Kombinerad nära infraröda fluorescerande Imaging och Micro-datortomografi för direkt Visualisera Cerebral tromboemboli

Summary

Detta protokoll beskriver tillämpningen av kombinerade nära infraröda fluorescerande (NIRF) avbildning och mikro datortomografi (microCT) för visualisering cerebral tromboemboli. Denna teknik medger kvantifiering av trombbördan och evolution. Den NIRF avbildningsteknik visualiserar fluorescensmärkt tromb i utskuren hjärnan, medan microCT tekniken visualiserar trombos inuti levande djur med hjälp av guldnanopartiklar.

Abstract

Direkt trombosavbildande visualiserar den grundläggande orsaken till tromboembolisk infarkt. Att kunna bild tromb direkt tillåter mycket bättre undersökning av stroke än att förlita sig på indirekta mätningar, och kommer att vara en potent och robust vaskulär forskningsverktyg. Vi använder en optisk avbildningsteknik som märker tromber med en molekylär avbildning tromb markör – en Cy5.5 nära infraröda fluorescerande (NIRF) prob som är kovalent bunden till de fibrinsträngarna av tromben av fibrin-tvärbindande enzymatiska verkan av aktiverad koagulationsfaktor Xllla under processen för koagel mognad. En mikro-datortomografi (microCT) -baserade tillvägagångssätt använder tromb söker guldnanopartiklar (AuNPs) funktionaliserade för att rikta den största delen av proppen: fibrin. Detta dokument beskriver ett detaljerat protokoll för den kombinerade in vivo microCT och ex vivo NIRF avbildning av tromboemboli i en musmodell av emboli stroke. Vi visar att in vivo </ em> microCT och fibrin inriktade glykol kitosan AuNPs (FIB-GC-AuNPs) kan användas för att visualisera både in situ tromber och cerebral embolisk tromber. Vi beskriver även användningen av in vivo microCT baserade direkttrombosavbildande för att seriellt övervaka de terapeutiska effekterna av vävnads-plasminogenaktivator-medierad trombolys. Efter den sista avbildning session, visar vi genom ex vivo NIRF avbildning omfattningen och fördelningen av rest tromboemboli i hjärnan. Slutligen beskriver vi kvantitativ bild analyser av microCT och NIRF bilddata. Den kombinerade tekniken direkt trombosavbildande gör två oberoende metoder för tromb visualisering att jämföra: området trombrelaterade fluorescerande signal på ex vivo NIRF imaging kontra volym hyperdense microCT tromber in vivo.

Introduction

En av 6 personer kommer att ha en stroke någon gång under sin livstid. Ischemisk stroke är den i särklass vanligaste stroke typ, och svarar för cirka 80 procent av alla strokefall. Eftersom tromboemboli orsakar majoriteten av dessa ischemisk stroke, det finns ett ökande intresse för direkt trombosavbildande.

Det uppskattas att cirka 2 miljoner hjärnceller dör under varje minut av Middle Cerebral artärocklusion ^en, vilket leder till parollen "Time is Brain". Datortomografi (CT) studier kan göras snabbt, och är allmänt tillgängliga; av denna anledning förblir CT avbildning av valet för den inledande diagnos och behandling av hyperakut ischemisk stroke. CT är särskilt värdefullt för att informera de kritiska tidiga beslut: administrera vävnadsplasminogenaktivator (tPA) för trombolys och / eller triaging till endovaskulär koagulera-hämtning ^två. Nuvarande CT-baserad trombosavbildande kan emellertid inte i serie spåra cerebral tromboemboli in vivo, eftersom den använder indirekta metoder för att demonstrera tromber: efter kontrast blodet poolen av joderade kontrastmedel är tromb demonstreras som fyller defekter i kärlen. Det finns dosgränser och risker som är förknippade med upprepad administrering av joderade kontrastmedel, som förhindrar upprepade avbildning av tromber på detta sätt.

Det finns således ett kritiskt behov av en direkt avbildning metodik för cerebral tromber hos strokepatienter, att möjliggöra bättre behandlingsbeslut snabbare och göras. Vi föreslår att åstadkomma detta genom att öka värdet på CT, det för närvarande använda frontlinjen avbildningsmodalitet för stroke, med användning av en tromb sökande nanopartikulära molekylär avbildningsmedel.

Vi har visat att användningen av detta medel med hjälp av mikro-datortomografi (microCT), en hög upplösning ex vivo eller in vivo (litet djur) avbildning version av CT som tillåter snabb datainsamling <sup> 3,4. Även med den relativt dåliga mjukdels kontrast för små djur microCT (mycket värre än tillgängliga från humana stora skannrar), avbildningsmedlet kunde söka och markera tromber genom att göra dem hyperdense på CT, en "tät fartyg tecken" förstärks av molekylär avbildning.

Som komplement till CT-tekniken, har vår grupp tidigare utvecklat en optisk direkttrombbildteknik med hjälp Cy5.5 nära infraröda fluorescerande (NIRF) sond för att visualisera cerebral trombos börda ^5. Detta är en ex vivo teknik på obduktions hjärnor, men är mycket känslig, och tjänar till att bekräfta in vivo-data i inställningen forskning.

