Summary

Роботизированной платформы для высокой пропускной способности выделения протопластов и трансформации

Published: September 27, 2016
doi:

Summary

Методология с высокой пропускной способностью, автоматизированное, табачных протопластов производство и преобразование описано. Роботизированная система позволяет массово-параллельной экспрессии генов и открытие в модельной системе BY-2, которая должна быть переводимым не-модельных культур.

Abstract

За последнее десятилетие наблюдается всплеск в использовании растительных протопластов, которые варьируются от модельных видов подрезать видов, для анализа путей передачи сигнала, транскрипционных регуляторных сетей, экспрессии генов, генома редактирования и гена-глушителей. Кроме того, значительный прогресс был достигнут в регенерации растений из протопластов, породившей еще больший интерес к использованию этих систем для растений геномики. В этой работе, протокол был разработан для автоматизации изоляции протопластов и трансформации из «Ярко-желтый '2 (BY-2) табака суспензионной культуры с использованием роботизированной платформы. Процедуры трансформации были подтверждены с использованием оранжевый флуоресцентный белок (ОФП) ген-репортер (pporRFP) под контролем промотора вируса мозаики цветной капусты 35S (35S). ОФП выражение в протопласты было подтверждено эпифлуоресцентной микроскопии. Анализы также включены протопластов методы эффективности производства с использованием propidiuм йодистый. И, наконец, недорогие ферменты пищевые были использованы для процедуры выделения протопластов, обходя необходимость лабораторного класса ферментов, которые непомерно в высокой пропускной способности автоматизированной изоляции и анализа протопластов. На основании протокола, разработанного в данной работе, полная процедура от выделения протопластов к трансформации может быть проведена в соответствии с 4 ч, без какого-либо вмешательства оператора. В то время как протокол, разработанный в данной работе была подтверждена с клеточной культурой BY-2, процедуры и методы должны быть переводимым к любой подвески растений культуры / протопластов системы, которая должна позволить ускорению исследований в области геномики культур.

Introduction

В последние годы наблюдается значительный импульс уделяется разработке трансгенных культур для преодоления различных заболеваний 1, наделяют устойчивость к гербицидам 2, придают засуху 3,4 и солеустойчивости 5, предотвратить herbivory 6, увеличить выход биомассы 7, и уменьшение клеточной стенки упрямство 8. Эта тенденция способствовала развитию новых молекулярных инструментов для создания трансгенных растений, в том числе генома редактирования с использованием CRISPR и Таленс 9 и молчанием генов через дсРНК 10, микроРНК 11 и миРНК 12. Несмотря на то, что эти технологии упростили поколение трансгенных растений, они также создали узкое место, где огромное количество трансгенных растений, генерируемый не могут быть подвергнуты скринингу с использованием традиционных систем, которые полагаются на регенерации растений. В связи с этим узким местом, в то время как глушителей и геном-редактирования конструкции могут быть быстро вставлены в растения, многие изцелевые черты не производят желаемого эффекта, который часто не обнаружен, пока растения не анализируются в теплице. В этой работе, мы разработали метод для быстрого, автоматизированного, высокопроизводительного скрининга растительных протопластов, специально для решения текущего узкого места в начале скрининга большого количества генома-редактирования и молчанием генов мишеней.

Использование протопластов, в отличие от интактных клеток растений, имеет ряд преимуществ для разработки автоматизированной платформы. Во- первых, Протопласты были выделены после переваривания клеточной стенки растений, и с этим барьером больше нет, эффективность преобразования повышается 13. В интактных клетках растений существуют только два хорошо известных методов трансформации, биолистики 14 и Agrobacterium опосредованной трансформации 15. Ни один из этих методов могут быть легко переведены на жидких погрузочно-платформ, так как биолистики требует специального оборудования для Трансформатория, в то время как Agrobacterium -опосредованного преобразование требует совместной культуре и последующее удаление бактерий. Ни один не поддаются для высоких методов пропускной способности. В случае протопластов, преобразование обычно проводят с использованием полиэтиленгликоля (PEG) -опосредованного трансфекцию 16, которая требует только несколько обменов решения, и идеально подходит для жидких обработки платформ. Во-вторых, протопласты, по определению, являются одноклеточные культуры, и, таким образом, проблемы, связанные с слипания и цепи формирования в растительных клеточных культурах, не наблюдаются в протопласты. С точки зрения быстрого скрининга с использованием планшетов на основе спектрофотометра, слипание клеток, или клетки в нескольких плоскостях, приведет к трудности в получении устойчивых результатов измерений. Так как протопласты также более плотной, чем их культуральных сред, они оседают на дно лунок, образуя монослой, которая благоприятна для плиты на основе спектрофотометрии. И, наконец, в то время как клетки растения суспензионные культуры являются примарILY полученный из каллуса 17, протопласты могут быть собраны из ряда тканей растений, что приводит к возможности идентификации экспрессии тканеспецифической. Например, возможность анализа или листа: корневой-специфическую экспрессию гена, может быть очень важным для прогнозирования фенотипа. По этим причинам, протоколы , разработанные в этой работе были проверены с использованием протопластов , выделенных из широко используемых табака (Nicotiana аЬасит L.) 'Ярко – желтый' 2 (BY-2) суспензионную культуру.

