्थानांतरण 5 μl / अच्छी तरह से करने के लिए काले स्पष्ट अच्छी तरह से फ्लैट नीचे 384 अच्छी तरह प्लेटें।
      1. कॉलम 1, 2, 23, और मानक नियंत्रण के लिए 24 का प्रयोग करें। नकारात्मक नियंत्रण के लिए, siRNAs (अभिकर्मक अभिकर्मक केवल) के बिना गैर लक्षित कर siRNA (तले हुए) और नकली कुओं का उपयोग करें। अभिकर्मक नियंत्रण के लिए, एक siRNA कि कोशिका मृत्यु लाती (KIF11), साथ ही ब्रूसिला संक्रमण (जैसे, ARPC3 में शामिल जाना जाता मेजबान कारकों के सकारात्मक नियंत्रण का उपयोगArp2 / 3 actin polymerization में शामिल जटिल) की एक घटक है। शेष कुओं के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध siRNA पुस्तकालयों या कस्टम siRNAs स्थानांतरण।
      2. peelable एल्यूमीनियम पन्नी के साथ सील प्लेटें। -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर प्लेटें।
        नोट: प्लेट्स निर्माता की सिफारिशों के आधार पर साल के लिए कम से कम 6 महीने के लिए और ऊपर -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।

2. रिवर्स siRNA अभिकर्मक

  1. कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए 300 XG पर centrifugation द्वारा एक काले रंग की 384 अच्छी तरह से थाली गला लें।
    नोट: यह नीचे सभी तरल जो ढक्कन या कुओं की ओर का पालन हो सकता है लाएगा।
  2. कमरे के तापमान पर बिना एफसीएस DMEM में 200: अभिकर्मक मध्यम अभिकर्मक अभिकर्मक 1 गिराए द्वारा तैयार करें। अभिकर्मक मध्यम 20 मिनट का उपयोग करने से पहले की तुलना में अब कोई तैयार करें। सावधानी से उपयोग करने से पहले समाधान मिश्रण।
  3. 25 प्रत्येक के लिए अभिकर्मक मध्यम μl जोड़े अच्छी तरह से एक अभिकर्मक की मशीन का उपयोग करऔर प्लेट के आगे और पीछे ले जाकर समाधान मिश्रण।
  4. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए थाली सेते siRNA / अभिकर्मक अभिकर्मक जटिल गठन की अनुमति है।
  5. इस बीच में, पीबीएस में 2.5 मिलीलीटर 0.05% trypsin EDTA (trypsin) के साथ एक बार एक 75 सेमी 2 कुप्पी के उप मिला हुआ कोशिकाओं धोने से हेला कोशिकाओं को तैयार।
  6. 1.5 मिलीलीटर ताजा trypsin जोड़ें और जब तक कोशिकाओं दौर में 2-3 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस के लिए कुप्पी हस्तांतरण।
  7. 10 मिलीलीटर पूर्व गर्म DMEM / 16% एफसीएस में कोशिकाओं Resuspend।
  8. एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग कोशिकाओं की गणना और DMEM / 16% एफसीएस में 10,000 कोशिकाओं / एमएल के एक सेल निलंबन तैयार करते हैं।
  9. प्रत्येक अच्छी तरह से अच्छी तरह / 500 कोशिकाओं में जिसके परिणामस्वरूप एक अभिकर्मक की मशीन का उपयोग करने के 50 μl सेल निलंबन जोड़ें।
  10. आगे और पीछे की कोशिकाओं का भी वितरण को प्राप्त करने की थाली ले जाएँ। 5-10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर थाली छोड़ दो कोशिकाओं बसने के लिए अनुमति देने के लिए।
  11. Parafilm के साथ प्लेट को सील करने और एक पूर्व गर्म एल्यूमीनियम पर 72 घंटे के लिए यह सेते5% सीओ 2 के साथ एक 37 डिग्री सेल्सियस नम इनक्यूबेटर में थाली।
    ध्यान दें: पूर्व गर्म एल्यूमिनियम प्लेट पूरे 384 अच्छी तरह से थाली भर में बराबर तापमान वितरण की अनुमति देता है।

