Abstract
Één klonale tracing en analyse op het hele hart kan tijdens hartontwikkeling cardiale voorlopercellen celgedrag en differentiatie vast, en zorgen voor de studie van de cellulaire en moleculaire basis van normale en abnormale cardiale morfogenese. Recente opkomende technologieën van retrospectieve enkele klonale analyses maken van de studie van de cardiale morfogenese bij enkele resolutie cel haalbaar is. Echter, wordt het weefsel dekking en lichtverstrooiing van het hart als imaging diepte toegenomen hinder hele hart imaging bij enkele resolutie cel. Om deze obstakels, een hele embryo clearing systeem dat het hart zeer transparant voor zowel de belichting en detectie worden ontwikkeld kan maken overwinnen. Gelukkig is in de afgelopen jaren, veel methodieken voor hele organisme clearing systemen zoals DUIDELIJKHEID, Sca le, SeeDB, ClearT, 3DISCO, CUBIC, DBE, BABB en PACT gemeld. Dit lab is geïnteresseerd in de cellulaire en moleculaire mechanismen van de kaartiac morfogenese. Onlangs, hebben we enkele cel lineage tracing via de ROSA26-Cre ERT2; ROSA26-Confetti systeem om spaarzaam label cellen tijdens de ontwikkeling van het hart. We aangepast enkele hele embryo clearing methodieken waaronder Sca le en CUBIC (helder, onbelemmerd brain imaging cocktails en computationele analyse) voor het embryo in combinatie ontruimen met hele mount vlekken op de foto om enkele klonen in het hart. Het hart werd met succes afgebeeld op één resolutie cel. We vonden dat Sca le het embryonale hart kan duidelijk, maar niet effectief duidelijk de postnatale hart, terwijl CUBIC de postnatale hart kan duidelijk, maar schade toebrengt aan het embryonale hart door het oplossen van het weefsel. De hier beschreven werkwijzen zal het onderzoek van genfunctie mogelijk te maken een resolutie kloon gedurende cardiale morfogenese, die op hun beurt kunnen de cellulaire en moleculaire basis van aangeboren hartafwijkingen onthullen.
Introduction
Cardiale morfogenese is een sequentiële Indien de spatiotemporele organisatie van vier verschillende typen cardiale progenitorcellen in verschillende sectoren van het hart nodig en vereist meerdere genetische regulerende netwerken om dit proces orkestreren de functionele hart 1,2 vormen ook. Cardiale specificatie, differentiatie, patronen, en kamermuziek rijping worden gereguleerd door cardiogene transcriptiefactoren 3. Genetische mutatie of posttranscriptionele aberratie van deze factoren in het hart stamcellen zou kunnen resulteren in een van beide embryonische dodelijkheid of aangeboren hartafwijkingen (CHD) 4. De studie van cardiale morfogenese vereist een begrip van de inherente structurele details in drie dimensies (3D) en single gelabelde cardiale voorlopercellen cel lineage tracing tijdens de ontwikkeling van het hart zal het begrip van cardiale morfogenese te promoten. Een aantal high-resolution sectie, gebaseerd tomografie methoden ontwikkeld in the afgelopen decennia aan het orgel structuur 5,6; Deze werkwijzen vereisen dure, gespecialiseerde instrumenten, uitgebreide arbeid en gebrek gedetailleerde structurele organisatie op één resolutiecel in de uiteindelijke volumetrische gereconstrueerde beeld 7,8.
3D volumetrische beeldvorming op enkele cel niveau verschaft een middel om voorlopercellen celdifferentiatie en cellulair gedrag te bestuderen in vivo 7. Echter, weefsel lichtverstrooiing blijft de belangrijkste hinderpaal voor de beeldvorming van de cellen en structuren in 3D diep in het intacte hart. Lipiden zijn een belangrijke bron van lichtverstrooiing, en het verwijderen van lipiden en / of aanpassing van het brekingsindexverschil tussen lipiden en hun omgeving zijn mogelijke benaderingen voor toenemende weefsel transparantie 8. In de afgelopen jaren een aantal weefsels clearing methoden ontwikkeld, waarmee weefsel dichtheid en lichtverstrooiing te verminderen, zoals BABB (benzylalcohol en benzyl benzoate mengsel) en DBE (tetrahydrofuran en dibenzylether); maar bij deze werkwijzen, fluorescentiedoving blijft een probleem 8-10. Het oplosmiddel gebaseerde hydrofiele methoden, zoals SeeDB (fructose / thioglycerol) en 3DISCO (dichloormethaan / dibenzylether), het behoud van fluorescerende signalen, maar niet maken het hele orgel transparant 7,8,11. Ter vergelijking: de CLARITY weefsel-clearing werkwijze maakt het orgel transparant, maar het vereist een speciale elektroforese apparaat lipiden 8,12 verwijderen, evenals PACT (passieve duidelijkheid techniek), waarvoor ook hydrogel insluiten 7,13. Voor gedetailleerde informatie over alle beschikbare weefsel opruimmethoden, zie tabel 1 in Richardson en Lichtman, et al. 7.
