Summary

التصوير نيون المشتركة القريبة من تحت الحمراء والتصوير المقطعي مايكرو لتصور مباشرة الشلل Thromboemboli

Published: September 25, 2016
doi:

Summary

يصف هذا البروتوكول تطبيق التصوير المقطعي جنبا إلى جنب الفلورسنت الأشعة تحت الحمراء القريبة (NIRF) التصوير والجزئي حسابها (microCT) لتصور thromboemboli الدماغي. هذا الأسلوب يسمح للتقدير حجم عبء الجلطة والتطور. تقنية التصوير NIRF يتصور fluorescently المسمى خثرة في الدماغ المستأصل، في حين أن تقنية microCT يتصور خثرة داخل الحيوانات الحية باستخدام الذهب النانوية.

Abstract

التصوير خثرة المباشر يتصور السبب الجذري للاحتشاء الانسداد التجلطي. أن تكون قادرة على خثرة صورة يسمح مباشرة التحقيق أفضل بكثير من السكتة الدماغية من الاعتماد على القياسات غير المباشرة، وسوف يكون أداة بحث قوية الأوعية الدموية وقوية. نحن نستخدم هذا النهج التصوير الضوئي التي تصف الجلطة الدموية مع الجزيئية علامة التصوير خثرة – مسبار Cy5.5 الفلورسنت الأشعة تحت الحمراء القريبة (NIRF) مرتبط تساهميا إلى خيوط الفيبرين من الجلطة بفعل الأنزيمية، يشابك الفيبرين من تنشيط XIIIa عامل التخثر خلال عملية نضوج جلطة. يستخدم النهج القائم التصوير المقطعي المحسوبة الدقيقة (microCT) جزيئات الذهب التي تسعى خثرة (AuNPs) functionalized لاستهداف المكون الرئيسي للجلطة: الفيبرين. وتصف هذه الورقة بروتوكول مفصلة للمجتمعة في الجسم الحي microCT وخارج الحي NIRF التصوير thromboemboli في نموذج الفأر من السكتة الدماغية الصمية. وتبين لنا أن في الجسم الحي </ م> microCT وAuNPs-غليكول الشيتوزان المستهدفة الفيبرين (أكذوبة-GC-AuNPs) يمكن استخدامها لتصور كل من الجلطات الدماغية والجلطة الدموية الموقع صمي. وصفنا أيضا استخدام في الجسم الحي القائم microCT التصوير خثرة المباشرة لمراقبة متسلسل الآثار العلاجية للمنشط نسيج الجلطات بوساطة المنشط. بعد جلسة التصوير الأخيرة، علينا أن نظهر من خارج الحي NIRF تصوير مدى وتوزيع thromboemboli المتبقية في الدماغ. وأخيرا، نحن تصف صورة الكمية تحليل البيانات التصوير microCT وNIRF. تقنية الجمع بين التصوير خثرة المباشر تتيح طريقتين مستقلة التصور الجلطة يمكن مقارنتها: مجال إشارة الفلورسنت ذات الصلة خثرة على فيفو السابقين NIRF التصوير مقابل حجم الجلطة الدموية hyperdense microCT في الجسم الحي.

Introduction

وسيكون أحد في 6 أشخاص إصابة بسكتة دماغية في مرحلة ما من حياتهم. السكتة الدماغية هي حتى الآن نوع السكتة الدماغية الأكثر شيوعا، وتشكل نحو 80 في المئة من جميع حالات السكتة الدماغية. لأن thromboemboli تسبب معظم هذه الجلطات الدماغية، وهناك اهتمام متزايد في مجال التصوير خثرة المباشر.

