Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

التصوير تطهيرها الجنينية وبعد الولادة قلوب في قرار وحيدة الخلية

Published: October 7, 2016 doi: 10.3791/54303
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 1
1Department of Molecular and Cellular Physiology, Albany Medical College, 2Department of Neuroscience and Experimental Therapeutics, Albany Medical College

Abstract

تتبع نسيلي واحد والتحليل على مستوى كامل للقلب يمكن تحديد القلب السلوك خلية سلفية والتمايز خلال تطوير القلبية، والسماح لدراسة أساس الخلوية والجزيئية من التشكل القلب الطبيعي وغير الطبيعي. التقنيات الحديثة الناشئة من التحليلات نسيلي واحدة بأثر رجعي تجعل دراسة التشكل القلب في قرار خلية واحدة قابلة للتنفيذ. ومع ذلك، يتم زيادة التعتيم الأنسجة وتشتت الضوء من القلب وعمق التصوير تعيق التصوير كله القلب في قرار خلية واحدة. للتغلب على هذه العقبات، ونظام المقاصة كامل الجنين التي يمكن أن تجعل القلب شفافة للغاية لكلا الإضاءة والكشف ويجب وضع. لحسن الحظ، في السنوات القليلة الماضية، تم الإبلاغ عن العديد من المنهجيات لأنظمة المقاصة كله الكائنات مثل وضوح، هيئة السلع التموينية جنيه، SeeDB، ClearT، 3DISCO، مكعب، قسم تعزيز الحدود، BABB وباكت. هذا المختبر هو مهتم في الآليات الخلوية والجزيئية للبطاقةIAC التشكل. في الآونة الأخيرة، أنشأنا النسب خلية واحدة تتبع عبر ROSA26-لجنة المساواة العرقية ERT2، ونظام ROSA26-النثار إلى خلايا التسمية قليلة خلال تطوير القلب. نحن تكييفها عدة منهجيات لازالة الجنين كلها بما في ذلك هيئة السلع التموينية جنيه ومكعب (واضحة، دون عائق الكوكتيلات تصوير الدماغ والتحليل الحسابي) لمسح الجنين في تركيبة مع جبل بأكمله تلطيخ لاستنساخ واحدة صورة داخل القلب. تم تصوير القلب بنجاح في قرار خلية واحدة. وجدنا أن هيئة السلع التموينية جنيه يمكن مسح قلب الجنين، ولكن لا يمكن مسح بشكل فعال القلب ما بعد الولادة، في حين CUBIC يمكن مسح قلب ما بعد الولادة، ولكن الأضرار قلب الجنين عن طريق إذابة الأنسجة. سوف الأساليب المذكورة هنا يسمح للدراسة وظيفة الجينات في قرار استنساخ واحد خلال التشكل القلب، والتي، بدورها، يمكن أن تكشف عن الأساس الخلوي والجزيئي لعيوب القلب الخلقية.

Introduction

التشكل القلب هو حدث متسلسل يتطلب تنظيم الزمانية المكانية من أربعة أنواع مختلفة من الخلايا الاصلية القلب في قطاعات متميزة من القلب، وأيضا يتطلب عدة شبكات تنظيمية الوراثية لتنظيم هذه العملية لتشكيل 1،2 القلب وظيفية. وينظم القلب مواصفات، والتمايز، الزخرفة، ونضوج غرفة من عوامل النسخ قلبية 3. طفرة جينية أو انحراف posttranscriptional هذه العوامل في الخلايا الاصلية في القلب يمكن أن يؤدي في أي الفتك الجنينية أو عيوب خلقية في القلب (CHD) 4. دراسة التشكل القلب تتطلب فهم التفاصيل الكامنة الهيكلية في ثلاثة أبعاد (3D) واحد وصفت القلب النسب خلية سلفية تتبع أثناء التطور القلب وتعزيز فهم التشكل القلب. وقد تم تطوير عدد من عالية الدقة القسم على أساس أساليب التصوير المقطعي في الالبريد الماضي بضعة عقود إلى صورة هيكل الجهاز 5،6. ومع ذلك، وهذه الأساليب تتطلب باهظة الثمن، والأدوات المتخصصة، والعمل المكثف، وتفتقر إلى التنظيم الهيكلي مفصلة في قرار خلية واحدة في الحجمي النهائي بناؤها صورة 7،8.

التصوير الحجمي 3D على مستوى خلية واحدة يوفر وسيلة لدراسة تمايز الخلايا السلف والسلوك الخلوية في الجسم الحي 7. ومع ذلك، لا يزال ضوء الأنسجة نثر العقبة الرئيسية أمام تصوير الخلايا والهياكل في 3D عمق قلب سليمة. الدهون هي المصدر الرئيسي للتشتت الضوء، وإزالة الدهون و / أو تعديل الفرق معامل الانكسار بين الدهون والمناطق المحيطة بها من النهج المحتملة لزيادة الشفافية الأنسجة 8. في السنوات القليلة الماضية، تم تطوير عدد من الطرق المقاصة الأنسجة، مما يقلل من التعتيم الأنسجة وتشتت الضوء، مثل BABB (الكحول البنزيل وbenzoat البنزيلالبريد خليط) وقسم تعزيز الحدود (رباعي هيدرو الفوران وdibenzylether)؛ ولكن في هذه الأساليب، لا يزال مضان تبريد قضية 8-10. المذيب تستند أساليب ماء، مثل SeeDB (الفركتوز / thioglycerol) و3DISCO (ثنائي كلورو ميثان / dibenzylether)، والحفاظ على إشارات الفلورسنت، ولكن لا تجعل الجهاز كله شفاف 7،8،11. في المقارنة، وضوح طريقة الأنسجة إزالة يجعل الجهاز شفافة، ولكنه يتطلب جهاز الكهربائي متخصص لإزالة الدهون 8،12، كما يفعل باكت (تقنية الوضوح السلبي)، الأمر الذي يتطلب أيضا هيدروجيل تضمينها 7،13. للحصول على معلومات مفصلة عن جميع طرق ازالة الأنسجة المتاحة، يرجى الرجوع إلى الجدول 1 في ريتشاردسون ويختمن، وآخرون. 7.

