Abstract
Одно клоновая трассировка и анализ на уровень целого сердца может определить сердечный поведение и дифференцировку клеток-предшественников во время развития сердца, а также позволяют при изучении клеточной и молекулярной основе нормальных и ненормальных сердечной морфогенеза. Последние новые технологии ретроспективных отдельных клоновых анализов делают исследование сердца формообразования при разовом разрешении клеток осуществимо. Однако непрозрачности ткани и рассеяние света сердца как глубина изображения увеличивается Hinder визуализации целого сердца в одной резолюции клетки. Для преодоления этих препятствий, клиринговую систему целого эмбриона, который может оказывать сердце высоко прозрачной как для освещения и обнаружения должны быть разработаны. К счастью, в последние несколько лет, было зарегистрировано много методик для целого организма клиринговых систем , таких как CLARITY, Sca ле, SeeDB, ClearT, 3DISCO, кубические, DBE, Бабб и ПАКТ. Эта лаборатория заинтересована в клеточных и молекулярных механизмов картыIAC морфогенез. Недавно мы установили одноклеточной родословие трассировку через ROSA26-Cre ERT2; система ROSA26-конфетти , чтобы разреженно клеток меток во время развития сердца. Мы адаптировали несколько целых эмбрионов очистив методик , включая Sca ле и кубика (четкое, беспрепятственное коктейлей изображения мозга и компьютерного анализа) , чтобы очистить эмбрион в сочетании с целой горы окрашиванием к изображению отдельных клонов внутри сердца. Сердце было успешно отображены в одной резолюции ячейки. Мы обнаружили , что Sca ле может очистить эмбриональное сердце, но не может эффективно очистить послеродовую сердце, в то время как CUBIC может очистить послеродовую сердце, но повреждает эмбриональные сердце путем растворения ткани. Методы, описанные здесь, позволят исследование функции генов в одном разрешении клона во время остановки морфогенеза, который, в свою очередь, может выявить клеточные и молекулярные основы врожденных пороков сердца.
Introduction
Сердечный морфогенез является последовательное событие , которое требует пространственно - временной организации четырех различных типов сердечных клеток - предшественников в различных секторах сердца, а также требует множественных генетических регуляторных сетей , чтобы организовать этот процесс для формирования функционального сердца 1,2. Сердечный спецификация, дифференцировка, структурирование, и камера Созревание регулируются кардиогенных транскрипционных факторов 3. Генетическая мутация или посттранскрипционная аберрация этих факторов в сердечных клеток - предшественников может привести либо к эмбриональной летальности или врожденных пороков сердца (ИБС) 4. Изучение сердечной морфогенеза требует понимания присущих структурных деталей в трех измерениях (3D) и одного меченого сердца клеток-предшественников линии отслеживании во время развития сердца будет способствовать пониманию сердечной морфогенеза. Ряд секций на основе методов томографии с высокой разрешающей способностью были разработаны в гое за последние несколько десятилетий в структуре 5,6 органа изображения; Однако эти методы требуют дорогие специализированные инструменты, обширный труд, и не хватает подробной структурной организации в одной резолюции ячейки в финале объемное изображение реконструировано 7,8.
3D объемные изображения на уровне одной клетки обеспечивает средство для изучения дифференцировки клеток - предшественников и клеточного поведения в естественных условиях 7. Тем не менее, рассеяние света ткани остается основным препятствием для визуализации клеток и структур в 3D глубоко внутри интактного сердца. Липиды являются основным источником рассеяния света, а также удаление липидов и / или корректировки разности показателей преломления между липидами и окружающих их областей являются потенциальными подходы к повышению прозрачности ткани 8. За последние несколько лет, был разработан ряд методов клиринговых ткани, которые уменьшают прозрачность ткани и рассеяние света, как Бабб (бензиловый спирт и бензиловый бензоате смеси) и DBE (тетрагидрофуран и dibenzylether); но в этих методах, тушение флуоресценции остается проблемой 8-10. Растворитель на основе гидрофильных методы, такие как SeeDB (фруктоза / тиоглицерин) и 3DISCO (дихлорметан / dibenzylether), сохраняют флуоресцентные сигналы, но не оказывают весь орган прозрачный 7,8,11. Для сравнения, метод ЯСНОСТЬ ткани клиринговые делает орган прозрачным, но это требует специализированного устройства электрофореза для удаления липидов 8,12, как это делает ПАКТ (пассивная техника ясности), что также требует гидрогель вложения 7,13. Для получения более подробной информации о всех доступных методов тканевой очистки, обратитесь к таблице 1 в Ричардсона и Лихтман и др. 7.
