Роботизированной платформы для высокой пропускной способности выделения протопластов и трансформации
Summary
Методология с высокой пропускной способностью, автоматизированное, табачных протопластов производство и преобразование описано. Роботизированная система позволяет массово-параллельной экспрессии генов и открытие в модельной системе BY-2, которая должна быть переводимым не-модельных культур.
Abstract
За последнее десятилетие наблюдается всплеск в использовании растительных протопластов, которые варьируются от модельных видов подрезать видов, для анализа путей передачи сигнала, транскрипционных регуляторных сетей, экспрессии генов, генома редактирования и гена-глушителей. Кроме того, значительный прогресс был достигнут в регенерации растений из протопластов, породившей еще больший интерес к использованию этих систем для растений геномики. В этой работе, протокол был разработан для автоматизации изоляции протопластов и трансформации из «Ярко-желтый '2 (BY-2) табака суспензионной культуры с использованием роботизированной платформы. Процедуры трансформации были подтверждены с использованием оранжевый флуоресцентный белок (ОФП) ген-репортер (pporRFP) под контролем промотора вируса мозаики цветной капусты 35S (35S). ОФП выражение в протопласты было подтверждено эпифлуоресцентной микроскопии. Анализы также включены протопластов методы эффективности производства с использованием propidiuм йодистый. И, наконец, недорогие ферменты пищевые были использованы для процедуры выделения протопластов, обходя необходимость лабораторного класса ферментов, которые непомерно в высокой пропускной способности автоматизированной изоляции и анализа протопластов. На основании протокола, разработанного в данной работе, полная процедура от выделения протопластов к трансформации может быть проведена в соответствии с 4 ч, без какого-либо вмешательства оператора. В то время как протокол, разработанный в данной работе была подтверждена с клеточной культурой BY-2, процедуры и методы должны быть переводимым к любой подвески растений культуры / протопластов системы, которая должна позволить ускорению исследований в области геномики культур.
Introduction
В последние годы наблюдается значительный импульс уделяется разработке трансгенных культур для преодоления различных заболеваний 1, наделяют устойчивость к гербицидам 2, придают засуху 3,4 и солеустойчивости 5, предотвратить herbivory 6, увеличить выход биомассы 7, и уменьшение клеточной стенки упрямство 8. Эта тенденция способствовала развитию новых молекулярных инструментов для создания трансгенных растений, в том числе генома редактирования с использованием CRISPR и Таленс 9 и молчанием генов через дсРНК 10, микроРНК 11 и миРНК 12. Несмотря на то, что эти технологии упростили поколение трансгенных растений, они также создали узкое место, где огромное количество трансгенных растений, генерируемый не могут быть подвергнуты скринингу с использованием традиционных систем, которые полагаются на регенерации растений. В связи с этим узким местом, в то время как глушителей и геном-редактирования конструкции могут быть быстро вставлены в растения, многие изцелевые черты не производят желаемого эффекта, который часто не обнаружен, пока растения не анализируются в теплице. В этой работе, мы разработали метод для быстрого, автоматизированного, высокопроизводительного скрининга растительных протопластов, специально для решения текущего узкого места в начале скрининга большого количества генома-редактирования и молчанием генов мишеней.
Использование протопластов, в отличие от интактных клеток растений, имеет ряд преимуществ для разработки автоматизированной платформы. Во- первых, Протопласты были выделены после переваривания клеточной стенки растений, и с этим барьером больше нет, эффективность преобразования повышается 13. В интактных клетках растений существуют только два хорошо известных методов трансформации, биолистики 14 и Agrobacterium опосредованной трансформации 15. Ни один из этих методов могут быть легко переведены на жидких погрузочно-платформ, так как биолистики требует специального оборудования для Трансформатория, в то время как Agrobacterium -опосредованного преобразование требует совместной культуре и последующее удаление бактерий. Ни один не поддаются для высоких методов пропускной способности. В случае протопластов, преобразование обычно проводят с использованием полиэтиленгликоля (PEG) -опосредованного трансфекцию 16, которая требует только несколько обменов решения, и идеально подходит для жидких обработки платформ. Во-вторых, протопласты, по определению, являются одноклеточные культуры, и, таким образом, проблемы, связанные с слипания и цепи формирования в растительных клеточных культурах, не наблюдаются в протопласты. С точки зрения быстрого скрининга с использованием планшетов на основе спектрофотометра, слипание клеток, или клетки в нескольких плоскостях, приведет к трудности в получении устойчивых результатов измерений. Так как протопласты также более плотной, чем их культуральных сред, они оседают на дно лунок, образуя монослой, которая благоприятна для плиты на основе спектрофотометрии. И, наконец, в то время как клетки растения суспензионные культуры являются примарILY полученный из каллуса 17, протопласты могут быть собраны из ряда тканей растений, что приводит к возможности идентификации экспрессии тканеспецифической. Например, возможность анализа или листа: корневой-специфическую экспрессию гена, может быть очень важным для прогнозирования фенотипа. По этим причинам, протоколы , разработанные в этой работе были проверены с использованием протопластов , выделенных из широко используемых табака (Nicotiana аЬасит L.) 'Ярко – желтый' 2 (BY-2) суспензионную культуру.