في عام 2011، حماة وآخرون. اكتشف مصادفة خليط ماء "هيئة السلع التموينية جنيه" (اليوريا والجليسرول وتريتون X-100 خليط) أن يجعل دماغ الفأر وtranspar الجنينوالأنف والحنجرة مع الحفاظ تماما إشارات الفلورسنت من الحيوانات المستنسخة وصفت 14. وهذا يسمح لتصوير الدماغ سليمة على عمق عدة ملليمترات وإعادة البناء على نطاق واسع من السكان والتوقعات العصبية في قرار التحت خلوية. سوساكي وآخرون. زيادة تحسين هيئة السلع التموينية جنيه بإضافة aminoalcohols وضعت "مكعب" (واضحة، دون عائق الكوكتيلات تصوير الدماغ والتحليل الحسابي) طريقة إزالة الأنسجة، مما أدى إلى زيادة ذوبانية فوسفورية، وخفض الوقت المقاصة، ويسمح للمتعدد الألوان الفلورسنت التصوير 8. في هذه الدراسة، والاستفادة من هيئة السلع التموينية جنيه وتقنيات إزالة الأنسجة مكعب وعالية الدقة 3D باجتزاء البصرية، استنساخ الفردية داخل القلب أثناء تخلق القلب وتتبع باستخدام Rosa26Cre ERT2 15، R26R-النثار 16، αMHC-لجنة المساواة العرقية 17، cTnT-لجنة المساواة العرقية 18، Nfatc1-لجنة المساواة العرقية 19، وRosa26-mTmG (mTmG) 20 خطوط الماوس. مزيج من طريقة جبل بأكمله تلطيخ (WMS) وضعت سابقا 21،22 مع طرق إزالة الأنسجة يسمح كذلك إلى تلطيخ للبروتينات أخرى في استنساخ وصفت ولدراسة سلوكهم في سياق الحجمي 3D. مزيج من تطهير الأنسجة وWMS يسمح لفهم أفضل لدور الجينات والبروتينات المختلفة أثناء التطور القلب، والمسببات من عيوب خلقية في القلب. ويمكن تطبيق هذا البروتوكول لدراسة أخرى تمايز الخلايا السلف، والسلوك الخلوي، والأحداث الجهاز التشكل خلال التنمية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وقد وافق جميع التجارب على الحيوانات من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي (IACUC) في كلية ألباني الطبية وإجراء وفقا لدليل المعاهد الوطنية للصحة للرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية.

1. الاستعدادات الحل

ملاحظة: Rosa26Cre ERT2 15، R26R-النثار 16، αMHC-لجنة المساواة العرقية 17، وRosa26-mTmG (mTmG) تم شراء 20 خطوط الماوس تجاريا كان cTnT-لجنة المساواة العرقية 18 هدية من الدكتور جياو في جامعة ألاباما Nfatc1-لجنة المساواة العرقية. كانت هدية من الدكتور بن تشو في كلية ألبرت أينشتاين للطب 19. والموت الرحيم الفئران عن طريق استنشاق ثاني أكسيد الكربون في غرفة مغلقة لمدة 60 ثانية على الأقل تليها الوسائل المادية التحقق الموت بضع الصدر الثنائي، قطع الرأس أو خلع عنق الرحم.

  1. إعداد تاموكسيفين. حل 10 ملغ من عقار تاموكسيفين في 10 مل من منظمة اوكسفام الدولية بذور عباد الشمسل. مرة واحدة يتم حله تماما، قسامة ومخزن في -20 درجة مئوية.
  2. إعداد مخزنة المالحة الفوسفات (PBS). حل نا 2 هبو 4 (1.41960 جم)، KH 2 PO 4 (0.24496 جم)، كلوريد الصوديوم (8.0669 ز) و بوكل (0.20129 جم) في 1 لتر من الماء المقطر، وضبط درجة الحموضة إلى 7.4.
  3. إعداد PBST: 0.1٪ توين 20 الحل في برنامج تلفزيوني عن طريق تذويب 100 ميكرولتر من توين-20 في 100 مل من برنامج تلفزيوني.
  4. إعداد عازلة تمنع. تقديم 3٪ زلال المصل البقري (BSA) عرقلة الحل عن طريق إذابة 3 غرام من جيش صرب البوسنة في 100 مل من PBST تحتوي على 0.2٪ توين-20.
  5. إعداد مكعب 1 (كاشف 1). خلط 25٪ بالوزن اليوريا 25٪ بالوزن N، N، N '، N' tetrakis (2-هيدروكسي) الإيثيلين و 15٪ بالوزن تريتون X-100 في DH 2 O.
  6. إعداد مكعب 2 (الكاشف 2). خلط 50٪ بالوزن السكروز، 25٪ بالوزن اليوريا، و 10٪ بالوزن 2، 2، 2 '' - nitrilotriethanol و 0.1٪ (ت / ت) تريتون X-100 في DH 2 O.
  7. إعداد هيئة السلع التموينية جنيه A2: 4 M اليوريا، و 10٪ ث / الجلسرين الخامس و 0.1٪ ث / ت تريتون X-100 في DH 2 O. ضبط درجة الحموضة إلى 7.7.
  8. إعداد هيئة السلع التموينية جنيه B4: 8 M اليوريا و 0.1٪ ث / ت تريتون X-100 في DH 2 O. ضبط درجة الحموضة إلى 8.7.
  9. إعداد هيئة السلع التموينية لو 70: 4 M اليوريا، و 70٪ ث / ت الجلسرين و 0.1٪ ث / ت تريتون X-100 في DH 2 O.