В 2011 году , Хама и др. Обнаружили по счастливой случайности гидрофильную смесь 'Le SCa фирмы ' (мочевина, глицерин и тритон Х-100 смесь) , что делает мозг мыши и зародыша transparлор при полном сохранении флуоресцентные сигналы от меченных клонов 14. Это позволяет визуализации интактного мозга на глубине нескольких миллиметров и крупномасштабной реконструкции нейрональных популяций и прогнозов на субклеточном резолюции. Susaki и др. дальнейшее улучшение Sca ле путем добавления аминоспирты и разработал 'КУБИЧЕСКИЕ' (четкое, беспрепятственное коктейли визуализации мозга и компьютерного анализа) способ очистки ткани, что позволило увеличить фосфолипидов солюбилизации, сокращение времени клиринговую и позволило многоцветной флуоресцентной визуализации 8. В настоящем исследовании, воспользовавшись Sca ле и кубические методы клиринговых ткани и высокое разрешение 3D оптический секционирования, отдельные клоны внутри сердца во время кардиогенеза были прослежены с помощью Rosa26Cre ERT2 15, R26R-конфетти 16, αMHC-Cre 17, cTnT-Cre 18, Nfatc1-Cre 19 и Rosa26-mTmG (mTmG) 20 линий мыши. Сочетание метода целом крепление окрашивание (WMS) разработан ранее 21,22 с тканевых методами клиринговых далее разрешенное для окрашивания других белков в маркированных клонов и для изучения их поведения в 3D - мерную контексте. Сочетание очистки ткани и ЗЦМ позволяет для лучшего понимания роли различных генов и белков во время развития сердца и этиологии врожденных пороков сердца. Этот протокол может быть применен для изучения другой дифференцировки клеток-предшественников, клеточного поведения и органа морфогенеза события в процессе разработки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты на животных были одобрены по уходу и использованию комитета Institutional животных (IACUC) в Олбани Медицинский Колледж по и осуществляется в соответствии с Руководством NIH по уходу и использованию лабораторных животных.
1. Решение Препараты
ПРИМЕЧАНИЕ: Rosa26Cre ERT2 15, R26R-Конфетти 16, αMHC-Cre 17 и Rosa26-mTmG (mTmG) 20 линий мышей были приобретены коммерчески cTnT-Cre 18 был подарок от доктора Jiao в Университете штата Алабама Nfatc1-Cre.. был подарок от доктора бен Чжоу в колледже Альберта Эйнштейна медицины 19. Мышей подвергали эвтаназии путем ингаляции диоксида углерода в закрытой камере в течение не менее 60 секунд, после физических средств проверки смерти по двусторонним торакотомии, обезглавливание или цервикальной дислокации.
- Подготовка тамоксифен. Растворите 10 мг тамоксифена в 10 мл подсолнечного О.И.л. После того, как он полностью не растворится, аликвоты и хранят при -20 ° С.
- Готовят забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS). Растворите Na 2 HPO 4 (1,41960 г), КН 2 РО 4 (0,24496 г), NaCl (8,0669 г) и КСl (0,20129 г) в 1 л дистиллированной воды и доведения рН до 7,4.
- Готовят PBST: 0,1% Tween-20 в PBS, раствор путем растворения 100 мкл Tween-20 в 100 мл PBS.
- Подготовка блокирующего буфера. Сделать 3% бычий сывороточный альбумин (БСА) блокирующего раствора растворением 3 г бычьего сывороточного альбумина в 100 мл PBST, содержащем 0,2% Tween-20.
- Подготовьте CUBIC-1 (реагент 1). Смешайте 25 мас% мочевины, 25 мас% N, N, N ', N'-тетракис (2-гидроксипропил) этилендиамина и 15 мас% Тритон Х-100 в дН 2 O.
- Подготовка CUBIC-2 (реагент 2). Смешайте 50 мас% сахарозы, 25 мас% мочевины, 10% вес 2, 2 ', 2' '- nitrilotriethanol и 0,1% (об / об) Тритона X-100 в дН 2 O.
- Готовят ле A2 количество присадок SCA: 4 М мочевины, 10% вес / об глицерина и 0,1% вес / об Triton X-100 в дН 2 O. Доводят рН до 7,7.
- Приготовьте Sca ле B4: 8 М мочевины и 0,1% вес / об Тритон Х-100 в дН 2 O. Доводят рН до 8,7.
- Готовят Sca ле 70: 4 М мочевины, 70% вес / объем глицерина и 0,1% вес в дН 2 O. / об Тритона Х-100
2. Тамоксифен Индукционная, Эмбрион Выделение и фиксация
- Тамоксифен Индукционные и Эмбрион Изоляция
- С помощью изогнутой трубки подачи утвержденного протокола (ACUP 13-12007), через желудочный зонд самки мышей R26Cre ERT2 конфетти (закупорки R26Cre ERT2 мышей - самцов) с 10 мкг / г тамоксифена в день эмбрионального развития E7.75 33. В день эмбрионального 9.5 (E9.5) или E10.5, усыпить самок мышей с CO 2 и цервикальной дислокации.
- После проверки смерти мыши (смотрите раздел 1 Note), откройте брюшную полость мыши с ножницами и рассечь из рога матки, удалить слои маточной трубы с помощью ножниц и пинцета и повторноаренда эмбрионов от 23,24 маточной трубы.
- Перенос эмбрионов в чашку Петри, содержащую PBS (рН 7,4). Под микроскопом рассекает, удалите не-эмбриональных слоев (хориона, желтка и амнион) с помощью пинцета.
- С помощью пинцета и ножниц, собирать самок мышей и эмбрионов хвоста образцы для генотипирования , как сообщалось ранее 22. С помощью пластмассовой пипетки перенос каждого эмбриона на лунку 48-луночного планшета, содержащего 1 мл 1х PBS.