Побочный 2 суспензионной культуры была описана как "HeLa" клетки высших растений, из – за его повсеместной использования в молекулярном анализе растительных клеток 18. В последнее время BY-2 клетки были использованы для изучения влияния основных стрессоров 19-22, локализация внутриклеточный белок 23,24, и основной клеточной биологии 25-27 демонстрируют широкой полезности этих культур в биологии растений. Дополнительное преимущество × 2 культур являетсявозможность синхронизации культур с aphidicolin, что может привести к повышению воспроизводимости для экспрессии гена исследования 28. Кроме того, были разработаны методы для извлечения BY-2 протопласты с использованием недорогих ферментов 29,30, так как ферменты , традиционно используемые для формирования протопластов являются экономически запретительной для систем с высокой пропускной способностью . Таким образом, протокол, описанный ниже, была проверена с использованием суспензионного культуры BY-2, но оно должно быть исправимо к любой клеточной суспензии растений культуры. Доказательство концептуальных экспериментов проводили с использованием оранжевого флуоресцентного белка (ОФП) ген – репортер (pporRFP) из твердых кораллов Porites Porites 31 под контролем промотора CaMV 35S.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол, описанный выше, был успешно проверен для выделения протопластов, перечисления и трансформации с использованием табака культуры суспензии клеток BY-2; Тем не менее, протокол может быть легко расширена на любое растение подвески культуры. В настоящее время протопластов выделен?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by Advanced Research Projects Agency – Energy (ARPA-E) Award No. DE-AR0000313.
Materials
| Orbitor RS Microplate mover | Thermo Scientific | ||
| Bravo Liquid Handler | Agilent | ||
| Synergy H1 Multi-mode Reader | BioTek | ||
| MultiFlo FX Multi-mode Dispenser | BioTek | ||
| Teleshake | Inheco | 3800048 | |
| CPAC Ultraflat Heater/cooler | Inheco | 7000190 | |
| Vworks Automation Software | Agilent | Software used to control and write protocols for Agilent Bravo | |
| Momentum Software | Thermo Scientific | Task scheduling software for controlling Orbiter RS | |
| Liquid Handling Control 2.17 Software | Biotek | Software used to control and write protocols for MultiFlo FX | |
| IX81 Inverted Microscope | Olympus | ||
| Zyla 3-Tap microscope camera | Andor | ||
| ET-CY3/TRITC Filter Set | Chroma Technology Corp | 49004 | |
| Rohament CL | AB Enzymes | sample bottle | low-cost cellulase |
| Rohapect UF | AB Enzymes | sample bottle | low-cost pectinase |
| Rohapect 10L | AB Enzymes | sample bottle | low-cost pectinase/arabinase |
| Linsmaier & Skoog Basal Medium | Phytotechnology Laboratories | L689 | |
| 2,4 dichlorophenoxyacetic acid | Phytotechnology Laboratories | D295 | |
| propidium iodide | Sigma Aldrich | P4170 | |
| Poly (ethylene glycol) 4000 | Sigma Aldrich | 95904-250G-F | Formerly Fluka PEG |
| Propidium Iodide | Fisher Scientific | 25535-16-4 | Acros Organics |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C7902-1KG | |
| Sodium Acetate | Fisher Scientific | BP333-500 | |
| Mannitol | Sigma Aldrich | M1902-1KG | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | AC424205000 | |
| KOH | Sigma Aldrich | P1767 | |
| Gelzan CM | Sigma Aldrich | G1910-250G | |
| 6-well plate | Thermo Scientific | 103184 | |
| 96-well 1.2 ml deep well plate | Thermo Scientific | AB-0564 | |
| 96 well optical bottom plate | Thermo Scientific | 165305 | |
| Finntip 1000 Wide bore Pipet tips | Thermo Scientific | 9405 163 | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P4504-1KG | |
| MES | Fisher Scientific | AC17259-5000 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | M33-500 |
References
- Atkinson, H. J., Lilley, C. J., Urwin, P. E. Strategies for transgenic nematode control in developed and developing world crops. Curr. Opin. Biotech. 23 (2), 251-256 (2012).