2. تاموكسيفين والاستقراء، وعزل الأجنة والتثبيت

  1. تاموكسيفين الحث وعزل الأجنة
    1. باستخدام بروتوكول أنبوب التغذية المنحني المعتمدة (ACUP 13-12007)، أنبوب تغذية للإناث الفئران R26Cre ERT2 النثار (توصيل بواسطة R26Cre ERT2 الفئران الذكور) مع 10 ميكروغرام / غرام من تاموكسيفين في اليوم التنموي الجنينية E7.75 33. في اليوم الجنينية 9.5 (E9.5) أو E10.5، الموت ببطء إناث الفئران مع CO 2 والتفكك عنق الرحم.
    2. بعد التحقق من وفاة الماوس (انظر القسم 1 لاحظ)، فتح الماوس تجويف البطن مع مقص وتشريح خارج قرن الرحم، وإزالة طبقات أنبوب الرحم بمساعدة مقص وملاقط، وإعادةاستئجار الأجنة من 23،24 أنبوب الرحم.
      1. نقل الأجنة إلى طبق بتري تحتوي على برنامج تلفزيوني (الرقم الهيدروجيني 7.4). تحت المجهر تشريح، وإزالة طبقات غير الجنينية (المشيمه، الكيس المحي والسلى) مع مساعدة من ملاقط.
    3. باستخدام الملقط والمقص، وجمع العينات الماوس وذيل الجنين الأنثى التنميط الجيني كما ذكرت سابقا 22. باستخدام ماصة بلاستيكية، ونقل كل جنين إلى بئر من لوحة جيدا 48 تحتوي على 1 مل من برنامج تلفزيوني 1X.
    4. تحت المجهر الفلورسنت، وتحديد GFP / RFP / CFP الأجنة إيجابية عن طريق مجهر مقلوب مع كاميرا. قشر بعيدا التأمور باستخدام الملقط وتدوير القلب / جنين مع مساعدة من ملاقط منحنية لتحديد عدد من الحيوانات المستنسخة الفلورسنت على كلا الجانبين من القلب مع المرشحات GFP / RFP / الحراجية المعتمدة. هناك حاجة إلى أي تخفيضات.
  2. بعد تحديد GFP / RFP / CFP الأجنة إيجابية، بسرعة غسل الأجنة مرتين (2 دقيقة لكل منهما) مع برنامج تلفزيوني 1X في اله 48 جيدا لوحة على شاكر لوحة في درجة حرارة الغرفة (RT). سيؤدي هذا إلى إزالة الدم الزائد.
  3. إصلاح الجنين / قلب الجنين باستخدام 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) في RT. الساعة التثبيت يعتمد على الجنينية العمر والنسيج الحجم. لE9.5 إصلاح الجنين لمدة 2 ساعة على RT. تتطلب الأجنة المرحلة الجنينية في وقت متأخر أطول وقت التثبيت، والتي يمكن أن يكون حتى لفترات طويلة على مدار 24 ساعة لقلبك ما بعد الولادة.
    تنبيه: لامتصاص العرق غير سامة، وتجنب ملامسة الجلد والعينين والأغشية المخاطية.
  4. بعد التثبيت، وغسل الجنين / القلب في البئر لوحة 48 مرتين (10 دقيقة لكل منهما) مع برنامج تلفزيوني 1X على شاكر لوحة في RT. هذا يزيل الزائد PFA من الجنين / قلب. ثم يتم زيادة معالجة الأجنة لجبل بأكمله تلطيخ والمقاصة الأنسجة.

3. الجامع جبل تلطيخ

ملاحظة: بعد تثبيت PFA يتعرض الجنين / قلب لجبل بأكمله تلطيخ على النحو التالي.

  1. Permeabilize الجنين / القلب في طبق بشكل جيد لمدة 48 باستخدام 1 ملتر من 0.1٪ PBST لمدة 2 ساعة على لوحة شاكر في RT.
  2. بعد permeabilization، تزج الجنين / القلب في 1 مل من العازلة حظر، لمدة 2 ساعة أو طوال الليل على شاكر لوحة عند 4 درجات مئوية.
  3. تزج الجنين / القلب إلى خلايا محددة البطانية الأجسام المضادة PECAM (CD31)، المخفف (1: 100) في 0.3 مل عازلة تمنع لمدة 48 ساعة على لوحة شاكر في 4 درجة مئوية.
  4. غسل الجنين / القلب باستخدام PBST 5 مرات، 30 دقيقة لكل منهما في RT على لوحة شاكر. هذا يزيل الأجسام المضادة الزائدة غير محددة ملزمة الأساسي من الأنسجة.
  5. تزج الجنين / القلب في اليكسا فلور 647 الماعز المضادة للفأر الضد الثانوية، المخفف (1: 1000) في 1 مل عازلة تمنع لمدة 48 ساعة على لوحة شاكر في 4 درجة مئوية.
  6. كرر الخطوة 3.4 لغسل الأجسام المضادة الثانوية.
  7. بعد إصلاح جنين / القلب مع PFA 4٪ لمدة 1 ساعة على RT على لوحة شاكر ويغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني 5 دقائق لكل منهما.
  8. وصمة عار على الجنين / القلب مع وصمة عار النووية 4، 6 diamidino-2-phenylindole (دابي) (المخفف في PBST في تناسقالتموينية من 0.01 ملغ / مل) لمدة 10 دقيقة على لوحة شاكر في RT. اتبع مع اثنين من يغسل PBS من 5 دقائق لكل منهما.

4. جنين / المقاصة القلب مع هيئة السلع التموينية ل ه أو أسلوب مكعب

ملاحظة: بعد جبل بأكمله تلطيخ، يتعرض الجنين / قلب إما جنيه هيئة السلع التموينية أو CUBIC طريقة إزالة الأنسجة. اختيار طريقة يعتمد على حجم الأنسجة والعمر الجنيني. لE11.5 أو السابقة الأجنة العمر، واستخدام هيئة السلع التموينية ل ه طريقة إزالة الأنسجة، في حين أن الأجنة القديمة أو قلوب ما بعد الولادة ويفضل CUBIC طريقة إزالة الأنسجة.

  1. على نطاق والأنسجة المقاصة الطريقة
    1. احتضان الجنين / القلب مع 1 مل من هيئة السلع التموينية ل حل ه A2 في قارورة التلألؤ (ملفوفة في رقائق الألومنيوم) مع بعض الأحيان لطيف الهز (باليد) لمدة 48 ساعة في 4 درجات مئوية.
    2. بعد مرور فترة الحضانة هيئة السلع التموينية ل ه A2، واحتضان الجنين / القلب مع 1 مل من هيئة السلع التموينية ل حل ه B4 في 4 درجات مئوية في نفس القارورة مع عرضية هز لطيف لanotلها 48 ساعة.
    3. احتضان الجنين / قلب لمدة 48 ساعة أخرى مع 1 مل هيئة السلع التموينية ل ه 70 في 4 درجات مئوية مع اهتزاز لطيف في بعض الأحيان. جبل الجنين باستخدام 90٪ الجلسرين (انظر القسم 5.1).
  2. الأنسجة مكعب المقاصة الطريقة
    1. لكامل جنين / قلب المقاصة مكعب، تزج كل جنين / القلب في 1 مل من مكعب 1 مع عرضية لطيف تهتز لمدة 48 ساعة على 37 درجة مئوية 7. بعد 48 ساعة، يستعاض عن حل مع نفس الحجم من كاشف CUBIC الطازجة 1، واحتضان العينة لمدة 48 ساعة إضافية عند 37 درجة مئوية مع عرضية هز بيده.
    2. غسل مكعب 1 يعامل القلب / جنين مع برنامج تلفزيوني 1X عدة مرات في درجة حرارة الغرفة مع طيف تهتز بيده. هذا يزيل الزائد مكعب 1 الحل.
    3. بعد الغسيل خارج مكعب 1 مع برنامج تلفزيوني، تزج الأجنة / قلوب في حل مكعب 2 (1 غ لكل جنين / القلب) لمدة 48 ساعة على 37 درجة مئوية مع عرضية لطيف تهتز بيده. ويأتي ذلك بعد جنين / قلب تزايد استخدام الجلسرين (انظر القسم 50.2).