وتشير التقديرات إلى أن حوالي 2000000 خلايا المخ تموت خلال كل دقيقة من وسط انسداد الشريان الدماغي مما أدى إلى شعار "الوقت هو الدماغ". التصوير المقطعي (CT) دراسات يمكن القيام به بسرعة، وتتوفر على نطاق واسع. لهذا السبب، لا تزال CT التصوير من خيار لتشخيص وعلاج السكتة الدماغية المفرط الحدة الأولي. CT هو قيمة خاصة لإعلام القرارات الحرجة الأولى: إدارة منشط منشط نسيج (TPA) لالجلطات و / أو triaging إلى اللف تكوين جلطة دموية استرجاع 2. الحالي القائم على CT خثرة التصوير، ومع ذلك، لا يمكن أن تتبع متسلسل الشللل thromboemboli في الجسم الحي، لأنه يستخدم وسائل غير مباشرة للتدليل الجلطة الدموية: بعد عتامة تجمع الدم على النقيض من ذلك المعالج باليود، وأظهر الجلطة الدموية كما شغل عيوب في الأوعية. هناك حدود ومخاطر الجرعة يرتبط مع الادارة المتكررة على النقيض من ذلك المعالج باليود، الذي يحول دون تكرار التصوير من الجلطة الدموية في هذه الطريقة.

وبالتالي، هناك حاجة ماسة لمنهجية التصوير المباشر للخثرة الدماغية في مرضى السكتة الدماغية، للسماح أسرع والقرارات معاملة أفضل في هذا الشأن. نقترح لتحقيق ذلك من خلال تعزيز قيمة CT، المستخدمة حاليا طريقة التصوير في الخطوط الأمامية للسكتة الدماغية، مع استخدام nanoparticular وكيل التصوير الجزيئي تسعى الجلطة.

لقد أثبتنا استخدام هذا العامل باستخدام المحسوبة الصغيرة التصوير المقطعي (microCT)، عالية الدقة خارج الجسم الحي أو في الجسم الحي (حيوان صغير) نسخة تصوير CT التي تسمح الحصول على البيانات السريع <سوب> 3،4. حتى مع الفقراء نسبيا على النقيض من الأنسجة اللينة متاحة للmicroCT الحيوانات الصغيرة (أسوأ بكثير مما كان متاحا من الماسحات الضوئية الإنسان الحجم)، وكان وكيل التصوير قادرا على السعي وبمناسبة الجلطة الدموية بجعلها hyperdense على CT، وهو 'علامة سفينة كثيفة "تتعزز الجزيئية التصوير.

واستكمالا لتقنية CT، وقد وضعت مجموعتنا من قبل تقنية خثرة التصوير مباشرة البصرية باستخدام Cy5.5 الفلورسنت الأشعة تحت الحمراء القريبة (NIRF) التحقيق لتصور عبء الجلطة الدماغية 5. هذا هو أسلوب خارج الجسم الحي على بعد الوفاة العقول، ولكنها حساسة للغاية، ويعمل على تأكيد في البيانات المجراة في إعداد البحوث.

وجود كل المقطعية وNIRF أساس تقنيات التصوير التي تسعى خثرة يسمح لنا مقارنة وهذه التقنيات الحصول على بيانات غنية بالمعلومات حول دور خثرة والتصوير خثرة في عملية التنمية السكتة الدماغية.

Hيحرث، وصفنا بروتوكول مفصلة من تقنية الجمع في الجسم الحي microCT وخارج الحي NIRF التصوير لتصور مباشرة thromboemboli في نموذج الفأر من السكتة الدماغية الصمية. هذه أساليب بسيطة وقوية ومفيدة لتعميق فهمنا للأمراض الجلطات من خلال تمكين دقة في تقييم المجراة من الجلطة عبء / توزيع وتوصيف تطور خثرة الديناميكي بطريقة سريعة والكمية في الجسم الحي أثناء العلاج، تليها خارج الحي البيانات التي تخدم كما تحكم والمعيار المرجعي للتأكيد في الجسم الحي نتائج التصوير.

Protocol

وقد تم استعراض جميع الإجراءات الحيوانية موضح في هذا البروتوكول والموافقة عليها من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان مستشفى Ilsan جامعة دونغ وأجرى وفقا للمبادئ والإجراءات المبينة في دليل المعاهد الوطنية للصحة للرعاية واستخدام الحيوانات. 1. إعدا?…

Representative Results

صور الأساس microCT، حصلت في الجسم الحي بعد إدارة أكذوبة-GC-AuNP (10 ملغ / مل، 300 ميكرولتر) في 1 ساعة بعد السكتة الدماغية الصمية، تصور بوضوح الجلطة الدماغية في MCA – ACA منطقة التشعب من الشريان السباتي الداخلي البعيدة (الشكل 6 ). وأظهرت المتابعة التصوي…