3. संक्रमण और फिक्सेशन

  1. एक दिन पूर्व संक्रमण के, बी के 1.1.7 में निर्धारित राशि टीका लगाना 50 मिलीलीटर टीएसबी / किमी एक 250 मिलीलीटर में मध्यम में abortus स्टार्टर संस्कृति टोपी बोतल पेंच। Parafilm के साथ बोतल सील और 37 डिग्री सेल्सियस और एक कक्षीय प्रकार के बरतन पर 100 rpm पर रात भर बैक्टीरिया बढ़ने 600 = 0.8-1.1 ओवर ड्राफ्ट के लिए।
  2. जीवाणु संस्कृति के आयुध डिपो 600 उपाय और DMEM / 10% एफसीएस में जीवाणु संस्कृति गिराए संक्रमण के वांछित बहुलता (MOI) को प्राप्त करने से संक्रमण मध्यम तैयार करते हैं।
    नोट: हेला कोशिकाओं में 5-10% की एक संक्रमण की दर प्राप्त करने के लिए, 10,000 के MOI प्रयोग किया जाता है। एक MOI अनुमापन वक्र इष्टतम संक्रमण दर प्राप्त करने के लिए प्रत्येक कोशिका प्रकार के लिए किया जाना चाहिए।
  3. 384 अच्छी तरह से थाली के अभिकर्मक मध्यम विनिमयसंक्रमण माध्यम के 50 μl के साथ एक स्वचालित प्लेट वॉशर का उपयोग कर।
  4. 400 XG पर 384 अच्छी तरह से थाली अपकेंद्रित्र और 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस।
    नोट: यह संक्रमण प्रक्रिया सिंक्रनाइज़ करने के लिए मदद करता है।
  5. Parafilm के साथ थाली सील और यह 4 घंटे के लिए 5% सीओ 2 के साथ एक 37 डिग्री सेल्सियस नम इनक्यूबेटर में एक पूर्व गर्म एल्यूमिनियम प्लेट पर सेते हैं।
  6. DMEM / 10% 100 माइक्रोग्राम / एमएल ग्राम स्वचालित प्लेट वॉशर का उपयोग कर कोशिकी बैक्टीरिया को निष्क्रिय करने के लिए युक्त एफसीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें (200 μl / अच्छी तरह से ओवरफ्लो धोने का उपयोग करें)।
    नोट: एक अतिप्रवाह धोने के दौरान स्वचालित प्लेट वॉशर एक साथ dispenses और मध्यम रेस्पायरेट्रस।
  7. प्रवेश परख के लिए, कोशिकाओं DMEM / 10% 100 माइक्रोग्राम / एमएल जीएम और 100 एनजी / एमएल एटीसी युक्त स्वचालित प्लेट वॉशर का उपयोग कर एफसीएस साथ एक दूसरी बार (200 μl / अच्छी तरह से धोने का उपयोग अतिप्रवाह) धो लें।
  8. Parafilm के साथ प्लेट को सील करने और 37 डिग्री सेल्सियस नम इनक्यूबेटर में एक पूर्व गर्म एल्यूमिनियम प्लेट के लिए इसे वापस 5% सीओ 2 के साथ किसी अन्य के लिए40 घंटा या 4 घंटा, समापन बिंदु परख और प्रवेश परख, क्रमशः के लिए।
  9. निर्धारण के लिए, स्वचालित प्लेट वॉशर (200 μl / अच्छी तरह से धोने का उपयोग अतिप्रवाह) का उपयोग पीबीएस के साथ कुओं धो लें।
  10. पीएच 7.4 से 0.2 एम HEPES में 50 μl 3.7% paraformaldehyde (पीएफए) स्वचालित प्लेट वॉशर का उपयोग कर के साथ एक्सचेंज पीबीएस।
    नोट: सावधानी: पीएफए ​​साँस लेना द्वारा विषैला होता है, त्वचा के साथ संपर्क में है और अगर निगल लिया।
  11. कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए सेते हैं।
  12. स्वचालित प्लेट वॉशर का उपयोग कर 50 μl पीबीएस के साथ निर्धारण मध्यम विनिमय। नोट: नमूने अब BSL3 से बाहर ले जाया जा सकता है अगर जरूरत के लिए तैयार कर रहे हैं।
    सावधानी: एक BSL3 सुविधा से किसी भी नमूने का हटाया जाना जोखिम मूल्यांकन और प्रक्रिया के सत्यापन के अधीन है और जैव सुरक्षा के लिए लागू नियमों पर निर्भर करता है।

4. धुंधला

  1. कोशिकाओं 50 μl पीबीएस के साथ दो बार धोएं।
  2. 10 मिनट के लिए 50 μl 0.1% ट्राइटन X-100 पीबीएस में कोशिकाओं Permeabilize।
  3. डब्ल्यूराख कोशिकाओं पीबीएस के साथ तीन बार। 1 माइक्रोग्राम / एमएल DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole) युक्त पीबीएस के 20 μl जोड़ें और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए सेते हैं।
  4. पीबीएस में कोशिकाओं तीन बार धोएं और एक एल्यूमीनियम पन्नी के साथ प्रकाश से धुंधला की रक्षा करना।

5. इमेजिंग

  1. छवि अधिग्रहण के लिए स्वचालित व्यापक क्षेत्र माइक्रोस्कोप सेट करें।
    ध्यान दें: एक आण्विक डिवाइस ImageXpress MetaXpress सॉफ्टवेयर का उपयोग कर खुर्दबीन के लिए सेटिंग्स नीचे वर्णित हैं। उचित हार्डवेयर विशिष्टताओं और इमेजिंग सॉफ्टवेयर के साथ वैकल्पिक 2 डी व्यापक क्षेत्र माइक्रोस्कोपी उपकरणों (विवरण के लिए सामग्री / उपकरण की तालिका देखें) का इस्तेमाल किया जा सकता है।
    1. 10X उद्देश्य, कैमरा binning = 1, लाभ = 1 का चयन करें।
    2. 384 अच्छी तरह से थाली करने के लिए इसी थाली प्रारूप का चयन करें।
    3. अच्छी तरह से प्रति 9 साइटों मोल।
    4. का प्रयोग करें "लेजर आधारित फोकस सक्षम करें" और "थाली और अच्छी तरह से नीचे पर ध्यान दें"।
    5. सेट के लिए प्रारंभिक और साथ ही "सबसे पहले अच्छी तरह से"नमूना साइट ऑटोफोकस के लिए "सभी साइटों" खोजने और।
    6. मैन्युअल जेड ऑफसेट ध्यान देने के लिए स्थापित करने के लिए DAPI चैनल का प्रयोग करें।
    7. मैन्युअल जेड ऑफसेट अन्य सभी चैनलों के लिए DAPI से चुनें।
    8. स्वयं सभी चैनलों कम overexposure के साथ एक व्यापक गतिशील रेंज सुनिश्चित करने के लिए जोखिम समय सही है।
      1. ऑटो जोखिम समारोह का उपयोग कर एक प्रतिनिधि साइट की एक छवि मोल। प्लेट भर में 3-5 साइटों छवि के लिए इस समय जोखिम का प्रयोग करें और सभी साइटों पर जोखिम समय मैन्युअल अधिक से अधिक चमक के 80% समायोजित जब तक प्रतिभाशाली पिक्सल तक पहुँचने ~।
    9. छवि पूरी थाली समापन बिंदु परख के लिए DAPI और GFP चैनलों का उपयोग। प्रवेश परख के लिए इसके अलावा में आरएफपी चैनल का चयन करें।