In 2011, Hama et al. Serendipitously ontdekte een hydrofiel mengsel 'Sca le' (ureum, glycerol en Triton X-100 mengsel), die de hersenen van muizen en embryo tran maaktent terwijl volledig behoud fluorescentiesignalen van gelabelde klonen 14. Dit zorgt voor de beeldvorming van de intacte hersenen op een diepte van enkele millimeters en grootschalige reconstructie van neuronale populaties en projecties bij een subcellulaire resolutie. Susaki et al. verder verbeterd Sca le door het toevoegen van aminoalcoholen en ontwikkelde de 'cubic' (helder, onbelemmerd brain imaging cocktails en computationele analyse) weefsel clearing methode, die fosfolipiden oplosbaar verhoogd, verminderde clearing tijd, en toegestaan voor multicolor fluorescerende beeldvorming 8. In de huidige studie, gebruik te maken van de Sca le en CUBIC weefsel clearing technieken en een hoge resolutie 3D-optische sectie, individuele klonen in het hart tijdens cardiogenese werden opgespoord met behulp van Rosa26Cre ERT2 15, R26R-Confetti 16, αMHC-Cre 17, cTnT-Cre 18, Nfatc1-Cre 19 en Rosa26-mTmG (mTmG) 20 muis lijnen. De combinatie van de werkwijze ganse berg kleuring (WMS) ontwikkeld eerder 21,22 met weefsel wismethodes verder toegestaan voor de kleuring van andere eiwitten in gelabelde klonen en voor de studie van hun gedrag in een 3D volumetrische context. De combinatie van weefsel en clearing WMS zorgt voor een beter begrip van de rol van de verschillende genen en eiwitten bij ontwikkeling van het hart en de etiologie van aangeboren hartafwijkingen. Dit protocol kan worden toegepast op andere voorlopercellen celdifferentiatie, celgedrag en orgel morfogenese gebeurtenissen bestuderen tijdens de ontwikkeling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierproeven werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) in Albany Medical College en uitgevoerd volgens de NIH Gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren.
1. Oplossing Voorbereidingen
LET OP: De Rosa26Cre ERT2 15, R26R-Confetti 16, αMHC-Cre 17 en Rosa26-mTmG (mTmG) 20 muis lijnen werden in de winkel gekochte cTnT-Cre 18 was een geschenk van Dr. Jiao aan de Universiteit van Alabama Nfatc1-Cre.. was een gift van Dr. Bin Zhou bij Albert Einstein College of Medicine 19. Muizen werden gedood door inhalatie van kooldioxide in een gesloten kamer gedurende ten minste 60 seconden gevolgd door fysieke middelen dood verificatie door bilaterale thoracotomie, onthoofding of cervicale dislocatie.
- Bereid Tamoxifen. Los 10 mg Tamoxifen in 10 ml van zonnebloemzaad oil. Zodra het volledig is opgelost, hoeveelheid en bewaar bij -20 ° C.
- Bereid fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Ontbinden Na 2 HPO 4 (1,41960 g), KH 2 PO 4 (0,24496 g), NaCl (8,0669 g) en KCl (0,20129 g) in 1 liter gedestilleerd water en breng de pH op 7,4.
- Bereid PBST: 0,1% Tween-20 in PBS oplossing door het oplossen van 100 ul Tween-20 in 100 ml PBS.
- Bereid blokkerende buffer. Voeg 3% runderserumalbumine (BSA) blokkeeroplossing door het oplossen van 3 g BSA in 100 ml PBST dat 0,2% Tween-20.
- Bereid CUBIC-1 (reagens 1). Meng 25 gew% ureum, 25 gew% N, N, N ', N'-tetrakis (2-hydroxypropyl) ethyleendiamine en 15 gew% Triton X-100 in dH 2 O.
- Bereid CUBIC-2 (reagens 2). Meng 50 gew% sucrose, 25 gew% ureum, 10 gew% 2, 2 ', 2' '- nitrilotriethanol en 0,1% (v / v) Triton X-100 in dH 2 O.
- Bereid Sca le A2: 4 M ureum, 10% w / v glycerol en 0,1% w / v Triton X-100 in dH 2 O. Breng de pH op 7,7.
- Bereid Sca le B4: 8 M ureum en 0,1% w / v Triton X-100 in dH 2 O. Stel de pH tot 8,7.
- Bereid Sca le 70: 4 M ureum, 70% w / v glycerol en 0,1% w / v Triton X-100 in dH 2 O.
2. Tamoxifen Inductie, Embryo Isolatie en Fixation
- Tamoxifen Inductie en Embryo Isolation
- Met behulp van een gebogen voedingssonde goedgekeurde protocol (ACUP 13-12007), maagsonde de vrouwelijke R26Cre ERT2 Confetti muizen (gestopt door R26Cre ERT2 mannelijke muizen) met 10 ug / g van Tamoxifen op embryonale ontwikkelingsstoornis dag E7.75 33. Op embryonale dag 9,5 (E9.5) of E10.5, euthanaseren de vrouwelijke muizen met CO 2 en cervicale dislocatie.
- Na controle van de muis dood (zie paragraaf 1 Opmerking), opent u de muis buikholte met een schaar en ontleden de baarmoeder hoorn, verwijder de eileider lagen met behulp van een schaar en pincet, en release het embryo uit de eileider 23,24.
- Breng de embryo een petrischaaltje met PBS (pH 7,4). Onder de dissectiemicroscoop opheffen van de niet-embryonale lagen (chorion, dooierzak en amnion) met behulp van een pincet.