Discussion

أثبتنا استخدام اثنين من تقنيات التصوير الجزيئي التكميلية للتصوير خثرة المباشر في نماذج تجريبية من السكتة الدماغية الصمية: الليفين استهدف الذهب جسيمات متناهية الصغر (أكذوبة-GC-AuNP) في الجسم الحي التصوير القائم على microCT، وFXIIIa المستهدفة التحقيق التصوير الضوئي لا?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل من قبل كوريا الرعاية الصحية والتكنولوجيا R & مشروع التطوير، وزارة الصحة والرعاية الاجتماعية (HI12C1847، HI12C0066)، وبرنامج الحيوية والعلوم الطبية التنمية (2010-0019862) وبرنامج مختبر الأبحاث العالمية الخاضعة للتفتيش (جبهة الخلاص الوطني، 2015K1A1A2028228) من مؤسسة البحوث الوطنية، بتمويل من الحكومة الكورية.

Materials

Machines
microCT NanoFocusRay, JeonJu, Korea NFR Polaris-G90
NIRF imaging system Roper-scientific,Tucson, AZ coolsnap-Ez
Laser Doppler flowmeter Perimed, Stockholm, Sweden PeriFlux System 5000
Surgical microscope Leica Microsystems, Seoul, Korea EZ4HD
Inhalation anesthesia machine PerkinElmer, Massachusetts, USA XGI-8
Software
NFR control NanoFocusRay, JeonJu, Korea NFR Polaris-G90 microCT control software
Lucion Infinitt, Seoul, Korea Lucion 3D render imaging software
Lab chart 7 ADInstruments, Colorado, USA Lab chart 7 rCBF
Image J software Wanye Rasband, NIH, USA 1.49d imaging analysis
Devices/Instruments
Infusion pump Harvard, Massachusetts, USA pump 22(55-2226)
Homeothermic blanket Panlab, Barcelona, Spain HB101
Pocket cautery Daejong, Seoul, Korea DJE-39
Brain matrice Ted pella, CA, USA 15003 coronal section
PE-50 tubing Natsume, Tokyo, Japan SP-45(PE-50) I.D. 0.58 mm O.D. 0.96 mm
PE-10 tubing Natsume, Tokyo, Japan SP-10(PE-10) I.D. 0.28mm O.D. 0.61 mm
30 gauge needle sungshim-medical, Seoul, Korea
Syringe CPL-medical, Ansan, Korea 1 & 3 cc
Gauze Panamedic, Cheonan, Korea
Tape Scotch, Seoul, Korea 3M-810
Micro forceps Fine Science Tools, Vancouver, Canada  11253-27 Dumont #L5
Micro scissor Fine Science Tools, Vancouver, Canada 15000-03 Vannas spring
Scissor Fine Science Tools, Vancouver, Canada 14084-08 8.5 cm
Black silk suture Ailee, Busan, Korea SK6071, SK728 6-0 and 7-0
Reagents
meloxicam Yuhan, Seoul, Korea
vet ointment Novartis, Basel, Swiss
10% Povidone-iodine (betadine) Firson, Cheon-an, Korea
FeCl3 Sigma, Missouri, United States 157740-5G
TTC Amresco, Ohio, USA 0765-100g
Isoflurane Hana-Pham, Gyeonggi, Korea Ifran 100 mL
PBS Welgene, Daegu, Korea LB001-02 500 mL
Gold nanoparticles Synthesis
C15 optical agent Synthesis
Tissue plasminogen activator Boehringer Ingelheim, Biberach, Germany rtPA(actilyse) 20 mg
Normal saline Daihan Pham, Seoul, Korea 48N3AF3 20 mL