- Duke, S. O. Perspectives on transgenic, herbicide-resistant crops in the United States almost 20 years after introduction. Pest Manag. Sci. 71 (5), 652-657 (2015).
- Mir, R., Zaman-Allah, M., Sreenivasulu, N., Trethowan, R., Varshney, R. Integrated genomics, physiology and breeding approaches for improving drought tolerance in crops. Theor. Appl. Genet. 125 (4), 625-645 (2012).
- Hu, H., Xiong, L. Genetic engineering and breeding of drought-resistant crops. Annu. Rev. Plant Bio. 65, 715-741 (2014).
- Marco, F., et al. . Plant Biology and Biotechnology. , 579-609 (2015).
- Edgerton, M. D., et al. Transgenic insect resistance traits increase corn yield and yield stability. Nat. Biotechnol. 30 (6), 493-496 (2012).
- Vanhercke, T., et al. Metabolic engineering of biomass for high energy density: oilseed-like triacylglycerol yields from plant leaves. Plant Biotech. J. 12 (2), 231-239 (2014).
- Baxter, H. L., et al. Two-year field analysis of reduced recalcitrance transgenic switchgrass. Plant Biotech. J. 12 (7), 914-924 (2014).
- Xing, H. L., et al. A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants. BMC Plant Biol. 14 (1), 327 (2014).
- Cao, J., Yao, D., Lin, F., Jiang, M. PEG-mediated transient gene expression and silencing system in maize mesophyll protoplasts: a valuable tool for signal transduction study in maize. Acta Physio. Plant. 36 (5), 1271-1281 (2014).
- Martinho, C., et al. Dissection of miRNA pathways using Arabidopsis mesophyll protoplasts. Mol. Plant. 8 (2), 261-275 (2015).
- Bart, R., Chern, M., Park, C. J., Bartley, L., Ronald, P. C. A novel system for gene silencing using siRNAs in rice leaf and stem-derived protoplasts. Plant Methods. 2 (1), 13 (2006).
- Jiang, F., Zhu, J., Liu, H. -. L. Protoplasts: a useful research system for plant cell biology, especially dedifferentiation. Protoplasma. 250 (6), 1231-1238 (2013).
- Martin-Ortigosa, S., Valenstein, J. S., Lin, V. S. Y., Trewyn, B. G., Wang, K. Nanotechnology meets plant sciences: Gold functionalized mesoporous silica nanoparticle mediated protein and DNA codelivery to plant cells via the biolistic method. Adv. Funct. Mater. 22 (17), 3529-3529 (2012).
- Křenek, P., et al. Transient plant transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens: Principles, methods and applications. Biotechnol. Adv. , (2015).
- Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat. Protoc. 2 (7), 1565-1572 (2007).
- Mustafa, N. R., de Winter, W., van Iren, F., Verpoorte, R. Initiation, growth and cryopreservation of plant cell suspension cultures. Nat. Protoc. 6 (6), 715-742 (2011).
- Nagata, T., Nemoto, Y., Hasezawa, S. Tobacco BY-2 cell line as the "HeLa" cell in the cell biology of higher plants. Int. Rev. Cytol. 132 (1), 1-30 (1992).
- Centomani, I., et al. Involvement of DNA methylation in the control of cell growth during heat stress in tobacco BY-2 cells. Protoplasma. , 1-9 (2015).
- Sgobba, A., et al. Cyclic AMP deficiency stimulates a stress condition in tobacco BY-2 cells. BioTechnologia. 94 (2), (2013).
- Väisänen, E. E., et al. Coniferyl alcohol hinders the growth of tobacco BY-2 cells and Nicotiana benthamiana seedlings. Planta. 242 (3), 747-760 (2015).
- Ortiz-Espìn, A., et al. Over-expression of Trxo1 increases the viability of tobacco BY-2 cells under H2O2 treatment. Ann. Botany. 116 (4), 571-582 (2015).
- Ito, Y., et al. cis-Golgi proteins accumulate near the ER exit sites and act as the scaffold for Golgi regeneration after brefeldin A treatment in tobacco BY-2 cells. Mol. Bio. Cell. 23 (16), 3203-3214 (2012).
- Madison, S. L., Nebenführ, A. Live-cell imaging of dual-labeled Golgi stacks in tobacco BY-2 cells reveals similar behaviors for different cisternae during movement and brefeldin A treatment. Mol. Plant. 4 (5), 896-908 (2011).