5. تركيب العينة والتصوير

ملاحظة: الأجنة أو أجهزة مسح في هيئة السلع التموينية ل ه 70 أو مكعب 2 الحل يمكن تصويرها مباشرة مع مقياس 70 ومكعب 2 حل باعتبارها وسيلة التصوير، على التوالي. ومع ذلك، بالنظر إلى ضعف عينات الجنينية إلى الكواشف المقاصة، إذا لا يمكن تصوير العينات على الفور، ولكن تخزين على المدى الطويل، وتخزين العينات في 90٪ الجلسرين بعد بروتوكول أدناه.

  1. تزج مباشرة هيئة السلع التموينية جنيه مسح العينة في 1 مل من 90٪ الجلسرين وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى التصوير.
  2. غسل العينة تعامل مكعب مع برنامج تلفزيوني 1X مرتين، 5 دقائق لكل منهما وبالتتابع احتضان العينة مع 1 مل من 30٪، 50٪، 70٪ و 90٪ الحل الجلسرين كل لمدة 30 دقيقة.
  3. للتصوير، ونقل العينة إلى أسفل الزجاج طبق بيتري مع الحد الأدنى من 90٪ الجلسرين وصورة استنساخ مع المجهر متحد البؤر مجهزة مع اثنين من قدرات الفوتون.
  4. صورة قلب أو الجنين في الجلسرين مع 10X / 0.3 NA، و25X / 0.8 NA الغمر، أو 40X / 1.2 NA المياه التصحيحية عدسة الهدف. صورة دابي باستخدام 2 الفوتون الإثارة من التيتانيوم متماسك: الياقوت حرباء الليزر. وسيكون اختيار المجهر والعدسة الشيئية يتوقف على الغرض من التجارب، على سبيل المثال لفائقة الدقة، ويمكن استخدام المجهر الفلورسنت ورقة الخفيفة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تصوير القلب الجنينية مسح

تشكيل قلب الفقاريات هو عملية morphogenic ينظم spatiotemporally ويعتمد على التنظيم وتمايز الخلايا السلف من أربعة مصادر مختلفة 1. والخلايا من مجال القلب الأول من الهلال القلب أضعاف باتجاه خط الوسط بطني لتشكيل أنبوب القلب الخطي. الخلايا من حقل قلبية ثانية، ويقيم في البداية dorsomedially إلى الميدان قلبية للمرة الأولى، نقل من بعد ذلك إلى البلعوم وحشوي الأديم المتوسط، من حيث تهاجر إلى السقالة الموجودة من قبل من أنبوب القلب الخطي. فإن الخلايا حقل قلبية ثانية تسهم في البطين الأيمن، المسالك تدفق (OFT) عضلة القلب وبعض البطانة 25-28. سوف القلب خلايا القمة العصبية (CNCC)، والتي تنشأ من rhombomeres postotic 6 و 7 و 8 و الهجرة إلى البلعوم الذيلية وتسهم significantly إلى طبقة العضلات الملساء وسائد شغافية في التجارة المشروعة. كما تساهم في تشكيل الحاجز الأبهري 29،30. ويتكون السكان الرابع من خلايا النخابية المستمدة من الجهاز الموالية للالنخابية (بيو)، ويسهم في الخلايا الليفية، وخلايا العضلات الملساء وربما غيرها من أنواع الخلايا القلبية 31. والنخاب ينظم تطوير الأوعية الدموية التاجية، ونمو القلب والتشكل 21.

مفهوم الأكثر أهمية حول التشكل القلب هو أنه خلال تطوير القلب وهجرة الخلايا الشاذة / التمايز من السكان الخلية أربعة السلف سوف يؤدي إلى تشوهات أو عيوب خلقية في القلب 4،22،32، والذي هو السبب رقم واحد من العيوب الخلقية في العالم . تحديد آليات التشكل القلب على المستوى الخلوي والجزيئي هو خطوة أساسية نحو تحسين التشخيص والعلاجات المحتملة لو CHDs.لذا، فمن الأهمية بمكان أن صورة عملية التشكل القلب على مستوى القلب كله لقرار خلية واحدة. لتحقيق ذلك، ونحن صفت العضلية عن طريق عبور خط لجنة المساواة العرقية تحت سيطرة القلب محدد التروبونين T (cTnT)، وهو ما يعبر عنه على وجه التحديد في العضلية 18، مع خط مراسل mTmG. وقد تم حصاد الأجنة في E8.5 وملطخة للPECAM لتمييز الخلايا داخل القلب والبطانية من العضلية. ثم تم مسح الأجنة عن طريق هيئة السلع التموينية جنيه وتصوير القلب. وصفت عضلة القلب عن طريق GFP بسبب إعادة التركيب بوساطة لجنة المساواة العرقية يحركها cTnT للمراسل mTmG، وكان يسمى البطانة مع PECAM (الشكل 1A والفيلم التكميلي 1). والعضلية يمكن ملاحظتها في قرار خلية واحدة (الشكل 1A). الهياكل قلب الجزء تصوير، مثل البطين البدائي وأفت يمكن تحديدها بوضوح بعد إعادة الإعمار 3D باستخدام 3D إعادةبناء البرمجيات (1B الشكل والسينما التكميلية 2).