Побочный 2 суспензионной культуры была описана как "HeLa" клетки высших растений, из – за его повсеместной использования в молекулярном анализе растительных клеток 18. В последнее время BY-2 клетки были использованы для изучения влияния основных стрессоров 19-22, локализация внутриклеточный белок 23,24, и основной клеточной биологии 25-27 демонстрируют широкой полезности этих культур в биологии растений. Дополнительное преимущество × 2 культур являетсявозможность синхронизации культур с aphidicolin, что может привести к повышению воспроизводимости для экспрессии гена исследования 28. Кроме того, были разработаны методы для извлечения BY-2 протопласты с использованием недорогих ферментов 29,30, так как ферменты , традиционно используемые для формирования протопластов являются экономически запретительной для систем с высокой пропускной способностью . Таким образом, протокол, описанный ниже, была проверена с использованием суспензионного культуры BY-2, но оно должно быть исправимо к любой клеточной суспензии растений культуры. Доказательство концептуальных экспериментов проводили с использованием оранжевого флуоресцентного белка (ОФП) ген – репортер (pporRFP) из твердых кораллов Porites Porites 31 под контролем промотора CaMV 35S.

Protocol

1. Создание суспензионных клеточных культур Готовят жидкость × 2 сред путем добавления 4,43 г Linsmaier & Скоог основных сред, 30 г сахарозы, 200 мг KH 2 PO 4, и 200 мкг 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-D) до 900 мл дистиллированной воды и рН до 5,8 с помощью 0,1 М КОН. После доведения рН, ?…

Representative Results

В текущем исследовании, удвоение скорости BY-2 изменялась от 14-18 ч в зависимости от температуры, при которой инкубировались культуры, в соответствии с предыдущими сообщениями о средней продолжительности клеточного цикла 15 ч. При этом скорость удвоения, 1: 100, начиная при?…

Discussion

Протокол, описанный выше, был успешно проверен для выделения протопластов, перечисления и трансформации с использованием табака культуры суспензии клеток BY-2; Тем не менее, протокол может быть легко расширена на любое растение подвески культуры. В настоящее время протопластов выделен?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This research was supported by Advanced Research Projects Agency – Energy (ARPA-E) Award No. DE-AR0000313.

Materials

Orbitor RS Microplate mover Thermo Scientific
Bravo Liquid Handler Agilent
Synergy H1 Multi-mode Reader BioTek
MultiFlo FX Multi-mode Dispenser BioTek
Teleshake Inheco 3800048
CPAC Ultraflat Heater/cooler Inheco 7000190
Vworks Automation Software Agilent Software used to control and write protocols for Agilent Bravo
Momentum Software Thermo Scientific Task scheduling software for controlling Orbiter RS
Liquid Handling Control 2.17 Software Biotek Software used to control and write protocols for MultiFlo FX
IX81 Inverted Microscope Olympus
Zyla 3-Tap microscope camera Andor
ET-CY3/TRITC Filter Set Chroma Technology Corp 49004
Rohament CL AB Enzymes sample bottle low-cost cellulase
Rohapect UF AB Enzymes sample bottle low-cost pectinase
Rohapect 10L AB Enzymes sample bottle low-cost pectinase/arabinase
Linsmaier & Skoog Basal Medium Phytotechnology Laboratories L689
2,4 dichlorophenoxyacetic acid Phytotechnology Laboratories D295
propidium iodide Sigma Aldrich P4170
Poly (ethylene glycol) 4000 Sigma Aldrich 95904-250G-F Formerly Fluka PEG
Propidium Iodide Fisher Scientific 25535-16-4 Acros Organics
CaCl2 Sigma Aldrich C7902-1KG
Sodium Acetate Fisher Scientific BP333-500
Mannitol Sigma Aldrich M1902-1KG
Sucrose Fisher Scientific S5-3
KH2PO4 Fisher Scientific AC424205000
KOH Sigma Aldrich P1767
Gelzan CM Sigma Aldrich G1910-250G
6-well plate Thermo Scientific 103184
96-well 1.2 ml deep well plate Thermo Scientific AB-0564
96 well optical bottom plate Thermo Scientific 165305
Finntip 1000 Wide bore Pipet tips Thermo Scientific 9405 163
NaCl Fisher Scientific BP358-10
KCl Sigma Aldrich P4504-1KG
MES Fisher Scientific AC17259-5000
MgCl2 Fisher Scientific M33-500

