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Genetics

높은 처리량 원형질체 분리 및 변환을위한 로봇 플랫폼

doi: 10.3791/54300 Published: September 27, 2016

Summary

높은 처리량, 자동화, 담배 원형질체 생산 및 변환 방법이 설명되어 있습니다. 로봇 시스템이 아닌 모델 작물로 번역해야한다 모델 BY-2 시스템에 대규모 병렬 유전자 발현 및 검색 할 수 있습니다.

Abstract

지난 10 년간의 신호 전달 경로, 전사 조절 네트워크, 유전자 발현, 유전자 편집 및 유전자 침묵의 분석 종을 잘라내 모델 종에서부터 식물 원형질체의 사용 부활되고있다. 또한, 상당한 진전 식물 게놈 이러한 시스템의 사용에 더 많은 이익을 생성 한 원형질체로부터 식물의 재생에 만들어졌다. 이 작품에서, 프로토콜은 로봇 플랫폼을 사용하여 '밝은 노란색'2 (BY-2) 담배 현탁 배양에서 원형질체 분리 및 변환의 자동화를 위해 개발되었다. 변환 절차는 콜리 플라워 모자이크 바이러스 35S 프로모터 (35S)의 제어하에 오렌지색 형광 단백질 (OFP) 리포터 유전자 (pporRFP)을 사용하여 검증 하였다. 원형질체의 OFP 발현 표면 형광 현미경으로 확인 하였다. 분석은 propidiu을 사용하여 원형질체 생산 효율 방법을 포함m 요오드화. 마지막으로, 저가 식용 효소는 엄청난 비용 원형질체의 분리 및 분석을 자동화 높은 처리량에 실험실 등급 효소의 필요성을 우회 원형질체 분리 절차를 사용 하였다. 본 연구에서 개발 된 프로토콜에 기초하여, 변형에 원형질 분리의 전체 과정은 운영자의 입력없이, 4 시간 이내에 수행 될 수있다. 이 연구에서 개발 된 프로토콜은 BY-2 세포 배양과 검증 동안, 절차 및 방법은 작물의 게놈 연구의 가속을 활성화해야합니다 모든 식물 현탁 배양 / 원형질체 시스템에 번역해야합니다.

Introduction

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최근, 초식 동물 6 방지 매스 수율 7 증가하고 세포벽 들음 감소 가뭄 3,4- 내염성 5 부여 제초제 저항성 2 부여 각종 질병 한 극복 유전자 변형 작물의 설계에 배치 상당한 자극이 있었다 8. 이러한 경향은 dsRNA를 10, 11의 miRNA와 siRNA를 12까지 침묵 CRISPR TALENs과 9를 사용하여 게놈 편집 및 유전자를 포함한 형질 전환 식물을 생성하는 새로운 분자 도구의 개발에 힘 입어되었다. 이들 기술은 형질 전환 체의 생성을 단순화되었지만, 또한 트랜스 제닉 식물의 투명 수 식물 재생에 의존하는 기존의 시스템을 이용하여 스크리닝 될 수 생성 병목을 만들었다. 상기의 많은 침묵과 게놈 구조 편집 빠르게 식물에 삽입 될 수 있지만, 이러한 병목 관련타겟 특성 식물을 온실에서 분석 할 때까지 종종 발견되지 않는 목적하는 효과를 생산하지 못한다. 본 논문에서는 특히 표적 유전자 사일런 편집 및 유전자의 다수의 초기 스크리닝에서의 전류 병목 현상을 해결하기 위해, 식물 원형질체의 신속한 자동화 고 처리량 스크리닝하기위한 방법을 개발 하였다.

그대로 식물 세포 반대로 원형질체의 사용은 자동화 된 플랫폼의 개발을위한 여러 가지 장점을 갖는다. 먼저, 원형질체는 식물 세포벽의 분해 후에 격리되고, 더 이상 존재하지 않는 장벽이, 변환 효율은 13 커진다. 그대로 식물 세포 (14)아그로 박테 리움 - 매개 형질 전환 15 바이오리 스틱스 (biolistics) 변환을위한 두 개의 잘 확립 된 방법이있다. 바이오리 스틱스 (biolistics)는 변압기의 용 전문 장비를 필요로 이러한 방법 중 어느 것도 쉽게, 액체 처리 플랫폼으로 변환 할 수 있습니다rmation, 아그로 박테 리움 반면 - 매개 변환은 공동의 문화와 박테리아의 연속적인 제거가 필요합니다. 둘 다 높은 처리량 방법에 대한 의무가 없습니다. 원형질체의 경우, 변환은 통상적으로 단지 몇 액 교환이 필요하며, 이상적으로는 액체 처리 플랫폼에 적합 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) - 매개 형질 감염 (16)를 사용하여 수행된다. 둘째, 원형질체는 정의에 의해 단일 세포 배양, 따라서 식물 세포 배양에서 응집 및 체인의 형성과 관련된 문제들, 원형질체에서 관찰되지 않는다. 접시 기반 분광 광도계, 세포의 응집을 사용하여 빠른 심사의 관점에서, 또는 여러면에서 세포는 일관된 측정을 획득 어려움으로 이어질 것입니다. 원형질체가 배지보다 또한 치밀하기 때문에, 이들은 플레이트 기반 측정법위한 도움이되는 단일 층을 형성하고, 웰의 바닥에 침전. 마지막으로, 식물 세포의 현탁 배양은 PRIMAR 반면ILY 캘러스 (17)로부터 유래 된 원형질체는 조직 - 특이 적 발현을 확인 할 수있는 능력에 이르는, 식물 조직의 개수에서 수확 될 수있다. 예를 들어, 기능 표현형 예측에 매우 중요 할 수 루트 레벨 또는 유전자의 잎 특이 적 발현을 분석한다. 이러한 이유로,이 연구에서 개발 된 프로토콜은 널리 사용되는 담배 (담배 속 tabacum L.) '밝은 노란색'2 (BY-2) 현탁 배양에서 분리 된 원형질체를 사용하여 검증 하였다.