- Met behulp van een pincet en een schaar, het verzamelen van de vrouwelijke muis en embryo staart monsters voor genotypering zoals eerder gemeld 22. Met een plastic pipet elk embryo een putje van een 48 putjesplaat met 1 ml 1x PBS.
- Onder een fluorescentiemicroscoop, identificeren de GFP / RFP / CFP positieve embryo via een omgekeerde microscoop met camera. Schil weg het hartzakje met een pincet en draai het hart / embryo met behulp van gebogen pincet om het aantal fluorescerende klonen aan beide zijden van het hart met de GFP / RFP / GVB filters te bepalen. Geen bezuinigingen nodig zijn.
- Na het identificeren van GFP / RFP / GVB positieve embryo's snel de embryo's te wassen tweemaal (2 min elk) met 1x PBS in the 48 goed plaat op een bord shaker bij kamertemperatuur (RT). Dit zal overtollig bloed te verwijderen.
- Bevestig de embryo / embryonale hart met behulp van 4% paraformaldehyde (PFA) bij kamertemperatuur. De bevestiging is afhankelijk van de embryonale leeftijd en weefselgrootte. Voor E9.5 bevestig de embryo gedurende 2 uur bij KT. De late embryonale stadium embryo's vereisen een langere fixatie tijd, die zelfs kan worden verlengd tot 24 uur voor postnatale hart.
LET OP: Paraformaldehyde is giftig, contact met de huid, ogen en slijmvliezen vermijden. - Na fixatie, was de embryo / hart in de 48 goed plaat twee keer (10 min elk) met 1x PBS op een plaat schudder bij RT. Dit verwijdert het overtollige PFA van het embryo / hart. De embryo's worden dan verder verwerkt voor de hele mount kleuring en weefsel clearing.
3. Hele Mount kleuring
OPMERKING: Nadat PFA fixatie het embryo / hart als volgt wordt onderworpen aan ganse berg vlekken.
- Permeabilize het embryo / hart in een 48 goed plaat met behulp van 1 ml 0,1% PBST gedurende 2 uur op plaat schudder bij kamertemperatuur.
- Na permeabilisatie, dompel de embryo / hart in 1 ml van het blokkeren van buffer, gedurende 2 uur of 's nachts op een plaat schudder bij 4 ºC.
- Dompel het embryo / hart naar de endotheelcel-specifiek antilichaam PECAM (CD31), verdund (1: 100) in 0,3 ml blokkerende buffer gedurende 48 uur op plaat schudder bij 4 ° C.
- Was de embryo / hart met behulp van PBST 5 keer, 30 min elk bij RT op plaat shaker. Dit verwijdert de overmaat niet-specifiek gebonden primair antilichaam uit het weefsel.
- Dompel het embryo / hart in Alexa Fluor 647 geit anti-rat secundair antilichaam, verdund (1: 1000) in 1 ml blokkeerbuffer gedurende 48 uur op plaat schudder bij 4 ° C.
- Herhaal stap 3,4 aan het secundaire antilichaam was.
- Post-fix het embryo / hart met 4% PFA gedurende 1 uur bij kamertemperatuur op plaat schudder en tweemaal wassen met PBS 5 minuten elk.
- Vlekken op het embryo / hart met de nucleaire vlek 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (verdund in PBST bij een concentverhouding van 0,01 mg / ml) gedurende 10 min op plaat schudder bij kamertemperatuur. Volg met PBS twee wassingen van 5 minuten elk.
4. Embryo / hart Clearing met Sca l e of CUBIC Method
LET OP: Na het ganse berg kleuring, wordt het embryo / hart onderworpen aan ofwel de Sca le of KUBIEKE weefsel clearing methode. De wijze is afhankelijk van de weefselgrootte en embryonale leeftijd. Voor E11.5 of jongere leeftijd embryo's, gebruik Sca l e weefsel clearing methode, terwijl voor oudere embryo's of postnatale harten de CUBIC weefsel clearing methode heeft de voorkeur.
- Schaal Tissue Clearing Methode
- Incubeer de embryo / hart met 1 ml Sca l e A2 oplossing in een scintillatieflesje (verpakt in aluminiumfolie) waarbij af en toe voorzichtig schudden (handmatig) gedurende 48 uur bij 4 ° C.
- Na Sca l e A2 incubatie Incubeer de embryo / hart met 1 ml Sca l e B4 oplossing bij 4 ° C in dezelfde flacon af en toe lichtjes schudden Anothaar 48 uur.
- Incubeer de embryo / hart voor een 48 uur met 1 ml Sca l e 70 bij 4 ° C met af en toe voorzichtig schudden. Mount embryo met behulp van 90% glycerol (zie paragraaf 5.1).
- CUBIC Tissue Clearing Methode
- Voor de hele embryo / hart CUBIC clearing, dompel elk embryo / hart in 1 ml kubieke-1 met af en toe voorzichtig schudden gedurende 48 uur bij 37 ° C 7. Na 48 uur werd de oplossing vervangen met hetzelfde volume verse CUBIC reagens 1 en incubeer het monster gedurende nog 48 uur bij 37 ° C met af en toe schudden met de hand.
- Was de CUBIC-1 behandelde hart / embryo met 1x PBS meerdere malen bij kamertemperatuur onder zacht schudden met de hand. Dit verwijdert de overtollige CUBIC-1 oplossing.