تصوير الحيوانات المستنسخة واحدة من القلب الجنينية مسح

التشكل القلب يعتمد على التمايز النسب القلب وتنظيم خلية فردية على مستوى القلب كله 22، وبالتالي، فمن الضروري أن صورة واحدة تمايز الخلايا الاصلية القلب إلى أنواع مختلفة من الخلايا القلبية وأيضا صورة خلية التشكل في قرار خلية واحدة. لتحقيق ذلك، Rosa26Cre ERT2 15 وقد عبرت لR26R-النثار 16، وكان gavaged الأنثى الحامل مع تاموكسيفين في تركيز منخفض. بعد 48 ساعة، وكان حصاد الجنين في E9.5، وكلها جبل الملون لPECAM، وبعد ذلك تم تصوير القلب كله. وجدنا أن لم يكن هناك سوى مجموعة واحدة من الخلايا، مترجمة إلى التجارة المشروعة، وكان هذا استنساخ س 8 الخلايا استنادان الصورة أعيد بناؤها وأقسام متتالية (أرقام 2A، 2B والتكميلي فيلم 3)، مما يدل على أن يتم الحصول على هذه الخلايا من خلية سلفية واحدة. مورفولوجيا الخلايا والسلوك الخلوي مثل انتشار الخليوي، والهجرة ويمكن الاستدلال على ذلك من المواقع النهائي من الخلايا (الشكل 2A). نحن أيضا تطبيق طريقة مكعب الى مسح القلب الجنينية في E9.5 وE10.5، وجدت أنه حتى بعد ساعة فقط 24 من الحضانة مع كاشف 1، والأجنة حلت بمهارة وبنية الأنسجة تتأثر سلبا (لا تظهر البيانات ).

التصوير من بعد الولادة مسح وقلوب الجنينية في وقت متأخر

طبقنا كل من هيئة السلع التموينية ل ه ومكعب الى مسح قلوب بعد الولادة. قلوب P2 مع التركيب الوراثي من αMHC-لجنة المساواة العرقية. mTmG (يتم التعبير αMHC-لجنة المساواة العرقية تحديدا في العضلية <سوب> 17) تم تطهير مع هيئة السلع التموينية ل ه لمدة 48 ساعة، ولكن لم يظهر أي مزيد من الشفافية من قلوب تعامل مع برنامج تلفزيوني فقط (لا تظهر البيانات)، مشيرا إلى أن هيئة السلع التموينية ل ه المقاصة ليست فعالة لقلوب بعد الولادة. عندما تم تطهير القلوب P2 مع كاشف CUBIC 1 لمدة 48 ساعة، وكاشف 2 لمدة 96 ساعة، وكانوا أكثر شفافية بكثير من قلوب مسح مع كاشف 1 لمدة 48 ساعة وكاشف 2 لمدة 48 ساعة. وزاد عمق التصوير بشكل ملحوظ مع 96 ساعة من كاشف 2 حضانة (أفلام التكميلية 4 و 5)، مشيرا إلى أن أطول الحضانة مع الكواشف مكعب تعزز الشفافية وتنطوي على زيادة في عمق التصوير. شكل وحجم كل cardiomyocyte يمكن تحديدها عن طريق الغشاء المحلية GFP (الشكل 3A)، والتي يمكن استخدامها لتحديد تضخم.

نحن أيضا مسح Nfatc1-لجنة المساواة العرقية، النثار (النثار أنثى توصيله مع نفatc1Cre الذكور) قلوب E17.5 (يتم التعبير عن Nfatc1-لجنة المساواة العرقية في الخلايا داخل القلب القلب 19) مع كاشف CUBIC 1 لمدة 48 ساعة وكاشف 2 لمدة 48 ساعة. قلوب شفافة، ومن المتوقع أن تسمية الخلايا داخل القلب والخلايا المستمدة البروتينات الفلورية بما في ذلك GFP، YFP، CFP وطلب تقديم العروض. ومع ذلك، فقط GFP و YFP يمكن تصويرها من خلال القلب كله (أرقام 3B، 3C وأفلام التكميلية 6 و 7)، ويمكن أن لا يتم الكشف عن CFP وطلب تقديم العروض (البيانات لا تظهر). تلطيخ لPECAM (الكسيا فلور 647) أيضا لا يمكن أن يتم الكشف عن (لا تظهر البيانات)، مما يوحي بأن كاشف CUBIC يروي الحراجية المعتمدة، طلب تقديم العروض والأجسام المضادة مترافق fluorophore في هذا البروتوكول.

شكل 1
الشكل 1: التصوير الكيس / ه تطهير القلب الجنينية (A) واحد المرجعويرد، شريحة tical من قلب E8.75 (mTmG cTnT-لجنة المساواة العرقية). الخامس: البطين. أفت: تدفق المسالك. (ب) ويبين هيكل القلب أعيد بناؤها من 93 شرائح ضوئية متتالية مع عمق إجمالي قدره 110.4 ميكرون. شريط مقياس = 20 ميكرومتر في A. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: التصوير استنساخ واحد من هيئة السلع التموينية / ه تطهير القلب الجنينية (A) واحد قسم البصري للاستنساخ من قلب E9.5 مع التركيب الوراثي من ROSA26-لجنة المساواة العرقية ERT2؛ ROSA26-النثار. يشير السهم إلى بروز الخلوي من cardiomyocyte. (ب) ويبين استنساخ أعيد بناؤها في المنطقة كثيرا من قلب E9.5 مع 10 شرائح بصرية و 36 ميكرومتر عمق إجمالي. شريط مقياس = 20 ميكرومتر في A. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
. الشكل (3): التصوير على بعد الولادة مسح مكعب وقلوب الجنينية في وقت متأخر (A) ويبين القسم البصري واحد من قلب P2 مع التركيب الوراثي من αMHC-لجنة المساواة العرقية، mTmG. يتم عرض جميع المقاطع البصرية في الفيلم التكميلي 5. (B) يظهر مقطع واحد من قلب E17.5 مع التركيب الوراثي من Nfatc1-لجنة المساواة العرقية، ROSA26-النثار. (C) ويبين هيكل القلب بناؤها من 106 شرائح البصرية مع عمق إجمالي قدره 630 ميكرون. شريط مقياس = 20 ميكرومتر في ألف وهو 100 ميكرون في B. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

والأنف والحنجرة "FO: المحافظة على together.within الصفحات =" 1 "> فيلم 1
. الفيلم التكميلي 1: التصوير وهيئة السلع التموينية جنيه تطهير القلب الجنينية (انقر بالزر الأيمن للتحميل) فيلم 1 يبين المقاطع البصرية لهيئة السلع التموينية لو تعامل E8.75 القلب (cTnT-لجنة المساواة العرقية، mTmG) من سطح القلب لتجويف القلب. على عمق 110.4 ميكرون، وهناك 93 شرائح في المجموع.