References

  1. Atkinson, H. J., Lilley, C. J., Urwin, P. E. Strategies for transgenic nematode control in developed and developing world crops. Curr. Opin. Biotech. 23 (2), 251-256 (2012).
  2. Duke, S. O. Perspectives on transgenic, herbicide-resistant crops in the United States almost 20 years after introduction. Pest Manag. Sci. 71 (5), 652-657 (2015).
  3. Mir, R., Zaman-Allah, M., Sreenivasulu, N., Trethowan, R., Varshney, R. Integrated genomics, physiology and breeding approaches for improving drought tolerance in crops. Theor. Appl. Genet. 125 (4), 625-645 (2012).
  4. Hu, H., Xiong, L. Genetic engineering and breeding of drought-resistant crops. Annu. Rev. Plant Bio. 65, 715-741 (2014).
  5. Marco, F., et al. . Plant Biology and Biotechnology. , 579-609 (2015).
  6. Edgerton, M. D., et al. Transgenic insect resistance traits increase corn yield and yield stability. Nat. Biotechnol. 30 (6), 493-496 (2012).
  7. Vanhercke, T., et al. Metabolic engineering of biomass for high energy density: oilseed-like triacylglycerol yields from plant leaves. Plant Biotech. J. 12 (2), 231-239 (2014).
  8. Baxter, H. L., et al. Two-year field analysis of reduced recalcitrance transgenic switchgrass. Plant Biotech. J. 12 (7), 914-924 (2014).
  9. Xing, H. L., et al. A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants. BMC Plant Biol. 14 (1), 327 (2014).
  10. Cao, J., Yao, D., Lin, F., Jiang, M. PEG-mediated transient gene expression and silencing system in maize mesophyll protoplasts: a valuable tool for signal transduction study in maize. Acta Physio. Plant. 36 (5), 1271-1281 (2014).
  11. Martinho, C., et al. Dissection of miRNA pathways using Arabidopsis mesophyll protoplasts. Mol. Plant. 8 (2), 261-275 (2015).
  12. Bart, R., Chern, M., Park, C. J., Bartley, L., Ronald, P. C. A novel system for gene silencing using siRNAs in rice leaf and stem-derived protoplasts. Plant Methods. 2 (1), 13 (2006).
  13. Jiang, F., Zhu, J., Liu, H. -. L. Protoplasts: a useful research system for plant cell biology, especially dedifferentiation. Protoplasma. 250 (6), 1231-1238 (2013).
  14. Martin-Ortigosa, S., Valenstein, J. S., Lin, V. S. Y., Trewyn, B. G., Wang, K. Nanotechnology meets plant sciences: Gold functionalized mesoporous silica nanoparticle mediated protein and DNA codelivery to plant cells via the biolistic method. Adv. Funct. Mater. 22 (17), 3529-3529 (2012).
  15. Křenek, P., et al. Transient plant transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens: Principles, methods and applications. Biotechnol. Adv. , (2015).
  16. Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat. Protoc. 2 (7), 1565-1572 (2007).
  17. Mustafa, N. R., de Winter, W., van Iren, F., Verpoorte, R. Initiation, growth and cryopreservation of plant cell suspension cultures. Nat. Protoc. 6 (6), 715-742 (2011).
  18. Nagata, T., Nemoto, Y., Hasezawa, S. Tobacco BY-2 cell line as the "HeLa" cell in the cell biology of higher plants. Int. Rev. Cytol. 132 (1), 1-30 (1992).
  19. Centomani, I., et al. Involvement of DNA methylation in the control of cell growth during heat stress in tobacco BY-2 cells. Protoplasma. , 1-9 (2015).
  20. Sgobba, A., et al. Cyclic AMP deficiency stimulates a stress condition in tobacco BY-2 cells. BioTechnologia. 94 (2), (2013).
  21. Väisänen, E. E., et al. Coniferyl alcohol hinders the growth of tobacco BY-2 cells and Nicotiana benthamiana seedlings. Planta. 242 (3), 747-760 (2015).
  22. Ortiz-Espìn, A., et al. Over-expression of Trxo1 increases the viability of tobacco BY-2 cells under H2O2 treatment. Ann. Botany. 116 (4), 571-582 (2015).
  23. Ito, Y., et al. cis-Golgi proteins accumulate near the ER exit sites and act as the scaffold for Golgi regeneration after brefeldin A treatment in tobacco BY-2 cells. Mol. Bio. Cell. 23 (16), 3203-3214 (2012).
  24. Madison, S. L., Nebenführ, A. Live-cell imaging of dual-labeled Golgi stacks in tobacco BY-2 cells reveals similar behaviors for different cisternae during movement and brefeldin A treatment. Mol. Plant. 4 (5), 896-908 (2011).