6. स्वचालित छवि विश्लेषण

नोट: CellProfiler 2 15 खंड सेलुलर और बैक्टीरियल वस्तुओं के लिए छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के रूप में कार्यरत है और स्वचालित measur प्रदर्शनपहचान वस्तुओं के भीतर ements। सॉफ्टवेयर स्वचालित रूप से एक विशिष्ट छवि विश्लेषण कार्य करने के लिए, अलग-अलग मॉड्यूल है, जो एक पाइपलाइन कि मॉड्यूल सभी छवियों पर लगातार अमल करेंगे में जोड़ा जा सकता है में छवि विश्लेषण एल्गोरिदम प्रदान करता है। प्रोटोकॉल का पालन करने के लिए, CellProfiler 2.1.1 या एक नया संस्करण स्थापित करें। फिर, प्रदान की पाइप लाइन लोड और मॉड्यूल के भीतर आवश्यक मानकों को समायोजित करने के लिए नीचे दिए गए निर्देशों का पालन करें। सभी पाइपलाइनों के अलग-अलग मॉड्यूल का विवरण पूरक फ़ाइलों में पाया जा सकता है।

नोट: दो अलग पाइपलाइनों प्रत्येक परख के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। पहले पाइप लाइन एक छायांकन मॉडल है, जो विश्लेषण करने से पहले छवियों को सही करने के लिए दूसरा पाइप लाइन द्वारा प्रयोग किया जाता है खरीदते हैं। छायांकन सुधार छवियों के लिए लागू किया जाता है माइक्रोस्कोप से एक inhomogeneous प्रकाश पथ के प्रभाव को कम करने के लिए। पहले पाइप लाइन में छायांकन मॉडल कंप्यूटिंग एक लंबी प्रक्रिया है, लेकिन परिणाम उच्च सटीकता का हो जाएगा।