에 의해-2 현탁 배양은 식물 세포 (18)의 분자 분석에서의 유비쿼터스 사용하기 때문에, 고등 식물의 "헬라"셀로 설명되었다. 최근 BY-2 세포는 식물의 효과를 연구하는 데 사용 된 세포 내 단백질 지역화 23, 24, 및 식물 생물학에서 이러한 문화의 다양한 유틸리티를 보여주는 기본적인 세포 생물학 25-27, 19-22을 스트레스. BY-2 문화의 또 다른 장점입니다유전자 발현에 대한 향상된 재현성을 초래할 수있는 aphidicolin와 문화를 동기화 할 수있는 능력은 28 연구. 또한, 방법은 전통적 원형질체를 생성하는데 사용 효소 선정 높은 스루풋 시스템 금지이기 때문에, 저비용 29,30 효소를 사용하여 -2- 원형질체의 추출을 위해 개발되었다. 이와 같이, 후술하는 프로토콜 BY-2 현탁 배양을 이용하여 검증되었지만, 어떤 식물 세포의 현탁 배양으로 수정할 수있는 있어야한다. 개념 증명 실험은 하드 산호 Porites에서 오렌지 형광 단백질 (OFP) 리포터 유전자 (pporRFP)는는 CaMV 35S 프로모터의 제어하에 31 porites 사용하여 수행됩니다.

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Protocol

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서스펜션 세포 배양 1. 구축

  1. BY-2 미디어 PO 4 4.43 g Linsmaier & 스쿡 기저 배지, 수크로오스 30 g, 200 mg의 KH 2를 첨가하여 액을 제조하고, 증류하여 200 내지 900 μg의 2,4- 디클로로 페녹시 아세트산 (2,4-D)의 용액 물과 0.1 M KOH와 5.8의 pH. pH를 조정 한 후, 증류수 및 오토 클레이브 1,000 ml의에 최종 볼륨을 조정합니다. 미디어는 4 ° C에서 2 주까지 저장할 수 있습니다.
  2. 1 %의 추가 BY-2 미디어 250 ㎖의 삼각 고체 BY-2 미디어에 성장 100 BY-2 미디어 액체 ml의 BY-2 캘러스의 한 조각 (> 직경 1cm)와 플라스크 (액체 접종 한천) 및 알루미늄 호일로 밀봉. 5 일간 진탕 28-30 ° C에서 문화를 품어.
    참고 : 액체 문화가 빠르게 자라다 바와 같이 BY-2 캘러스는 장기 저장을위한 고체 배지에 유지된다. 배양 부피는 통상적으로 100 ml의 배양은 세 서른 6 w 로딩 가능한 것, 필요에 따라 조정할 수있다엘 플레이트.
  3. 전송이 BY-2 배양 신선한 BY-2 미디어의 98 ml의에 로그 상 ㎖의 진탕 28 ~ 30 ℃에서 5~7일 동안 품어.
    참고 캘러스 100 5-7일 오래 배양 희석보다는 접종 : 확립 된 액체 배양 물의 계대 정기적 하나를 사용하여 수행 될 수있다.
  4. 세포가 빠르게 정착하는 바와 같이, 철저하게 문화를 믹스 및 전송 세포 배양의 6 ml의 15 ML 원뿔 바닥 원심 분리기 튜브와 세포가 적어도 10 분 동안 정착하자. 상등액을 제거하여 총 부피의 50 %까지 충전 셀 볼륨을 조정한다.
  5. 소화를위한 6 웰 플레이트의 각 웰에 500 μl를 반전하고 피펫으로 튜브를 흔들어. 그들은 조밀 한,이 단계에서 세포를 전송 넓은 구멍 피펫을 사용하여 표준 피펫 팁을 방해 할 것입니다.