فيلم 2
الفيلم التكميلي 2: التصوير وهيئة السلع التموينية جنيه تطهير القلب الجنينية (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل) فيلم 2 يظهر صور سطح 3D من القلب أعيد بناؤها في الفيلم 1، reconstrucتيد عبر برنامج إعادة الإعمار 3D. علامات الصفراء للتعبير PECAM والعلامات الخضراء كل العضلية.

فيلم 3
الفيلم التكميلي 3: التصوير استنساخ واحد من هيئة السلع التموينية جنيه تطهير القلب الجنينية (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل). الفيلم 3 يبين أجزاء من نسخة من قلب E9.5 مع التركيب الوراثي من ROSA26-لجنة المساواة العرقية ERT2.

فيلم 4
الفيلم التكميلي 4: تصوير مكعب قلوب بعد الولادة تطهيرها (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل). ويظهر الفيلم 4 مقاطع من CUBIC تعامل P2 القلب (& #945، MHC-لجنة المساواة العرقية، mTmG) من سطح القلب لتجويف القلب. تم مسح هذا القلب P2 مع كاشف CUBIC 1 لمدة 48 ساعة، وكاشف CUBIC 2 لمدة 96 ساعة.

فيلم 5
الفيلم التكميلي 5: تصوير مكعب قلوب بعد الولادة تطهيرها (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل). ويظهر الفيلم 5 القلب الذي تمت تبرئته مع كاشف CUBIC 1 لمدة 48 ساعة وكاشف CUBIC 2 لمدة 48 ساعة. على عمق 136 ميكرون مع 6 ميكرون لكل مقطع في فيلم (4) وسمك 76 ميكرون مع 6 ميكرون لكل مقطع في الفيلم 5.

الفيلم 6
الفيلم التكميلي 6: التصوير وCUBIC مسح أواخر امبريالقلب أونك (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل) الفيلم 6 يظهر أجزاء من CUBIC القلب E17.5 المعالجة (Nfatc1-لجنة المساواة العرقية، ROSA26-النثار). من سطح القلب لتجويف القلب. على عمق 630 ميكرون مع 6 ميكرون لكل قسم.

فيلم 7
الفيلم التكميلي 7: التصوير وCUBIC مسح أواخر القلب الجنينية (حق انقر للتحميل). الفيلم 7 يظهر صور سطح 3D للقلب في فيلم 6، أعيد بناؤها من خلال برنامج إعادة الإعمار 3D.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

عزل الجنين هو خطوة حاسمة جدا. الأجنة E9.5 هشة جدا وصغيرة الحجم، لذلك ينبغي اتخاذ مزيد من الحذر على عدم الإضرار الهياكل جنين / القلب أثناء العزلة. يجب إزالة طبقات اضافية غير الجنينية يغلف الجنين / قلب بعناية خاصة عند تصوير الجنين كله. وهذا يسمح اختراق الأجسام المضادة والمقاصة خليط عمق الأنسجة الجنينية، ويساعد أيضا في إزالة إشارة الخلفية عند التصوير. تم فحص الأجسام المضادة متعددة بما في ذلك الأجسام المضادة ضد PECAM، الأسيتيل α تويولين وβ1 إنتغرين وجميع تم الكشف عن بنجاح (لا تظهر البيانات) 33. هذا يدل على أن سلامة الجزيئية ووحدة الخلوية والتوافق مستضد لم تتعطل خلال هذه العملية المقاصة.

نقل الجنين / القلب باستخدام اسعة نقل الفم ماصة (قطع رأس). هذا يتجنب الضرر أثناء المناولة. وGFP / YFP / RFP / CFP نمط التعبير ونبني مصفر من الحيوانات المستنسخة يجب أن سجلت بعناية في قلب لتحديد الجرعة المناسبة لتسمية استنساخ واحدة في القلب أو أي أجهزة أخرى. ويرجع ذلك إلى جرعة منخفضة من عقار تاموكسيفين (10 ميكروغرام / غرام)، وأحيانا قلب لا يحتوي على أي نسخ أو من الصعب الكشف عن أي استنساخ. ولذلك، فمن المستحسن استخدام الكيس المحي لتحديد ما إذا كان الجنين لديه أي GFP / YFP / RFP / استنساخ CFP.

الجنين أو القلب تثبيت هو خطوة حاسمة، والإفراط في تثبيت سوف يؤدي إلى خلفية عالية في حين تحت تثبيت سوف يؤدي ذلك إلى ضعف تلطيخ. فمن المستحسن لإصلاح E8.5-E10.5 الجنين كله لمدة 2 ساعة على RT على شاكر لوحة. أما بالنسبة للأجنة E11.5-E15.5، والتوصية لعزل بعناية القلب واصلاحها مع PFA 4٪ لمدة 2 ساعة على RT. بعد التأكد من إزالة طبقات المحيطة القلب إذا تجهيز الجنين كله، يمكن للأجنة E11.5- E13.5 أيضا أن تكون ثابتة لمدة 3-4 ساعة على RT ولكن ذلك يتطلب زيادة الوقت المقاصة الأنسجة. وE16.5-P1 (بعد الولادةوتحدد يوم 1) قلوب لمدة 3-4 ساعة على RT على شاكر لوحة. عند تحديد الجنين كله، يجب إزالة الصدارة وأطرافه الخلفية لأنها تعيق التصوير القلب.

ينبغي أن يعامل العينات مع مكعب، وهيئة السلع التموينية جنيه في قارورة التلألؤ للحد من عينة التجفيف. وقد لاحظنا المقاصة أفضل من العينات مع طريقة إزالة الأنسجة CUBIC عند 37 درجة مئوية، في حين يتم هيئة السلع التموينية جنيه المقاصة على النحو الأمثل في 4 درجات مئوية. بعد التصوير، والعينات ويمكن تخزين على المدى القصير في مكعب 2 أو هيئة السلع التموينية 70 جنيه. وينبغي دائما أن تغطي عينات بورق الألمنيوم لمنع تبييض مضان.