    <li> समापन बिंदु परख
    1. छायांकन मॉडल की गणना
      1. मेनू "फाइल" के पास जाओ, चुनें "आयात" → "फाइल से पाइप लाइन ...", और प्रदान की पाइपलाइन "BrucellaShadingCorrectionPart1-Ver007" का चयन करें। जब उनसे पूछा गया कि क्या, विरासत पाइप लाइन में परिवर्तित जवाब देने के लिए "परिवर्तित न करें"।
      2. "आउटपुट" → "देखें उत्पादन सेटिंग्स" के लिए जाओ और छवियों के साथ एक इनपुट फ़ोल्डर और जिसके परिणामस्वरूप छायांकन मॉडल के लिए एक आउटपुट फ़ोल्डर का चयन करें।
      3. मॉड्यूल (1) में "LoadImages" नाम की समायोजित छवि नाम मैच के लिए "पाठ कि इन छवियों को आम में है"।
      4. सुनिश्चित करें कि मॉड्यूल में से कोई भी मॉड्यूल के बगल में सब आंख प्रतीकों अनचेक करके पूरा विश्लेषण करने से पहले चल रहे उनके प्रदर्शन दिखा। नोट: यह काफी आवश्यक कम हो जाती है कम्प्यूटेशनल संसाधनों पाइपलाइन को संसाधित करते समय।
      5. प्रेस छायांकन मॉडल की गणना शुरू करने के लिए "छवियों का विश्लेषण"।
      6. भागो छवि विश्लेषण
        1. मेनू "फाइल" के पास जाओ, चुनें "आयात" → "फाइल से पाइप लाइन ...", और प्रदान की पाइपलाइन "BrucellaEndpointWithShadingCorrectionPart2-Ver007" का चयन करें। जब उनसे पूछा गया कि क्या, विरासत पाइप लाइन में परिवर्तित जवाब देने के लिए "परिवर्तित न करें"।
        2. "आउटपुट" → "देखें उत्पादन सेटिंग्स" के लिए जाओ और छवियों के साथ एक इनपुट फ़ोल्डर और जिसके परिणामस्वरूप स्प्रेडशीट के लिए एक आउटपुट फ़ोल्डर का चयन करें।
        3. मॉड्यूल में (1) "LoadImages", "पाठ कि इन छवियों को आम में है" छवि नाम से मेल करने के नाम पर समायोजित करें।
        4. मॉड्यूल (2) "LoadSingleImage" में, स्थान और दो छायांकन मॉडल की फ़ाइल नाम का चयन करके 6.1.1 के तहत की गणना छायांकन मॉडल लोड।
        5. मॉड्यूल (4) - (5) "ImageMath", पैरामीटर समायोजित माइक्रोस्कोप कैमरा की थोड़ी गहराई मिलान "द्वारा पहली छवि गुणा"। के लिए 8 और 16 बिटछवियों पैरामीटर सेट "1.0", करने के लिए 12 बिट छवियों पैरामीटर सेट करने के लिए "16.0"।
        6. मॉड्यूल में (9) "ImageMath" पैरामीटर समायोजित एक मूल्य (0.25 के साथ शुरू) कि नाभिक को दबाने के बिना DAPI धुंधला में ब्रूसिला संकेत दबाने होगा करने के लिए "द्वारा दूसरी छवि गुणा"।
          1. "प्रारंभ टेस्ट मोड" क्लिक करें, फिर थामने के प्रतीक और मॉड्यूल (9) के लिए प्रदर्शन समारोह मॉड्यूल की इसी माउस पर क्लिक करके सक्रिय करें।
            नोट: थामने के प्रतीक, पीले रंग में दिखाई देंगे जबकि आंख प्रतीक एक खुली आंख यदि सक्रिय दिखाएगा।
          2. ऊपर सक्रिय ठहराव प्रतीक के साथ (9) मॉड्यूल को चलाने के लिए विश्लेषण "भागो" पर क्लिक करें। मॉड्यूल, प्रेस "कदम" के लिए मूल्यों का परीक्षण करने के लिए।
          3. नव खोला छवि राइट क्लिक करें और "छवि विपरीत" "सामान्यीकृत लॉग ऑन" के लिए निर्धारित किया है। बार बार वापस मॉड्यूल के लिए कदम (9), पैरामीटर समायोजित "द्वारा दूसरी छवि गुणा", और टी पर कदमवह फिर मॉड्यूल, जब तक ब्रूसिला संकेत पूरी तरह से दबा दिया जाता है, जबकि एक ही समय में काले क्षेत्रों है कि अधिक घटाव का संकेत परिणाम छवि में कम कर रहे हैं।
        7. मॉड्यूल में (10) "IdentifyPrimaryObjects" पैरामीटर "लोअर दहलीज पर बाध्य" पर्याप्त उच्च (शून्य के साथ शुरू) इतना है कि नाभिक खंडित होते हैं और पृष्ठभूमि नजरअंदाज कर दिया है निर्धारित किया है।
          1. मॉड्यूल पर मॉड्यूल (10), कदम के लिए एक अच्छा मूल्य की पहचान के रूप में और कदम 6.1.2.6.1 और 6.1.2.6.2 में समझाया इनपुट छवि प्रदर्शित करने के लिए।
          2. इनपुट छवि पर राइट क्लिक करें और हिस्टोग्राम प्रदर्शित करते हैं।
            नोट: हिस्टोग्राम के शिखर आम तौर पर पृष्ठभूमि इंगित करता है।
          3. पृष्ठभूमि तीव्रता से शुरू पैरामीटर जब तक नाभिक का एक अच्छा विभाजन के रूप में उत्पादन छवि में दिखाया हासिल की है वृद्धि हुई है।
            नोट: स्थापना दहलीज पृष्ठभूमि तीव्रता की तुलना में अधिक खाली साइटों के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है।
        8. मॉड्यूल में (15)4; FilterObjects न्यूनतम मूल्य "", पैरामीटर समायोजित "इतना है कि नाभिक में स्पष्ट रूप से दिखाई ब्रूसिला के साथ कोशिकाओं को रखा जाता है, और सभी अन्य लोगों को दूर छान रहे हैं इस चरण में, नाभिक के बाहर ब्रूसिला उपेक्षा।।
          1. एक अच्छा मूल्य, मॉड्यूल पर कदम की पहचान के रूप में और कदम 6.1.2.6.1 और 6.1.2.6.2 में समझाया उत्पादन छवि प्रदर्शित करने के लिए। शून्य है, जो सभी कोशिकाओं के रूप में संक्रमित पहचानती से प्रारंभ करें, और केवल नाभिक में स्पष्ट रूप से दिखाई ब्रूसिला के साथ कोशिकाओं को रखा जाता है जब तक छोटे कदमों से मूल्य वृद्धि हुई है।
        9. मॉड्यूल (16) "FilterObjects" में, पैरामीटर "न्यूनतम मूल्य" समायोजित इतना है कि perinucleus पर स्पष्ट रूप से दिखाई ब्रूसिला के साथ कोशिकाओं को रखा जाता है, और अन्य सभी कोशिकाओं को दूर छान रहे हैं। पिछले मॉड्यूल में के रूप में एक समान दृष्टिकोण का प्रयोग करें।
        10. मॉड्यूल (17) "FilterObjects" में, पैरामीटर "न्यूनतम मूल्य" समायोजित इतना है कि Vor पर स्पष्ट रूप से दिखाई ब्रूसिला के साथ कोशिकाओंonoi सेल शरीर रखा जाता है, और अन्य सभी कोशिकाओं को दूर छान रहे हैं। पिछले मॉड्यूल में के रूप में एक समान दृष्टिकोण का प्रयोग करें।
          नोट: Voronoi सेल शरीर एक रेडियल पड़ोसी Voronoi सेल शरीर के साथ कोई ओवरलैप के साथ 25 पिक्सल द्वारा नाभिक का विस्तार है।