2. 원형질체 분리

  1. 로봇 시스템 (그림 1A)의 모든 구성 요소의 전원을 켜고 소프트 예약 판 이동기 작업을 엽니 다제품. 작업 스케줄링 프로그램은 장비의 각 부분 사이의 판의 전송을 가능하게하는 다른 장비와 마이크로 이동기를 통합합니다.
  2. 다음과 같이 이전에 실험에, 플레이트 이동기 소프트웨어 실험 실용의 각 부분에 대한 기술적 프로토콜에 사용되는 실험 실용 사양 (예를 들면, 접시, 뚜껑)뿐만 아니라, 시작 및 종료 위치를 정의합니다 :
    1. 판 이동기 소프트웨어의 기본 도구 모음에서 설치 프로그램을 클릭하고 관리 컨테이너 형식의 명령을 선택합니다.
    2. 컨테이너 유형이 기존의 컨테이너 형식 라이브러리에 나와있는 경우, 해당 컨테이너를 선택합니다.
    3. 컨테이너 유형이 기존의 컨테이너 형식 라이브러리에없는 경우 새 컨테이너 유형을 지정하기 위해 추가를 클릭합니다.
    4. 새 컨테이너 유형을 추가 한 후, 해당 탭에 (오프셋 높이, 폭, 스택 크기 및 그리퍼) 새로운 컨테이너의 크기를 삽입하고 저장을 클릭합니다.
      1. 정확한 치수는 제조 업체에서 사용할 수없는 경우, 정확하게 캘리퍼스를 사용하여 가장 가까운 밀리미터에 모든 차원을 결정합니다. 컨테이너의 크기를 측정하는 오류는 판 이동기의 고장의 원인이됩니다.
    5. 반복 판 이동기가 발생하는 모든 컨테이너 유형에 대한 2.2.4.1 통해 2.2.2 단계를 반복합니다. 모든 실험 실용이 단계의 종료 후, 각 용기 (단계 2.2.6)의 시작 및 종료 위치를 정의 할 필요가있다.
      참고 :이 프로토콜에 대한 실험 실용은 6 웰 플레이트, 깊은 웰 플레이트, 그리고 96 웰 형광 검사 플레이트를 포함한다.
    6. 각 컨테이너의 시작과 끝 위치를 정의하려면, 특정 프로토콜에 시작 / 종료 탭을 클릭합니다. 우선, 각 콘테이너의 개시 위치를 선택한다. 다음으로, 시작과 끝 위치에서 모두 뚜껑 / Unlidded에 대한 확인란을 선택합니다. 모든 컨테이너에 대해 반복합니다.
      참고 : 용기는 EQU의 또 다른 조각에 남아있을 경우ipment은 (대신 판 이동기의) 최종 위치는 비워 둘 수 있습니다.
  3. 이 단계에서 수동으로 전체 워크 플로우의 시작 위치로 모든 판을로드합니다. 호텔 (3)에 BY-2 세포 호텔에 플레이트 히터 / 냉각 둥지 (2) 상 변환에 사용되는 96 깊은 웰 플레이트, 및 50 ml의 원뿔 2, 6 웰 플레이트를 96 웰 형광 검사 판을로드 다중 모드 분배기 상에 효소 용액 (보조 파일 1.2.2 절 참조)를 포함하는 튜브.
    1. 변환이 프로토콜하에 수행 될 경우, 웰 당 플라스미드 DNA 10 μL에 96 딥 웰 플레이트를 미리로드 (1 μg의 / μL하는 260/280> 1.8)을 OFP 리포터 작 제물을 함유하는 플레이트에 부화 4 ℃에서 가열 / 냉각. 각 웰은, 하나의 변환을위한 실험 장치에 따라 달라집니다 가득 우물 따라서 번호를 사용합니다.
  4. 하려면 자동 모든 용품 및 플레이트로드지정된 위치에서 D 액 처리 플랫폼은 자동화 제어 소프트웨어 (도 1b)의 각 항목의 위치를 정의한다.
    1. 1 열의 MMG에 40 % PEG 200 μL (0.4 M 만니톨, 100 밀리미터의 MgCl 2, 4 밀리미터 MES, pH를 5.7), 프로피 듐 요오다 이드 200 μL 미리로드 96 웰 플레이트 하중 (PI, 1 μg의 / ㎖) 2 열 및 3 열 (둥지 2) 에탄올 200 μL, 그리고 둥지 8 피펫 팁 상자에 입력하십시오.
    2. 메뉴에서 자동 액체 처리 플랫폼의 소프트웨어의 실험 실용의 위치를 선택 도구를 정의하고 연구소 용 편집기를 클릭합니다.
    3. 풀다운 메뉴에서 실험 실용의 유형을 선택하거나 새 연구소 용 버튼을 사용하여 새 실험 실용 유형을 정의합니다.
    4. 기본 프로토콜 탭을 선택하고 구성 연구소 용을 클릭하여 선택 실험 실용의 각 부분의 위치를 정의합니다. 자동화 된 액체 처리 플랫폼에 배치 실험 실용의 각 부분이 있는지 확인프로토콜을 실행하기 전에 정의.
    5. 자동화 된 프로토콜을 트리거하려면 프로필 탐색기 창을 클릭하고 실행하는 프로토콜 (원형질체 분리, 세포 수,PEG-매개 변환)의 이름을 선택합니다.
    6. 프로토콜에서 사용되는 모든 장치를 초기화 실행을 클릭합니다.
    7. 마지막으로, 작업 탐색기 창에서 시스템에있는 모든 용기 / 실험 실용을 확인하고 자동화 된 프로토콜을 시작하기 위해 작업 단위 추가를 클릭합니다.
      참고 : 자동화 된 프로토콜의 전체 설명은 보조 파일에 포함되어 있습니다.