- Под флуоресцентным микроскопом, идентифицировать GFP / RFP / CFP положительных эмбрионов с помощью инвертированного микроскопа с камерой. Отслаиваться перикард с помощью пинцета и повернуть сердца / эмбриона с помощью изогнутых пинцета, чтобы определить количество флуоресцентных клонов с обеих сторон сердца с GFP / RFP / CFP фильтров. не требуется никаких сокращений.
- После выявления GFP / RFP / CFP положительных эмбрионов, быстро мыть эмбрионов в два раза (2 мин каждый) с 1x PBS в гое 48 хорошо пластины на шейкере при комнатной температуре (RT). Это позволит удалить лишнюю кровь.
- Закрепить эмбриона / эмбрионального сердца с использованием 4% параформальдегида (PFA) при комнатной температуре. Время фиксации зависит от эмбрионального возраста и ткани размера. Для E9.5 фиксации эмбриона в течение 2 ч при комнатной температуре. Поздние эмбриональные стадии эмбрионов требуют больше времени фиксации, которая даже может быть продлен до 24 часов для послеродового сердца.
ВНИМАНИЕ: параформальдегид токсичен, избегать контакта с кожей, глазами и слизистой оболочки. - После фиксации, вымыть эмбриона / сердце в 48 луночного планшета в два раза (10 мин каждый) с 1x PBS на шейкере при комнатной температуре. Это удаляет избыток PFA из эмбриона / сердца. Эмбрионы затем дополнительно обрабатываются для всей горы окрашивания и очистки ткани.
3. Всего горе Окрашивание
Примечание: После того, как PFA фиксации эмбриона / сердце подвергается всем горе окрашивания следующим образом.
- Проницаемыми эмбриона / сердце в 48 луночного планшета с использованием 1 мл 0,1% PBST в течение 2 часов на шейкере при комнатной температуре.
- После пермеабилизации, погружают зародыш / сердце в 1 мл блокирующего буфера, в течение 2 часов или в течение ночи на шейкере при температуре 4 ° С.
- Опустить эмбриональной / сердце к клеточно-специфической PECAM эндотелиальной антител (CD31), разбавленным (1: 100) в 0,3 мл блокирующего буфера в течение 48 часов на шейкере при температуре 4 ° С.
- Вымойте эмбриона / сердце с помощью PBST 5 раз, 30 мин каждый раз при комнатной температуре на шейкере. Это удаляет избыток неспецифическое связанного первичного антитела из ткани.
- Погрузитесь эмбриона / сердце в Alexa Fluor 647 козьего анти-крысиного вторичным антителом, разведенным (1: 1000) в 1 мл блокирующего буфера в течение 48 часов на шейкере при температуре 4 ° С.
- Повторите шаг 3.4 для промывки вторичного антитела.
- После фиксации эмбриона / сердце с 4% PFA в течение 1 часа при комнатной температуре на шейкере и дважды промывают PBS 5 минут каждый.
- Пятно зародыш / сердце с окрашивающим ядра 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) (разведенного в PBST при ОБОГАЩЕНИЯРацион 0,01 мг / мл) в течение 10 мин на шейкере при комнатной температуре. Последующие с двумя PBS промывками 5 мин каждый.
4. Эмбрион / сердце Клиринг с Sca л е или метод с кубическим
Примечание: После того, как вся гора окрашивания, эмбрион / сердце подвергается либо Sca ле или метода КУБИЧНОЙ клирингового ткани. Выбор способа зависит от размера ткани и эмбриональном возрасте. Для E11.5 или более раннего возраста эмбрионов, использование Sca л е способ очистки ткани, в то время как для более старых эмбрионов или послеродовых сердца является предпочтительным методом КУБИЧЕСКИЙ клиринг ткани.
- Масштаб ткани Клиринговый Метод
- Выдержите зародыш / сердце с 1 мл ВОС л раствора е A2 в сцинтилляционный флакон (заворачивали в алюминиевую фольгу) , периодически слегка встряхивая (вручную) в течение 48 ч при температуре 4 ° С.
- После того, как Sca л е А2 инкубации инкубировать эмбриона / сердце 1 мл Sca л раствора е B4 при 4 ° С в одном флаконе с редкими осторожном встряхивании для anotее 48 ч.
- Выдержите эмбриона / сердце еще 48 ч с 1 мл Sca л е 70 при 4 ° С при периодическом осторожном встряхивании. Маунт-эмбрион с использованием 90% глицерина (смотри раздел 5.1).
- CUBIC ткани Клиринговый Метод
- Для всего сердца эмбриона / КУБИЧНОЙ очистки, погрузить каждого эмбриона / сердце в 1 мл КУБИЧНОЙ-1 с редкими осторожном встряхивании в течение 48 ч при температуре 37 ºC 7. Через 48 ч заменить раствор с тем же объемом свежей КУБИЧНОЙ реагента 1, и инкубируют образец еще в течение 48 ч при 37 ° С при периодическом встряхивании с рукой.
- Вымойте кубическая-1 обработанную сердца / эмбриона с 1x PBS несколько раз при комнатной температуре при осторожном встряхивании с рукой. Это удаляет избыток раствора КУБИЧЕСКИЙ-1.