- Na uitwassen CUBIC-1 met PBS, dompel de embryo's / hearts in kubieke-2-oplossing (1 g per embryo / heart) gedurende 48 uur bij 37 ° C met af en toe lichtjes schudden met de hand. Dit volgt embryo / heart montage met behulp van glycerol (zie hoofdstuk 50,2).
5. Sample Montage en Imaging
LET OP: De ontruimde embryo's of organen in Sca l e 70 of CUBIC-2-oplossing kan direct respectievelijk worden afgebeeld met schaal 70 en CUBIC-2-oplossing als de beeldvormende medium. Echter, gezien de kwetsbaarheid van de embryonale monsters clearing reagentia, indien de monsters worden niet onmiddellijk worden afgebeeld, maar opgeslagen langdurige monsters worden in 90% glycerol de onderstaande protocol.
- Direct dompel de Sca le ontruimd monster in 1 ml van 90% glycerol en bewaar bij 4 ° C tot beeldvorming.
- Was de kubische behandelde monster met 1x PBS tweemaal 5 min elk en achtereenvolgens incuberen van het monster met 1 ml van 30%, 50%, 70% en 90% glycerol oplossing elke 30 minuten.
- Voor beeldvorming, breng het monster glazen bodem petrischaal met een minimale hoeveelheid van 90% glycerol en beeld klonen met een confocale microscoop met twee foton mogelijkheden.
- Afbeelding het hart of embryo in de glycerol met een 10X / 0.3 NA, een 25X / 0.8 NA onderdompeling, of een 40X / 1.2 NA water corrigerende objectief. Afbeelding DAPI met behulp van 2-foton excitatie van een coherent titanium: saffier kameleon laser. De keuze van de microscoop objectieflens zal afhangen van het doel van de experimenten, bijvoorbeeld voor superresolutie kan een lichtwaaier fluorescentiemicroscoop worden gebruikt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Beeldvorming van het ontruimde embryonale hart
Gewervelde hartvorming een spatiotemporeel morfogene gereguleerd proces en is afhankelijk van de organisatie en differentiatie van progenitorcellen uit vier verschillende bronnen 1. Cellen van het eerste hart gebied van cardiale halve maan zal vouw in de richting van de ventrale middellijn om een lineaire hart buis te vormen. De cellen van het tweede hart veld aanvankelijk dorsomedially wonende aan het eerste gebied hart vervolgens transloceren naar de keelholte en splanchnische mesoderm, vanwaar ze migreren naar de bestaande steiger van het lineaire hartbuis. De cellen van tweede hart veld zal bijdragen tot de rechterkamer uitstroombaan (OFT) myocardium en endocardium enige 25-28. Cardiale neurale cellen (CNCC), afkomstig van postotic rhombomeres 6, 7 en 8, zal migreren naar de caudale keelholte en signifi bijdragencant aan de gladde spierlaag en endocardiale kussens in de OFT. Zij dragen ook bij aan de vorming van de aorticopulmonary septum 29,30. De vierde populatie bestaat uit epicardiale cellen afkomstig van de pro-epicardiale orgaan (PEO), en draagt bij aan fibroblasten, gladde spiercellen en mogelijk andere cardiale cellen 31. Het epicard regelt coronaire vasculaire ontwikkeling, groei en cardiale morfogenese 21.
De belangrijkste begrip van cardiale morfogenese is dat tijdens hartontwikkeling, abnormale celmigratie / differentiatie van de voorlopercellen vier celpopulaties leidt tot misvormingen of aangeboren hartafwijkingen 4,22,32, dat de voornaamste oorzaak van aangeboren afwijkingen in de wereld . Het bepalen van de mechanismen van cardiale morfogenese op cellulair en moleculair niveau is een essentiële stap naar het verbeteren van de diagnose en de mogelijke behandelingen voor CHDS.Daarom is het van cruciaal belang om het beeld van het proces van het hart morfogenese naar de hele hoogte van het hart met een enkele oplossing cel. Om dat te bereiken, gelabeld we de cardiomyocyten onder die de Cre lijn onder de controle van cardiale specifieke troponine T (cTnT), dat specifiek tot expressie in cardiomyocyten 18, met mTmG reporter lijn. De embryo's in E8.5 geoogst en gekleurd voor PECAM te endocardiale en endotheelcellen onderscheiden van cardiomyocyten. De embryo's werden vervolgens goedgekeurd door Sca le en het hart werd in beeld gebracht. Het myocard werd gelabeld door GFP door cTnT aangedreven Cre gemedieerde recombinatie van de mTmG reporter en het endocardium werd gelabeld met PECAM (Figuur 1A en aanvullende Film 1). De hartspiercellen kunnen worden waargenomen bij een enkele cel resolutie (Figuur 1A). Het hart structuren van het afgebeelde deel, zoals de primitieve hartkamer en OFT kan duidelijk worden geïdentificeerd na het 3D-reconstructie met behulp van 3D rebouw software (Figuur 1B en aanvullende Movie 2).