  25. de Pinto, M. C., et al. S-nitrosylation of ascorbate peroxidase is part of programmed cell death signaling in tobacco Bright Yellow-2 cells. Plant Physiol. 163 (4), 1766-1775 (2013).
  26. Hanamata, S., et al. In vivo imaging and quantitative monitoring of autophagic flux in tobacco BY-2 cells. Plant Signa. Behav. 8 (1), 22510 (2013).
  27. Sakai, A., Takusagawa, M., Nio, A., Sawai, Y. Cytological Studies on proliferation, differentiation, and death of BY-2 cultured tobacco cells. Cytologia. 80 (2), 133-141 (2015).
  28. Yasuhara, H., Kitamoto, K. Aphidicolin-induced nuclear elongation in tobacco BY-2 cells. Plant Cell Physiol. 55 (5), 913-927 (2014).
  29. Buntru, M., Vogel, S., Stoff, K., Spiegel, H., Schillberg, S. A versatile coupled cell-free transcription-translation system based on tobacco BY-2 cell lysates. Biotechnol. Bioeng. 112 (5), 867-878 (2015).
  30. Buntru, M., Vogel, S., Spiegel, H., Schillberg, S. Tobacco BY-2 cell-free lysate: an alternative and highly-productive plant-based in vitro translation system. BMC Biotechnol. 14 (1), 37 (2014).
  31. Alieva, N. O., et al. Diversity and evolution of coral fluorescent proteins. PLoS ONE. 3 (7), 2680 (2008).
  32. Maćkowska, K., Jarosz, A., Grzebelus, E. Plant regeneration from leaf-derived protoplasts within the Daucus genus: effect of different conditions in alginate embedding and phytosulfokine application. Plant Cell Tiss. Org. 117 (2), 241-252 (2014).
  33. Guo, Y., Song, X., Zhao, S., Lv, J., Lu, M. A transient gene expression system in Populus euphratica Oliv. protoplasts prepared from suspension cultured cells. Acta Physio. Plant. 37 (8), 1-8 (2015).
  34. Wang, H., Wang, W., Zhan, J., Huang, W., Xu, H. An efficient PEG-mediated transient gene expression system in grape protoplasts and its application in subcellular localization studies of flavonoids biosynthesis enzymes. Sci. Hort. 191, 82-89 (2015).
  35. Masani, M. Y. A., Noll, G. A., Parveez, G. K. A., Sambanthamurthi, R., Pruefer, D. Efficient transformation of oil palm protoplasts by PEG-mediated transfection and DNA microinjection. PLoS One. 9 (5), 96831 (2014).
  36. Sasamoto, H., Ashihara, H. Effect of nicotinic acid, nicotinamide and trigonelline on the proliferation of lettuce cells derived from protoplasts. Phytochem. Lett. 7, 38-41 (2014).
  37. Uddin, M. J., Robin, A. H. K., Raffiand, S., Afrin, S. Somatic embryo formation from co-cultivated protoplasts of Brassica rapa & B. juncea. Am. J. Exp. Ag. 8 (6), 342-349 (2015).
  38. Hayashimoto, A., Li, Z., Murai, N. A polyethylene glycol-mediated protoplast transformation system for production of fertile transgenic rice plants. Plant Physiol. 93 (3), 857-863 (1990).
  39. Mazarei, M., Al-Ahmad, H., Rudis, M. R., Stewart, C. N. Protoplast isolation and transient gene expression in switchgrass, Panicum virgatum L. Biotechnol. J. 3 (3), 354-359 (2008).
  40. Mazarei, M., Al-Ahmad, H., Rudis, M. R., Joyce, B. L., Stewart, C. N. Switchgrass (Panicum virgatum L.) cell suspension cultures: Establishment, characterization, and application. Plant Sci. 181 (6), 712-715 (2011).
  41. Locatelli, F., Vannini, C., Magnani, E., Coraggio, I., Bracale, M. Efficiency of transient transformation in tobacco protoplasts is independent of plasmid amount. Plant Cell Rep. 21 (9), 865-871 (2003).
  42. Di Sansebastiano, G. P., Paris, N., Marc-Martin, S., Neuhaus, J. M. Specific accumulation of GFP in a non-acididc vacuolar compartment via a C-terminal propeptide-mediated sorting pathway. Plant J. 15 (4), 449-457 (1998).
  43. De Sutter, V., et al. Exploration of jasmonate signalling via automated and standardized transient expression assays in tobacco cells. Plant J. 44 (6), 1065-1076 (2005).

Play Video

Cite This Article
Dlugosz, E. M., Lenaghan, S. C., Stewart, Jr., C. N. A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation. J. Vis. Exp. (115), e54300, doi:10.3791/54300 (2016).

View Video