Abstract
Enkelt klonal sporing og analyse ved hel-hjertenivå kan bestemme hjertestamcelle oppførsel og differensiering i løpet av hjerte-utvikling, og tillate for studium av den cellulære og molekylære grunnlaget for normal og unormal hjerte morfogenese. Siste nye teknologier av retrospektive enkelt klonal analyser gjøre studiet av hjerte morphogenesis på enkelt celle oppløsning gjennomførbart. Imidlertid er vevet opasitet og lysspredning i hjertet som avbildningsdybden økes hindre hel-hjerteavbildning ved enkelt celle oppløsning. For å overvinne disse hindringene, en hel-embryo clearing system som kan gjengi hjerte svært oversiktlig for både belysning og deteksjon må utvikles. Heldigvis, i de siste årene, mange metoder for hel-organisme avregningssystemer som CLARITY, Sca le, SeeDB, ClearT, 3DISCO, CUBIC, DBE, og babb PACT er rapportert. Dette laboratoriet er interessert i de cellulære og molekylære mekanismer for kortIAC morphogenesis. Nylig etablerte vi enkelt celle avstamning sporing via ROSA26-Cre ERT2; ROSA26-Konfetti system til tynt label celler under hjerte utvikling. Vi tilpasset flere hele embryo-clearing metoder inkludert Sca le og CUBIC (klar, uhindret hjernen imaging cocktails og beregningsorientert analyse) for å fjerne fosteret i kombinasjon med hele mount flekker til bildeenkelt kloner inne i hjertet. Hjertet ble vellykket avbildes på enkelt celle oppløsning. Vi fant at Sca le kan fjerne embryonale hjertet, men kan ikke effektivt fjerne postnatal hjertet, mens CUBIC kan tømme postnatal hjertet, men skader embryonale hjertet ved å løse opp vevet. Metodene som beskrives her, vil muliggjøre studier av genfunksjon ved en enkelt klon oppløsning i løpet av hjerte-morfogenese, som i sin tur kan avsløre den cellulære og molekylære basis av medfødt hjertefeil.
Introduction
Cardiac morphogenesis er en sekvensiell hendelse som krever tid og rom organiseringen av fire ulike typer hjerte stamceller inn i forskjellige deler av hjertet, og også krever flere genetiske regulatoriske nettverk for å organisere denne prosessen for å danne funksjonelle hjerte 1,2. Cardiac spesifikasjon, differensiering, mønster, og kammer modning er regulert av kardiotranskripsjonsfaktorer 3. Genetisk mutasjon eller posttranskripsjonelt avvik av disse faktorene i hjerte stamceller kan resultere i enten embryonale dødelighet eller medfødte hjertefeil (CHD) 4. Studiet av hjerte morphogenesis krever en forståelse av iboende strukturelle detaljer i tre dimensjoner (3D) og enkelt merket hjertestamcelle avstamning tracing under hjerte utvikling vil fremme forståelsen av hjerte morphogenesis. En rekke høyoppløste seksjonsbasert tomografi metoder har blitt utviklet i the siste tiårene til bilde organ struktur 5,6; Men disse metodene krever dyre, spesialiserte instrumenter, omfattende arbeid, og mangler detaljert strukturell organisasjon på enkelt celle oppløsning i det endelige volumetriske rekonstruert bilde 7,8.
3D volumet bildebehandling på celle-nivå gir et middel for å studere stamceller differensiering og cellulær oppførsel in vivo 7. Men vev lysspredning fortsatt den primære hinderet for å avbilde celler og strukturer i 3D dypt inne i intakt hjerte. Lipider er en viktig kilde for lysspredning, og fjerning av lipidene og / eller justering av brytningsindeksforskjellen mellom lipider og deres omkringliggende områder er mulige fremgangsmåter for å øke vev transparens 8. I de siste årene er en rekke vev clearing metoder utviklet, noe som reduserer vev opasitet og lysspredning, som BABB (benzylalkohol og benzyl benzoate blanding) og DBE (tetrahydrofuran og dibenzylether); men i disse metodene, fluorescensslukking forblir et problem 8-10. Den løsemiddelbasert hydrofile metoder, for eksempel SeeDB (fruktose / thioglycerol) og 3DISCO (diklormetan / dibenzylether), bevare fluorescerende signaler, men ikke gjengi hele orgelet gjennomsiktig 7,8,11. Til sammenligning gjengir CLARITY vev-clearing metode orgelet gjennomsiktig, men det krever en spesialisert elektroforese enhet for å fjerne lipider 8,12, som gjør PACT (passiv klarhet teknikk), som også krever hydrogel innebygging 7,13. For detaljert informasjon om alle tilgjengelige vev-clearing metoder, se tabell 1 i Richardson og Lichtman, et al. 7.