الأنسجة والأعضاء الجنينية أقل الدهون وخارج الخلية ترسب مصفوفة، مما يؤدي في أقل وقت المقاصة. من ناحية أخرى، هم أكثر عرضة لالكواشف المقاصة. قد تؤثر على الكواشف المقاصة على سلامة بنية الأنسجة والمستضدات، مما أدى إلى تبريد من CFP، طلب تقديم العروض وconju الأجسام المضادةfluorophore مسور. لذلك، وأحيانا تثبيت أطول قد يمنع التبريد. تسقية من البروتينات الفلورية ويمكن أيضا أن يكون بسبب حساسيتها للمواد الكيميائية ودرجة الحموضة كما ذكرت سابقا (34). ينبغي استكشاف وصفات أخرى الكيميائية، ودرجة الحموضة، المثبتات، وطول حضانة للحد من التبريد من البروتينات الفلورية.

قد أحدثت ثورة في طريقة transparentizing الجهاز كليا أو إزالة الأنسجة التصوير 3D الحجمي. طريقة التصوير السابق لالتشكل القلب، الذي ينطوي على دليل 2D أو 3D إعادة بناء أقسام المسلسل، هو مضيعة للوقت وأداة يطالبون 5،6. عالية الدقة episcopic المجهري (HREM) بالتزامن مع النمذجة 3D يمكن تطبيقها على دراسة التشكل من قلب فأر وينص على وصف تشريحي ممتاز للبنية تربيقية في وضع الجنين الماوس 35. ومع ذلك، HREM لا تسمح بتحديد من fluorescالخلايا المسمى البروتين والأنف والحنجرة أو الأجسام المضادة صبغ الخلايا عن بقية الخلايا 35. باستخدام البروتوكول الحالي، مع الحد الأدنى من الجهد وفعالية عالية التكلفة، ولقد نجحنا في الحفاظ على إشارات الفلورسنت في قلب الجنينية باستخدام هيئة السلع التموينية جنيه أو طرق إزالة الأنسجة مكعب (الشكلان 1-3). جنبا إلى جنب مع جرعة منخفضة (10 ميكروغرام / غرام) من تاموكسيفين للحث على الأحداث التوحد لجنة المساواة العرقية وتوليد عدد قليل من الحيوانات المستنسخة داخل الجنين كله وفي القلب، وهذا النظام يمكن أن تستخدم لتتبع ودراسة واحدة القلب تمايز الخلايا السلف والسلوكيات الخلوية في فيفو (الشكل 2A) 33. وبالإضافة إلى ذلك، جنبا إلى جنب مع حذف الجينات لجنة المساواة العرقية بوساطة أو overexpression ولجنة المساواة العرقية بوساطة العلامات خلية واحدة، ويمكن تطبيق هذا النظام التصوير لدراسة فقدان الوراثية وظيفة أو كسب وظيفة على تمايز الخلايا السلف والسلوك الخلوي أثناء التشكل القلب، وبالتالي يوفر قوية أداة إلى study مسببات عيوب خلقية في القلب.

أظهر الأنسجة نظامين المقاصة هيئة السلع التموينية / ه وCUBIC المستخدمة في هذه الدراسة كفاءات مختلفة المقاصة، الذي يميز كذلك الأنظمة القائمة على العمر الجنيني، سمك الأنسجة ومدة من الزمن المقاصة الأنسجة. في أوائل مرحلة الأجنة E9.5-E10.5، ونظام / ه هيئة السلع التموينية تقديم ليس فقط الأنسجة واضحة ولكن أيضا حماية التشكل الجنين والحفاظ على إشارات الفلورسنت، في حين أدت المعاملة مكعب في حل الجنين. هذا قد يكون نتيجة لaminoalcohols إضافي وتركيز أعلى من تريتون X-100 في الحلول مكعب 8. للقلوب كبار السن، وفشل النظام / ه هيئة السلع التموينية لمسح الأنسجة تماما حتى مع وجود فترة حضانة أطول. الحل المقاصة CUBIC تقديم كبار السن الأنسجة واضحة (الشكل 3). ومع ذلك، أدت زيادة فترة حضانة في الإشارات الضعيفة وGFP الذاتية فقط المحمية، في حين طلب تقديم العروض، CFP وإشارات الأجسام المضادة مترافقلقد ضعنا. لهذا السبب، ستكون هناك حاجة إلى وصفة أكثر الأمثل من الكواشف المقاصة وأفضل فترة حضانة لvolumetrically قلوب صورة أو الأجهزة مع مجموعة أكبر من العلامات الفلورية.

وأظهرت هذه الدراسة أن واحدا يمكن تسمية واقتفاء أثرها، وصورة استنساخ القلب احدة في توليفة مع جبل تلطيخ كله من الشغاف / البطانية PECAM علامة الخلية من القلب النامية. جبل تلطيخ كله من PECAM ودابي في هذا النظام يساعد ليس فقط للتعرف على أنواع الخلايا والتشكل خلية من الخلايا المسمى داخل القلب، ولكن أيضا يسمح دراسة نمط نسيلي والهجرة والسلوك أثناء التشكل القلب. في الشكل 2A لاحظنا استنساخ مع 8 خلايا في التجارة المشروعة. باستخدام عدد من الخلايا الموجودة في هذا استنساخ مع الإشارة إلى الوقت وضع العلامات، ومعدل تكاثر الخلايا يمكن أن تحسب بسهولة. وفي دراسة أخرى باستخدام هذا النظام نفسه حددنا نمط انقسام الخلايا المنحى وmigrنمط أوجه من cardiomyocyte واحد خلال عملية تربق 33. تطبيق هذا البروتوكول لدراسة الآثار المترتبة على فقدان الوراثية وظيفة أو كسب وظيفة spatiotemporally على القلب تمايز الخلايا الاصلية المسمى، نمط نسيلي والسلوك الخلوي هو ممكن، وسوف تساعد في دراسات المسببات عيوب القلب الخلقية على المستوى الجيني و المستوى الجزيئي في سياق 3D. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تطبيق هذا البروتوكول لدراسة التشكل في أجهزة الجسم الأخرى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2,2′,2′’-nitrilotriethanol  Sigma Aldrich 90279
4% Paraformaldehyde in PBS Affymetrix 19943
BSA Fischer Scientific  BP16000
N,N,N’,N’-tetrakis(2-hydroxypropyl) ethylenediamine  Sigma Aldrich 122262
Phosphate Buffer Saline Sigma Aldrich P5368-10PAK
Triton X-100 Sigma Aldrich T8787
Urea Sigma Aldrich U-1250
Sucrose Sigma Aldrich 84097
Glycerol Sigma Aldrich G8773
Tamoxifen Sigma Aldrich T5648
Sunflower seed oil Sigma Aldrich S5007
Tween 20 Sigma Aldrich P1379
PECAM (CD31) BD Pharmingen  550274
Alexa Fluor 647  Invitrogen A-21247
DAPI nuclear stain Sigma Aldrich D9542
37oC Incubator Thermoscientific Fischer Heratherm, Compact Microbiological Incubators
48 well plates Cell Treat 229148
Analytical Balance Metler Toledo PB153-S/FACT
Confocal microscope Zeiss Zeiss 510 confocal microscope
Disecting Microscope Unitron Z850
Fluorescent microscope Zeiss Observer. Z1
Germinator 500 Glass Bead Sterilizer CellPoint Scientific GER-5287-120V
Light Source SCHOTT ACE I
Pair of Scissors Fine Science Tools 14084-08
Petri dish 60 mm x15 mm  TPP Techno Plastic Products AG 93060
Rocker II  Platform Rocker Boekel Scientific 260350
Scintillating tubes Fischer Scientific  03-337-26
Transfer pipette Samco Scientific 202
Tweezers Fine Science Tools 11251-20