Beeldvorming enkele klonen van de ontruimde embryonale hart
Cardiale morfogenese afhankelijk cardiale lineage differentiatie en individuele cel organisatie op de gehele hoogte van het hart 22, en dus is het essentieel om het interne cardiale voorlopercellen differentiatie tot verschillende typen cardiale cellen en ook het celmorfologie op één resolutiecel. Om dat te bereiken, Rosa26Cre ERT2 15 werd gekruist met R26R-Confetti 16, en de zwangere vrouw werd gavaged met Tamoxifen bij een lage concentratie. Na 48 uur werd het embryo geoogst bij E9.5 en geheel mount gekleurd PECAM, en vervolgens werd het gehele hart afgebeeld. We vonden dat er was slechts één cluster van cellen, gelokaliseerd in het OFT, en deze kloon had 8 cellen op basis on het gereconstrueerde beeld en opeenvolgende secties (figuren 2A, 2B en aanvullende Film 3), wat aangeeft dat deze cellen zijn afgeleid van een enkele voorlopercel. De cellulaire morfologie en cellulair gedrag zoals cellulaire proliferatie en migratie kunnen worden afgeleid uit de uiteindelijke positionering van de cellen (Figuur 2A). Ook toegepast Cubic methode om het embryonale hart bij E9.5 en E10.5 uit en vonden dat zelfs na 24 uur incubatie met reagens 1, werden de embryo subtiel opgelost en de weefselstructuur negatief beïnvloed (gegevens niet getoond ).
Beeldvorming van ontruimd postnatale en late embryonale harten
We pasten zowel Sca l e en CUBIC tot postnatale harten te wissen. P2 harten met het genotype van αMHC-Cre; mTmG (αMHC-Cre is specifiek uitgedrukt in hartspiercellen <sup> 17) werden vereffend met Sca l e 48 uur, maar meer transparantie dan de harten behandeld met PBS alleen (gegevens niet getoond) wordt weergegeven, wat aangeeft dat Sca l e clearing is niet effectief voor postnatale harten. Toen P2 harten werden ontruimd met cubic reagens 1 voor 48 uur, en reagens 2 voor 96 uur, waren ze veel transparanter dan de ontruimde met reagens 1 voor 48 uur en reagens 2 voor 48 uur harten. De imaging diepte was significant verhoogd met 96 uur reagens 2 incubatie (Aanvullende Movies 4 en 5), wat aangeeft dat langere incubatie met de CUBIC reagentia bevordert de transparantie en voorziet in een verhoging in de beeldvorming diepte. De vorm en grootte van elk cardiomyocyt kan worden geïdentificeerd door de gelokaliseerde GFP (Figuur 3A), die kan worden gebruikt om hypertrofie te identificeren.
We hebben ook ontruimd Nfatc1-Cre; Confetti (Confetti vrouwelijke aangesloten met Nfatc1Cre mannelijke) E17.5 hearts (Nfatc1-Cre wordt uitgedrukt in cardiale endocardiale cellen 19) met cubic reagens 1 voor 48 uur en reagens 2 voor 48 uur. De harten zijn transparant, en fluorescerende eiwitten zoals GFP, YFP, CFP en RFP werd verwacht dat de endocardiale cellen en hun afgeleide cellen te labelen; kon echter alleen GFP en YFP worden afgebeeld door het gehele hart (Figuren 3B, 3C en aanvullende films 6 en 7), en de GVB en RFP kon niet worden gedetecteerd (gegevens niet getoond). De kleuring van PECAM (Alexia Fluor 647) ook kon worden gedetecteerd (gegevens niet getoond), wat suggereert dat de kubische reagens dooft de CFP, RFP en het antilichaam geconjugeerd fluorofoor in dit protocol.
Figuur 1:. Beeld brengen van de Sac / e embryonale hart gewist (A) Eén opsche segment van een E8.75 hart (cTnT-Cre; mTmG) wordt getoond. V: ventrikel; OFT: uitstroom. (B) Toont het gereconstrueerde hart structuur van 93 opeenvolgende optische schijven met een totale diepte van 110,4 urn. Schaal bar = 20 urn in A. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Imaging enkele kloon van SCA / e embryonale hart gewist (A) Een optische gedeelte van een kloon van een E9.5 hart met het genotype van ROSA26-Cre ERT2;. ROSA26-Confetti. De pijl wijst naar een cellulaire uitsteeksel van een cardiomyocyt. (B) Toont het gereconstrueerde kloon in de OFT regio van het E9.5 hart met 10 optische schijfjes en 36 micrometer totale diepte. Schaal bar = 20 urn in A. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
. Figuur 3: beeld brengen van de CUBIC ontruimd postnatale en late embryonale harten (A) toont een optische gedeelte van een P2 hart met het genotype van αMHC-Cre; mTmG; alle van de optische onderdelen worden getoond in Aanvullende Movie 5. (b) toont een deel van een E17.5 hart met het genotype van Nfatc1-Cre; ROSA26-Confetti. (C) Geeft de gereconstrueerde hart structuur van 106 optische schijfjes met een totale diepte van 630 micrometer. De Schaal bar = 20 urn in A en is 100 micrometer op B. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
. Aanvullende Movie 1: beeld brengen van de Sca le embryonale hart gewist (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden) Film 1 toont optische onderdelen van een Sca le behandeld E8.75 hart (cTnT-Cre; mTmG) van hart tot hart oppervlak lumen. De diepte 110,4 pm en er 93 segmenten in totaal.
Aanvullende Movie 2:. Beeld brengen van de Sca le embryonale hart gewist (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden) Movie 2 toont de 3D-oppervlak beeld van de gereconstrueerde hart in Movie 1, reconstructed via de 3D-reconstructie software. Gele markeert het PECAM expressie en groene labels alle hartspiercellen.