- После того, как вымывание CUBIC-1 с PBS, погружают / эмбрионов сердца в кубическом-2 раствора (1 г на эмбриона / сердца) в течение 48 ч при 37 ° С с редкими осторожном встряхивании с рукой. Это следует эмбриона / сердце для монтажа с использованием глицерина (смотри раздел 5.2).
5. Пример монтажа и обработки изображений
Примечание: Очищенные зародыши или органы в Sca л е 70 или кубического-2 раствора могут быть отображены непосредственно со шкалой 70 и кубические-2 раствора в качестве носителя изображения, соответственно. Тем не менее, принимая во внимание уязвимость эмбриональных образцов очищающих реагентов, если образцы не будут отображены сразу, но сохраняются в долгосрочной перспективе, хранить образцы в 90% глицерина соответствии с приведенным ниже протоколом.
- Непосредственно погрузить Sca ле очищается образец в 1 мл 90% глицерина и хранят при температуре 4 ° С до визуализации.
- Промыть Кубическую обработанного образца с 1x PBS в два раза, 5 мин каждый и последовательно инкубирование образца с 1 мл 30%, 50%, 70% и 90% раствора глицерина каждый в течение 30 мин.
- Для получения изображений, переноса образца к стеклянным дном чашки Петри с минимальным количеством 90% глицерина и изображения клонов с помощью конфокального микроскопа, снабженного двумя возможностями фотонов.
- Изображение сердца или эмбрионов в глицерине с 10X / 0,3 NA, A 25X / 0,8 NA погружения, или 40X / 1.2 NA воды корректирующие линзы объектива а. Изображение DAPI с помощью 2-фотонной возбуждение от когерентного титана: хамелеона лазера сапфира. Выбор микроскопа и объектива будет зависеть от цели экспериментов, например , для супер-разрешением, легкий лист флуоресцентного микроскопа может быть использован.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Визуализация очищенную эмбриональное сердце
Позвоночной формирование сердца является spatiotemporally регулируется морфогенетического процесса и зависит от организации и дифференциации клеток - предшественников из четырех различных источников 1. Клетки из первого сердца области кардиального полумесяца сбросит к вентральной срединной линии, чтобы сформировать линейную сердечную трубку. Клетки из второго поля сердца, изначально проживающих dorsomedially к первому полю сердца, затем транслоцироваться глоточной и висцеральной мезодермы, откуда они мигрируют к ранее существовавшей эшафот линейной сердечной трубки. Клетки второго поля сердца будет способствовать в правый желудочек, выносящий тракт (OFT) миокарда и в некоторой эндокарда 25-28. Сердечные клетки нервного гребня (CNCC), происходящих из заушный ромбомерах 6, 7 и 8, будут мигрировать в хвостовом глотку и способствуют значительно к слою гладких мышц и эндокарда подушки в ОСТ. Они также способствуют формированию aorticopulmonary перегородке 29,30. Четвертая популяция состоит из эпикарда клеток , полученных из про-эпикарда органа (ПЭО), а также способствует фибробластов, клеток гладких мышц и потенциально других типов клеток сердца 31. Эпикард регулирует развитие коронарных сосудов сердца, роста и формообразования 21.
Самое важное понятие о сердечной морфогенеза является то , что во время развития сердца, миграции клеток ненормальным / дифференциация популяций четырех клеток - предшественников приводит к пороки развития или врожденных пороков сердца 4,22,32, который является номером один причиной врожденных дефектов в мире , Определение механизмов сердечной морфогенеза на клеточном и молекулярном уровне является важным шагом на пути к улучшению диагностики и лечения возможных для ВПС.Следовательно, крайне важно, чтобы изображение, процесс сердца морфогенеза на уровне целого сердца с одной элемента разрешения. Для достижения этой цели, мы пометили кардиомиоциты, пересекая линию Cre под контролем сердечного тропонина Т специфической (cTnT), который специфически экспрессируется в кардиомиоцитах 18, с mTmG репортер линии. Зародыши на E8.5 собирали и окрашивали на PECAM отличить эндокарда и эндотелиальные клетки из кардиомиоцитов. Эмбрионы затем очищается Sca ле и сердце изображался. Миокард метили GFP за счет cTnT управляемых Cre-опосредованной рекомбинации репортера mTmG и эндокарда метили PECAM (рисунок 1А и дополнительного Movie 1). Кардиомиоциты могут наблюдаться в одной элемента разрешения (Рис . 1А) Сердечные структуры изображаемого части, такие, как примитивный желудочек и ОСТ могут быть четко определены после того, как 3D-реконструкции с использованием 3D рестроительство программного обеспечения (Рисунок 1В и Дополнительный Movie 2).