3. 세포 수에 대한 표준 곡선을 설정

  1. 수동 1 ㎖를 1 × 106 원형질체 / ml의 농도로 원형질체를 농축시킨다. 원심 분리기는 10 분 동안 1,000 XG에서 원형질체 및 상층 액을 제거합니다.
  2. 수동으로 원형질체 펠릿에 (4 ° C로 유지) 70 % 에탄올 900 μl를 추가와 펠렛을 다시 일시 중지합니다. 세포를 해결하기 위해 얼음에 10 분 동안 품어.
  3. 핵 라벨 및 플레이트 리더 검출을 허용하도록 원형질체에 PI 100 ㎕ (1 μg의 / ㎖)를 추가합니다.
  4. 로드 2 열에서 시작하여 96 웰 형광 검사 판의 각각의 열과 행에 BY-2 미디어 액의 80 μL.
  5. 96 웰 형광 검사 판의 1 열에서 열에서 각 웰에 BY-2 미디어 원형질체의 70 μl를 50 μl를 추가합니다.
  6. 자동화 된 액체 처리 플랫폼의 둥지 6 접시를 놓고 2 배 연속 희석을 실행합니다.
    1. 자동화 된 액체 처리 플랫폼에 일련의 희석을 수행하려면 직렬 희석 마법사를 실행 클릭하고 전송 볼륨 (60 μL), 믹스 및 볼륨 (2, 70 μL), 초기 우물의 수 (열 1, 행 AF), 희석을 조절 우물 (열 2-11, 행 AF) 및 흡인 및 분배 특성 (물론 바닥에서 0.5 mm).
    2. 매개 변수를 설정 후, 저장프로토콜을 실행하는 거라고.
      주 : 모든 원형질체는 (인해 세포의 고정에) PI으로 표시되기 때문에, 형광은 원형질 농도에 비례한다.
    3. 시리얼 희석이 완료되면 둥지 (9)으로부터 상기 플레이트를 제거하고, 플레이트 리더에 삽입하고 플레이트 판독기 소프트웨어의 표준 곡선 프로토콜을 실행.
      주 : 표준 곡선은 다음 공지 원형질 농도로 각 웰에 PI에서 (여기 536 ㎚ / 620 nm의 발광)을 형광을 비교하여 생성된다.
  7. 플레이트 리더 프로토콜의 종료 후 플레이트를 제거한 오토 클레이브 또는 '바이오 프로토콜에 정의 된 다른 드 및 활성화 절차에 대한 형질 전환 세포를 수집한다.

변환 4. 현미경 분석

  1. 형질 전환 된 원형질체 로봇 시스템의 호텔 (1)에서 (자동 프로토콜 3, 보충 파일의 제품)와 플레이트를 제거합니다.
  2. 회전거꾸로 현미경, 카메라, 형광 램프.
  3. , 원형질체에 초점을 맞춘 초기의 10 배 목표를 선택 할로겐 램프를 켠 형광 램프 셔터를 닫습니다.
  4. 브라이트를 사용하여 원형질체에 현미경 시스템과 초점 상에로드 플레이트.
  5. 원형질체에 초점을 맞춘 후, 할로겐 전구를 끄고 형광 램프 셔터를 엽니 다.
  6. 형질 전환 원형질체로 표시되는 pporRFP 단백질의 시각화를위한 설정 CY3 / TRITC 필터를 선택합니다.
  7. pporRFP 형광 마커를 표현 원형질체의 수를 결정하기 위해 각 웰을 스캔합니다.
  8. 형광 마커를 원형질체의 총 수를 표현 원형질체의 총 개수 등의 변환 효율을 계산한다.
  9. 고압 증기 멸균 또는 '바이오 안전성 프로토콜에 정의 된 다른 탈 활성화에 절차에 대한 승인 바이오 안전성 가방에 형질 전환 세포를 포함하는 접시를 수집합니다.

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Representative Results

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현재 연구에서, BY-2 배 속도는 15 hr의 평균 세포주기 길이 이전보고와 일치 배양은 배양되는 온도에 따라 14 ~ 18 시간에서 변화. 이 두배 속도로, 1 : 100부터 접종 5-7 일 동안 50 %의 적혈구 용적 (PCV)를 배양 선도 배양을 개시 하였다. 배양 매체 200㎖에 성장 된 상기 현재 프로토콜에서, 100 ㎖의 PCV 33 6- 웰 플레이트를 채우기에 충분한 세포를 제공 칠일, 생성 하였다. 원형질체 수율의 관점에서, 프로토콜에 규정 된 조건에서 분해 6 웰 플레이트 (도 2a) 당 2.82 × 106 원형질체 결과 웰 당 4.70 × 105 ± 5.77 × 103 원형질체 생성. 이들 데이터에 기초하여, (214)를 96- 웰 플레이트 (웰 당 70 μL의 원형질체)의 전위와 FO 단일 6 웰 플레이트 소화로부터로드 될 수있는R 개의 6- 웰 플레이트는 두 플레이트 히터 / 냉각 스테이션을 이용하는 동시에 절단한다. 따라서, 하나의 3 시간 소화 프로토콜 동안 생성 될 수있는 원형질체의 최대 수는 5.64 × 106이다.