Aanvullende Movie 3: Imaging een enkele kloon van de Sca le embryonale hart gewist (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden). Movie 3 toont delen van een kloon van een E9.5 hart met het genotype van ROSA26-Cre ERT2.
Aanvullende Movie 4: beeld brengen van de CUBIC gewist postnatale harten (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden). Movie 4 toont delen van een CUBIC behandeld P2 hart (& #945; MHC-Cre; mTmG) van hart tot hart oppervlak lumen. Dit P2 hart werd ontruimd met cubic reagens 1 voor 48 uur, en CUBIC reagens 2 voor 96 uur.
Aanvullende Movie 5: beeld brengen van de CUBIC gewist postnatale harten (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden). Movie 5 toont een hart dat werd ontruimd met reagens KUBIEKE 1 voor 48 uur en reagens CUBIC 2 voor 48 uur. De diepte is 136 micrometer met 6 micrometer per sectie in de film 4 en de dikte is 76 urn met 6 micrometer per sectie in de film 5.
Aanvullende Movie 6: beeld brengen van de CUBIC ontruimd late embryonic hart (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden) Movie 6 toont delen van een CUBIC behandeld E17.5 hart (Nfatc1-Cre; ROSA26-Confetti). van hart tot hart oppervlak lumen. De diepte is 630 micrometer met 6 micrometer per sectie.
Aanvullende Movie 7: beeld brengen van de CUBIC ontruimd late embryonale hart (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden). Movie 7 toont de 3D-oppervlak beeld van het hart in Movie 6, gereconstrueerd via de 3D-reconstructie software.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De embryo isolatie is een zeer belangrijke stap. E9.5 embryo's zijn erg kwetsbaar en klein in omvang, dus extra zorg moeten worden genomen van het embryo / hart structuren niet te beschadigen tijdens het isolement. De niet-embryonale extra lagen omhult het embryo / hart moeten zorgvuldig vooral als beeldvorming van de hele embryo worden verwijderd. Dit maakt het mogelijk antilichaam en clearing mengsel penetratie diep in de embryonale weefsels, en helpt ook bij het verwijderen van de achtergrond signaal wanneer beeldvorming. Meerdere antilichamen zoals antilichamen tegen PECAM, geacetyleerde α-tubuline en integrine β1 onderzocht en werd alle succesvol gedetecteerd (gegevens niet getoond) 33. Dit toont aan dat de moleculaire integriteit, cellulaire integriteit en antigen compatibiliteit werden gedurende deze clearingproces verstoord.
Breng de embryo / hart met behulp van een brede mond overdracht pipet (snijd de tip). Dit voorkomt beschadigingen tijdens de behandeling. De GFP / YFP / RFP / GVB uitdrukking patroon en de nomber klonen moeten zorgvuldig worden geregistreerd in het hart om de geschikte dosering één kloon per hart of andere organen labelen bepalen. Vanwege de lage dosering van Tamoxifen (10 ug / g), soms het hart geen klonen verwezen of is moeilijk om klonen te detecteren. Daarom wordt aanbevolen de dooierzak om te bepalen of het embryo elke GFP / YFP / RFP / CFP klonen.
De embryo of fixatie hart is een belangrijke stap, over-fixatie resulteert in een hoge achtergrond terwijl onvoldoende fixatie resulteren in een slechte kleuring. Het wordt aanbevolen om de E8.5-E10.5 hele embryo vast te stellen gedurende 2 uur bij kamertemperatuur op een bord shaker. Terwijl voor E11.5-E15.5 embryo's, de aanbeveling is om het hart zorgvuldig te isoleren en zet deze vast met 4% PFA gedurende 2 uur bij kamertemperatuur. Na ervoor te zorgen om de lagen rond het hart als de verwerking van het hele embryo te verwijderen, kan de E11.5- E13.5 embryo's ook worden vastgesteld voor 3-4 uur bij KT, maar dat vereist een verhoogde weefsel clearing tijd. De E16.5-P1 (postnataledag 1) harten zijn vastgesteld voor 3-4 uur bij KT op een bord shaker. Bij de vaststelling van het hele embryo, moeten de voor- en achterpoten worden verwijderd omdat ze belemmeren het hart beeldvorming.
De monsters moeten worden behandeld met CUBIC en SCA le in scintillatieflacon monster drogen te minimaliseren. We hebben betere opheldering van monsters met de kubische weefsel clearing werkwijze waargenomen bij 37 ° C, terwijl Sca le clearing optimaal wordt uitgevoerd bij 4 ° C. Na beeldvorming, kan de monsters worden opgeslagen op korte termijn in kubieke-2 of Sca le 70. De monsters altijd afgedekt met aluminiumfolie fluorescentie bleken voorkomen.
Embryonale weefsels en organen minder lipiden en extracellulaire matrixafzetting, waardoor minder tijd clearing. Aan de andere kant zijn ze gevoeliger voor de clearing reagentia. De clearing reagentia invloed kunnen zijn op de integriteit van de weefselstructuur en antigen, resulterend in de uitdoving van de GVB, RFP en antilichaam conjugated fluorofoor. Daarom kan langer fixatie keer het blussen te voorkomen. Het doven van de fluorescerende eiwitten kunnen ook vanwege hun gevoeligheid voor chemische stoffen en pH zoals eerder vermeld 34. Andere chemische recepten, pH, fixatieven en incubatie lengte moet worden onderzocht om de uitdoving van de fluorescerende eiwitten te minimaliseren.