I 2011 Hama et al. Serendipitously oppdaget en hydrofil blanding 'Sca le' (urea, glyserol og Triton X-100 blanding) som gjør musen hjernen og embryo gjennoent mens fullstendig bevare fluorescerende signaler fra merket kloner 14. Dette gjør det mulig for avbildning av den intakte hjerne i en dybde på flere millimeter og store rekonstruksjon av neuronale populasjoner og fremspring på en subcellulære oppløsning. Susaki et al. ytterligere forbedret Sca le ved å legge aminoalkoholer og utviklet 'cubic' (klar, uhindret hjernen imaging cocktailer og beregningsorientert analyse) vev clearing metoden, som økte fosfolipid oppløselighet, redusert clearing tid, og er tillatt for flerfarget fluorescerende bildebehandling 8. I denne studien var å dra nytte av Sca le og CUBIC vev clearing teknikker og høyoppløselig 3D optisk snitting individuelle kloner inne i hjertet under cardiogenesis spores ved hjelp Rosa26Cre ERT2 15, R26R-Confetti 16, αMHC-Cre 17, cTnT-Cre 18, Nfatc1-Cre 19, og Rosa26-mTmG (mTmG) 20 mus linjer. Kombinasjonen av hele mount farging (WMS) metode som er utviklet tidligere 21,22 med vev tømme metoder ytterligere tillatt for farging av andre proteiner i merkede kloner og for studier av deres oppførsel i et 3D volumetrisk kontekst. Kombinasjonen av vev clearing og WMS åpner for en bedre forståelse av rollene til forskjellige gener og proteiner i løpet av hjertestans utvikling, og etiologien av medfødte hjertefeil. Denne protokollen kan brukes til å studere andre stamcelledifferensiering, celle oppførsel, og organ morfogenese begivenheter i utviklingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøk ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) at Albany Medical College og utført i henhold til NIH Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr.
1. Løsning Forberedelser
MERK: Rosa26Cre ERT2 15, R26R-Confetti 16, αMHC-Cre 17, og Rosa26-mTmG (mTmG) 20 mus linjer ble kjøpt kommersielt cTnT-Cre 18 var en gave fra Dr. Jiao ved University of Alabama Nfatc1-Cre.. var en gave fra Dr. Bin Zhou ved Albert Einstein College of Medicine 19. Mus ble avlivet ved karbondioksid inhalering i et lukket kammer i minst 60 sekunder fulgt av fysikalske midler til død verifisering av bilateral torakotomi, halshugging eller cervikal dislokasjon.
- Forbered Tamoxifen. Løs opp 10 mg Tamoxifen i 10 ml solsikkefrø oil. Når den er helt oppløst, delmengde og oppbevar ved -20 ° C.
- Forbered fosfatbufret saltvann (PBS). Oppløs Na2 HPO 4 (1,41960 g), KH 2PO 4 (0,24496 g), NaCl (8,0669 g) og KCl (0,20129 g) i 1 liter destillert vann, og justere pH til 7,4.
- Forbered PBST: 0,1% Tween-20 i PBS-løsning ved å løse opp 100 ul Tween-20 i 100 ml PBS.
- Forbered blokkering buffer. Gjør 3% bovint serumalbumin (BSA) blokkeringsløsning ved å oppløse 3 g av BSA i 100 ml PBST inneholdende 0,2% Tween-20.
- Forbered CUBIC-en (reagens 1). Blande 25 vekt% urea, 25 vekt% N, N, N ', N'-tetrakis (2-hydroksypropyl) etylendiamin og 15 vekt% Triton X-100 i dH 2 O.
- Forbered CUBIC-2 (reagens 2). Blande 50 vekt% sakkarose, 25 vekt% urea, 10 vekt% 2, 2 ', 2' '- nitrilotriethanol og 0,1% (v / v) Triton X-100 i dH 2 O.
- Forbered Sca le A2: 4 M urea, 10% w / v glyserol og 0,1% vekt / volum Triton X-100 i dH 2 O. Juster pH-verdien til 7,7.
- Forbered Sca le B4: 8 M urea og 0,1% vekt / volum Triton X-100 i dH 2 O. Juster pH til 8,7.
- Forbered Sca le 70: 4 M urea, 70% w / v glyserol og 0,1% vekt / volum Triton X-100 i dH 2 O.
2. Tamoxifen Induksjon, Embryo Isolasjon og Fiksering
- Tamoxifen Induksjon og Embryo Isolation
- Ved hjelp av en buet materør godkjent protokoll (ACUP 13-12007), sonde de kvinnelige R26Cre ERT2 Confetti mus (plugget av R26Cre ERT2 hannmus) med 10 mikrogram / g Tamoxifen på embryonale utviklings dag E7.75 33. På embryonale dag 9,5 (E9.5) eller E10.5, avlive den kvinnelige mus med CO 2 og halshugging.
- Etter verifisering av mus død (se pkt en merknad), åpner musen bukhulen med saks og dissekere ut livmorhorn, fjerne livmor tube lag med hjelp av saks og pinsett, og release embryoene fra livmor tube 23,24.
- Overfør embryoene til en petriskål inneholdende PBS (pH 7,4). Under dissekere mikroskop, fjerne ikke-embryonale lag (chorion, plommesekk og amnion) ved hjelp av pinsett.
- Ved hjelp av pinsett og saks, samle de kvinnelige mus og embryo halen prøver for genotyping som tidligere rapportert 22. Ved hjelp av en plastpipette, overfører hver embryo til en brønn i en 48-brønners plate inneholdende 1 ml av 1 x PBS.
