Abstract
Enkelt klonal opsporing og analyse på hel-hjerte niveau kan bestemme cardiac progenitorcelle adfærd og differentiering under hjerte- udvikling, og giver mulighed for undersøgelse af cellulære og molekylære grundlag for normal og unormal hjertefunktion morfogenese. Nylige nye teknologier af retrospektive enkelt klonale analyser gøre studiet af hjerte morfogenese på enkelt celle opløsning muligt. Imidlertid er vævet opacitet og lysspredning af hjertet som billeddannende dybde forøget hindre hel-afbildning af hjertet ved enkelt celle opløsning. For at overvinde disse forhindringer, en hel-foster clearingsystem, der kan gøre hjerte meget gennemsigtigt for både belysning og detektion skal udvikles. Heldigvis i de sidste mange år, er blevet rapporteret mange metoder til hel-organisme clearingsystemer såsom CLARITY, Sca le, SeeDB, ClearT, 3DISCO, CUBIC, DBE, Babb og PACT. Dette laboratorium er interesseret i de cellulære og molekylære mekanismer i kortIAC morfogenese. For nylig har vi etableret enkelt celle afstamning sporing via ROSA26-Cre ERT2; ROSA26-Confetti system tyndt label celler under hjerte-udvikling. Vi tilpassede flere hele embryo-clearing metoder herunder Sca le og CUBIC (klare, uhindret hjerne imaging cocktails og beregningsmæssige analyse) for at rydde embryo i kombination med hele mount farvning til billedet enkelte kloner inde i hjertet. Hjertet blev succesfuldt afbildet ved enkelt celle opløsning. Vi fandt, at SCA le kan rydde embryoniske hjerte, men kan ikke effektivt fjerne den postnatale hjerte, mens CUBIC kan rydde postnatale hjerte, men skader den embryoniske hjerte ved at opløse vævet. De her beskrevne metoder vil tillade undersøgelse af genfunktion i en enkelt klon beslutning under cardiac morfogenese, hvilket igen kan afsløre den cellulære og molekylære grundlag for medfødte hjertefejl.
Introduction
Cardiac morfogenese er en sekventiel begivenhed, der kræver Spatiotemporal organisering af fire forskellige typer af hjerte-stamceller i forskellige sektorer af hjertet, og også kræver flere genetiske regulerende net at orkestrere denne proces til at danne den funktionelle hjerte 1,2. Cardiac specifikation, differentiering, mønster, og kammer modning reguleres af cardiogene transkriptionsfaktorer 3. Genetisk mutation eller posttranskriptionel aberration af disse faktorer i hjerte-stamceller kan resultere i enten embryonale letalitet eller medfødte hjertefejl (CHD) 4. Studiet af hjerte morfogenese kræver en forståelse af iboende strukturelle detaljer i tre dimensioner (3D) og enkelt mærkede hjerte-stamcelle afstamning sporing under hjerte-udvikling vil fremme forståelsen af hjerte-morfogenese. En række høj opløsning sektion baseret tomografi metoder er blevet udviklet i the fortid årtier til billedet orgel struktur 5,6; men disse metoder kræver dyre, specialiserede instrumenter, omfattende arbejdskraft, og mangler detaljeret strukturel organisation på enkelt celle opløsning i det endelige volumetriske rekonstruerede billede 7,8.
3D volumetriske billeddannelse på enkelt celle niveau giver et middel til at studere progenitorcelle differentiering og cellulære adfærd in vivo 7. Imidlertid væv lysspredning fortsat den primære hindring for billeddannelse celler og strukturer i 3D dybt inde det intakte hjerte. Lipider er en væsentlig kilde til lysspredning, og fjernelse af lipider og / eller justering af forskellen i brydningsindeks mellem lipider og de omkringliggende områder er potentielle metoder til forøgelse af væv gennemsigtighed 8. I de sidste mange år, blev en række væv clearing metoder udviklet, som reducerer væv opacitet og lysspredning, ligesom Babb (benzylalkohol og benzyl benzoate blanding) og DBE (tetrahydrofuran og dibenzylether); men i disse fremgangsmåder, fluorescensslukning stadig et problem 8-10. Opløsningsmidlet baseret hydrofile metoder, såsom SeeDB (fruktose / thioglycerol) og 3DISCO (dichlormethan / dibenzylether), bevare fluorescerende signaler, men ikke gør det hele orgel gennemsigtig 7,8,11. Til sammenligning CLARITY væv-clearing metode gør organet transparent, men det kræver en specialiseret elektroforeseapparat at fjerne lipider 8,12, ligesom PACT (passiv klarhed teknik), hvilket også kræver hydrogel indlejring 7,13. For detaljerede oplysninger om alle tilgængelige væv-clearing metoder, se tabel 1 i Richardson og lichtman, et al. 7.