소화 프로토콜에 따라 생성 된 원형질체의 갯수가 시스템에 대한 하나의 측정을 제공하지만, 상기 원형질체는 프로토콜의 여러 단계를 통해 전송 될 때 원형질 농도의 손실을 평가할 필요가있다. 이와 같이, 원형질체의 농도는 프로토콜의 각 전송 단계 후에 평가 하였다. 변환 프로토콜, 또는 96 웰 형광 차폐 판 (도 2B)를 행하는 경우 소화 프로토콜 후, 1.15 × 104 ± 1.35 × 106이 원형질체는도 96 딥 웰 플레이트의 각각에 옮겼다. 프로토콜 변환이 완료된 후, 1.23 × 103 ± 4.66 X10 원형질체는 96 웰 형광 검사 판 (그림 2C)로 옮겼다. 전사 원형질체의 수 또한, 다수의 피펫 팅 단계는 원형질체를 손상하지 않도록 원형질체의 생존력을 결정하는데 중요하다.

원형질체 95.1 ± 0.04 %로 소화 후 생존 하였다 생존력 분석의 결과, 96 웰 형광 스크리닝 플레이트에 전사 한 후 92.1 ± 0.06 %이고, 프로토콜 변환 후에 91.7 ± 16.67 %에 대하여. 여러 피펫 단계에도 불구하고, 샘플의 어떠한 유의 한 차이 (p> 0.44)이 없었다. 생존이 측정 외에, 프로토콜은 PI 염색 원형질체의 총 수를 측정하는 절차의 모든 단계에서 원형질체의 농도를 결정하기 위해 개발되었다. 도 3에 도시 바와 같이, 표준 곡선 generat라는이었다시스템에서 공지 된 원형질체의 농도에 대한 형광 강도를 측정하여 에드. 표준 곡선 웰 당 0 내지 30,000 원형질체의 범위에 걸친 원형질체의 총 수와 잘 맞는 (= 0.967 R (2))이었다. 표준 곡선 (8125 및 24375은 혈구를 이용하여 계산) 원형질체 알려진 번호 샘플의 형광 강도를 수득하고, 표준 곡선의 식으로부터 계산 된 원형질체의 개수를 확인한다. 이러한 결과에 기초하여, 표준 곡선은도 15 및 14 %의 오차를 각각 9,560 및 28,200 원형질체를 예측했다. 또한 혈구를 이용하여 세포 수를 측정하는 변화가 있음을 고려하여,이 에러는 허용 가능한 것으로 간주되었다.

F - 세포 수 및 생존율의 결과에 더하여, 형질 전환 프로토콜 OFP (도 2D를 발현하는 형질 전환 세포를 생성하는데 성공). 불행하게도 사용되는 프로토콜은 ~, 저이 연구에서와 프로토콜은 BY-2 원형질체를 위해 특별히 최적화되지 이후 사용되는 대형 16,028 bp의 이진 플라스미드로 인해 2 %, 변환 효율을, 결과. 논의에서 밝혀진 바와 같이 BY-2 원형질체에 대한 특이 시약 및 조건의 관점에서 변환 프로토콜 최적화는, 변환 효율이 증가 할 것으로 예상된다. 이 프로토콜의 관점에서, 상기 형질 전환 과정은 형질 전환에 대한 원형질 분리의 개념 증명 경로를 입증하도록 설계 목표를 달성하는데 성공 하였다.

성공적 개별 모든 절차의 유효성을 검사 한 후, 측정 항목으로 변환 원형질체로부터 분리 프로토콜 timecourse 얻어졌다. 도 4에서 증명 된 바와 같이, 시간의 큰 투자가 3 시간이 fo를 요구되었던 소화 단계에 소요되는원형질체의 세포벽 및 릴리스 완전히 소화 r에. 이 절차를 수행하는 동안, 18 루프는 두 역 사이의 판을 이동 플레이트 이동기와, 플레이트 통 및 플레이트 히터 / 냉각기 1 부화 역 사이에 실행됩니다. 플레이트 통 및 플레이트 히터 사이의 전송 시간은 / 냉각 한 단지 8.9 초 소요되며, 분해 과정의 대부분은 배양 진탕 소비되는 것을 보장한다. 다중 모드 디스펜서 효소 로딩을 완료 절차의 개시로부터 총 시간은 2.2 분이다. 전반적으로, 전체 원형질체 분리 프로토콜은 3 시간 22.8 분에 완료된다. 이러한 결과에 기초하여, 원형질체 분리 프로토콜의 88 %가 분해 소요된다. 원형질체 분리 프로토콜 완료 후, 변환 프로토콜을 개시하고, 275 분 이내에 완료. 원형질체 분리 프로토콜과 유사하게, 변환 절차의 72 %가 반응 배양 소요된다. 프로토콜에서 유일하게 다른 단계그 중요한 시간 구성 요소 (> 총 시술 시간의 10 %) 절차의 전체 시간의 14 %를 차지 자동화 된 액체 처리 플랫폼으로 프로토콜의 초기화에 있습니다. 이러한 방식으로, 프로토콜의 86 %는 피펫 및 전송 단계에서 소요되는 시간의 14 %로, 초기 배양에서 소비된다. 원형질체 분리 및 변환의 전체 기간은 운영자의 필요없이 외부 입력으로, 3 시간, 50 분, 53 초였다.