Med både CT och NIRF baserad tromb söker avbildningstekniker tillåter oss att jämföra och kontrastera dessa tekniker för att uppnå mycket informativa uppgifter om rollen av blodproppar och tromber avbildning i processen för ischemisk stroke utveckling.

Here, beskriver vi ett detaljerat protokoll av en kombinerad teknik för in vivo microCT och ex vivo NIRF avbildning för att direkt visualisera tromboemboli i en musmodell av emboli stroke. Dessa enkla och robusta metoder är användbara för att öka vår förståelse av trombotiska sjukdomar genom att aktivera exakt in vivo bedömning av trombbördan / distribution och karakterisering av dynamisk tromb utveckling på ett snabbt och kvantitativt sätt in vivo under behandlingen, följt av ex vivo-data som tjänar som en kontroll och referensstandard för bekräftelsen av in vivo imaging fynd.

Protocol

Alla djurförsök visat i detta protokoll har granskats och godkänts av Dongguk Universitets Ilsan Hospital Djurvård och användning kommittén och genomförs i enlighet med de principer och förfaranden som beskrivs i NIH Guide för skötsel och användning av djur. 1. Framställning av Exogent Bildas Clot märkt med fluorescens Marker (Figur 1) Söva en mus i en induktionskammare med 3% isofluran blandat med 30% syre (1,5 l / min 100% syre). Säkerställa tillräcklig anestesidjup genom att observ…

Representative Results

Baslinje microCT bilder, som erhållits in vivo efter administrering av fib-GC-AuNP (10 mg / ml, 300 | j, l) vid 1 h efter embolisk stroke, visualiseras tydligt cerebral tromb i MCA – ACA bifurkation område av det distala inre halsartären (Figur 6 ). Uppföljning microCT avbildning visade ingen förändring i COW tromben med koksaltlösning behandling. Emellertid behandling med tPA visade en gradvis upplösning av COW tromb (blå pilspetsar i figur 6)….

Discussion

Vi visade användningen av två kompletterande molekylära avbildningstekniker för direkttrombosavbildande i experimentella modeller av emboli stroke: en fibrin riktad guld nanopartiklar (FIB-GC-AuNP) för in vivo microCT baserad avbildning och en FXIIIa riktad optisk avbildning sond för ex vivo fluorescerande avbildning.

Efter intravenös administrering av fib-GC-AuNPs blev tromber synliga för CT som täta strukturer, som orsakas av partiklarna blir inneslutna i tromber…

Materials

Machines
microCT	NanoFocusRay, JeonJu, Korea	NFR Polaris-G90
NIRF imaging system	Roper-scientific,Tucson, AZ	coolsnap-Ez
Laser Doppler flowmeter	Perimed, Stockholm, Sweden	PeriFlux System 5000
Surgical microscope	Leica Microsystems, Seoul, Korea	EZ4HD
Inhalation anesthesia machine	PerkinElmer, Massachusetts, USA	XGI-8
Software
NFR control	NanoFocusRay, JeonJu, Korea	NFR Polaris-G90	microCT control software
Lucion	Infinitt, Seoul, Korea	Lucion	3D render imaging software
Lab chart 7	ADInstruments, Colorado, USA	Lab chart 7	rCBF
Image J software	Wanye Rasband, NIH, USA	1.49d	imaging analysis
Devices/Instruments
Infusion pump	Harvard, Massachusetts, USA	pump 22(55-2226)
Homeothermic blanket	Panlab, Barcelona, Spain	HB101
Pocket cautery	Daejong, Seoul, Korea	DJE-39
Brain matrice	Ted pella, CA, USA	15003	coronal section
PE-50 tubing	Natsume, Tokyo, Japan	SP-45(PE-50)	I.D. 0.58 mm O.D. 0.96 mm
PE-10 tubing	Natsume, Tokyo, Japan	SP-10(PE-10)	I.D. 0.28mm O.D. 0.61 mm
30 gauge needle	sungshim-medical, Seoul, Korea
Syringe	CPL-medical, Ansan, Korea		1 & 3 cc
Gauze	Panamedic, Cheonan, Korea
Tape	Scotch, Seoul, Korea	3M-810
Micro forceps	Fine Science Tools, Vancouver, Canada	11253-27	Dumont #L5
Micro scissor	Fine Science Tools, Vancouver, Canada	15000-03	Vannas spring
Scissor	Fine Science Tools, Vancouver, Canada	14084-08	8.5 cm
Black silk suture	Ailee, Busan, Korea	SK6071, SK728	6-0 and 7-0
Reagents
meloxicam	Yuhan, Seoul, Korea
vet ointment	Novartis, Basel, Swiss
10% Povidone-iodine (betadine)	Firson, Cheon-an, Korea
FeCl3	Sigma, Missouri, United States	157740-5G
TTC	Amresco, Ohio, USA	0765-100g
Isoflurane	Hana-Pham, Gyeonggi, Korea	Ifran	100 mL
PBS	Welgene, Daegu, Korea	LB001-02	500 mL
Gold nanoparticles			Synthesis
C15 optical agent			Synthesis
Tissue plasminogen activator	Boehringer Ingelheim, Biberach, Germany	rtPA(actilyse)	20 mg
Normal saline	Daihan Pham, Seoul, Korea	48N3AF3	20 mL