I 2011 Hama et al. Serendipitously opdaget en hydrofil blanding 'Sca le' (urinstof, glycerol og Triton X-100-blanding), der gør muse hjerne og embryo genneent samtidig helt bevare fluorescerende signaler fra mærkede kloner 14. Dette giver mulighed for billeddannelse af den intakte hjerne i en dybde på flere millimeter og genopbygning af neuronale populationer og fremspring storstilet ved en subcellulær opløsning. Susaki et al. yderligere forbedret Sca le ved at tilføje aminoalkoholer og udviklet den "CUBIC '(klare, uhindret hjerne imaging cocktails og beregningsmæssige analyse) væv clearing metode, der steg phospholipid solubilisering, reduceret clearing tid, og tilladt for flerfarvet fluorescerende billeddannelse 8. I den foreliggende undersøgelse, at drage fordel af Sca le og CUBIC væv clearing teknikker og høj opløsning 3D optisk sektionering, individuelle kloner inde i hjertet under cardiogenese blev sporet ved hjælp Rosa26Cre ERT2 15, R26R-Confetti 16, αMHC-Cre 17, cTnT-Cre 18, Nfatc1-Cre 19, og Rosa26-mTmG (mTmG) 20 mus linjer. Kombinationen af hele mount farvning (WMS) metode udviklet tidligere 21,22 med væv clearing metoder længere tillades til farvning af andre proteiner i mærkede kloner og til undersøgelse af deres adfærd i en 3D volumetrisk kontekst. Kombinationen af væv clearing og WMS giver mulighed for en bedre forståelse af de roller forskellige gener og proteiner i løbet hjerte-udvikling, og ætiologien af medfødte hjertefejl. Denne protokol kan anvendes til at studere andre progenitorceller differentiering, cellulær adfærd, og orgel morfogenese hændelser under udvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) ved Albany Medical College og udført i overensstemmelse med NIH Guide til Pleje og anvendelse af forsøgsdyr.
1. Løsning Forberedelser
BEMÆRK: Rosa26Cre ERT2 15, R26R-Confetti 16, αMHC-Cre 17, og Rosa26-mTmG (mTmG) 20 mus linjer blev indkøbt kommercielt cTnT-Cre 18 var en gave fra Dr. Jiao ved University of Alabama Nfatc1-Cre.. var en gave fra Dr. Bin Zhou på Albert Einstein College of Medicine 19. Mus blev aflivet ved kuldioxid indånding i et lukket kammer i mindst 60 sekunder efterfulgt af fysiske medier døden kontrol ved bilateral torakotomi, halshugning eller cervikal dislokation.
- Forbered Tamoxifen. Opløs 10 mg Tamoxifen i 10 ml solsikkefrø oil. Når det er helt opløst, alikvot og opbevares ved -20 ° C.
- Forbered phosphatbufret saltvand (PBS). Opløs Na 2 HPO 4 (1,41960 g), KH 2 PO 4 (0,24496 g), NaCl (8,0669 g) og KCI (0,20129 g) i 1 L destilleret vand og justere pH til 7,4.
- Forbered PBST: 0,1% Tween-20 i PBS ved opløsning af 100 pi Tween-20 i 100 ml PBS.
- Forbered blokerende buffer. Foretag 3% bovint serumalbumin (BSA) blokeringsopløsning ved opløsning 3 g BSA i 100 ml PBST indeholdende 0,2% Tween-20.
- Forbered CUBIC-1 (reagens 1). Bland 25 vægt% urinstof, 25 vægt% N, N, N ', N'-tetrakis (2-hydroxypropyl) ethylendiamin og 15 vægt-% Triton X-100 i dH 2 O.