Визуализация одиночных клонов очищенного эмбрионального сердца
Сердечный морфогенез зависит от сердечной дифференциации клонального и отдельной организации клеток на уровне всего 22 сердца, и , таким образом, важно , чтобы изображения одной дифференциации сердечных клеток - предшественников к различным типам клеток сердечной и также изображение морфологии клеток при разовом разрешении клеток. Для достижения этой цели, Rosa26Cre ERT2 15 был подошел к R26R-конфетти 16, и беременная самка через желудочный зонд с тамоксифена при низкой концентрации. Через 48 ч эмбрион был собран на E9.5, и вся гора окрашивали на PECAM, а затем все сердце изображался. Мы обнаружили, что существует только один кластер клеток, локализованных в OFT, и этот клон имел 8 клеток на основе Oп восстановленное изображение и последовательных секций (фиг 2А, 2В и дополнительного кино 3), что указывает , что эти клетки получают из одной клетки - предшественника. Клеточной морфологии и клеточного поведения , таких , как клеточной пролиферации и миграции могут быть выведены из конечного расположения клеток (фиг.2А). Мы также применили метод с кубическим, чтобы очистить эмбрионального сердца в E9.5 и E10.5, и обнаружили, что даже после того, как только через 24 ч инкубации с реагентом 1, эмбрионы были тонко растворенным и структура ткани неблагоприятному воздействию (данные не показаны ).
Визуализация очищенную послеродовом и поздних эмбриональных сердец
Применялся как Sca л е и кубические , чтобы очистить послеродовые сердца. P2 сердца с генотипом αMHC-Cre; mTmG (αMHC-Cre специфически экспрессируется в кардиомиоциты <SUP> 17) были очищены с Sca л е в течение 48 часов, но не проявил большей прозрачности , чем сердца , обработанных PBS только (данные не показаны), указывая , что Sca л е очистка не является эффективным для послеродовых сердца. Когда P2 сердца были очищены с кубическими реагентом 1 в течение 48 ч, и реагента 2 в течение 96 часов, они были гораздо более прозрачными, чем сердца расчищенных с реагентом 1 в течение 48 ч и реагента 2 в течение 48 часов. Глубина визуализации была значительно увеличена с 96 ч реагента 2 инкубации (дополнительные фильмы 4 и 5), что свидетельствует о том , что больше инкубации с кубическая реагентов способствует прозрачности и обеспечивает увеличение глубины изображения. Форма и размер каждого кардиомиоциты могут быть идентифицированы с помощью мембранной локализованной GFP (рис 3А), который может быть использован для идентификации гипертрофию.
Мы также очистили Nfatc1-Cre; Конфетти (Confetti женщина закупорены Nfatc1Cre мужчины) E17.5 сердца (Nfatc1-Cre выражается в сердечных клетках эндокарда 19) с кубическими реагентом 1 в течение 48 ч и реагента 2 в течение 48 часов. Сердца являются прозрачными, и флуоресцентные белки, в том числе, GFP, YFP CFP и RFP должны были маркировать эндокарда клетки и их производные клетки; Тем не менее, только GFP и YFP может быть отображена в течение всего сердца (фигуры 3В, 3С и дополнительные фильмы 6 и 7), а СФП и ЗП не может быть обнаружено (данные не показаны). Окрашивание для PECAM (Алексиа Fluor 647) также не может быть обнаружено (данные не показаны), предполагая, что кубические реагент гасит CFP, RFP и антитело, конъюгированное флуорофор в данном протоколе.
Рисунок 1:. Визуализация мешочке / е очистили эмбриональное сердце (A) Один орTical вырезка сердца E8.75 (cTnT-Cre; mTmG) показан. V: желудочек; OFT: пути оттока. (B) Показывает реконструированный структуру сердца 93 последовательных оптических срезов с общей глубиной 110,4 мкм. Шкала бар = 20 мкм в A. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Визуализация одного клона Sca / е очистили эмбрионального сердца (А) Один оптический участок клона из E9.5 сердца с генотипом ROSA26-Cre ERT2;. ROSA26-конфетти. Стрелка указывает на клеточном протрузии кардиомиоцитов. (B) показывает восстановленную клон в OFT области E9.5 сердца с 10 оптических срезов и общей глубиной 36 мкм. Шкала бар = 20 мкм в A. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
. Рисунок 3: Визуализация кубическая очищенную послеродовые и поздних эмбриональных сердца (А) показывает один оптический разрез P2 сердца с генотипом αMHC-Cre; mTmG; все оптические секций приведены в дополнительном кино 5. (B) показывает один разрез E17.5 сердца с генотипом Nfatc1-Cre; ROSA26-конфетти. (C) показывает реконструированный структуру сердца из 106 оптических срезов с общей глубиной 630 мкм. Бар Scale = 20 мкм в А и 100 мкм в B. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
. Дополнительный Movie 1: Визуализация АСС ле очистили эмбриональное сердце (Щелкните правой кнопкой мыши , чтобы скачать) Фильм 1 показывает оптические участки в Sca ле обрабатывали E8.75 сердце (cTnT-Cre; mTmG) от поверхности сердца к сердцу просвет. Глубина 110,4 мкм и есть 93 ломтиков в общей сложности.
Дополнительный Movie 2:. Воображение АСС ле очистили эмбриональное сердце (Щелкните правой кнопкой мыши , чтобы скачать) Фильм 2 показывает 3D - изображение поверхности реконструированной сердца в кино 1, ВосстановленныйТэд с помощью программного обеспечения 3D-реконструкции. Желтые знаки выражение РЕСАМ и зеленые этикетки всех кардиомиоцитов.