- Under et fluorescerende mikroskop, identifisere GFP / RFP / CFP positive embryo via en invertert mikroskop med et kamera. Skrell bort hjerteposen ved hjelp av pinsett og roter hjerte / embryo ved hjelp av buet pinsett til å bestemme antall fluorescerende kloner på begge sider av hjertet med GFP / RFP / CFP filtre. Ingen kutt er nødvendig.
- Etter å identifisere GFP / RFP / CFP positive embryoer, raskt vaske embryoene to ganger (2 min hver) med 1x PBS i the 48 vel-plate på en plate rister ved romtemperatur (RT). Dette vil fjerne overflødig blod.
- Fest embryo / foster hjertet bruker 4% Paraformaldehyde (PFA) ved RT. Fiksering Tiden avhenger av den embryoniske vev alder og størrelse. For E9.5 fikse embryo for 2 timer ved RT. Den avdøde fosterstadiet embryoer krever lengre fiksering tid, som selv kan forlenges til 24 timer for postnatal hjerte.
FORSIKTIG: Paraformaldehyde er giftig, unngå kontakt med hud, øyne og slimhinner. - Etter fiksering vaskes embryo / hjerte i 48 vel-plate to ganger (10 min hver) med 1 x PBS på en plate rister ved RT. Dette fjerner overflødig PFA fra embryo / hjerte. Embryoene blir så videre behandlet for hele mount farging og vev clearing.
3. Hele Mount Farging
MERK: Etter PFA fiksering embryo / hjertet blir utsatt for hele mount flekker som følger.
- Permeabilize embryo / hjerte i en 48 godt plate ved hjelp av en ml 0,1% PBST i 2 timer på platerister ved romtemperatur.
- Etter permeabilization, senk embryo / hjertet i 1 ml blokkeringsbuffer, for 2 timer eller over natten på en plate shaker ved 4 ºC.
- Senkes ned embryo / hjerte til endotelcelle-spesifikt antistoff PECAM (CD31), fortynnet (1: 100) i 0,3 ml blokkeringsbuffer i 48 timer på plate rister ved 4 ° C.
- Vask embryo / hjerte hjelp PBST 5 ganger, 30 min hver på RT på plate shaker. Dette fjerner overskudd av ikke-spesifikt bundet primært antistoff fra vevet.
- Senkes ned embryo / hjerte i Alexa Fluor 647 geit-anti-rotte-sekundært antistoff, fortynnet (1: 1000) i 1 ml blokkeringsbuffer i 48 timer på plate rister ved 4 ° C.
- Gjenta trinn 3,4 for å vaske det sekundære antistoff.
- Post-fikse embryo / hjerte med 4% PFA i 1 time ved romtemperatur på platerister og vask to ganger med PBS 5 min hver.
- Flekker på embryo / hjerte med atom flekken 4 ', 6-diamidino-to-phenylindole (DAPI) (fortynnet i PBST på en concentrasjon på 0,01 mg / ml) i 10 minutter på platerister ved RT. Følge med to vaskinger av PBS 5 min hver.
4. Embryo / hjerte Clearing med Sca l e eller CUBIC Method
MERK: Etter at hele mount flekker, er embryoet / hjerte utsatt til enten Sca le eller CUBIC vev clearing metode. Valg av metode avhenger av vev størrelse og embryonale alder. For E11.5 eller tidligere alder embryoer, bruk Sca l e vev clearing metode, mens for eldre embryoer eller postnatal hjerter foretrekkes den CUBIC vev clearing metode.
- Scale Tissue Clearing Method
- Inkuber embryo / hjerte med 1 ml av Sca l e A2 oppløsning i en scintillasjonsampulle (innpakket i aluminiumsfolie) med leilighetsvis forsiktig risting (for hånd) i 48 timer ved 4 ° C.
- Etter Sca l e A2 inkubasjon, inkuber embryo / hjerte med 1 ml Sca l e B4 løsning ved 4 ° C i samme hetteglass med sporadiske forsiktig risting for anothenne 48 timer.
- Inkuber embryo / hjerte for en annen 48 timer med 1 ml Sca l e 70 ved 4 ° C med leilighetsvis forsiktig risting. Mount embryo ved hjelp av 90% glyserol (se punkt 5.1).
- CUBIC Tissue Clearing Method
- For hele embryo / hjerte CUBIC clearing, dyppe hver embryo / hjerte i 1 ml CUBIC-en med sporadisk forsiktig risting i 48 timer ved 37 ºC 7. Etter 48 timer, må du bytte løsningen med det samme volumet av fersk CUBIC reagens 1, og inkuber prøven for ytterligere 48 timer ved 37 ° C med sporadiske risting med hånd.
- Vask CUBIC-en behandles hjerte / embryo med 1x PBS flere ganger ved romtemperatur med forsiktig risting med hånd. Dette fjerner overskudd av kubisk en løsning.
- Etter å ha vasket ut CUBIC-en med PBS, fordype embryoene / hjerter i CUBIC-to-løsning (1 g pr embryo / hjerte) i 48 timer ved 37 ºC med sporadisk forsiktig risting med hånd. Dette følger embryo / hjerte montering ved hjelp av glyserol (se kapittel 50,2).
5. Prøve Montering og bildebehandling
MERK: ryddet embryoer eller organer i Sca l e 70 eller CUBIC-to-løsning kan avbildes direkte med Scale 70 og CUBIC-to-løsning som bildebehandling medium, henholdsvis. Men vurderer sårbarhet embryonale prøver å tømme reagenser, hvis prøvene ikke skal avbildes umiddelbart, men lagret langsiktig og lagre prøvene i 90% glyserol følge protokollen under.
- Direkte senk Sca le ryddet prøve i 1 ml 90% glyserol og oppbevares ved 4 ° C til bildebehandling.
- Vask den kubiske behandlede prøve med 1 x PBS to ganger, 5 minutter hver og sekvensielt inkubere prøven med 1 ml 30%, 50%, 70% og 90% glycerol-løsning hver i 30 min.
- For bildebehandling, overføre prøven til glassbunn petriskål med en minimal mengde av 90% glyserol og bilde kloner med en konfokalmikroskop utstyrt med to foton evner.
- Bilde hjertet eller embryo i glyserol med en 10X / 0.3 NA, 25x / 0.8 NA nedsenking, eller en 40X / 1.2 NA vann korrigerende objektiv. Bilde DAPI å bruke to-foton eksitasjon fra en sammenhengende titan: safir kameleon laser. Valget av mikroskopobjektivlinse og vil avhenge av formålet med forsøkene, for eksempel for super-oppløsning, kan en lett plate fluorescerende mikroskop anvendes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Imaging ryddet embryonale hjertet
Vertebrate hjerte formasjon er et spatiotemporally regulert morphogenic prosess og avhenger av organiseringen og differensiering av progenitorceller fra fire forskjellige kilder 1. Celler fra den første hjerte feltet i hjerte halvmåne vil kaste seg mot den ventrale midtlinje for å danne en lineær hjerte rør. Cellene fra andre hjerte-feltet, i første omgang som befinner seg dorsomedially til den første hjerte-feltet, deretter translocate til den i svelget og innvoller mesoderm, hvor de migrerer til den pre-eksisterende stillas av den lineære hjerte røret. Cellene av andre hjerte-feltet vil bidra til den høyre ventrikkel, utløpskanalen (OFT) myocardium og i en viss endokardet 25-28. Hjerte neural crest cellene (CNCC), som stammer fra postotic rhombomeres 6, 7 og 8, vil migrere til hale svelget og bidra signifilig til glatt muskulatur lag og endokardiale puter i OFT. De bidrar også til dannelsen av aorticopulmonary septum 29,30. Den fjerde populasjon består av epikardiale celler avledet fra pro-epikardiell organ (PEO), og bidrar til fibroblaster, glatte muskelceller og potensielt andre hjertecelletyper 31. Epikardet regulerer koronar vaskulær utvikling, hjerte vekst og morphogenesis 21.
Det viktigste konseptet om hjerte morphogenesis er at under hjerte utvikling, unormal cellemigrasjon / differensiering av fire stamcellepopulasjoner vil resultere i misdannelser eller medfødte hjertefeil 4,22,32, som er nummer én årsak til fødselsskader i verden . Bestemme mekanismene for hjerte morphogenesis på cellulært og molekylært nivå er et viktig skritt mot å forbedre diagnostikk og mulige behandlinger for CHDs.Derfor er det viktig å avbilde fremgangs hjerte morfogenese i hele hjertenivå med enkeltcelle-oppløsning. For å oppnå dette, merket vi cardiomyocytes ved å krysse Cre linje under kontroll av hjertets bestemt troponin T (cTnT), som er spesielt uttrykt i cardiomyocytes 18, med mTmG reporter linje. Embryoene på E8.5 ble høstet og farget for PECAM å skille endokardiale og endotelceller fra kardiomyocytter. Embryoene ble deretter klarert av Sca le og hjertet ble fotografert. Hjertemuskelen ble merket med GFP grunn cTnT drevet Cre-mediert rekombinasjon av mTmG reporter, og endocardium var merket med PECAM (figur 1A og analytiker Movie 1). De cardiomyocytes kan observeres på en enkelt celle oppløsning (figur 1A). Hjerte strukturer av den avbildede parti, slik som det primitive ventrikkel og OFT klart kan identifiseres etter 3D-rekonstruksjon ved bruk av 3D-rekonstruksjon programvare (figur 1B og analytiker Movie 2).