그림 1
그림 1 :. 프로토콜 동안 로봇 플랫폼과 자동화 된 액체 처리 플랫폼의 구성의 도식은 (A) 로봇 시스템은 판 이동기에서 액세스 할 수있는 3 판 스택 / 호텔로 구성되어있다. 호텔 1 지정된 리딩 / delidding 방송국 호텔 2 96 웰 형광은판 스택, 호텔 3 6- 웰 플레이트의 스택이다. 이 시스템은 두 개의 액체 핸들러, 자동화 된 액체 핸들링 플랫폼 및 노즐 기반 멀티 모드 디스펜서를 갖는다. 로봇 플랫폼을 냉각 가열 /를 들어 접시를 혼합 판 쉐이커와 함께 두 개의 플레이트 가열 / 냉각 장치가 있습니다. 마지막으로, 시스템은 형광을 측정하기위한 단색화 기반 플레이트 판독기를 갖는다. 모든 구성 요소는 사용자 정의 내장 바이오 안전성 캐비닛에 보관되어 있습니다. (B) 종래 실험 프로토콜을 호출하는 자동화 된 액체 핸들링 플랫폼 둥지 제 (C)의 구성에 놓인 시약 판과 팁 박스에 의해 점유 둥지 2 자동화 된 액체 핸들링 플랫폼의 구성을 시작. 깊은 웰 플레이트 둥지 (4)에 위치하고 있으며, 96 웰 형광 검사 판 둥지 (6)에 위치하며, 원형질체를 포함하는 6 웰 플레이트가 둥지 (5)에있는 V 여기를 클릭하십시오 이 그림의 더 큰 버전을 서평.

그림 2
그림 2 : 각 전송 후와 오렌지 형광 단백질 리포터 유전자로 변환 후 BY-2 원형질체의 대표 이미지 (A - C)의 현미경 사진 BY-2 원형질체의 밀도를 6 웰 플레이트 (70)의 전송 후 96 웰 플레이트입니다. 6 웰 플레이트에서 μL, 96 웰 형광 검사 판 후 변환. 변환 후 BY-2 원형질체의 (D) 브라이트 현미경 사진. OFP의 유전자를 발현 (E) 형광 BY-2 원형질체는 Cy3에 / TRITC 필터 설정을 사용하여 시각. (F) 시야의 중첩 형광 현미경 사진 변환의 낮은 효율을 보여주는. 스케일 바는 50 μm의 =. 대상 = "_ 빈">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
3. 원형질체의 수를 계산하기위한 표준 곡선 웰에 주어진 원형질체의 수는 표준 곡선에 대한 방정식을, 임의 단위 (AU)에서 형광 강도를 비교함으로써 계산 될 수있다. 원형질체 번호의 유효성 검사는 혈구 계산에 9561 플레이트 판독기에서 식별 원형질체 및 8125와, 그래프에 표시된 시점에서의 표준 곡선과 혈구를 비교 하였다. 전반적으로, 15 %의 오류가 두 기술 사이에서 발견되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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도 4 :. BY-2 원형질체 형질 전환 유전자의 제조에 기술 된 절차 간트 차트 프로토콜의 대부분 ~ 3 시간이 원형질체를 생성 BY-2 세포의 분해에 소비된다. 효소 솔루션 및 불 활성화의로드는 전체 시술 시간의 12 %를 필요로한다. 유사하게, 플레이트 쉐이커상에서 변환 반응의 인큐베이션 변환 프로토콜의 72 %를 차지한다. 전반적으로, 유전자 변형이 달성 될 때까지 원형질체 분리의 절차를 4 시간 (3 시간, 50 분, 53 초)을 받고있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

추가 파일 : 원형질체 분리, 세포 계수 및 PEG-매개 형질 전환을위한 자동화 된 프로토콜 <.이 파일에 포함 된 위의 각 작업을 수행하는 로봇 플랫폼에 사용하기 위해 개발 / strong>을 완료 프로토콜을 지원합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

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위에서 설명한 프로토콜은 성공적으로 원형질체 분리, 열거, 및 변환에 의해-2 담배 현탁 세포 배양을 사용하기위한 검증되었습니다; 그러나, 프로토콜은 쉽게 식물 현탁 배양으로 확장 될 수있다. 현재, 원형질체 분리 및 변형 옥수수 (ZEA 메이스) (10), 당근 (Daucus의 carota) (32), 포플러 (사시 나무속 euphratica) (33), 포도 (유럽 종 포도) (34), 기름 야자 (Elaeis의 guineensis) (35) 등 다양한 식물에서 달성되었다 양상추 (왕 고들빼기 속 sativa로구나) (36), 겨자 (브라 시카 사건) (37),(벼) (38), 및 스위치 그래스 (Panicum의 virgatum) 39, 40. 문화와 소화 조건의 변화 동안 발굴의 조건을 배양 배지를 교체 또는 변경,이 연구에서 개발 한 프로토콜의 측면에서 종 종 발생estion는 기본 프로토콜을 변경하지 마십시오. 따라서 이러한 구성 요소를 교체하는 것은 사소한 이전 프로토콜의 초기화에 운영자에 의해로드 된 소화에 필요한 다른 종, 문화 미디어와 효소로 조정합니다. 추가 이점으로서,이 프로토콜은 시스템에 의해 측정 된 원형질체의 수율 여러 소화 조건 스크리닝을 수정할 수있는 것이다. 저비용 효소의 사용은 높은 쓰루풋 어플리케이션에 필요한 이것은 따라서 소화에 사용되는 효소의 양을 최소화하는 것이 중요하다, 필수 성분이다.