References

  1. Saver, J. L. Time is brain–quantified. Stroke. 37 (1), 263-266 (2006).
  2. Latchaw, R. E., et al. Recommendations for imaging of acute ischemic stroke: a scientific statement from the American Heart Association. Stroke. 40 (11), 3646-3678 (2009).
  3. Kim, D. E., et al. Hyperacute direct thrombus imaging using computed tomography and gold nanoparticles. Ann Neurol. 73 (5), 617-625 (2013).
  4. Kim, J. Y., et al. Direct Imaging of Cerebral Thromboemboli Using Computed Tomography and Fibrin-targeted Gold Nanoparticles. Theranostics. 5 (10), 1098-1114 (2015).
  5. Kim, D. E., et al. Direct thrombus imaging as a means to control the variability of mouse embolic infarct models: the role of optical molecular imaging. Stroke. 42 (12), 3566-3573 (2011).
  6. Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. J Pharmacol Pharmacother. 1 (2), 87-93 (2010).
  7. Durukan, A., Tatlisumak, T., Fisher, M. Animal models of ischemic stroke. Handbook of clinical neurology: Stroke Part 1: Basic and epidemiological aspects.Volume 92. 92, 43-66 (2009).
  8. Overoye-Chan, K., et al. EP-2104R: a fibrin-specific gadolinium-Based MRI contrast agent for detection of thrombus. J Am Chem Soc. 130 (18), 6025-6039 (2008).
  9. Kim, D. E., Schellingerhout, D., Jaffer, F. A., Weissleder, R., Tung, C. H. Near-infrared fluorescent imaging of cerebral thrombi and blood-brain barrier disruption in a mouse model of cerebral venous sinus thrombosis. J Cereb Blood Flow Metab. 25 (2), 226-233 (2005).
  10. Tung, C. H., et al. Novel factor XIII probes for blood coagulation imaging. Chembiochem. 4 (9), 897-899 (2003).
  11. Robinson, B. R., Houng, A. K., Reed, G. L. Catalytic life of activated factor XIII in thrombi. Implications for fibrinolytic resistance and thrombus aging. Circulation. 102 (10), 1151-1157 (2000).
  12. Reed, G. L., Houng, A. K. The contribution of activated factor XIII to fibrinolytic resistance in experimental pulmonary embolism. Circulation. 99 (2), 299-304 (1999).
  13. Sun, I. C., et al. Biocompatible glycol chitosan-coated gold nanoparticles for tumor-targeting CT imaging. Pharm Res. 31 (6), 1418-1425 (2014).
  14. Celi, A., et al. Thrombus formation: direct real-time observation and digital analysis of thrombus assembly in a living mouse by confocal and widefield intravital microscopy. J Thromb Haemost. 1 (1), 60-68 (2003).
  15. Chen, I. Y., Wu, J. C. Cardiovascular molecular imaging: focus on clinical translation. Circulation. 123 (4), 425-443 (2011).
  16. Wintermark, M., et al. Imaging recommendations for acute stroke and transient ischemic attack patients: a joint statement by the American Society of Neuroradiology, the American College of Radiology and the Society of NeuroInterventional Surgery. J Am Coll Radiol. 10 (11), 828-832 (2013).
  17. Weissleder, R., Tung, C. H., Mahmood, U., Bogdanov, A. In vivo imaging of tumors with protease-activated near-infrared fluorescent probes. Nat Biotechnol. 17 (4), 375-378 (1999).
  18. Narayanan, S., et al. Biocompatible magnetite/gold nanohybrid contrast agents via green chemistry for MRI and CT bioimaging. ACS Appl Mater Interfaces. 4 (1), 251-260 (2012).
  19. Amendola, V., et al. Magneto-plasmonic Au-Fe alloy nanoparticles designed for multimodal SERS-MRI-CT imaging. Small. 10 (12), 2476-2486 (2014).
  20. Zhu, J., et al. Synthesis of Au-Fe3O4 heterostructured nanoparticles for in vivo computed tomography and magnetic resonance dual model imaging. Nanoscale. 6 (1), 199-202 (2014).

Play Video

Cite This Article
Kim, D., Kim, J., Lee, S., Ryu, J. H., kwon, I. C., Ahn, C., Kim, K., Schellingerhout, D. Combined Near-infrared Fluorescent Imaging and Micro-computed Tomography for Directly Visualizing Cerebral Thromboemboli. J. Vis. Exp. (115), e54294, doi:10.3791/54294 (2016).

View Video