- de Pinto, M. C., et al. S-nitrosylation of ascorbate peroxidase is part of programmed cell death signaling in tobacco Bright Yellow-2 cells. Plant Physiol. 163 (4), 1766-1775 (2013).
- Hanamata, S., et al. In vivo imaging and quantitative monitoring of autophagic flux in tobacco BY-2 cells. Plant Signa. Behav. 8 (1), 22510 (2013).
- Sakai, A., Takusagawa, M., Nio, A., Sawai, Y. Cytological Studies on proliferation, differentiation, and death of BY-2 cultured tobacco cells. Cytologia. 80 (2), 133-141 (2015).
- Yasuhara, H., Kitamoto, K. Aphidicolin-induced nuclear elongation in tobacco BY-2 cells. Plant Cell Physiol. 55 (5), 913-927 (2014).
- Buntru, M., Vogel, S., Stoff, K., Spiegel, H., Schillberg, S. A versatile coupled cell-free transcription-translation system based on tobacco BY-2 cell lysates. Biotechnol. Bioeng. 112 (5), 867-878 (2015).
- Buntru, M., Vogel, S., Spiegel, H., Schillberg, S. Tobacco BY-2 cell-free lysate: an alternative and highly-productive plant-based in vitro translation system. BMC Biotechnol. 14 (1), 37 (2014).
- Alieva, N. O., et al. Diversity and evolution of coral fluorescent proteins. PLoS ONE. 3 (7), 2680 (2008).
- Maćkowska, K., Jarosz, A., Grzebelus, E. Plant regeneration from leaf-derived protoplasts within the Daucus genus: effect of different conditions in alginate embedding and phytosulfokine application. Plant Cell Tiss. Org. 117 (2), 241-252 (2014).
- Guo, Y., Song, X., Zhao, S., Lv, J., Lu, M. A transient gene expression system in Populus euphratica Oliv. protoplasts prepared from suspension cultured cells. Acta Physio. Plant. 37 (8), 1-8 (2015).
- Wang, H., Wang, W., Zhan, J., Huang, W., Xu, H. An efficient PEG-mediated transient gene expression system in grape protoplasts and its application in subcellular localization studies of flavonoids biosynthesis enzymes. Sci. Hort. 191, 82-89 (2015).
- Masani, M. Y. A., Noll, G. A., Parveez, G. K. A., Sambanthamurthi, R., Pruefer, D. Efficient transformation of oil palm protoplasts by PEG-mediated transfection and DNA microinjection. PLoS One. 9 (5), 96831 (2014).
- Sasamoto, H., Ashihara, H. Effect of nicotinic acid, nicotinamide and trigonelline on the proliferation of lettuce cells derived from protoplasts. Phytochem. Lett. 7, 38-41 (2014).
- Uddin, M. J., Robin, A. H. K., Raffiand, S., Afrin, S. Somatic embryo formation from co-cultivated protoplasts of Brassica rapa & B. juncea. Am. J. Exp. Ag. 8 (6), 342-349 (2015).
- Hayashimoto, A., Li, Z., Murai, N. A polyethylene glycol-mediated protoplast transformation system for production of fertile transgenic rice plants. Plant Physiol. 93 (3), 857-863 (1990).
- Mazarei, M., Al-Ahmad, H., Rudis, M. R., Stewart, C. N. Protoplast isolation and transient gene expression in switchgrass, Panicum virgatum L. Biotechnol. J. 3 (3), 354-359 (2008).
- Mazarei, M., Al-Ahmad, H., Rudis, M. R., Joyce, B. L., Stewart, C. N. Switchgrass (Panicum virgatum L.) cell suspension cultures: Establishment, characterization, and application. Plant Sci. 181 (6), 712-715 (2011).
- Locatelli, F., Vannini, C., Magnani, E., Coraggio, I., Bracale, M. Efficiency of transient transformation in tobacco protoplasts is independent of plasmid amount. Plant Cell Rep. 21 (9), 865-871 (2003).
- Di Sansebastiano, G. P., Paris, N., Marc-Martin, S., Neuhaus, J. M. Specific accumulation of GFP in a non-acididc vacuolar compartment via a C-terminal propeptide-mediated sorting pathway. Plant J. 15 (4), 449-457 (1998).
- De Sutter, V., et al. Exploration of jasmonate signalling via automated and standardized transient expression assays in tobacco cells. Plant J. 44 (6), 1065-1076 (2005).