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vincent, S. D., Buckingham, M. E. How to make a heart: the origin and regulation of cardiac progenitor cells. Curr Top Dev Biol. 90, 1-41 (2010).
  2. Olson, E. N. A decade of discoveries in cardiac biology. Nat Med. 10, 467-474 (2004).
  3. Olson, E. N. Gene regulatory networks in the evolution and development of the heart. Science. 313, 1922-1927 (2006).
  4. Bruneau, B. G. The developmental genetics of congenital heart disease. Nature. 451, 943-948 (2008).
  5. Mohun, T. J., Weninger, W. J. Embedding embryos for high-resolution episcopic microscopy (HREM). Cold Spring Harb Protoc. , 678-680 (2012).
  6. Soufan, A. T., et al. Three-dimensional reconstruction of gene expression patterns during cardiac development. Physiol Genomics. 13, 187-195 (2003).
  7. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162, 246-257 (2015).
  8. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157, 726-739 (2014).
  9. Becker, K., Jahrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains. PLoS One. 7, e33916 (2012).
  10. Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).
  11. Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).
  12. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
  13. Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158, 945-958 (2014).
  14. Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
  15. Badea, T. C., Wang, Y., Nathans, J. A noninvasive genetic/pharmacologic strategy for visualizing cell morphology and clonal relationships in the mouse. J Neurosci. 23, 2314-2322 (2003).
  16. Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450, 56-62 (2007).
  17. Agah, R., et al. Gene recombination in postmitotic cells. Targeted expression of Cre recombinase provokes cardiac-restricted, site-specific rearrangement in adult ventricular muscle in vivo. J Clin Invest. 100, 169-179 (1997).
  18. Jiao, K., et al. An essential role of Bmp4 in the atrioventricular septation of the mouse heart. Genes Dev. 17, 2362-2367 (2003).
  19. Wu, B., et al. Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling. Cell. 151, 1083-1096 (2012).
  20. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
  21. Wu, M., et al. Epicardial spindle orientation controls cell entry into the myocardium. Dev Cell. 19, 114-125 (2010).
  22. Zhao, C., et al. Numb family proteins are essential for cardiac morphogenesis and progenitor differentiation. Development. 141, 281-295 (2014).
  23. Kaufman, M. H., Kaufman, M. H. The atlas of mouse development. , Academic Press. London. (1992).
  24. Nagy, A. Manipulating the mouse embryo : a laboratory manual. , 3rd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2003).
  25. Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nat Rev Genet. 6, 826-835 (2005).
  26. Kelly, R. G., Buckingham, M. E. The anterior heart-forming field: voyage to the arterial pole of the heart. Trends Genet. 18, 210-216 (2002).
  27. Verzi, M. P., McCulley, D. J., De Val, S., Dodou, E., Black, B. L. The right ventricle, outflow tract, and ventricular septum comprise a restricted expression domain within the secondary/anterior heart field. Dev Biol. 287, 134-145 (2005).
  28. Ward, C., Stadt, H., Hutson, M., Kirby, M. L. Ablation of the secondary heart field leads to tetralogy of Fallot and pulmonary atresia. Dev Biol. 284, 72-83 (2005).
  29. Echelard, Y., Vassileva, G., McMahon, A. P. Cis-acting regulatory sequences governing Wnt-1 expression in the developing mouse CNS. Development. 120, 2213-2224 (1994).
  30. Jiang, X., Rowitch, D. H., Soriano, P., McMahon, A. P., Sucov, H. M. Fate of the mammalian cardiac neural. Developement. 127, 1607-1616 (2000).
  31. Viragh, S., Challice, C. E. The origin of the epicardium and the embryonic myocardial circulation in the mouse. Anat Rec. 201, 157-168 (1981).
  32. Wu, M., Li, J. Numb family proteins: novel players in cardiac morphogenesis and cardiac progenitor cell differentiation. Biomolecular concepts. 6, 137-148 (2015).
  33. Li, J., et al. Single-Cell Lineage Tracing Reveals that Oriented Cell Division Contributes to Trabecular Morphogenesis and Regional Specification. Cell reports. 15, 158-170 (2016).
  34. Alkaabi, K. M., Yafea, A., Ashraf, S. S. Effect of pH on thermal- and chemical-induced denaturation of GFP. Appl Biochem Biotechnol. 126, 149-156 (2005).
  35. Captur, G., et al. Morphogenesis of myocardial trabeculae in the mouse embryo. J Anat. , (2016).

Tags

علم الأحياء التنموي، العدد 116، كلها المقاصة القلب، كلها التصوير القلب والنسب تتبع والتنمية القلب
التصوير تطهيرها الجنينية وبعد الولادة قلوب في قرار وحيدة الخلية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shaikh Qureshi, W. M., Miao, L.,… More

Shaikh Qureshi, W. M., Miao, L., Shieh, D., Li, J., Lu, Y., Hu, S., Barroso, M., Mazurkiewicz, J., Wu, M. Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution. J. Vis. Exp. (116), e54303, doi:10.3791/54303 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter