Abstract
Un solo trazado clonal y el análisis a nivel de todo el corazón pueden determinar el comportamiento de células progenitoras cardíacas y diferenciación durante el desarrollo cardíaco, y permitir el estudio de las bases celulares y moleculares de la morfogénesis cardíaca normal y anormal. Recientes tecnologías emergentes de los análisis retrospectivos clonales individuales hacen que el estudio de la morfogénesis cardíaca a una resolución de una sola célula viable. Sin embargo, la opacidad del tejido y dispersión de la luz del corazón como la profundidad de imagen se aumenta la imagen de todo el corazón obstaculizar a una resolución de una sola célula. Para superar estos obstáculos, un sistema de compensación de todo el embrión que puede hacer que el corazón de gran transparencia, tanto para la iluminación y detección deben ser desarrollados. Afortunadamente, en los últimos años, se han reportado muchas metodologías para sistemas de compensación de todo el organismo, tales como la claridad, le Sca, SeeDB, ClearT, 3DISCO, cúbico, DBE, Babb y PACT. Este laboratorio está interesado en los mecanismos celulares y moleculares de la tarjetamorfogénesis IAC. Recientemente, hemos establecido el linaje de células individuales de rastreo a través de la ROSA26-Cre ERT2; sistema de ROSA26-confeti a las células de la etiqueta escasamente durante el desarrollo cardíaco. Se adaptó varias metodologías integrales de embriones de compensación, incluida Sca-le-(y, cócteles de imágenes cerebrales sin obstáculos claros y análisis computacional) CÚBICAS para despejar el embrión en combinación con toda la tinción de montaje de imagen clones individuales dentro del corazón. El corazón fue fotografiada con éxito en la resolución de una sola célula. Se encontró que Sca le puede borrar el corazón embrionario, pero no puede limpiar con eficacia el corazón postnatal, mientras CUBIC puede limpiar el corazón postnatal, pero daña el corazón embrionario disolviendo el tejido. Los métodos descritos aquí permitirán el estudio de la función de genes en una sola resolución clon durante la morfogénesis cardíaca, la cual, a su vez, puede revelar las bases celulares y moleculares de los defectos congénitos del corazón.
Introduction
Morfogénesis cardíaca es un evento secuencial que requiere la organización espacio-temporal de cuatro tipos diferentes de células progenitoras cardíacas en sectores distintos del corazón, y también requiere múltiples redes de regulación genética para orquestar este proceso para formar la 1,2 corazón funcional. Cardiaco especificación, diferenciación, patrones, y la maduración de cámara están regulados por factores de transcripción cardiogénico 3. Mutación genética o la aberración postranscripcional de estos factores en las células progenitoras cardiacas podrían resultar en la letalidad embrionaria o defectos congénitos del corazón (CHD) 4. El estudio de la morfogénesis cardíaca requiere una comprensión de los detalles inherentes estructurales en tres dimensiones (3D) y solo linaje de células progenitoras cardíacas etiqueta de rastreo durante el desarrollo cardiaco promoverá la comprensión de la morfogénesis cardíaca. Una serie de métodos basados sección de tomografía de alta resolución se han desarrollado en THe últimos años, que la estructura del órgano de imagen 5,6; Sin embargo, estos métodos requieren instrumentos especializados, costosos y extensa de trabajo, y carecen de organización estructural detallado en la resolución de las células del volumétrica final de la imagen reconstruida 7,8.
De imagen volumétrica en 3D en el nivel de células individuales proporciona un medio para estudiar la diferenciación de células progenitoras y el comportamiento celular in vivo 7. Sin embargo, la dispersión de luz de tejido sigue siendo el principal obstáculo para imágenes de células y estructuras en 3D en el interior del corazón intacto. Los lípidos son una fuente importante de dispersión de la luz, y la eliminación de lípidos y / o el ajuste de la diferencia de índice de refracción entre los lípidos y sus alrededores son posibles enfoques para aumentar la transparencia del tejido 8. En los últimos años, se han desarrollado una serie de métodos de compensación de tejido, lo que reduce la opacidad del tejido y la dispersión de la luz, como Babb (alcohol bencílico y benzoato de bencilomezcla e) y DBE (tetrahidrofurano y dibenzylether); pero en estos métodos, extinción de fluorescencia sigue siendo un problema 8-10. El disolvente basa métodos hidrófilos, tales como SeeDB (fructosa / tioglicerol) y 3DISCO (diclorometano / dibenzylether), preservar señales fluorescentes, pero no hacen que el conjunto del órgano transparente 7,8,11. En comparación, el método de limpieza de tejido CLARITY hace que el órgano transparente, pero requiere un dispositivo de electroforesis especializado para eliminar los lípidos de 8,12, como lo hace PACT (técnica de claridad pasivo), que también requiere la incorporación de hidrogel 7,13. Para obtener información detallada acerca de todos los métodos de limpieza de tejidos disponibles, consulte la Tabla 1 en Richardson y Lichtman, et al. 7.
En 2011, Hama et al. Serendipitously descubrió una mezcla hidrófila 'Sca le' (urea, glicerol y Triton X-100 mezcla) que hace que el cerebro de ratón y embrión transparent preservando al mismo tiempo completamente señales fluorescentes a partir de clones marcados 14. Esto permite la formación de imágenes del cerebro intacto a una profundidad de varios milímetros y reconstrucción a gran escala de poblaciones neuronales y proyecciones con una resolución subcelular. Susaki et al. aún más mejorada Sca le mediante la adición de aminoalcoholes y desarrolló el (claras, cócteles sin obstáculos de imágenes cerebrales y análisis computacional) '' CÚBICAS método de compensación de tejido, lo que aumentó la solubilización de fosfolípidos, un reducido tiempo de compensación, y se deja para la imagen multicolor fluorescente 8. En el presente estudio, aprovechando la Sca LE y técnicas de limpieza y eliminación de tejido cúbico y alta resolución en 3D seccionamiento óptico, clones individuales dentro del corazón durante cardiogénesis se trazaron utilizando Rosa26Cre ERT2 15, R26R-confeti 16, αMHC-Cre 17, cTnT-Cre 18, NFATc1 Cre-19, y Rosa26-mTmG (mTmG) 20 líneas de ratón. La combinación del método de tinción conjunto de montaje (WMS) desarrollado previamente 21,22 con los métodos de limpieza y eliminación de tejido permitidos adicional para la tinción de otras proteínas en clones etiquetados y para el estudio de su comportamiento en un contexto volumétrica 3D. La combinación de la limpieza de tejidos y WMS permite una mejor comprensión de las funciones de los diferentes genes y proteínas durante el desarrollo cardiaco, y la etiología de los defectos congénitos del corazón. Este protocolo se puede aplicar para estudiar otra diferenciación de células progenitoras, el comportamiento celular, y eventos morfogénesis de órganos durante el desarrollo.
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Protocol
Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional (IACUC) en Albany Medical College y llevaron a cabo de acuerdo con la Guía del NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.
1. Preparación de soluciones
NOTA: El Rosa26Cre ERT2 15, R26R-16 confeti, αMHC Cre-17, y Rosa26-mTmG (mTmG) 20 líneas de ratón se adquirieron comercialmente cTnT Cre-18 fue un regalo del doctor Jiao en la Universidad de Alabama NFATc1-Cre.. fue un regalo del doctor Bin Zhou en el Albert Einstein College of Medicine 19. Los ratones fueron sacrificados por inhalación de dióxido de carbono en una cámara cerrada durante al menos 60 segundos, seguido por medios físicos de verificación muerte por toracotomía bilateral, decapitación o dislocación cervical.
- Preparar tamoxifeno. Disolver 10 mg de tamoxifeno en 10 ml de OI de semilla de girasoll. Una vez que esté completamente disuelta, alícuota y se almacena a -20 ° C.
- Preparar solución salina tamponada con fosfato (PBS). Disolver Na 2 HPO 4 (1,41960 g), KH 2 PO 4 (0,24496 g), NaCl (8,0669 g) y KCl (0,20129 g) en 1 L de agua destilada y ajustar el pH a 7,4.
- Preparar PBST: 0,1% de solución de Tween-20 en PBS disolviendo 100 l de Tween-20 en 100 ml de PBS.
- Preparar el tampón de bloqueo. Hacer 3% de albúmina de suero bovino (BSA) solución de bloqueo por disolución de 3 g de BSA en 100 ml de PBST que contenía 0,2% de Tween-20.
- Preparar CUBIC-1 (reactivo 1). Mezclar 25% en peso de urea, N, N, N ', N'-tetrakis etilendiamina 25% en peso (2-hidroxipropil) y 15% en peso de Triton X-100 en dH 2 O.
- Preparar CUBIC-2 (reactivo 2). Mezclar 50% en peso de sacarosa, 25% en peso de urea, 10% en peso de 2, 2 ', 2' '- nitrilotrietanol y 0,1% (v / v) de Triton X-100 en dH 2 O.
- Preparar Sca le A2: 4 M urea, 10% w / v de glicerol y 0,1% w / v Triton X-100 en dH2O Ajustar el pH a 7,7.
- Preparar Sca le B4: urea 8 M y 0,1% w / v Triton X-100 en dH 2 O. Ajustar el pH a 8,7.
- Preparar Sca le 70: 4 M urea, 70% w / v de glicerol y 0,1% w / v Triton X-100 en dH 2 O.
2. El tamoxifeno inducción, aislamiento de los embriones y Fijación
- El tamoxifeno Inducción y aislamiento de los embriones
- El uso de un protocolo aprobado tubo de alimentación curvada (ACUP 13-12.007), alimentación forzada de los ratones hembra R26Cre ERT2 confeti (tapado por los ratones macho R26Cre ERT2) con 10 mg / g de tamoxifeno en el desarrollo embrionario día 33 E7.75. En el día embrionario 9.5 (E9.5) o E10.5, la eutanasia a los ratones hembra con CO2 y dislocación cervical.
- Después de la verificación de la muerte del ratón (véase la Sección 1 Nota), abrir la cavidad abdominal del ratón con unas tijeras y diseccionar el cuerno uterino, eliminar las capas de tubos uterina con la ayuda de tijeras y pinzas, y rearrendar los embriones del 23,24 trompa uterina.
- La transferencia de los embriones para una placa de Petri que contiene PBS (pH 7,4). Bajo el microscopio de disección, eliminar las capas no embrionarias (corion, amnios y el saco vitelino) con la ayuda de unas pinzas.
- El uso de pinzas y tijeras, recoger las muestras de hembras de ratón y de la cola del embrión para la genotipificación como se informó anteriormente 22. Usando una pipeta de plástico, la transferencia de cada embrión a un pocillo de una placa de 48 pocillos que contenía 1 ml de 1x PBS.
- Bajo un microscopio de fluorescencia, identificar las GFP / RFP / embriones de la PPC positivos a través de un microscopio invertido con una cámara. Despegue del pericardio mediante pinzas y gire el corazón / embrión con la ayuda de unas pinzas curvas, para determinar el número de clones fluorescentes en ambos lados del corazón con los filtros GFP / RFP / CFP. No se necesitan cortes.
- Después de identificar GFP / RFP / embriones positivos de la PPC, lavar rápidamente los embriones dos veces (2 minutos cada uno) con 1 x PBS en THe-48 así placa en un agitador de placas a temperatura ambiente (TA). Esto eliminará el exceso de sangre.
- Fijar el embrión corazón / embrionario usando 4% de paraformaldehído (PFA) a TA. El tiempo de fijación depende de la edad y el tejido tamaño embrionario. Para E9.5 fijar el embrión durante 2 horas a RT. A finales de los embriones en etapa embrionaria requieren tiempo de fijación más largo, que incluso se pueden prolongarse hasta 24 horas para el corazón posnatal.
PRECAUCIÓN: El paraformaldehído es tóxico, evite el contacto con la piel, los ojos y las membranas mucosas. - Después de la fijación, lavar el embrión / el corazón en la placa de pocillos 48 dos veces (10 min cada una) con 1 x PBS en un agitador de placas a temperatura ambiente. Esto elimina el exceso de PFA a partir del embrión / corazón. Los embriones se procesan adicionalmente para toda la tinción de montaje y la limpieza de tejidos.
3. Todo el montaje de tinción
NOTA: Después de la fijación del embrión PFA / corazón se somete a toda la tinción de montaje de la siguiente manera.
- Permeabilizar el embrión / corazón en una placa de pocillos 48 por medio de 1 ml de 0,1% PBST durante 2 horas en un agitador de placas a temperatura ambiente.
- Tras la permeabilización, sumergir el embrión / corazón en 1 ml de tampón de bloqueo, durante 2 horas o durante la noche en un agitador de placas a 4 ºC.
- Sumergir el embrión / corazón a la PECAM anticuerpo específico de células endoteliales (CD31), diluido (1: 100) en 0,3 ml de tampón de bloqueo durante 48 horas en un agitador de placas a 4 ºC.
- Lavar el embrión / corazón usando PBST 5 veces, 30 minutos cada uno a temperatura ambiente en un agitador de placas. Esto elimina el anticuerpo primario unido no específica exceso del tejido.
- Sumergir el embrión / corazón en Alexa Fluor 647 de cabra anti-rata anticuerpo secundario, se diluyó (1: 1000) en 1 ml de tampón de bloqueo durante 48 horas en un agitador de placas a 4 ºC.
- Repita el paso 3.4 para lavar el anticuerpo secundario.
- Post-solucionar el embrión / corazón con 4% PFA durante 1 hora a RT en un agitador de placa y lavar dos veces con PBS 5 min cada uno.
- Teñir el embrión / corazón con la mancha nuclear 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (diluido en PBST a una concentración de 0,01 mg / ml) durante 10 minutos en un agitador de placas a temperatura ambiente. Siga con dos lavados de PBS de 5 minutos cada uno.
4. Embriones / Compensación corazón con Sca l eo Método CÚBICO
NOTA: Después de toda la tinción de montaje, el embrión / corazón se somete a cualquiera de las Le Sca o método de compensación de tejidos cúbica. La elección del método depende del tamaño del tejido y de la edad embrionaria. Por E11.5 embriones o edad más temprana, e l método de limpieza de tejidos uso Sca, mientras que para los embriones de más edad o corazones postnatales se prefiere el método de compensación de tejidos cúbica.
- Tejido escala Método de Compensación
- Se incuba el embrión / corazón con 1 ml de solución de e A2 Sca l en un vial de centelleo (envueltos en papel de aluminio) con ocasional agitación suave (con la mano) durante 48 horas a 4 ° C.
- Después de la incubación Sca l e A2, se incuba el embrión / corazón con 1 ml de solución de e B4 Sca l a 4 ° C en el mismo vial con agitación suave ocasional para anotsu 48 hr.
- Incubar el embrión / corazón para otro 48 horas con 1 ml Sca l e 70 a 4 ° C con agitación suave ocasional. Monte embrión utilizando glicerol al 90% (ver sección 5.1).
- Método de Compensación de tejidos cúbica
- Para el conjunto del embrión / compensación CÚBICO corazón, sumerja cada embrión / corazón en 1 ml de CUBIC-1 con ocasional agitación suave durante 48 horas a 37 ºC 7. Después de 48 horas, vuelva a colocar la solución con el mismo volumen de reactivo CÚBICO fresca 1, e incubar la muestra durante 48 horas adicionales a 37 ° C con agitación ocasional con la mano.
- Lavar la cúbica-1 tratada corazón / embrión con 1x PBS varias veces a temperatura ambiente con agitación suave con la mano. Esto elimina el exceso de solución CUBIC-1.
- Después de lavar a cabo cúbicas 1 con PBS, sumerja los embriones / corazones en solución CUBIC-2 (1 g por embrión / corazón) durante 48 horas a 37 ºC con ocasional agitación suave con la mano. Esto se deduce de montaje utilizando glicerol embrión / corazón (véase la sección 5.2).
5. Montaje de la muestra e Imagen
NOTA: Los embriones u órganos despejados en Sca l e 70 o solución CUBIC-2 se pueden obtener imágenes directamente con la escala 70 y la solución CUBIC-2 como el medio de imágenes, respectivamente. Sin embargo, teniendo en cuenta la vulnerabilidad de las muestras embrionarias para reactivos de compensación, si las muestras no se obtenerse imágenes de inmediato, sino que se almacena a largo plazo, almacenar las muestras en glicerol al 90% siguiendo el protocolo a continuación.
- Directamente sumerja el Sca le sacó la muestra en 1 ml de glicerol al 90% y se almacena a 4 ° C hasta el momento de formación de imágenes.
- Lavar la muestra tratada cúbicos con 1x PBS dos veces, 5 minutos cada uno y se incuban secuencialmente la muestra con 1 ml de 30%, 50%, 70% y solución de glicerol al 90% cada uno por 30 min.
- Para formación de imágenes, transferir la muestra a fondo de cristal placa de Petri con una cantidad mínima de 90% de glicerol y de imagen clones con un microscopio confocal equipado con dos capacidades de fotones.
- Image el corazón o el embrión en el glicerol con un / 0.3 NA 10X, una inmersión NA 25X / 0.8, o una lente de objetivo 40X correctiva / 1,2 NA agua. Imagen usando DAPI de excitación de 2 fotones de una coherente de titanio: zafiro láser camaleón. La elección de microscopio y la lente objetivo dependerá de la finalidad de los experimentos, por ejemplo para super-resolución, un microscopio de fluorescencia de lámina de luz podría ser utilizada.
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Representative Results
Obtención de imágenes del corazón embrionario aclarado
La formación del corazón de los vertebrados es un proceso morfogenética espaciotemporalmente regulado y depende de la organización y la diferenciación de las células progenitoras de cuatro fuentes diferentes 1. Las células del primer campo corazón de la media luna cardiaca se pliegan hacia la línea media ventral para formar un tubo lineal corazón. Las células de la segunda campo del corazón, inicialmente residen dorsomedial al campo corazón primero, posteriormente se translocan a la faringe y esplácnica mesodermo, desde donde migran al andamio pre-existente del tubo lineal corazón. Las células de campo de segundo corazón contribuirán al ventrículo derecho, tracto de salida del miocardio (OFT) y, en cierta endocardio 25-28. células de la cresta neural cardiaca (CNCC), procedentes de rombómeros postotic 6, 7 y 8, migrarán a la faringe caudal y contribuir significativamente a la capa de músculo liso y almohadillas endocárdicas en la OFT. También contribuyen a la formación del septo aortopulmonar 29,30. La cuarta población se compone de células epicárdicas derivados del órgano pro-epicárdica (PEO), y contribuye a fibroblastos, células de músculo liso y otros tipos de células potencialmente cardíaca 31. El epicardio regula el desarrollo vascular coronaria, el crecimiento y la morfogénesis cardíaca 21.
El concepto más importante sobre la morfogénesis cardíaca es que durante el desarrollo del corazón, la migración anormal de las células / diferenciación de las poblaciones de células progenitoras de cuatro dará lugar a malformaciones o defectos congénitos del corazón 4,22,32, que es la causa número uno de los defectos de nacimiento en el mundo . La determinación de los mecanismos de morfogénesis cardíaca a nivel celular y molecular es un paso esencial para mejorar el diagnóstico y los tratamientos potenciales para las CC.Por lo tanto, es fundamental para la imagen del proceso de morfogénesis del corazón en toda la altura del corazón con la resolución de una sola célula. Para lograr esto, hemos denominado los cardiomiocitos al cruzar la línea de Cre bajo el control de la troponina T cardíaca específica (cTnT), que se expresa específicamente en los cardiomiocitos 18, con la línea reportero mTmG. Los embriones en E8.5 se cosecharon y se tiñeron para PECAM para distinguir las células endocárdicas y endoteliales de los cardiomiocitos. Los embriones se aclara a Sca le fue fotografiada y el corazón. El miocardio se marcó mediante GFP debido a la recombinación mediada por Cre-conducido cTnT del reportero mTmG, y el endocardio se marcó con PECAM (Figura 1A y la película suplementario 1). Los cardiomiocitos se pueden observar en una sola resolución celular (Figura 1A). Las estructuras del corazón de la porción fotografiado, como el ventrículo primitivo y OFT pueden ser claramente identificados después de la reconstrucción 3D utilizando 3D resoftware de la construcción (Figura 1B y complementario Movie 2).
La formación de imágenes clones individuales del corazón embrionario aclarado
Morfogénesis cardíaca depende de la diferenciación de linaje cardiaco y organización de células individuales en toda la altura del corazón 22, y por lo tanto, es esencial para una sola imagen diferenciación cardiaca de células progenitoras a los diferentes tipos de células cardíacas y también la imagen la morfología celular a una resolución de una sola célula. Para lograr eso, Rosa26Cre ERT2 15 se acercó a R26R-16 confeti, y la hembra embarazada fue alimentado a la fuerza con tamoxifeno a una concentración baja. Después de 48 horas, el embrión se recogió a E9.5, y todo el montaje se tiñe para PECAM, y luego fue fotografiada todo el corazón. Se encontró que sólo había un grupo de células, localizada a la OFT, y este clon tenía 8 o células basadasn la imagen reconstruida y secciones consecutivas (Figuras 2A, 2B y complementaria de la película 3), indicando que estas células se derivan de una única célula progenitora. La morfología celular y el comportamiento celular como la proliferación celular y la migración pueden inferirse a partir del posicionamiento final de las células (Figura 2A). También se aplica el método cúbico a despejar el corazón embrionario en E9.5 y E10.5, y encontramos que incluso después de sólo 24 horas de incubación con el reactivo 1, los embriones se disolvieron de forma sutil y la estructura del tejido se vio afectada (datos no presentados ).
Obtención de imágenes de posnatal despejado y corazones embrionarios tardíos
Se aplicaron tanto Sca l ey cúbico a despejar corazones postnatales. corazones P2 con el genotipo de αMHC-Cre; mTmG (αMHC-Cre se expresa específicamente en los cardiomiocitos <sup> 17) se limpiaron con Sca e l durante 48 horas, pero no se ha mostrado más la transparencia de los corazones tratados con PBS solamente (datos no mostrados), lo que indica que Sca l e de compensación no es eficaz para corazones postnatales. Cuando los corazones P2 se limpiaron con el reactivo CÚBICO 1 durante 48 horas, y el reactivo 2 durante 96 horas, eran mucho más transparente que los corazones compensados con el reactivo 1 durante 48 horas y el reactivo 2 durante 48 horas. La profundidad de formación de imágenes se incrementó significativamente con 96 h de incubación del reactivo 2 (Películas complementarias 4 y 5), lo que indica que la incubación con los reactivos ya CÚBICAS promueve la transparencia y prevé un aumento de la profundidad de formación de imágenes. La forma y el tamaño de cada cardiomiocitos se pueden identificar por la membrana GFP localizada (Figura 3A), que puede utilizarse para identificar la hipertrofia.
También hemos aclarado NFATc1-Cre; confeti (confeti hembra conectado con Nfatc1Cre masculinas) corazones E17.5 (NFATc1-Cre se expresa en células endocárdicas cardíacos 19) con el reactivo CUBIC 1 durante 48 horas y el reactivo 2 durante 48 horas. Los corazones son transparentes, y se espera que las proteínas fluorescentes, incluyendo GFP, YFP, CFP y RFP para identificar a las células del endocardio y sus células derivadas; sin embargo, sólo GFP y YFP podrían obtenerse imágenes a través de todo el corazón (figuras 3B, 3C y Películas complementarias 6 y 7), y la PPC y RFP no se pudieron detectar (datos no mostrados). La tinción para PECAM (Alexia Fluor 647) tampoco pudo ser detectado (datos no presentados), lo que sugiere que el reactivo CÚBICO apaga la PPC, RFP y el fluoróforo anticuerpo conjugado en este protocolo.
Figura 1:. Imagine la salida / e aclaró corazón embrionario (A) Una opSe muestra; rebanada tica de un corazón E8.75 (mTmG cTnT-Cre). V: ventrículo; OFT: tracto de salida. (B) muestra la estructura del corazón reconstruido de 93 rebanadas ópticos consecutivos con una profundidad total de 110,4 micras. Barra de escala = 20 micras en A. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Proyección de imagen único clon de Sca / e aclaró corazón embrionario (A) Una sección óptica de un clon de un corazón E9.5 con el genotipo de ROSA26-Cre ERT2;. ROSA26-confeti. La flecha indica una protrusión celular de una cardiomiocitos. (B) Muestra el clon reconstruida en la región OFT del corazón E9.5 con 10 rebanadas ópticos y 36 micras de profundidad total. Barra de escala = 20 micras en A. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
. Figura 3: Imágenes de la postnatal aclarado cúbico y corazones embrionarias finales (A) muestra una sección óptica de un corazón P2 con el genotipo de αMHC-Cre; mTmG; todas las secciones ópticas se muestran en la película suplementario 5. (B) muestra una sección de un corazón E17.5 con el genotipo de NFATc1-Cre; ROSA26-confeti. (C) muestra la estructura del corazón reconstruido a partir de 106 rebanadas ópticos con una profundidad total de 630 m. La barra de escala = 20 micras de A y es 100 micras en B. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
. Película complementaria 1: Imagine la Sca le sacó el corazón embrionario (Haga clic derecho para descargar) Película 1 muestra secciones ópticas de un Sca le trataron corazón E8.75 (cTnT-Cre; mTmG) de la superficie del corazón hacia la luz del corazón. La profundidad es de 110,4 micras y hay 93 cortes en total.
Película complementaria 2:. Imagine la Sca le sacó el corazón embrionario (Haga clic derecho para descargar) Película 2 muestra la imagen 3D de la superficie del corazón reconstruido en Movie 1, reconsted a través del software de reconstrucción 3D. Marcas amarillas la expresión de PECAM y etiquetas de color verde todos los cardiomiocitos.
Película complementaria 3: imágenes de un solo clon del Sca le sacó el corazón embrionario (Haga clic derecho para descargar). Película 3 muestra secciones de un clon de un corazón E9.5 con el genotipo de ROSA26-Cre ERT2.
Película complementaria 4: obtención de imágenes del corazón postnatales despejadas cúbico (Haga clic derecho para descargar). Película 4 muestra secciones de un corazón P2 tratado cúbico (& #945; MHC-Cre; mTmG) de la superficie del corazón a lumen del corazón. Este corazón P2 fue despejado con el reactivo CÚBICO 1 durante 48 horas, y el reactivo CÚBICO 2 durante 96 horas.
Película complementaria 5: imágenes de los corazones postnatales despejadas cúbico (Haga clic derecho para descargar). Película 5 muestra un corazón que se borra con el reactivo CÚBICO 1 durante 48 horas y el reactivo CÚBICO 2 durante 48 horas. La profundidad es de 136 m con 6 micras en la sección en la película 4 y el espesor es de 76 m con 6 micras en la sección en la película 5.
Película complementaria 6: Imagine la CÚBICO embry finales de aclaradocorazón ONIC (Haga clic derecho para descargar) Película 6 muestra secciones de un corazón E17.5 tratado cúbico (NFATc1-Cre; ROSA26-confeti). desde la superficie del corazón hacia la luz del corazón. La profundidad es de 630 m con 6 m por sección.
Película complementaria 7: imagen del corazón embrionario tardío aclarado cúbico (Haga clic derecho para descargar). Película 7 muestra la imagen 3D de la superficie del corazón en la película 6, reconstruida a través del software de reconstrucción 3D.
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Discussion
El aislamiento de embriones es un paso muy crítico. E9.5 embriones son muy frágiles y de tamaño pequeño, por lo que la atención deberá tener precaución de no dañar las estructuras del embrión / corazón durante el aislamiento. Las capas adicionales no embrionarias que envuelve el embrión / corazón deben eliminarse cuidadosamente mediante la formación de imágenes sobre todo cuando todo el embrión. Esto permite la penetración mezcla de anticuerpos y la limpieza en el interior de los tejidos embrionarios, y también ayuda en la eliminación de la señal de fondo cuando se generan imágenes. Anticuerpos múltiples que incluyen anticuerpos contra PECAM, acetilado α-tubulina y β1 integrina fueron examinados y todos se detectaron con éxito (datos no mostrados) 33. Esto demuestra que la integridad molecular, la integridad celular y la compatibilidad antígeno no se interrumpe durante este proceso de compensación.
Transferir el embrión / corazón usando una pipeta de transferencia amplia boca (cortar la punta). Esto evita daños durante la manipulación. La GFP / YFP / RFP / patrón de expresión de la PPC y number de clones debe registrarse cuidadosamente en el corazón para determinar la dosificación apropiada para etiquetar un clon por el corazón o cualquier otro órgano. Debido a la baja dosis de tamoxifeno (10 mg / g), a veces el corazón no contiene ningún clones o es difícil de detectar cualquier clones. Por lo tanto, se recomienda utilizar el saco vitelino para determinar si el embrión tiene ningún / YFP / RFP clones GFP / CFP.
El embrión o el corazón de fijación es un paso crítico, como el exceso de fijación dará lugar a un alto fondo, mientras que bajo la fijación dará lugar a mala tinción. Se recomienda fijar todo el embrión E8.5-E10.5 durante 2 horas a temperatura ambiente en un agitador de placas. Mientras que para los embriones E11.5-E15.5, la recomendación es aislar cuidadosamente el corazón y fijarlo con PFA al 4% durante 2 horas a temperatura ambiente. Después de asegurarse de eliminar las capas que rodean el corazón si el procesamiento de todo el embrión, los embriones E13.5 E11.5- también pueden ser fijados para 3-4 horas a temperatura ambiente, pero que requiere un mayor tiempo de decoloración de los tejidos. El E16.5-P1 (posnatalDía 1) corazones se fijan para 3-4 horas a temperatura ambiente en un agitador de placas. Al fijar todo el embrión, la proa y extremidades posteriores deben ser retirados en que obstaculizan la formación de imágenes del corazón.
Las muestras deben ser tratados con cúbico y Sca le en viales de centelleo para minimizar el secado de la muestra. Hemos observado una mejor limpieza de las muestras con el método de compensación de tejidos cúbica, a 37 ° C, mientras que le Sca compensación se realiza de manera óptima a 4 ° C. Después de la imagen, las muestras se pueden almacenar a corto plazo en CUBIC-2 o Sca-le-70. Las muestras siempre deben estar cubiertos con papel de aluminio para evitar el blanqueo de fluorescencia.
tejidos y órganos embrionarias tienen menos de lípidos y la deposición de matriz extracelular, lo que resulta en menos tiempo de compensación. Por otro lado, son más vulnerables a los reactivos de compensación. Los reactivos de compensación podrían afectar a la integridad de la estructura del tejido y el antígeno, dando como resultado la extinción de la PPC, RFP y conju anticuerpofluoróforo cerrada. Por lo tanto, tiempos de fijación más largos podrían impedir la extinción. El enfriamiento rápido de las proteínas fluorescentes también podría ser debido a su sensibilidad a los productos químicos y pH 34 como se informó anteriormente. Otras recetas químicas, pH, fijadores, y la duración de la incubación deben ser exploradas para minimizar el enfriamiento de las proteínas fluorescentes.
El método de transparentizing órgano completo o limpieza de tejidos ha revolucionado imágenes en 3D volumétrico. El método de imagen anterior para la morfogénesis cardíaca, que implicó la 2D o 3D manual de reconstrucción de secciones en serie, es mucho tiempo y exigente instrumento 5,6. Alta resolución de la microscopía episcópica (HREM), en relación con el modelado 3D puede ser aplicado al estudio de la morfogénesis del corazón de ratón y proporciona una excelente descripción anatómica de la arquitectura trabecular en el embrión de ratón en desarrollo 35. Sin embargo, HREM no permite la identificación de la FLUORESCcélulas marcadas proteínas ent o células con anticuerpo del resto de las células 35. Utilizando el protocolo actual, con el mínimo esfuerzo y la eficacia de alto costo, hemos conservado con éxito las señales fluorescentes en el corazón embrionario usando Sca fichero o métodos de limpieza y eliminación de tejidos cúbica (Figuras 1 - 3). En combinación con una dosis baja (10 mg / g) de tamoxifeno para inducir eventos de recombinación Cre y generar unos clones dentro de todo el embrión y en el corazón, este sistema se puede utilizar para rastrear y estudiar única diferenciación de células progenitoras cardíaco y comportamientos celulares en vivo (Figura 2A) 33. Además, combinado con la supresión de genes mediada por Cre o sobreexpresión y etiquetado sola célula mediada por Cre, este sistema de formación de imágenes se puede aplicar para estudiar la pérdida genética de la función o ganancia de función en la diferenciación de células progenitoras y el comportamiento celular durante la morfogénesis cardíaca, y por lo tanto proporciona una robusta herramienta para stHNE de la etiología de los defectos congénitos del corazón.
El tejido de dos sistemas de compensación Sca / e y cúbico utilizado en este estudio mostraron diferentes eficiencias de compensación, que diferencia aún más los sistemas basados en la edad embrionaria, el espesor del tejido y la duración del tiempo de eliminación de tejido. Por temprana etapa de embriones E9.5-E10.5, el sistema / e Sca no sólo rindió el tejido transparente, pero también protegía a la morfología del embrión y conserva las señales fluorescentes, mientras que el tratamiento CÚBICO dio lugar a la disolución de embriones. Esto podría ser el resultado de aminoalcoholes adicionales y una mayor concentración de Triton X-100 en las soluciones CÚBICAS 8. Para los corazones de más edad, el sistema / e Sca no pudo despejar el tejido por completo, incluso con un tiempo de incubación más largo. La solución de aclaramiento CÚBICO rindió el más viejo tejido transparente (Figura 3). Sin embargo, el aumento del tiempo de incubación dio lugar a señales más débiles y solamente protegida GFP endógena, mientras que las señales de anticuerpo conjugado PP, PPC yperdidos. Por esta razón, se requiere una receta más optimizada de los reactivos de compensación y un mejor tiempo de incubación a volumétricamente corazones de imagen o de órganos con un mayor espectro de marcadores fluorescentes.
Este estudio demostró que uno puede etiquetar, vestigios, y de imagen individuales clones cardíacos en combinación con toda una tinción monte de endocárdico / endotelial PECAM marcador de las células del corazón en desarrollo. Toda la tinción de montaje de PECAM y DAPI en este sistema no sólo ayuda a identificar los tipos de células y la morfología celular de las células marcadas dentro de un corazón, pero también permite el estudio del patrón clonal, la migración y el comportamiento durante la morfogénesis cardíaca. En la Figura 2A se observó un clon con 8 células en OFT. Utilizando el número de células presente en este clon con referencia al tiempo de marcaje, la tasa de proliferación celular se puede calcular fácilmente. En otro estudio que utiliza este mismo sistema se identificó el patrón de división celular orientado y emigradosación patrón de un solo cardiomiocitos durante el proceso de trabeculation 33. La aplicación de este protocolo para estudiar los efectos de la pérdida genética de función o ganancia de función espacio-temporalmente en la diferenciación de células progenitoras cardíacas marcado, patrón clonal y el comportamiento celular es factible, y ayudará en los estudios sobre la etiología de los defectos congénitos del corazón en genética y nivel molecular en un contexto 3D. Además, este protocolo se puede aplicar para estudiar la morfogénesis en otros sistemas de órganos.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,2′,2′’-nitrilotriethanol | Sigma Aldrich | 90279 | |
| 4% Paraformaldehyde in PBS | Affymetrix | 19943 | |
| BSA | Fischer Scientific | BP16000 | |
| N,N,N’,N’-tetrakis(2-hydroxypropyl) ethylenediamine | Sigma Aldrich | 122262 | |
| Phosphate Buffer Saline | Sigma Aldrich | P5368-10PAK | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U-1250 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | 84097 | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G8773 | |
| Tamoxifen | Sigma Aldrich | T5648 | |
| Sunflower seed oil | Sigma Aldrich | S5007 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
| PECAM (CD31) | BD Pharmingen | 550274 | |
| Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21247 | |
| DAPI nuclear stain | Sigma Aldrich | D9542 | |
| 37oC Incubator | Thermoscientific Fischer | Heratherm, Compact Microbiological Incubators | |
| 48 well plates | Cell Treat | 229148 | |
| Analytical Balance | Metler Toledo | PB153-S/FACT | |
| Confocal microscope | Zeiss | Zeiss 510 confocal microscope | |
| Disecting Microscope | Unitron | Z850 | |
| Fluorescent microscope | Zeiss | Observer. Z1 | |
| Germinator 500 Glass Bead Sterilizer | CellPoint Scientific | GER-5287-120V | |
| Light Source | SCHOTT | ACE I | |
| Pair of Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Petri dish 60 mm x15 mm | TPP Techno Plastic Products AG | 93060 | |
| Rocker II Platform Rocker | Boekel Scientific | 260350 | |
| Scintillating tubes | Fischer Scientific | 03-337-26 | |
| Transfer pipette | Samco Scientific | 202 | |
| Tweezers | Fine Science Tools | 11251-20 |
References
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