        11. परीक्षण मोड से बाहर निकलें और सुनिश्चित करें कि मॉड्यूल में से कोई भी मॉड्यूल के बगल में सब आंख प्रतीकों अनचेक करके पूरा विश्लेषण करने से पहले चल रहे उनके प्रदर्शन दिखा।
          नोट: यह काफी आवश्यक कम हो जाती है कम्प्यूटेशनल संसाधनों पाइपलाइन को संसाधित करते समय।
        12. प्रेस विश्लेषण शुरू करने के लिए "छवियों का विश्लेषण"।
        13. जब विश्लेषण खत्म हो गया है, यह सुनिश्चित करने के लिए कि विश्लेषण प्लेट भर में मज़बूती से काम किया है, जिसके परिणामस्वरूप PNG छवियों के साथ ही सीएसवी चादर का निरीक्षण किया।
    2. एंट्री परख
      1. छायांकन मॉडल की गणना
        1. मेनू "फाइल" के पास जाओ, चुनें "आयात" → "फाइल से पाइप लाइन ...", और उपलब्ध कराने का चयनडी पाइपलाइन "BrucellaShadingCorrectionPart1-Ver007"। जब उनसे पूछा गया कि क्या, विरासत पाइप लाइन में परिवर्तित जवाब देने के लिए "परिवर्तित न करें"।
        2. "आउटपुट" → "देखें उत्पादन सेटिंग्स" के लिए जाओ और छवियों के साथ एक इनपुट फ़ोल्डर और जिसके परिणामस्वरूप छायांकन मॉडल के लिए एक आउटपुट फ़ोल्डर का चयन करें।
        3. मॉड्यूल में (1) "LoadImages", "पाठ कि इन छवियों को आम में है" छवि नाम से मेल करने के नाम पर समायोजित करें।
        4. सुनिश्चित करें कि मॉड्यूल में से कोई भी मॉड्यूल के बगल में सब आंख प्रतीकों अनचेक करके पूरा विश्लेषण करने से पहले चल रहे उनके प्रदर्शन दिखा।
          नोट: यह काफी आवश्यक कम हो जाती है कम्प्यूटेशनल संसाधनों पाइपलाइन को संसाधित करते समय।
        5. प्रेस छायांकन मॉडल की गणना शुरू करने के लिए "छवियों का विश्लेषण"।
      2. भागो छवि विश्लेषण
        1. मेनू "फाइल" के पास जाओ, चुनें "आयात" → "फाइल से पाइप लाइन ...", और प्रदान करता चयनएड पाइपलाइन "BrucellaEntryWithShadingCorrectionPart2-Ver007"। जब उनसे पूछा गया कि क्या, विरासत पाइप लाइन में परिवर्तित जवाब देने के लिए "परिवर्तित न करें"।
        2. "आउटपुट" → "देखें उत्पादन सेटिंग्स" के लिए जाओ और छवियों के साथ एक इनपुट फ़ोल्डर और जिसके परिणामस्वरूप स्प्रेडशीट के लिए एक आउटपुट फ़ोल्डर का चयन करें।
        3. मॉड्यूल में (1) "LoadImages", "पाठ कि इन छवियों को आम में है" छवि नाम से मेल करने के नाम पर समायोजित करें।
        4. मॉड्यूल (2) "LoadSingleImage" में, स्थान और दो छायांकन मॉडल की फ़ाइल नाम का चयन करके 6.2.1 के तहत की गणना छायांकन मॉडल लोड।
        5. मॉड्यूल (4) - (5) "ImageMath", पैरामीटर समायोजित माइक्रोस्कोप कैमरा की थोड़ी गहराई मिलान "द्वारा पहली छवि गुणा"। 8 और 16 बिट छवियों 12 बिट छवियों के लिए पैरामीटर के लिए "1.0", सेट के लिए करने के लिए "16.0" पैरामीटर निर्धारित किया है।
        6. मॉड्यूल में (6) "IdentifyPrimaryObjects" पैरामीटर "लो सेटwer दहलीज पर "पर्याप्त उच्च बाध्य है कि केवल नाभिक खंडित होते हैं और पृष्ठभूमि नजरअंदाज कर दिया है।
          1. मॉड्यूल (6), मॉड्यूल पर कदम के लिए एक अच्छा मूल्य की पहचान के रूप में और कदम 6.1.2.6.1 और 6.1.2.6.2 में समझाया इनपुट छवि प्रदर्शित करने के लिए।
          2. इनपुट छवि पर राइट क्लिक करें और हिस्टोग्राम प्रदर्शित करते हैं।
            नोट: हिस्टोग्राम के शिखर आम तौर पर पृष्ठभूमि इंगित करता है।
          3. पृष्ठभूमि तीव्रता से शुरू पैरामीटर जब तक नाभिक का एक अच्छा विभाजन के रूप में उत्पादन छवि में दिखाया हासिल की है वृद्धि हुई है।
            नोट: पृष्ठभूमि के ऊपर सीमा की स्थापना खाली साइटों के लिए महत्वपूर्ण है।
        7. मॉड्यूल में (8) "IdentifyPrimaryObjects" पैरामीटर "लोअर दहलीज पर बाध्य" पर्याप्त उच्च सेट है कि केवल ब्रूसिला खंडित होते हैं और पृष्ठभूमि नजरअंदाज कर दिया है।
          1. मॉड्यूल (8), मॉड्यूल पर कदम के लिए एक अच्छा मूल्य की पहचान के रूप में और कदम 6.1.2.6.1 और 6.1.2.6.2 में समझाया इनपुट छवि प्रदर्शित करने के लिए।
          2. इनपुट छवि पर राइट क्लिक करें और हिस्टोग्राम प्रदर्शित करते हैं।
            नोट: हिस्टोग्राम के शिखर आम तौर पर पृष्ठभूमि इंगित करता है।
          3. पृष्ठभूमि तीव्रता से शुरू पैरामीटर जब तक उत्पादन छवि में दिखाया गया के रूप में ब्रूसिला की भलाई के विभाजन से हासिल की है वृद्धि हुई है।
            नोट: पृष्ठभूमि के ऊपर सीमा की स्थापना खाली साइटों के लिए महत्वपूर्ण है।
        8. मॉड्यूल (11) "FilterObjects" में, पैरामीटर "न्यूनतम मूल्य" इतना है कि पृष्ठभूमि और कलाकृतियों दूर छान रहे हैं, और केवल ब्रूसिला कालोनियों रखा जाता है समायोजित करें।
          1. एक अच्छा मूल्य, मॉड्यूल पर कदम की पहचान के रूप में और कदम 6.1.2.6.1 और 6.1.2.6.2 में समझाया उत्पादन छवि प्रदर्शित करने के लिए। 6.2.2.7 और चरणबद्ध में चयनित मूल्य के साथ शुरू यह वृद्धि जब तक केवल ब्रूसिला वस्तुओं रखा जाता है।
        9. परीक्षण मोड से बाहर निकलें और उस मॉड्यूल से कोई भी उनके प्रदर्शन दिखाने के लिए सुनिश्चित करें unche द्वारा पूरा विश्लेषण करने से पहले चल रहा हैमॉड्यूल के बगल में सब आंख प्रतीकों cking।
          नोट: यह काफी आवश्यक कम हो जाती है कम्प्यूटेशनल संसाधनों पाइपलाइन को संसाधित करते समय।
        10. प्रेस विश्लेषण शुरू करने के लिए "छवियों का विश्लेषण"।
        11. जब विश्लेषण खत्म हो गया है, यह सुनिश्चित करने के लिए कि विश्लेषण प्लेट भर में अच्छी तरह से काम किया है, जिसके परिणामस्वरूप PNG छवियों के साथ ही सीएसवी चादर का निरीक्षण किया।