De werkwijze van de hele orgaan transparentizing of weefsel clearing heeft een revolutie teweeggebracht volumetrische 3D-imaging. De vorige beeldvormingswerkwijze cardiale morfogenese, waarbij de betrokken manual 2D- of 3D-reconstructie van seriële secties, is tijdrovend en instrument veeleisend 5,6. Hoge resolutie episcopische microscopie (HREM) in combinatie met 3D-modellering kan worden toegepast op de studie van de morfogenese van de muis hart en zorgt voor een uitstekende anatomische beschrijving van de trabeculaire architectuur in de ontwikkeling muizenembryo 35. Echter HREM niet de identificatie van de tl toestaanent eiwit of antilichaam gemerkte cellen gekleurde cellen van de rest van 35 cellen. Met behulp van het huidige protocol, met een minimale inspanning en hoge kosteneffectiviteit, hebben we met succes behouden de fluorescerende signalen in het embryonale hart met behulp van Sca le of KUBIEKE weefsel clearing methoden (figuren 1-3). In combinatie met een lage dosering (10 ug / g) Tamoxifen tot Cre recombinatie gebeurtenissen induceren en produceren een enkele klonen in het gehele embryo en in het hart, kan dit systeem worden gebruikt voor het opsporen en onderzoeken enkele cardiale voorlopercellen celdifferentiatie en cellulair gedrag bij vivo (Figuur 2A) 33. Bovendien, gecombineerd met Cre gemedieerde gen deletie of overexpressie en Cre gemedieerde cel labeling Dit afbeeldingssysteem kan worden toegepast voor genetische functieverlies of overexpressie-on voorlopercellen celdifferentiatie en cellulair gedrag te bestuderen gedurende cardiale morfogenese en verschaft aldus een robuuste tool om stUdy het ontstaan van aangeboren hartafwijkingen.
De twee weefsel-verrekeningssystemen Sca / e en Cubic die in deze studie toonde clearing verschillende efficiënties, die verder differentieert de systemen op basis van embryonale leeftijd huidlaag en de duur van weefsel clearing tijd. Voor een vroeg stadium embryo's E9.5-E10.5, de SCA / e-systeem niet alleen maakte de weefsel duidelijk, maar ook beschermd het embryo morfologie en bewaarde de fluorescerende signalen, terwijl de CUBIC behandeling resulteerde in embryo ontbinding. Dit kan worden veroorzaakt door extra aminoalcoholen en een hogere concentratie van Triton X-100 in de kubische oplossingen 8 zijn. Voor oudere harten, de SCA / e-systeem niet in geslaagd om het weefsel volledig te wissen, zelfs met een langere incubatietijd. De KUBIEKE clearing oplossing maakte de oudere weefsel duidelijk (figuur 3). Echter, verhoogde incubatietijd resulteerde in zwakkere signalen en alleen beschermd endogene GFP, terwijl RFP, GVB en antilichaam geconjugeerd signalengingen verloren. Daarom zou een geoptimaliseerd recept van de clearing reagentia en beter incubatietijd nodig om het hart of organen volumetrisch met een grotere spectrum van fluorescerende labels.
Deze studie toonde aan dat men kan bestempelen, spoor, en het beeld enkele cardiale klonen in combinatie met een hele berg kleuring van endocardiale / endotheelcellen marker PECAM van het ontwikkelen van hart. De hele mount kleuring van PECAM en DAPI in dit systeem helpt niet alleen de soorten cellen en celmorfologie van de gemerkte cellen te identificeren binnen een hart, maar maakt ook het onderzoek van de klonale patroon, migratie en gedrag gedurende cardiale morfogenese. In figuur 2A zagen we een kloon met 8 cellen in OFT. Hand van het aantal cellen aanwezig in deze kloon met betrekking tot de etikettering tijd kan de celproliferatie dosering gemakkelijk worden berekend. In een ander onderzoek met behulp van deze zelfde systeem identificeerden we de georiënteerde celdeling patroon en migratie patroon van enkele cardiomyocyt tijdens trabeculation proces 33. De toepassing van dit protocol om de effecten van genetische verlies van functie of gain of function spatiotemporeel op de gelabelde cardiale voorlopercellen celdifferentiatie studeren, klonen patroon en cellulaire gedrag is haalbaar, en zal helpen bij het onderzoek naar het ontstaan van aangeboren hartafwijkingen bij genetische en moleculair niveau in een 3D context. Bovendien kan dit protocol worden toegepast studie van morfogenese in andere orgaansystemen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,2′,2′’-nitrilotriethanol | Sigma Aldrich | 90279 | |
| 4% Paraformaldehyde in PBS | Affymetrix | 19943 | |
| BSA | Fischer Scientific | BP16000 | |
| N,N,N’,N’-tetrakis(2-hydroxypropyl) ethylenediamine | Sigma Aldrich | 122262 | |
| Phosphate Buffer Saline | Sigma Aldrich | P5368-10PAK | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U-1250 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | 84097 | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G8773 | |
| Tamoxifen | Sigma Aldrich | T5648 | |
| Sunflower seed oil | Sigma Aldrich | S5007 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
| PECAM (CD31) | BD Pharmingen | 550274 | |
| Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21247 | |
| DAPI nuclear stain | Sigma Aldrich | D9542 | |
| 37oC Incubator | Thermoscientific Fischer | Heratherm, Compact Microbiological Incubators | |
| 48 well plates | Cell Treat | 229148 | |
| Analytical Balance | Metler Toledo | PB153-S/FACT | |
| Confocal microscope | Zeiss | Zeiss 510 confocal microscope | |
| Disecting Microscope | Unitron | Z850 | |
| Fluorescent microscope | Zeiss | Observer. Z1 | |
| Germinator 500 Glass Bead Sterilizer | CellPoint Scientific | GER-5287-120V | |
| Light Source | SCHOTT | ACE I | |
| Pair of Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Petri dish 60 mm x15 mm | TPP Techno Plastic Products AG | 93060 | |
| Rocker II Platform Rocker | Boekel Scientific | 260350 | |
| Scintillating tubes | Fischer Scientific | 03-337-26 | |
| Transfer pipette | Samco Scientific | 202 | |
| Tweezers | Fine Science Tools | 11251-20 |
References
- Vincent, S. D., Buckingham, M. E. How to make a heart: the origin and regulation of cardiac progenitor cells. Curr Top Dev Biol. 90, 1-41 (2010).