Дополнительный Movie 3: Визуализация единственный клон Sca ле очистили эмбриональное сердце (Щелкните правой кнопкой мыши , чтобы скачать). Фильм 3 показывает разделы клона из E9.5 сердца с генотипом ROSA26-Cre ERT2.
Дополнительный Movie 4: Визуализация кубическая освобоженные послеродовые сердца (Щелкните правой кнопкой мыши , чтобы скачать). Фильм 4 показывает секции кубического обработанного P2 сердца (& #945; MHC-Cre; mTmG) от сердца к сердцу поверхности просвета. Это сердце P2 был очищен с кубическими реагентом 1 в течение 48 ч, и кубические реагента 2 в течение 96 часов.
Дополнительный Movie 5: Визуализация кубическая освобоженные послеродовые сердца (Щелкните правой кнопкой мыши , чтобы скачать). Фильм 5 показывает сердце , которое было очищено с реагентом CUBIC 1 в течение 48 ч и реагента КУБИЧНОЙ 2 в течение 48 часов. Глубина составляет 136 мкм с 6 мкм на участке в кино 4 и толщиной 76 мкм с 6 мкм на участке в кино 5.
Дополнительный Movie 6: Визуализация кубическая очищенную поздно ЭмбриОНИК сердце (Щелкните правой кнопкой мыши , чтобы скачать) Фильм 6 показывает участки кубического обработанного E17.5 сердца (Nfatc1-Cre; ROSA26-конфетти). от поверхности сердца к сердцу просвет. Глубина составляет 630 мкм с 6 мкм на секцию.
Дополнительный фильм 7: Визуализация кубическая очищенную поздних эмбриональных сердце (Щелкните правой кнопкой мыши , чтобы скачать). Фильм 7 показывает 3D - изображение поверхности сердца в кино 6, реконструированный с помощью программного обеспечения 3D - реконструкции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Выделение эмбриона является очень важным шагом. E9.5 эмбрионов очень хрупкие и небольшие по размеру, поэтому дополнительные следует позаботиться, чтобы не повредить структуры эмбриона / сердца во время изоляции. Не связанные с эмбриональными дополнительные слои, огибающие эмбриона / сердце следует осторожно удалить, особенно при визуализации всего эмбриона. Это позволяет проникновение антител и очистки смеси глубоко внутри эмбриональных тканей, а также помогает в устранении фонового сигнала при визуализации. Множественные антитела , включая антитела против PECAM, ацетилированный альфа-тубулина и интегрином & beta ; 1 , были рассмотрены и все были успешно обнаружены (данные не показаны) 33. Это свидетельствует о том, что молекулярная целостность, целостности клеток и совместимости антигена не были нарушены в ходе этого процесса клиринга.
Перенос эмбриона / сердце с использованием широкого переноса рот пипетку (обрезала кончик). Это позволяет избежать повреждений во время транспортировки. GFP / YFP / RFP / CFP паттерн экспрессии и пумбра клонов должны быть тщательно записаны в сердце, чтобы определить соответствующую дозировку маркировать один клон каждого сердца или любые другие органы. Из-за низкой дозировке тамоксифен (10 мкг / г), иногда сердце не содержит никаких клонов или трудно обнаружить какие-либо клоны. Поэтому рекомендуется использовать желтка, чтобы определить, является ли эмбрион имеет какие-либо GFP / YFP / RFP / CFP клонов.
Эмбрион или сердечной фиксации является важным шагом, так как чрезмерная фиксация приведет к высоким фоном в то время как под фиксации приведет к ухудшению окрашивания. Рекомендуется, чтобы зафиксировать E8.5-E10.5 весь эмбрион в течение 2 ч при комнатной температуре на шейкере. В то время как для E11.5-E15.5 эмбрионов, рекомендация тщательно изолировать сердце и зафиксировать его с 4% PFA в течение 2 ч при комнатной температуре. После того, как обеспечить, чтобы удалить слои, окружающие сердце, если обрабатывать весь зародыш, эмбрион E11.5- E13.5 также могут быть установлены в течение 3-4 ч при комнатной температуре, но это требует увеличенного времени клиринговую ткани. E16.5-P1 (послеродовые1-й день) сердца фиксируются в течение 3-4 ч при комнатной температуре на шейкере. При креплении весь эмбрион, передние и задние конечности должны быть удалены, поскольку они мешают визуализации сердца.
Образцы должны быть обработаны с кубическими и Sca ле в сцинтилляционные флаконы , чтобы свести к минимуму образец сушки. Мы наблюдали более очистку образцов с методом КУБИЧНОЙ клирингового ткани при температуре 37 ° С, в то время как Sca ле клиринг оптимально сделано при 4 ° С. После того, как изображения, образцы можно хранить краткосрочные в кубическом-2 или Sca ле 70. Образцы всегда должны быть покрыты алюминиевой фольгой, чтобы предотвратить флуоресценции отбеливания.
Эмбриональные ткани и органы имеют меньше липидов и внеклеточным отложением матрицы, что приводит к уменьшению времени клиринга. С другой стороны, они более уязвимы по отношению к клиринговым реагентов. Очищающие реагенты могут повлиять на целостность структуры ткани и антигена, что приводит к гашению CFP, RFP и conju антителкоттеджный флуорофор. Таким образом, более длительное время фиксации может предотвратить гашение. Тушение флуоресцентных белков также может быть из - за их чувствительности к воздействию химических веществ и рН , как сообщалось ранее 34. Другие химические рецепты, рН, фиксаторов и продолжительность инкубации должны быть изучены, чтобы свести к минимуму тушение флуоресцентных белков.
Метод всего transparentizing органа или очистки ткани революцию объемной 3D визуализации. Предыдущий метод визуализации для сердечной морфогенеза, в котором участвовали ручной 2D или 3D реконструкции серийных срезов, является трудоемким и инструментом требуют 5,6 раз. Высокое разрешение эпископический микроскопия (ТРЗМ) в сочетании с 3D - моделирования может быть применен к изучению морфогенеза сердца мыши и обеспечивает отличную анатомического описания трабекулярной архитектуры развивающегося эмбриона мыши 35. Однако ТРЗМ не позволяет идентифицировать fluorescлор белка меченые клетки или антитела окрашивали клетки от остальных клеток 35. Использование текущего протокола, с минимальными затратами и высокой экономической эффективностью, мы успешно сохранили флуоресцентные сигналы в эмбриональном сердце с помощью Sca ле или кубического методы клиринговых ткани (рис 1 - 3). В сочетании с низкой дозой (10 мкг / г) Тамоксифен , чтобы индуцировать Cre рекомбинации и генерировать несколько клонов внутри целого зародыша , и в сердце, эта система может быть использована для отслеживания и изучения одного сердечного дифференцировки клеток - предшественников и клеточных поведения в естественных условиях (рис 2A) 33. Кроме того, в сочетании с Cre опосредованной делеции гена или сверхэкспрессии и Cre опосредованной маркировки одноклеточ-, эта система формирования изображения может быть применен для изучения генетической потери функции или усиления функции на дифференцировку клеток-предшественников и клеточного поведения во время сердечного морфогенеза, и, таким образом, обеспечивает надежную инструмент для улУды этиологии врожденных пороков сердца.
Две ткани очистные устройства Sca / д и кубические используемые в данном исследовании показали различную эффективность клиринговых, что дополнительно отличает системы на основе эмбриональных возраста, толщины ткани и продолжительность времени клирингового ткани. Для ранней стадии эмбрионов E9.5-E10.5, система Sca / е не только оказали ткани ясно, но и защищали морфологии эмбриона и сохранил флуоресцентные сигналы, в то время как CUBIC лечение привело к роспуску эмбриона. Это может быть результатом дополнительных аминоспиртов и более высокой концентрации Тритона Х-100 в кубическом растворах 8. Для более старых сердец, система Sca / е не удалось полностью очистить ткань даже с более длительным временем инкубации. Кубическая клиринг решение вынес старую ткань ясно (рисунок 3). Тем не менее, увеличение времени инкубации приводит к более слабым сигналам и только защищенный эндогенного GFP, в то время как RFP, CFP и антитела, конъюгированного сигналыбыли потеряны. По этой причине, более оптимизированный рецепт клиринговых реагентов и лучшее время инкубации потребуется для объемно сердца или органов изображения с большим спектром флуоресцентных меток.
Это исследование показало, что можно обозначить, след, и изображение единичные сердечные клоны в сочетании с целым горе окрашивания эндокардиального / эндотелиальных клеток маркера PECAM развивающегося сердца. Вся гора окрашивание PECAM и DAPI в этой системе не только помогает идентифицировать типы клеток и морфологии клеток меченых клеток внутри сердца, но и позволяет исследовать клоновых образов, миграции и поведение во время остановки формообразования. На рисунке 2А мы наблюдали клон с 8 клеток в ОСТ. С помощью числа клеток, присутствующие в этом клоне со ссылкой на время маркировки, скорость пролиферации клеток может быть легко вычислена. В другом исследовании, используя ту же самую систему, которую мы определили ориентированный образец клеточного деления и MIGRвания модели единого кардиомиоцитов в процессе образование трабекул 33. Применение этого протокола для изучения влияния генетической потери функции или усиления функции spatiotemporally на маркированной сердечной дифференциации клеток-предшественников, клоновая модели и клеточная поведение возможно, и поможет в изучении этиологии врожденных пороков сердца у генетических и молекулярном уровне в 3D-контексте. Кроме того, этот протокол может быть применен для изучения морфогенеза в других системах органов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,2′,2′’-nitrilotriethanol | Sigma Aldrich | 90279 | |
| 4% Paraformaldehyde in PBS | Affymetrix | 19943 | |
| BSA | Fischer Scientific | BP16000 | |
| N,N,N’,N’-tetrakis(2-hydroxypropyl) ethylenediamine | Sigma Aldrich | 122262 | |
| Phosphate Buffer Saline | Sigma Aldrich | P5368-10PAK | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U-1250 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | 84097 | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G8773 | |
| Tamoxifen | Sigma Aldrich | T5648 | |
| Sunflower seed oil | Sigma Aldrich | S5007 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
| PECAM (CD31) | BD Pharmingen | 550274 | |
| Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21247 | |
| DAPI nuclear stain | Sigma Aldrich | D9542 | |
| 37oC Incubator | Thermoscientific Fischer | Heratherm, Compact Microbiological Incubators | |
| 48 well plates | Cell Treat | 229148 | |
| Analytical Balance | Metler Toledo | PB153-S/FACT | |
| Confocal microscope | Zeiss | Zeiss 510 confocal microscope | |
| Disecting Microscope | Unitron | Z850 | |
| Fluorescent microscope | Zeiss | Observer. Z1 | |
| Germinator 500 Glass Bead Sterilizer | CellPoint Scientific | GER-5287-120V | |
| Light Source | SCHOTT | ACE I | |
| Pair of Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Petri dish 60 mm x15 mm | TPP Techno Plastic Products AG | 93060 | |
| Rocker II Platform Rocker | Boekel Scientific | 260350 | |
| Scintillating tubes | Fischer Scientific | 03-337-26 | |
| Transfer pipette | Samco Scientific | 202 | |
| Tweezers | Fine Science Tools | 11251-20 |
References
- Vincent, S. D., Buckingham, M. E. How to make a heart: the origin and regulation of cardiac progenitor cells. Curr Top Dev Biol. 90, 1-41 (2010).