    7. संक्रमण स्कोरिंग

    नोट: siRNAs जो सेल व्यवहार्यता पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है सावधानी के साथ विचार किया जाना है, के बाद से इस झूठी सकारात्मक खोजों को बढ़ावा देने के कर सकते हैं। एक बदल सेल नंबर वास्तविक MOI को प्रभावित करता है और आवश्यक जीन का निशाना बना रोगज़नक़ संक्रमण पर pleiotropic प्रभाव हो सकता है। SiRNAs द्वारा अधूरा कमी आवश्यक जीन के अध्ययन के लिए अनुमति देता है, इस तरह के लक्ष्यों को वैकल्पिक तरीकों (जैसे, दवा हस्तक्षेप) मेजबान कारकों के रूप में उनकी भूमिका की पुष्टि करने से मान्य किया जा करने के लिए हैसंक्रमण के दौरान।

    1. समापन बिंदु परख
      1. कदम 6.1.2.12 में उत्पन्न सीएसवी चादर खोलें और संक्रमित कोशिकाओं की संख्या (CellProfiler पढ़ा गया: "Count_InfectedCells") को विभाजित करके अच्छी तरह से प्रति संक्रमण की दर एक गणना कोशिकाओं की कुल संख्या (: "CountNuclei" CellProfiler readout) द्वारा। अच्छी तरह से प्रति कई साइटों imaged किया गया है, तो पहले प्रत्येक के लिए सभी साइटों को अच्छी तरह संक्षेप में, संक्रमित कोशिकाओं की एक प्रति अच्छी तरह से संख्या और एक प्रति अच्छी तरह से कोशिकाओं की कुल संख्या का निर्माण करने के लिए।
      2. प्लेट से प्लेट बदलाव के लिए खाते में करने के लिए अगर प्लेटों पर्याप्त गैर मारा siRNAs शामिल जेड स्कोरिंग सामान्यीकरण प्रदर्शन करना। प्लेट प्रति गैर हिट siRNAs की एक पर्याप्त संख्या में मान लें, तो पूर्ण पुस्तकालयों जांच कर रहे हैं।
        1 समीकरण
    2. एंट्री परख
      1. "Count_InfectedCe: चरण 6.2.2.10 में उत्पन्न सीएसवी चादर खोलें और संक्रमित कोशिकाओं की संख्या से विभाजित करके अच्छी तरह से प्रति संक्रमण की दर एक गणना (CellProfiler readoutlls ") कोशिकाओं की कुल संख्या से (CellProfiler पढ़ा गया:"। CountNuclei ") प्रति अच्छी तरह से कई साइटों imaged किया गया है, तो पहले प्रत्येक के लिए सभी साइटों को अच्छी तरह संक्षेप में, संक्रमित कोशिकाओं की एक प्रति अच्छी तरह से संख्या और निर्माण करने के लिए एक प्रति अच्छी तरह से कोशिकाओं की कुल संख्या।
      2. संक्रमित कोशिकाओं के जीवाणु लोड यों, संक्रमित कोशिका प्रति intracellular बैक्टीरिया के कब्जे में औसत क्षेत्र का अनुमान है। इस साइट में संक्रमित कोशिकाओं की संख्या से: यह अंत करने के लिए, सभी intracellular बैक्टीरिया कोशिकाओं के साथ ओवरलैपिंग के एकीकृत क्षेत्र ( "AreaOccupied_AreaOccupied_TrueIntPathogenInCells" CellProfiler readout) विभाजित। कलाकृतियों के लिए खाते में करने के लिए, अच्छी तरह से readout के रूप में इस readout की सभी साइटों के औसत का उपयोग करें।
        नोट: इस परख एक परख ब्रूसिला संक्रमण में शामिल जीनों की एक बड़ी संख्या वाले अनुवर्ती कार्रवाई के रूप में इस्तेमाल किया जाता है, जेड स्कोर सामान्य बनाने के लिए लागू नहीं है। इसके बजाय, एक संदर्भ के रूप में नकली कुओं का उपयोग कर प्लेट से प्लेट बदलाव के लिए खाते में सामान्य बनाने प्रदर्शन करते हैं।

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Representative Results

चित्रा 1 ए स्वचालित रूप से समापन बिंदु परख में संक्रमित कोशिकाओं की पहचान करने के लिए इस्तेमाल छवि विश्लेषण का एक उदाहरण दिखाता है। DAPI के साथ दाग हेला कोशिकाओं के नाभिक की पहचान की गई, 8 पिक्सल चौड़ाई का एक पेरी नाभिक नाभिक के आस-पास, और एक Voronoi सेल शरीर 25 पिक्सल द्वारा नाभिक के विस्तार से गणना की गई। चूंकि बैक्टीरिया मुख्य रूप से पेरी परमाणु अंतरिक्ष में पैदा करना, सेल के इस क्षेत्र में GFP तीव्रता संक्रमित और गैर संक्रमित कोशिकाओं के बीच भेदभाव करने के लिए सबसे मजबूत माप है। कुछ मामलों में, बैक्टीरिया नाभिक के साथ एक बड़ी हद तक पेरी नाभिक या ओवरले के बाहर पैदा करने के लिए पाए जाते हैं। इसलिए, इन दो अतिरिक्त वस्तुओं को भी संक्रमित कोशिकाओं की पहचान के लिए विचार किया गया। विभाजन के साथ ही GFP तीव्रता माप छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर CellProfiler 2 के साथ प्रदर्शन किया गया।

ब्रूसिला 3 के सफल आक्रमण के लिए actin rearrangements की आवश्यकता है। इस प्रकार, actin remodeling घटकों की कमी siRNA स्क्रीनिंग के लिए एक उपयुक्त सकारात्मक नियंत्रण है। हमने पाया है कि Arp2 / 3 जटिल घटक है, जो actin polymerization में शामिल हैं के siRNA मध्यस्थता कमी, दृढ़ता से हेला कोशिकाओं के ब्रूसिला संक्रमण (अप्रकाशित डेटा) को रोकता है। इस प्रकार, ARPC3 की पछाड़ना एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था। के रूप में चित्रा 1 बी में देखा, ARPC3 की कमी कोशिकाओं है कि बैक्टीरिया के संक्रमण के बाद दो दिन proliferating शो की संख्या कम हो। इन छवियों को स्वचालित छवि विश्लेषण पाइपलाइन को लागू करने मनाया प्रभाव (चित्रा 1 सी) की मात्रा का ठहराव की अनुमति दी। डेटा जो यहाँ दिखाए जाते हैं एक जीनोम चौड़ा siRNA स्क्रीन के नियंत्रण कुओं से उत्पन्न। जेड स्कोरिंग प्लेट से प्लेट बदलाव के लिए खाते में करने के लिए लागू किया गया था।