Imaging enkelt kloner av ryddet embryonale hjertet
Cardiac morfogenese avhenger av hjerte avstamning differensiering og individuell celle organisasjon på hele hjertenivå 22, og derfor er det viktig å avbilde enkelt hjertestamcelledifferensiering til forskjellige hjertecelletyper og til også bilde cellemorfologi ved enkelt celle oppløsning. For å oppnå dette, ble Rosa26Cre ERT2 15 krysses for å R26R-Confetti 16, og den gravide kvinne ble gavaged med Tamoxifen til en lav konsentrasjon. Etter 48 timer ble embryo høstet på E9.5, og hele montere farget for PECAM, og deretter hele hjertet ble fotografert. Vi fant ut at det var bare en klynge av celler, lokalisert til OFT, og dette klone hadde 8 celler basert on det rekonstruerte bildet og påfølgende seksjoner (figur 2A, 2B og Supplerende Movie 3), noe som indikerer at disse cellene er avledet fra en enkelt stamcelle. Den cellulære morfologi og cellulær oppførsel så som cellulær proliferasjon og migrasjon kan utledes fra den endelige posisjoneringen av celler (figur 2A). Vi har også brukt den CUBIC metode for å fjerne den embryonale hjerte E9.5 og E10.5, og funnet ut at selv etter bare 24 timers inkubasjon med reagens 1, ble embryoene subtilt oppløst og vev strukturen ble negativt påvirket (data ikke vist ).
Imaging av ryddet postnatal og sene embryonale hjerter
Vi søkte både Sca l e og CUBIC å fjerne postnatal hjerter. P2 hjerter med genotype av αMHC-Cre; mTmG (αMHC-Cre er spesielt uttrykt i cardiomyocytes <sup> 17) ble klarert med Sca l e i 48 timer, men ikke vise noen mer åpenhet enn hjertene behandlet med PBS bare (data ikke vist), noe som indikerer at Sca l e clearing er ikke effektiv for postnatal hjerter. Når P2 hjerter ble fjernet med CUBIC reagens 1 i 48 timer, og reagens 2 i 96 timer, de var mye mer gjennomsiktige enn de hjerter ryddet med reagens 1 i 48 timer og reagens 2 i 48 timer. Den avbildningsdybden ble betydelig økt med 96 timers reagenser to inkubasjon (Utfyllende Movies 4 og 5), noe som indikerer at lengre inkubasjon med kubikk reagenser fremmer åpenhet og gir en økning i avbildningsdybden. Formen og størrelsen på hvert kardiomyocytt kan identifiseres av membranen lokaliserte GFP (figur 3A), som kan brukes til å identifisere hypertrofi.
Vi ryddet også Nfatc1-Cre, Confetti (Confetti kvinnelige plugget med Nfatc1Cre mannlige) E17.5 hjerter (Nfatc1-Cre er uttrykt i hjerte endokardiale celler 19) med CUBIC reagens 1 i 48 timer og reagens 2 i 48 timer. Hjertene er gjennomsiktige, og fluorescerende proteiner inkludert GFP, YFP, CFP og RFP var forventet å merke endokardiale celler og deres avledet celler; men kan bare GFP og YFP avbildes gjennom hele hjertet (Tall 3B, 3C og Utfyllende Movies 6 og 7), og CFP og RFP kunne ikke påvises (data ikke vist). Den farging for PECAM (Alexia Fluor 647) også kunne ikke påvises (data ikke vist), noe som tyder på at CUBIC reagent slukker CFP, RFP og antistoff konjugert fluoroforen i denne protokollen.
Figur 1:. Imaging Sac / e ryddet embryonale hjerte (A) En optiske bit av en E8.75 hjerte (cTnT-Cre; mTmG) vises. V: ventrikkel; OFT: outflow skrift. (B) Viser rekonstruert hjertet strukturen i 93 sammenhengende optiske skiver med en total dybde på 110,4 nm. Scale bar = 20 mikrometer i A. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Imaging enkelt klone av Sca / e ryddet embryonale hjerte (A) En optisk del av en klone fra en E9.5 hjerte med genotype av ROSA26-Cre ERT2;. ROSA26-Confetti. Pilen peker til mobil utvekst av en kardiomyocytt. (B) viser den rekonstruerte klonen i OFT regionen av E9.5 hjerte med 10 optiske skiver og 36 um total dybde. Scale bar = 20 mikrometer i A. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
. Figur 3: Imaging CUBIC ryddet barsel og sene embryonale hjerter (A) Viser en optisk seksjon av en P2 hjerte med genotype av αMHC-Cre; mTmG; alle av de optiske delene er vist i Tilleggsfilm 5. (b) viser en seksjon av en E17.5 hjerte med genotypen til Nfatc1-Cre; ROSA26-konfetti. (C) Viser rekonstruert hjertet strukturen fra 106 optiske skiver med en total dybde på 630 mikrometer. Den Scale bar = 20 mikrometer i A og er 100 mikrometer i B. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
. Supplerende Movie 1: Imaging Sca le ryddet embryonale hjerte (Høyreklikk for å laste ned) Movie 1 viser optiske deler av en Sca le behandlet E8.75 hjerte (cTnT-Cre; mTmG) fra hjertet overflaten til hjerte lumen. Dybden er 110,4 m og det er 93 stykker totalt.
Tilleggs Movie 2:. Imaging Sca le ryddet embryonale hjerte (Høyreklikk for å laste ned) Movie 2 viser 3D-overflaten bilde av den rekonstruerte hjerte i Movie 1, reconstructed via 3D-rekonstruksjon programvare. Gule markerer PECAM uttrykk og grønne etiketter alle cardiomyocytes.
Tilleggs Movie 3: Imaging en enkelt klone av Sca le ryddet embryonale hjerte (Høyreklikk for å laste ned). Movie 3 viser deler av en klone fra en E9.5 hjerte med genotype av ROSA26-Cre ERT2.
Tilleggs Movie 4: Imaging kubikk ryddet postnatal hjerter (Høyreklikk for å laste ned). Movie 4 viser deler av et CUBIC behandlet P2 hjerte (& #945, MHC-Cre; mTmG) fra hjertet overflaten til hjerte lumen. Dette P2 hjerte var klarert med CUBIC reagens 1 i 48 timer, og CUBIC reagens 2 for 96 timer.
Tilleggs Movie 5: Imaging kubikk ryddet postnatal hjerter (Høyreklikk for å laste ned). Movie 5 viser et hjerte som var klarert med reagens CUBIC en i 48 timer og reagenser CUBIC 2 i 48 timer. Dybden er 136 mikrometer med 6 mikrometer per seksjon i film 4 og tykkelsen er 76 mikrometer med 6 mikrometer per seksjon i filmen fem.
Tilleggs Film 6: Imaging CUBIC ryddet sent Embryonic hjerte (Høyreklikk for å laste ned) Movie 6 viser deler av et CUBIC behandlet E17.5 hjerte (Nfatc1-Cre; ROSA26-Confetti). fra hjertet overflaten til hjerte lumen. Dybden er 630 mikrometer med 6 mikrometer per seksjon.
Tilleggs Movie 7: Imaging CUBIC ryddet sent embryonale hjerte (Høyreklikk for å laste ned). Movie 7 viser 3D overflaten bilde av hjertet i Movie 6, rekonstruert via 3D-rekonstruksjon programvare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Embryoet isolasjon er et meget kritisk trinn. E9.5 embryoer er svært skjør og liten i størrelse, så ekstra forsiktighet bør utvises for ikke å skade fosteret / hjerte strukturer under isolasjon. De ikke-embryonale ekstra lag omslutter fosteret / hjerte bør fjernes forsiktig, spesielt når avbildning hele embryo. Dette gjør at antistoff og clearing blanding penetrasjon dypt inne i embryonale vev, og hjelper også på å fjerne bakgrunnssignalet når bildebehandling. Flere antistoffer inkludert antistoffer mot PECAM, acetylert α-tubulin og integrin β1 ble undersøkt, og alle ble vellykket påvist (data ikke vist) 33. Dette demonstrerer at molekyl integritet, ble cellulær integritet og antigen forenlighet ikke avbrytes under denne rensingen prosessen.
Overfør embryo / hjertet ved hjelp av en bred munn overføring pipette (kutte spissen). Dette unngår skader under håndtering. GFP / YFP / RFP / CFP uttrykk mønster og numbra av kloner bør være nøye registreres i hjertet for å finne riktig dosering til å merke en klone per hjertet eller andre organer. På grunn av den lave dose av Tamoxifen (10 ug / g), noen ganger hjertet ikke inneholder noen kloner eller er vanskelig å oppdage eventuelle kloner. Derfor anbefales det å bruke plommesekken for å finne ut om fosteret har noen GFP / YFP / RFP / CFP kloner.
Embryo eller hjerte fiksering er et kritisk trinn, som over-fiksering vil resultere i en høy bakgrunn, mens under-fiksering vil resultere i dårlig farging. Det anbefales å fikse E8.5-E10.5 hele embryo for 2 timer ved RT på en plate shaker. Mens for E11.5-E15.5 embryoer, er anbefalingen å isolere nøye hjertet og fikse det med 4% PFA for 2 timer ved RT. Etter å sikre for å fjerne lagene som omgir hjerte hvis behandlingen hele embryoet, kan E11.5- E13.5 embryoene også være løst i 3-4 timer ved romtemperatur, men som krever økt vev tømmetid. Den E16.5-P1 (postnataldag 1) hjerter er fast i 3-4 timer ved romtemperatur på en plateryster. Ved fastsettelse av hele embryoet, bør for- og bakben bli fjernet etter hvert som de hindrer hjerteavbildning.
Prøvene bør behandles med CUBIC og Sca le i scintillasjonsglass å minimere prøven tørking. Vi har observert bedre rydding av prøver med den CUBIC vev clearing metode ved 37 ° C, mens Sca le clearing er optimalt gjort ved 4 ° C. Etter bildebehandling, kan prøvene oppbevares kortsiktig i kubikk-2 eller Sca le 70. Prøvene bør alltid være dekket med aluminiumsfolie for å hindre at fluorescens bleking.
Embryonale vev og organer har mindre lipid og ekstracellulær matriks avsetning, noe som resulterer i mindre tømmetid. På den annen side, er de mer sårbare for tømme reagenser. Clearing reagenser kan påvirke integriteten av vevet struktur og antigen, som resulterer i slukking av CFP, RFP og antistoff conjugated fluorophore. Derfor kan lengre feste ganger hindre slukke. Quenching av de fluorescerende proteiner kan også være på grunn av deres følsomhet for kjemikalier og pH som tidligere rapportert 34. Andre kjemiske oppskrifter, pH, fiksativ og inkubasjon lengde bør utforskes for å minimere slukke av fluorescerende proteiner.
Metoden for hele organet transparentizing eller vev clearing har revolusjonert volumet 3D avbildning. Den forrige avbildningsmetode for hjerte morphogenesis, som involverte den manuelle 2D- eller 3D-rekonstruksjon av seriesnitt, er tidkrevende og instrument krevende 5,6. Høy oppløsning episcopic mikroskopi (HREM) sammen med 3D-modellering kan anvendes i studiet av morfogenese av musen hjerte og sørger for god anatomisk beskrivelse av trabekulært arkitekturen i den tredje mus embryo 35. Imidlertid, HREM ikke tillater identifisering av fluorescerendeent protein merkede celler eller antistoff farget celler fra resten av cellene 35. Ved hjelp av dagens protokoll, med minimal innsats og høy kostnadseffektivitet, har vi lykkes bevart fluorescerende signaler i embryonale hjertet ved hjelp Sca le eller kubisk vev clearing metoder (figur 1 - 3). Kombinert med en lav dose (10 mikrogram / g) av Tamoxifen å indusere Cre rekombinasjon og generere noen kloner inne hele embryo og i hjertet, kan dette systemet brukes til å spore og studere enkelthjertestamcelledifferensiering og cellulære atferd i vivo (Figur 2A) 33. I tillegg, i kombinasjon med Cre-formidlet gen-delesjon eller overekspresjon og Cre-formidlet enkeltcellemerking, dette bildedannende system kan brukes til å studere genetisk tap av funksjon eller vinning av funksjon på stamcelledifferensiering og cellulær oppførsel under hjerte morfogenese, og tilveiebringer således en robust verktøy for å stUdy etiologien av medfødte hjertefeil.
De to-vevet avregningssystemer Sca / e og kubiske anvendt i denne studien viste forskjellige clearing effektivitet, noe som ytterligere skiller systemene basert på embryonisk alder, tykkelse vev og varighet av vev tømmetid. For tidlig embryo E9.5-E10.5, SCA / e systemet ikke bare gjengitt vevet klart, men også beskyttet embryoet morfologi og bevart fluorescerende signaler, mens CUBIC behandlingen resulterte i embryo oppløsning. Dette kan være et resultat av flere aminoalkoholer og en høyere konsentrasjon av Triton X-100 i det kubiske løsninger 8. For eldre hjerter, SCA / e-systemet ikke klarte å fjerne vev helt selv med en lengre inkubasjonstid. Den CUBIC clearing løsning avsa eldre vev klar (figur 3). Men økt inkubasjonstid resulterte i svakere signaler og bare beskyttet endogen GFP, mens RFP, CFP og antistoff konjugert signalerhadde gått seg bort. Av denne grunn ville en mer optimal oppskrift av tømme reagenser og bedre inkubasjonstid være nødvendig for å volumetrisk bilde hjerter eller organer med et større spektrum av fluorescerende markører.
Denne studien viste at man kan merke, spor, og bilde enkle hjerte kloner i kombinasjon med en hel montere farging av endokardiale / endotelial cellemarkør PECAM av det fremkallende hjerte. Hele montere farging av PECAM og DAPI i dette systemet ikke bare bidrar til å identifisere celletyper og cellemorfologi av de merkede cellene inne i et hjerte, men gjør det også mulig å studere den klonale mønster, migrering og oppførsel under hjerte morfogenese. I figur 2A observerte vi en klone med 8 celler i OFT. Ved hjelp av antall celler tilstede i denne klon med referanse til merkingen tid, kan cellen formeringshastigheten lett beregnes. I en annen studie med samme system identifiserte vi orientert celledeling mønster og MIGRasjon mønster av enkelt kardiomyocytt under trabeculation prosess 33. Anvendelsen av denne protokollen for å studere effekter av genetisk tap av funksjon eller gevinst på funksjon spatiotemporally på merket hjertestamcelledifferensiering, klonal mønster og cellulær atferd er gjennomførbart, og vil hjelpe i studier av etiologi av medfødte hjertefeil hos genetisk og molekylært nivå i en 3D-sammenheng. I tillegg kan denne protokoll anvendes for å studere av morfogenese i andre organsystemer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,2′,2′’-nitrilotriethanol | Sigma Aldrich | 90279 | |
| 4% Paraformaldehyde in PBS | Affymetrix | 19943 | |
| BSA | Fischer Scientific | BP16000 | |
| N,N,N’,N’-tetrakis(2-hydroxypropyl) ethylenediamine | Sigma Aldrich | 122262 | |
| Phosphate Buffer Saline | Sigma Aldrich | P5368-10PAK | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U-1250 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | 84097 | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G8773 | |
| Tamoxifen | Sigma Aldrich | T5648 | |
| Sunflower seed oil | Sigma Aldrich | S5007 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
| PECAM (CD31) | BD Pharmingen | 550274 | |
| Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21247 | |
| DAPI nuclear stain | Sigma Aldrich | D9542 | |
| 37oC Incubator | Thermoscientific Fischer | Heratherm, Compact Microbiological Incubators | |
| 48 well plates | Cell Treat | 229148 | |
| Analytical Balance | Metler Toledo | PB153-S/FACT | |
| Confocal microscope | Zeiss | Zeiss 510 confocal microscope | |
| Disecting Microscope | Unitron | Z850 | |
| Fluorescent microscope | Zeiss | Observer. Z1 | |
| Germinator 500 Glass Bead Sterilizer | CellPoint Scientific | GER-5287-120V | |
| Light Source | SCHOTT | ACE I | |
| Pair of Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Petri dish 60 mm x15 mm | TPP Techno Plastic Products AG | 93060 | |
| Rocker II Platform Rocker | Boekel Scientific | 260350 | |
| Scintillating tubes | Fischer Scientific | 03-337-26 | |
| Transfer pipette | Samco Scientific | 202 | |
| Tweezers | Fine Science Tools | 11251-20 |
References
- Vincent, S. D., Buckingham, M. E. How to make a heart: the origin and regulation of cardiac progenitor cells. Curr Top Dev Biol. 90, 1-41 (2010).
- Olson, E. N. A decade of discoveries in cardiac biology. Nat Med. 10, 467-474 (2004).
- Olson, E. N. Gene regulatory networks in the evolution and development of the heart. Science. 313, 1922-1927 (2006).
- Bruneau, B. G. The developmental genetics of congenital heart disease. Nature. 451, 943-948 (2008).
- Mohun, T. J., Weninger, W. J. Embedding embryos for high-resolution episcopic microscopy (HREM). Cold Spring Harb Protoc. , 678-680 (2012).
- Soufan, A. T., et al. Three-dimensional reconstruction of gene expression patterns during cardiac development. Physiol Genomics. 13, 187-195 (2003).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W.
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157, 726-739 (2014).
- Becker, K., Jahrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains. PLoS One. 7, e33916 (2012).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158, 945-958 (2014).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
- Badea, T. C., Wang, Y., Nathans, J. A noninvasive genetic/pharmacologic strategy for visualizing cell morphology and clonal relationships in the mouse. J Neurosci. 23, 2314-2322 (2003).
- Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450, 56-62 (2007).
- Agah, R., et al. Gene recombination in postmitotic cells. Targeted expression of Cre recombinase provokes cardiac-restricted, site-specific rearrangement in adult ventricular muscle in vivo. J Clin Invest. 100, 169-179 (1997).
- Jiao, K., et al. An essential role of Bmp4 in the atrioventricular septation of the mouse heart. Genes Dev. 17, 2362-2367 (2003).
- Wu, B., et al. Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling. Cell. 151, 1083-1096 (2012).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
- Wu, M., et al. Epicardial spindle orientation controls cell entry into the myocardium. Dev Cell. 19, 114-125 (2010).
- Zhao, C., et al. Numb family proteins are essential for cardiac morphogenesis and progenitor differentiation. Development. 141, 281-295 (2014).
- Kaufman, M. H., Kaufman, M. H. The atlas of mouse development. , Academic Press. London. (1992).
- Nagy, A. Manipulating the mouse embryo : a laboratory manual. , 3rd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2003).
- Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nat Rev Genet. 6, 826-835 (2005).
- Kelly, R. G., Buckingham, M. E. The anterior heart-forming field: voyage to the arterial pole of the heart. Trends Genet. 18, 210-216 (2002).
- Verzi, M. P., McCulley, D. J., De Val, S., Dodou, E., Black, B. L. The right ventricle, outflow tract, and ventricular septum comprise a restricted expression domain within the secondary/anterior heart field. Dev Biol. 287, 134-145 (2005).
- Ward, C., Stadt, H., Hutson, M., Kirby, M. L. Ablation of the secondary heart field leads to tetralogy of Fallot and pulmonary atresia. Dev Biol. 284, 72-83 (2005).
- Echelard, Y., Vassileva, G., McMahon, A. P. Cis-acting regulatory sequences governing Wnt-1 expression in the developing mouse CNS. Development. 120, 2213-2224 (1994).
- Jiang, X., Rowitch, D. H., Soriano, P., McMahon, A. P., Sucov, H. M.
- Viragh, S., Challice, C. E. The origin of the epicardium and the embryonic myocardial circulation in the mouse. Anat Rec. 201, 157-168 (1981).
- Wu, M., Li, J. Numb family proteins: novel players in cardiac morphogenesis and cardiac progenitor cell differentiation. Biomolecular concepts. 6, 137-148 (2015).
- Li, J., et al. Single-Cell Lineage Tracing Reveals that Oriented Cell Division Contributes to Trabecular Morphogenesis and Regional Specification. Cell reports. 15, 158-170 (2016).
- Alkaabi, K. M., Yafea, A., Ashraf, S. S. Effect of pH on thermal- and chemical-induced denaturation of GFP. Appl Biochem Biotechnol. 126, 149-156 (2005).
- Captur, G., et al. Morphogenesis of myocardial trabeculae in the mouse embryo. J Anat. , (2016).