- Olson, E. N. A decade of discoveries in cardiac biology. Nat Med. 10, 467-474 (2004).
- Olson, E. N. Gene regulatory networks in the evolution and development of the heart. Science. 313, 1922-1927 (2006).
- Bruneau, B. G. The developmental genetics of congenital heart disease. Nature. 451, 943-948 (2008).
- Mohun, T. J., Weninger, W. J. Embedding embryos for high-resolution episcopic microscopy (HREM). Cold Spring Harb Protoc. , 678-680 (2012).
- Soufan, A. T., et al. Three-dimensional reconstruction of gene expression patterns during cardiac development. Physiol Genomics. 13, 187-195 (2003).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W.
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157, 726-739 (2014).
- Becker, K., Jahrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains. PLoS One. 7, e33916 (2012).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158, 945-958 (2014).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
- Badea, T. C., Wang, Y., Nathans, J. A noninvasive genetic/pharmacologic strategy for visualizing cell morphology and clonal relationships in the mouse. J Neurosci. 23, 2314-2322 (2003).
- Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450, 56-62 (2007).
- Agah, R., et al. Gene recombination in postmitotic cells. Targeted expression of Cre recombinase provokes cardiac-restricted, site-specific rearrangement in adult ventricular muscle in vivo. J Clin Invest. 100, 169-179 (1997).
- Jiao, K., et al. An essential role of Bmp4 in the atrioventricular septation of the mouse heart. Genes Dev. 17, 2362-2367 (2003).
- Wu, B., et al. Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling. Cell. 151, 1083-1096 (2012).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
- Wu, M., et al. Epicardial spindle orientation controls cell entry into the myocardium. Dev Cell. 19, 114-125 (2010).
- Zhao, C., et al. Numb family proteins are essential for cardiac morphogenesis and progenitor differentiation. Development. 141, 281-295 (2014).
- Kaufman, M. H., Kaufman, M. H. The atlas of mouse development. , Academic Press. London. (1992).
- Nagy, A. Manipulating the mouse embryo : a laboratory manual. , 3rd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2003).
- Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nat Rev Genet. 6, 826-835 (2005).
- Kelly, R. G., Buckingham, M. E. The anterior heart-forming field: voyage to the arterial pole of the heart. Trends Genet. 18, 210-216 (2002).
- Verzi, M. P., McCulley, D. J., De Val, S., Dodou, E., Black, B. L. The right ventricle, outflow tract, and ventricular septum comprise a restricted expression domain within the secondary/anterior heart field. Dev Biol. 287, 134-145 (2005).
- Ward, C., Stadt, H., Hutson, M., Kirby, M. L. Ablation of the secondary heart field leads to tetralogy of Fallot and pulmonary atresia. Dev Biol. 284, 72-83 (2005).
- Echelard, Y., Vassileva, G., McMahon, A. P. Cis-acting regulatory sequences governing Wnt-1 expression in the developing mouse CNS. Development. 120, 2213-2224 (1994).
- Jiang, X., Rowitch, D. H., Soriano, P., McMahon, A. P., Sucov, H. M.
- Viragh, S., Challice, C. E. The origin of the epicardium and the embryonic myocardial circulation in the mouse. Anat Rec. 201, 157-168 (1981).
- Wu, M., Li, J. Numb family proteins: novel players in cardiac morphogenesis and cardiac progenitor cell differentiation. Biomolecular concepts. 6, 137-148 (2015).
- Li, J., et al. Single-Cell Lineage Tracing Reveals that Oriented Cell Division Contributes to Trabecular Morphogenesis and Regional Specification. Cell reports. 15, 158-170 (2016).
- Alkaabi, K. M., Yafea, A., Ashraf, S. S. Effect of pH on thermal- and chemical-induced denaturation of GFP. Appl Biochem Biotechnol. 126, 149-156 (2005).
- Captur, G., et al. Morphogenesis of myocardial trabeculae in the mouse embryo. J Anat. , (2016).