चित्रा 2A मैं दिखाता हैदाना विश्लेषण संक्रमित कोशिकाओं की पहचान और परख प्रविष्टि में intracellular बैक्टीरियल लोड को मापने के लिए इस्तेमाल किया। समापन बिंदु परख के विपरीत, प्रवेश परख बैक्टीरियल विभाजन और सेलुलर वस्तु के रूप में एक Voronoi सेल शरीर का उपयोग करता है। केवल intracellular ब्रूसिला की GFP संकेत खंड के लिए इस छवि विश्लेषण पाइप लाइन में रोगज़नक़ इस्तेमाल किया गया था। Intracellular बैक्टीरिया 2 पिक्सल की एक न्यूनतम आकार और एक GFP तीव्रता जो बाह्य बैक्टीरिया के मंद GFP पृष्ठभूमि तीव्रता से अधिक से परिभाषित किया गया। एक सेल संक्रमित माना जाता था, तो कम से कम एक intracellular बैक्टीरियल वस्तु अपने Voronoi सेल शरीर के साथ छा। इसके अलावा, बैक्टीरियल लोड संक्रमित कोशिकाओं है कि intracellular जीवाणुओं द्वारा कवर किया जाता है की औसत क्षेत्र की गणना के द्वारा अनुमान लगाया गया था।

समापन बिंदु परख के लिए के रूप में, ARPC3 की कमी एक चोर के साथ इलाज किया कोशिकाओं की तुलना में प्रवेश परख में ब्रूसिला संक्रमण में कमी देखी गईtrol siRNA (चित्रा 2 बी)। संक्रमण की दर की मात्रा की पुष्टि की है कि संक्रमित कोशिकाओं (चित्रा 2 सी) के साथ ही संक्रमित कोशिकाओं (चित्रा 2 डी) में intracellular बैक्टीरिया की संख्या की संख्या ARPC3 की कमी की कमी थी।

आकृति 1
चित्रा 1: हेला कोशिकाओं का विश्लेषण बी से संक्रमित abortus समापन बिंदु परख में व्यक्त GFP (ए) समापन बिंदु परख:। प्रतिदीप्ति छवि समापन बिंदु परख (हरी = बी GFP, नीले = DAPI, स्केल बार = 50 माइक्रोन के साथ दाग नाभिक व्यक्त abortus) का एक उदाहरण दिखा। GFP बी व्यक्त abortus 4 घंटा जीएम द्वारा बाह्य बैक्टीरिया की हत्या कर दी लिए हेला कोशिकाओं में प्रवेश करने की अनुमति दी गई। 40 घंटा अनुमति बैक्टीरिया के लिए आगे ऊष्मायन हेला कोशिकाओं के अंदर दोहराने के लिए। स्वचालित छवि विश्लेषण करने S: एक CellProfiler पाइप लाइन खंड DAPI दाग नाभिक पेरी नाभिक की गणना के द्वारा पीछा करने के लिए इस्तेमाल किया गया था (गैर अतिव्यापी 8 नाभिक आसपास के पिक्सल की अंगूठी) और Voronoi सेल शरीर (गैर अतिव्यापी 25 पिक्सल द्वारा नाभिक के रेडियल विस्तार), दोनों लाल रंग में दिखाया गया है। एक सेल संक्रमित माना जाता था, तो कम से कम एक सेलुलर डिब्बे (नाभिक, पेरी नाभिक, Voronoi सेल शरीर) में एकीकृत GFP तीव्रता इसी सीमा पार हो गई। (बी) बी से संक्रमित हेला कोशिकाओं के प्रतिनिधि छवियाँ abortus संक्रमण के बाद GFP 44 मानव संसाधन व्यक्त। प्रकोष्ठों या तो एक तले (गैर लक्षित कर) siRNA नियंत्रण या एक siRNA को निशाना ARPC3 साथ ट्रांसफ़ेक्ट थे। स्केल बार 50 माइक्रोन =। (सी) ARPC3 के लिए समाप्त हो हेला कोशिकाओं के संक्रमण की मात्रा। डेटा बार रेखांकन के रूप में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं (; जेड सामान्य बनाने के स्कोर; त्रुटि सलाखों = मतलब की मानक त्रुटि; बार = मतलब *** पी <0.001; मान व्हिटनी परीक्षण, n = 7)।es / ftp_upload / 54263 / 54263fig1large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: बी से हेला कोशिकाओं के संक्रमण की मात्रा । abortus प्रविष्टि परख में tetr-व्यक्त GFP (ए) एंट्री परख: प्रतिदीप्ति छवि प्रविष्टि परख का एक उदाहरण (पीला = intracellular बी दिखा dsRed और GFP संकेत, लाल = बाह्य बी दिखा dsRed संकेत दिखा abortus abortus, नीले = नाभिक DAPI, स्केल बार = 50 माइक्रोन) के साथ दाग। बी abortus dsRed और tetr-GFP व्यक्त 4 घंटा कोशिकी बैक्टीरिया और 4 घंटे के लिए एटीसी से intracellular बैक्टीरिया में GFP के एक साथ प्रेरण की हत्या कर दी लिए हेला कोशिकाओं में प्रवेश करने की अनुमति दी गई स्वचालित छवि विश्लेषण: क। CellProfiler पाइपलाइन DAPI पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया थासना हुआ 25 पिक्सल द्वारा नाभिक के रेडियल विस्तार के द्वारा एक Voronoi सेल शरीर की गणना के द्वारा पीछा नाभिक (सफेद में दिखाया गया है)। जीवाणु GFP संकेत के आधार पर खंडित किया गया। एक सेल संक्रमित माना जाता था, तो इसकी Voronoi सेल शरीर पर्याप्त आकार और GFP तीव्रता का कम से कम एक खंडों बैक्टीरियल वस्तु के साथ छा। संक्रमित कोशिकाओं में बैक्टीरियल लोड इसकी Voronoi सेल शरीर के साथ सभी खंडों बैक्टीरियल वस्तुओं के क्षेत्र के एकीकरण से यह साफ है (यूनिट = पिक्सल; NaN = नहीं नंबर गैर संक्रमित कोशिकाओं में गणना की जाती है)। (बी) के उदाहरण छवियों intracellular बी की कमी को दर्शाता हुआ abortus एक siRNA को निशाना ARPC3 साथ ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं में (पीला जीवाणुओं की संख्या से दिखाया गया है) तले siRNA साथ इलाज किया कोशिकाओं को नियंत्रित करने की तुलना में। संक्रमित कोशिकाओं की संख्या के साथ ही संक्रमित कोशिकाओं में intracellular बैक्टीरिया की औसत संख्या ARPC3 पर कम हो जाता है नीचे दस्तक। हेला कोशिकाओं में संक्रमण की दर से (सी) मात्रा समाप्तARPC3 के लिए। डेटा बार रेखांकन के रूप में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं (; नकली को सामान्य बनाने, त्रुटि सलाखों = मतलब की मानक त्रुटि; बार = मतलब * पी <0.05, मान व्हिटनी परीक्षण; एन = 4)। (डी) ARPC3 के लिए समाप्त हो संक्रमित हेला कोशिकाओं के जीवाणु लोड की मात्रा। डेटा बार रेखांकन के रूप में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं (; नकली को सामान्य बनाने, त्रुटि सलाखों = मतलब की मानक त्रुटि, * पी ​​<0.05, मान व्हिटनी परीक्षण; बार = मतलब एन = 4)। यहाँ इस बात का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें चित्रा।