다른 식물 종으로부터 분리 된 원형질체의 형질 전환 시스템을 채택 할 때 배양 소화 마찬가지로, 변환 프로토콜에 대한 변경이 요구된다. 상당한 작업은 변환 효율에 영향을 미치는 다양한 요인 식물 원형질체 16,35에 PEG 매개 변환의 최적화를 실시하고있다. WO 현재의변환 효율에 영향을 미치는 하나의 제한 요소 RK 이진 테스트 플라스미드 대형이고, 게놈 편집 플라스미드 크기 모델링의 목적을 위해 사용되었다 16028 BP. BY-2 원형질체의 PEG-매개 형질 전환에 대한 이전의 연구에서 40-60 %의 변환은 달성되었다; 그러나, 이들 연구는 작은 5000 bp의 플라스미드 (41, 42)을 사용했다. 종 중 PEG-매개 형질 전환에 차 수정은 PEG와의 MgCl 2, 금액 및 DNA 농도의 농도 및 반응 시간을 포함한다. PEG 및 2의 MgCl 용액 시약 플레이트의 시스템에 도입하고 DNA가 사전로드 된 딥 웰 플레이트이다됨에 프로토콜 상술 이러한 조건을 용이하게 변경 될 수있다. 또한 정밀 로봇 플랫폼에 의해 제어 될 수 있으며, 증가 또는 혼합 속도의 변경과 함께 배양 시간을 감소시킨다. 변환 프로토콜의 전류 제한은 부족정당한 BY-2 원형질체의 PEG 매개 변환의 낮은 효율로 형광 리포터를 검출 플레이트 판독기를 사용하여 스크리닝. 이러한 애기 장대와 옥수수 (16)와 같은 다른 종에서, PEG-매개 형질 전환은 40 % 내지 90 % 효율적이다. 이러한 시스템에서 형질 빠르게 로봇에 플레이트 판독기를 사용하여 특성화 될 수있다. 따라서, 양의 형질 전환과 웰을 식별하고, 또한 발현 수준을 정량화하는 것이 가능하다. 이러한 프로모터 검사와 같은 애플리케이션의 경우,이 기능은 현재 프로토콜의 유틸리티를 증가, 시스템의 이상 반복에 추가됩니다.

BY-2 원형질체에 대한 변환 효율을 최적화하는 것 외에도 여러 가지 변형이 시스템의 효율성 및 전체 처리량을 증가시킬 수있다. 원형질체 변환 허용 원형질체의 자동화에 대한 이전의 연구는 이전에 있었다의 추가로, 우물의 바닥에 정착시간 솔루션 (43). 현재의 프로토콜에서, 원형질체는 침강 방지 평평한 바닥 웰 플레이트를 사용하여 현탁액의 원형질체를 유지 플레이트 진탕 기에서 혼합 하였다. 또한, 변환시, 원형질체는 깊은 웰 플레이트에 정착 장시간 노출을 통해 독성이있을 수 있습니다 PEG에 대한 노출을 줄이기 위해 허용되지 않았다. 96 웰 형광 스크리닝 플레이트에 깊은 웰 플레이트에서 전송 될 때와 같이, 원형질체는 웰 당 1.23 × 103 ± 4.66 × 106 1 원형질체 결과적 ~ W5 용액으로 10 배 희석 하였다. 변환 후 전송 원형질체의 수를 증가시키기 위하여, 배양 단계는 원형질체 정착 할 수 있도록 첨가 할 수 있고, 상층 액 BY-2 미디어의 작은 부피 첨가하여 제거 하였다. 판 원심 기반 시스템에 첨가하는 경우 또한,이 단계는 더 빠르게 달성 될 수있다. T로 기능을 추가 할 수있는 또 다른 수정그 시스템은 변환 전의 절연 원형질체의 실행 가능성을 결정하기 위해 실시간 / 죽은 형광 분석법의 사용 일 것이다. 현재 프로토콜에서, 플루오 레세 인 디 아세테이트 (FDA)은 라이브 염료로 시험 하였다; 그러나, BY-2 원형질체의 배경 형광은 FDA 신호를 가려. 보다 안정된 생존 성 염료가 사용 된 경우, 원형질체 생존 녹색, 적색 (PI)의 비 (칼 세인 AM 등) 형광 셀 카운팅 프로토콜 표준 유사한 같이 결정될 수있다. 이러한 수정은 시스템에 추가 기능을 추가하는 것, 및 미래의 프로토콜을 포함한다.