- Olson, E. N. A decade of discoveries in cardiac biology. Nat Med. 10, 467-474 (2004).
- Olson, E. N. Gene regulatory networks in the evolution and development of the heart. Science. 313, 1922-1927 (2006).
- Bruneau, B. G. The developmental genetics of congenital heart disease. Nature. 451, 943-948 (2008).
- Mohun, T. J., Weninger, W. J. Embedding embryos for high-resolution episcopic microscopy (HREM). Cold Spring Harb Protoc. , 678-680 (2012).
- Soufan, A. T., et al. Three-dimensional reconstruction of gene expression patterns during cardiac development. Physiol Genomics. 13, 187-195 (2003).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W.
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157, 726-739 (2014).
- Becker, K., Jahrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains. PLoS One. 7, e33916 (2012).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158, 945-958 (2014).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
- Badea, T. C., Wang, Y., Nathans, J. A noninvasive genetic/pharmacologic strategy for visualizing cell morphology and clonal relationships in the mouse. J Neurosci. 23, 2314-2322 (2003).
- Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450, 56-62 (2007).
- Agah, R., et al. Gene recombination in postmitotic cells. Targeted expression of Cre recombinase provokes cardiac-restricted, site-specific rearrangement in adult ventricular muscle in vivo. J Clin Invest. 100, 169-179 (1997).
- Jiao, K., et al. An essential role of Bmp4 in the atrioventricular septation of the mouse heart. Genes Dev. 17, 2362-2367 (2003).
- Wu, B., et al. Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling. Cell. 151, 1083-1096 (2012).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
- Wu, M., et al. Epicardial spindle orientation controls cell entry into the myocardium. Dev Cell. 19, 114-125 (2010).
- Zhao, C., et al. Numb family proteins are essential for cardiac morphogenesis and progenitor differentiation. Development. 141, 281-295 (2014).
- Kaufman, M. H., Kaufman, M. H. The atlas of mouse development. , Academic Press. London. (1992).
- Nagy, A. Manipulating the mouse embryo : a laboratory manual. , 3rd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2003).
- Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nat Rev Genet. 6, 826-835 (2005).
- Kelly, R. G., Buckingham, M. E. The anterior heart-forming field: voyage to the arterial pole of the heart. Trends Genet. 18, 210-216 (2002).
- Verzi, M. P., McCulley, D. J., De Val, S., Dodou, E., Black, B. L. The right ventricle, outflow tract, and ventricular septum comprise a restricted expression domain within the secondary/anterior heart field. Dev Biol. 287, 134-145 (2005).
- Ward, C., Stadt, H., Hutson, M., Kirby, M. L. Ablation of the secondary heart field leads to tetralogy of Fallot and pulmonary atresia. Dev Biol. 284, 72-83 (2005).
- Echelard, Y., Vassileva, G., McMahon, A. P. Cis-acting regulatory sequences governing Wnt-1 expression in the developing mouse CNS. Development. 120, 2213-2224 (1994).
- Jiang, X., Rowitch, D. H., Soriano, P., McMahon, A. P., Sucov, H. M.
- Viragh, S., Challice, C. E. The origin of the epicardium and the embryonic myocardial circulation in the mouse. Anat Rec. 201, 157-168 (1981).
- Wu, M., Li, J. Numb family proteins: novel players in cardiac morphogenesis and cardiac progenitor cell differentiation. Biomolecular concepts. 6, 137-148 (2015).
- Li, J., et al. Single-Cell Lineage Tracing Reveals that Oriented Cell Division Contributes to Trabecular Morphogenesis and Regional Specification. Cell reports. 15, 158-170 (2016).
- Alkaabi, K. M., Yafea, A., Ashraf, S. S. Effect of pH on thermal- and chemical-induced denaturation of GFP. Appl Biochem Biotechnol. 126, 149-156 (2005).
- Captur, G., et al. Morphogenesis of myocardial trabeculae in the mouse embryo. J Anat. , (2016).