पूरक फ़ाइल 1:। CP2 पाइपलाइन - छायांकन सुधार इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक फ़ाइल 2: CP2 पाइपलाइन- समापन बिंदु परख। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक फ़ाइल 3:। CP2 पाइपलाइन - प्रवेश परख इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक फ़ाइल 4:। मॉड्यूल का विवरण इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tryptic Soy Agar (TSA) BD 236950
Tryptic Soy Broth (TSB) Fluka 22092
Kanamycin sulfate Sigma-Aldrich 60615
Skim milk
250 ml screw cap bottle Corning 8396
DMEM Sigma-Aldrich D5796
Fetal Calf Serum (FCS) Gibco 10270 Heat-inactivated
Trypsin-EDTA (0.5%) Gibco 15400-054 10x stock solution, dilute 1:10 in PBS
Scepte 2.0 Cell Counter Merck Milipore PHCC20060 Alternative cell counting devices can be used
Greiner CELLSTAR 384-well plate Sigma-Aldrich M2062
Peelable aluminum foil Costar 6570
Reagent dispenser: "Multidrop 384 Reagent Dispenser" Thermo Scientific 5840150 Alternative reagent dispenser can be used.
Transfection reagent: "Lipofectamine RNAiMAX Invitrogen 13778-150
Automated plate washer: "Plate washer ELx50-16" BioTek ELX5016 This plate washer contains a 16-channel manifold suitable for 384-well plates. It fits into a biosafety cabinet and has a lid covering the plate during washing which reduces the risk of aerosol production. Alternative plate washers with similar features could be used.
Gentamicin Sigma-Aldrich G1397
Anhydrotetracycline hydrochloride Sigma-Aldrich 37919 100 μg/ml solution in 100% ethanol is kept at -20 °C protected from light in aluminum-foil
PBS Gibco 20012
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148 Dissolve in 0.2 M HEPES buffer, pH 7.4. Store at -20 °C and thaw freshly the day before use. Caution, PFA is toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed.
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Triton X-100 Sigma-Aldrich T9284
DAPI Roche 10236276001
Scrambled siRNA Dharmacon D-001810-10
Kif11 siRNA Dharmacon L-003317-00
ARPC3 siRNA Dharmacon L-005284-00
Brucella abortus 2308
pJC43 (apHT::GFP) Celli et al.12
pAC042.08 (apht::dsRed, tetO::tetR-GFP) Construction: pJC44 4 was digested with EcoRI followed by generation of blunt ends with Klenov enzyme and subsequent digestion with SalI. TetR-GFP was amplified from pNF106 using primer prAC090 and prAC092. Following digestion with SalI, the TetR-GFP product was ligated to the digested pJC44 vector.
Primer prAC090 Sigma-Aldrich TTT TTG AAT TCT GGC AAT TCC GAC GTC TAA GAA ACC
Primer prAC092 Sigma-Aldrich TTT TTG TCG ACT TTG TCC TAC TCA GGA GAG CGT TC
HeLa CCL-2 ATCC CCL-2
ImageXpress Micro Molecular Devices  IXM IMAGING MSCOPE Automated cellular imaging microscope equipped with a precision motorized Z-stage. Alternative systems for automated microscopy and alternative components for hard- and software specified below can be employed.
High-Speed Laser Auto-Focus Molecular Devices  1-2300-1037
CFI Super Fluor 10X objective Nikon  MRF00100 N.A 0.50, W.D 1.20 mm, DIC Prism: 10X, Spring loaded
Photometrics CoolSNAP HQ Monochrome CCD Camera Molecular Devices  1-2300-1060 1,392 x 1,040 imaging pixels, 6.45 x 6.45 µm pixels, 12 bits digitization
MetaXpress software Molecular Devices  9500-0100
LUI-Spectra-X-7 Lumencor SPECTRA X V-XXX-YZ Light engine. The following light sources are used: violet (DAPI), cyan (GFP), green/yellow (RFP)
Single Band Exciter for DAPI Semrock FF01-377/50-25
Single Band Emitter for DAPI Semrock FF02-447/60-25
Single Band Dichroic for DAPI Semrock FF409-Di03-25x36
Single Band Exciter for GFP Semrock FF02-472/30-25
Single Band Emitter for GFP Semrock FF01-520/35-25
Single Band Dichroic for GFP Semrock FF495-Di03-25x36
Single Band Exciter for RFP Semrock FF01-562/40-25
Single Band Emitter for RFP Semrock FF01-624/40-25
Single Band Dichroic for RFP Semrock FF593-Di03-25x36

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pappas, G., Papadimitriou, P., Akritidis, N., Christou, L., Tsianos, E. V. The new global map of human brucellosis. Lancet Infect Dis. 6, 91-99 (2006).
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Casanova, A., Low, S. H.,… More

Casanova, A., Low, S. H., Emmenlauer, M., Conde-Alvarez, R., Salcedo, S. P., Gorvel, J. P., Dehio, C. Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells. J. Vis. Exp. (114), e54263, doi:10.3791/54263 (2016).

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