현재의 프로토콜에 관해서, 프로토콜의 성공을 보장하기 위해 따라야하는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫째, BY-2 문화의 시대 / 건강은 가능한 원형질체가 다음 단계는 분리 될 수 보장하는 것이 필수적이다. (A)에서 신선한 플라스크에 로그 상 문화를 전송함으로써, 단계 1.3에서 설명하고있는 바와 같이배양 5-7 일 동안 성장하게 1시 50분 신선한 매체 세포의 비율, 그리고, 가능한 원형질체의 최대 수는 분리 될 수있다. 문화가 크게 원형질체의 수율을 감소시키고, 후속 프로토콜의 고장의 원인이됩니다 지정된 접종을 사용하여 길거나 짧은 기간에 대한 성장 할 수 있도록 허용. 두 번째 중요한 단계 대신 지정된 넓은 구멍 피펫 팁, 표준 피펫 팁의 사용, 이후 팁 방해 및 전송되는 잘못된 볼륨으로 이어질하게됩니다 단계 1.5입니다. 로봇 시스템의 설치에 관해서는, 자동화 된 액체 핸들링 플랫폼 판의 배치는, 2.4, 단계 6 웰 플레이트의 모든 웰에 도달하는 액체 핸들러의 선두를 방지 변경된 설정으로 중요하다. 때문에 자동화 된 액체 처리 플랫폼의 설계, 6 웰 플레이트 둥지 5에 위치해야하며,이 악기 선택 프로토콜이 실패합니다. 마찬가지로, 실패 올바르게 판에 실험 실용을 정의이동기 소프트웨어, 단계 2.2, 악기를 잡아 실패, 또는 ​​프로토콜의 종료의 결과로 실험 실용를 삭제하게됩니다. 셀 카운트 프로토콜의 경우, 중요한 단계는 에탄올, 단계 3.2 세포의 고정을 포함한다. 세포는 PI와 라벨 이전에 고정되지 않은 경우 만 생존 할 세포 대신 원형질체의 전체 인구의 레이블이 될 것입니다, 고립 된 원형질체의 수를 카운트 할 수 없습니다. 마지막으로 중요한 공정, 스텝 4.6은 pporRFP 형광 마커의 발현을 현미경 분석을위한 형광 필터들의 선택을 포함한다. 다른 "빨간색"필터 세트의 사용은 크게 변환 효율의 계산을 방지 모두 엽록체 함유 원형질체에서의 신호가 증가 엽록소으로부터 배경 형광을 허용한다. 조심스럽게이 중요한 단계에 사양을 준수하는 것은 성공을위한 최고의 기회와 가장 재현 datas의 생성을 보장등.

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Disclosures

저자는 더 경쟁 재정적 관심이 없음을 선언합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Orbitor RS Microplate mover Thermo Scientific
Bravo Liquid Handler Agilent
Synergy H1 Multi-mode Reader BioTek
MultiFlo FX Multi-mode Dispenser BioTek
Teleshake Inheco 3800048
CPAC Ultraflat Heater/cooler Inheco 7000190
Vworks Automation Software Agilent Software used to control and write protocols for Agilent Bravo
Momentum Software Thermo Scientific Task scheduling software for controlling Orbiter RS
Liquid Handling Control 2.17 Software Biotek Software used to control and write protocols for MultiFlo FX
IX81 Inverted Microscope Olympus
Zyla 3-Tap microscope camera Andor
ET-CY3/TRITC Filter Set Chroma Technology Corp 49004
Rohament CL AB Enzymes sample bottle low-cost cellulase
Rohapect UF AB Enzymes sample bottle low-cost pectinase
Rohapect 10L AB Enzymes sample bottle low-cost pectinase/arabinase
Linsmaier & Skoog Basal Medium Phytotechnology Laboratories L689
2,4-dichlorophenoxyacetic acid Phytotechnology Laboratories D295
propidium iodide Sigma Aldrich P4170
Poly(ethylene glycol) 4000 Sigma Aldrich 95904-250G-F Formerly Fluka PEG
Propidium Iodide Fisher Scientific 25535-16-4 Acros Organics
CaCl2 Sigma Aldrich C7902-1KG
Sodium Acetate Fisher Scientific BP333-500
Mannitol Sigma Aldrich M1902-1KG
Sucrose Fisher Scientific S5-3
KH2PO4 Fisher Scientific AC424205000
KOH Sigma Aldrich P1767
Gelzan CM Sigma Aldrich G1910-250G
6-well plate Thermo Scientific 103184
96-well 1.2 ml deep well plate Thermo Scientific AB-0564
96 well optical bottom plate Thermo Scientific 165305
Finntip 1000 Wide bore Pipet tips Thermo Scientific 9405 163
NaCl Fisher Scientific BP358-10
KCl Sigma Aldrich P4504-1KG
MES Fisher Scientific AC17259-5000
MgCl2 Fisher Scientific M33-500

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References

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높은 처리량 원형질체 분리 및 변환을위한 로봇 플랫폼
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Dlugosz, E. M., Lenaghan, S. C., Stewart, Jr., C. N. A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation. J. Vis. Exp. (115), e54300, doi:10.3791/54300 (2016).More

Dlugosz, E. M., Lenaghan, S. C., Stewart, Jr., C. N. A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation. J. Vis. Exp. (115), e54300, doi:10.3791/54300 (2016).

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