Imagen Fluorescente combinado del infrarrojo cercano y la tomografía computarizada-Micro para visualizar de manera directa tromboembolia cerebral
Summary
Este protocolo describe la aplicación de la tomografía combinado fluorescente en el infrarrojo cercano (NIRF) de formación de imágenes y micro-computarizada (microCT) para la visualización de tromboembolia cerebral. Esta técnica permite la cuantificación de la carga de trombo y la evolución. La técnica de imagen NIRF imagina y marcado con fluorescencia de trombos en el cerebro escindido, mientras que la técnica microCT visualiza trombo dentro de animales vivos utilizando nanopartículas de oro-.
Abstract
la visualización de trombos directa visualiza la causa del infarto tromboembólica. Ser capaz de imagen de trombo directamente permite mucho mejor la investigación de accidente cerebrovascular de confiar en mediciones indirectas, y será una herramienta de investigación vascular potente y robusto. Utilizamos un enfoque de imágenes ópticas que etiqueta trombos con un marcador de trombos imagen molecular – un Cy5.5 fluorescente en el infrarrojo cercano (NIRF) sonda que se une covalentemente a las hebras de fibrina del trombo por la acción enzimática de fibrina-reticulación de activado XIIIa factor de coagulación durante el proceso de maduración del coágulo. Un enfoque basado en tomografía micro-computarizada (microCT) utiliza nanopartículas de oro trombo de búsqueda (AuNPs) funcionalizados para orientar el componente principal del coágulo: fibrina. Este documento describe un protocolo detallado para el combinado in vivo y ex vivo microCT NIRF de imágenes de trombos en un modelo murino de accidente cerebrovascular embólico. Se demuestra que in vivo </ em> microCT y AuNPs glicol-quitosano de fibrina-dirigida (fib-GC-AuNPs) se puede utilizar para la visualización de trombos tanto en situ y trombos embólico cerebral. También describimos el uso de imágenes de trombos in vivo directa a base de microCT para controlar en serie los efectos terapéuticos de plasminógeno tisular trombólisis activador mediada. Después de la última sesión de imágenes, se demuestra por el ex vivo NIRF imágenes de la extensión y la distribución de tromboembolias residual en el cerebro. Por último, se describen los análisis de imagen cuantitativo de los datos de imagen y microCT NIRF. La técnica combinada de la visualización de trombos directa permite dos métodos independientes para la visualización de trombos que deben compararse: el área de la señal fluorescente relacionada trombo-en ex vivo NIRF de imágenes frente al volumen de trombos hyperdense microCT in vivo.
Introduction
Uno de cada 6 personas tendrá un derrame cerebral en algún momento de su vida. El ictus isquémico es de lejos el tipo más común de accidente cerebrovascular, y representa alrededor del 80 por ciento de todos los casos de accidente cerebrovascular. Debido a que los trombos causan la mayoría de estos accidentes cerebrovasculares isquémicos, existe un interés creciente en la visualización de trombos directa.
Se estima que alrededor de 2 millones de células cerebrales mueren durante cada minuto de oclusión de la arteria cerebral media 1, lo que lleva a la consigna "El tiempo es cerebro". La tomografía computarizada (TC) los estudios se puede hacer rápidamente, y están ampliamente disponibles; por esta razón, CT sigue siendo la imagen de elección para el diagnóstico y el tratamiento del ictus isquémico hiperagudo inicial. CT es particularmente valioso para informar a las decisiones tempranas críticas: la administración de activador de plasminógeno tisular (tPA) para la trombólisis y / o triaging a endovascular coágulo de recuperación de 2. Actual de formación de imágenes de trombos a base de CT, sin embargo, no puede realizar un seguimiento en serie cerebrosl trombos in vivo, ya que utiliza métodos indirectos para demostrar trombos: después de la opacificación de la acumulación de sangre en contraste yodado, los trombos se demostró como el relleno de defectos en los vasos. Hay límites y riesgos de dosis asociados con la administración repetida de contraste yodado, que excluyen la posibilidad de formación de imágenes de trombos repiten de esta manera.
Por lo tanto, hay una necesidad crítica de una metodología de formación de imágenes directa de trombos cerebral en pacientes con accidente cerebrovascular, para permitir mejores decisiones de tratamiento más rápido y a realizar. Proponemos de lograr esto mediante la mejora del valor de CT, la técnica de imagen de primera línea se utiliza actualmente para el accidente cerebrovascular, con el uso de un agente de imagen molecular de nanopartículas de trombos de búsqueda.
Hemos demostrado el uso de este agente mediante tomografía computarizada micro-(microCT), una alta resolución ex vivo o in vivo (animales pequeños) versión de imágenes de la TC que permite la adquisición rápida de datos <sup> 3,4. Incluso con el contraste de tejidos blandos relativamente pobre disponible para microCT de pequeños animales (mucho peor que la disposición de los escáneres de tamaño humano), el agente de imagen fue capaz de buscar y marcar trombos haciéndolos hyperdense en la TC, una "densa barco Indicativo 'reforzada por molecular formación de imágenes.
Como complemento a la técnica de TC, nuestro grupo ha desarrollado previamente una técnica de imagen óptica trombo directa usando la sonda fluorescente Cy5.5 en el infrarrojo cercano (NIRF) para visualizar cerebral carga trombótica 5. Esta es una técnica ex vivo en cerebros post mortem, pero es muy sensible, y sirve para confirmar los datos in vivo realizados en el marco de la investigación en.
Habiendo tanto la TC y NIRF basan las técnicas de imagen de trombo en busca nos permite comparar y contrastar estas técnicas para lograr datos de gran valor informativo sobre el papel de trombos y la visualización de trombos en el proceso de desarrollo de un accidente cerebrovascular isquémico.
MARIDOERE, se describe un protocolo detallado de una técnica combinada de microCT in vivo y ex vivo de formación de imágenes para visualizar directamente NIRF tromboembolia en un modelo murino de accidente cerebrovascular embólico. Estos métodos sencillos y robustos son útiles para avanzar en nuestra comprensión de las enfermedades trombóticas habilitando la precisión en la evaluación in vivo de trombos carga / distribución y caracterización de la evolución del trombo dinámica de una manera rápida y cuantitativa in vivo durante el tratamiento, seguido de los datos ex vivo que sirve como control y estándar de referencia para la confirmación de los resultados de formación de imágenes in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Se comprobó el uso de dos técnicas de imagen molecular complementarios para la visualización de trombos directa en modelos experimentales de accidente cerebrovascular embólico: un fibrina dirigido nanopartículas de oro (FIB-GC-AuNP) de imágenes basado en microCT in vivo, y un FXIIIa apuntamos sonda de imagen óptica para la ex vivo de imágenes fluorescentes.
Después de la administración intravenosa de fib-GC-AuNPs, los trombos se hizo visible a la TC como estructur…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el Korea Salud Tecnología Proyecto I + D, Ministerio de Salud y Bienestar (HI12C1847, HI12C0066), el Programa de Biología y Medicina Tecnología para el Desarrollo (desde 2.010 hasta 0019862) y el programa Laboratorio de Investigación Global (GRL) (NRF-2015K1A1A2028228) de la Fundación nacional de Investigación, financiado por el gobierno de Corea.
Materials
| Machines | |||
| microCT | NanoFocusRay, JeonJu, Korea | NFR Polaris-G90 | |
| NIRF imaging system | Roper-scientific,Tucson, AZ | coolsnap-Ez | |
| Laser Doppler flowmeter | Perimed, Stockholm, Sweden | PeriFlux System 5000 | |
| Surgical microscope | Leica Microsystems, Seoul, Korea | EZ4HD | |
| Inhalation anesthesia machine | PerkinElmer, Massachusetts, USA | XGI-8 | |
| Software | |||
| NFR control | NanoFocusRay, JeonJu, Korea | NFR Polaris-G90 | microCT control software |
| Lucion | Infinitt, Seoul, Korea | Lucion | 3D render imaging software |
| Lab chart 7 | ADInstruments, Colorado, USA | Lab chart 7 | rCBF |
| Image J software | Wanye Rasband, NIH, USA | 1.49d | imaging analysis |
| Devices/Instruments | |||
| Infusion pump | Harvard, Massachusetts, USA | pump 22(55-2226) | |
| Homeothermic blanket | Panlab, Barcelona, Spain | HB101 | |
| Pocket cautery | Daejong, Seoul, Korea | DJE-39 | |
| Brain matrice | Ted pella, CA, USA | 15003 | coronal section |
| PE-50 tubing | Natsume, Tokyo, Japan | SP-45(PE-50) | I.D. 0.58 mm O.D. 0.96 mm |
| PE-10 tubing | Natsume, Tokyo, Japan | SP-10(PE-10) | I.D. 0.28mm O.D. 0.61 mm |
| 30 gauge needle | sungshim-medical, Seoul, Korea | ||
| Syringe | CPL-medical, Ansan, Korea | 1 & 3 cc | |
| Gauze | Panamedic, Cheonan, Korea | ||
| Tape | Scotch, Seoul, Korea | 3M-810 | |
| Micro forceps | Fine Science Tools, Vancouver, Canada | 11253-27 | Dumont #L5 |
| Micro scissor | Fine Science Tools, Vancouver, Canada | 15000-03 | Vannas spring |
| Scissor | Fine Science Tools, Vancouver, Canada | 14084-08 | 8.5 cm |
| Black silk suture | Ailee, Busan, Korea | SK6071, SK728 | 6-0 and 7-0 |
| Reagents | |||
| meloxicam | Yuhan, Seoul, Korea | ||
| vet ointment | Novartis, Basel, Swiss | ||
| 10% Povidone-iodine (betadine) | Firson, Cheon-an, Korea | ||
| FeCl3 | Sigma, Missouri, United States | 157740-5G | |
| TTC | Amresco, Ohio, USA | 0765-100g | |
| Isoflurane | Hana-Pham, Gyeonggi, Korea | Ifran | 100 mL |
| PBS | Welgene, Daegu, Korea | LB001-02 | 500 mL |
| Gold nanoparticles | Synthesis | ||
| C15 optical agent | Synthesis | ||
| Tissue plasminogen activator | Boehringer Ingelheim, Biberach, Germany | rtPA(actilyse) | 20 mg |
| Normal saline | Daihan Pham, Seoul, Korea | 48N3AF3 | 20 mL |
References
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