- Forbered CUBIC-2 (reagens 2). Bland 50 vægt-% saccharose, 25 vægt-% urinstof, 10 vægt-% 2, 2 ', 2' '- nitrilotriethanol og 0,1% (volumen / volumen) Triton X-100 i dH 2 O.
- Forbered Sca le A2: 4 M urinstof, 10% vægt / volumen glycerol og 0,1% vægt / volumen Triton X-100 i dH 2 O. Justere pH til 7,7.
- Forbered Sca le B4: 8 M urinstof og 0,1% vægt / volumen Triton X-100 i dH 2 O. Justere pH til 8,7.
- Forbered Sca le 70: 4 M urinstof, 70% w / v glycerol og 0,1% vægt / volumen Triton X-100 i dH 2 O.
2. Tamoxifen Induktion, Embryo Isolation og fiksering
- Tamoxifen Induktion og Embryo Isolation
- Ved hjælp af en buet ernæringssonde godkendt protokol (Acup 13-12.007), sondeernæring de kvindelige R26Cre ERT2 Confetti mus (sluttet af R26Cre ERT2 hanmus) med 10 ug / g Tamoxifen på embryonale udviklingsmæssige dag E7.75 33. På embryonal dag 9,5 (E9.5) eller E10.5, aflive den hunmus med CO 2 og cervikal dislokation.
- Efter kontrol af musen død (se afsnit 1 Note), åbne musen bughulen med en saks og dissekere ud børhornet, fjerne æggelederen lag ved hjælp af saks og pincet og release embryoner fra æggelederen 23,24.
- Overfør embryoner til en petriskål indeholdende PBS (pH 7,4). Under dissektionsmikroskop, fjerne ikke-embryonale lag (chorion, blommesækken og amnion) med hjælp fra pincet.
- Brug pincet og saks, indsamle de kvindelige mus og embryo hale prøver til genotypning som tidligere rapporteret 22. Ved hjælp af en plastik pipette hver embryo til en brønd i en plade med 48 indeholdende 1 ml 1x PBS.
- Under et fluorescensmikroskop, identificere GFP / RFP / FFP positive embryoner via et inverteret mikroskop med et kamera. Peel væk pericardium med en pincet og rotere hjerte / embryo ved hjælp af buede pincet til at bestemme antallet af fluorescerende kloner på begge sider af hjertet med filtrene GFP / RFP / FFP. Der behøves ingen udskæringer.
- Efter at have identificeret GFP / RFP / FFP positive embryoner, hurtigt vaske embryoner to gange (2 min hver) med 1x PBS i the 48 brønd-plade på en pladeryster ved stuetemperatur (RT). Dette vil fjerne overskydende blod.
- Fastgør embryo / embryoniske hjerte ved hjælp 4% paraformaldehyd (PFA) ved stuetemperatur. Fikseringen afhænger af embryonale alder og væv størrelse. For E9.5 fix embryoet i 2 timer ved stuetemperatur. De sene embryonale embryoer kræve længere fiksering tid, hvilket endda kan forlænges til 24 timer for postnatal hjerte.
ADVARSEL: Paraformaldehyd er giftigt, undgå kontakt med hud, øjne og slimhinder. - Efter fiksering vaskes embryo / hjerte i det godt pladen 48 to gange (10 min hver) med 1x PBS på en pladeryster ved stuetemperatur. Dette fjerner overskydende PFA fra embryo / hjerte. De embryoner derefter videreforarbejdes til hele mount farvning og væv clearing.
3. Hele Mount Farvning
BEMÆRK: Efter PFA fiksering embryoet / hjerte udsættes for hele mount farvning som følger.
- Permeabilisere embryo / hjerte i en 48 brønd-plade ved anvendelse af 1 ml 0,1% PBST i 2 timer på plade ryster ved stuetemperatur.
- Efter permeabilisering, nedsænkes embryo / hjerte i 1 ml blokerende buffer, i 2 timer eller natten over på en pladeryster ved 4 ºC.
- Fordyb embryo / hjerte til endothelcelle-specifikt antistof PECAM (CD31), fortyndet (1: 100) i 0,3 ml blokerende buffer i 48 timer på plade ryster ved 4 ºC.
- Vask embryo / hjerte ved hjælp af PBST 5 gange, 30 min hver ved RT på plade ryster. Dette fjerner den overskydende ikke-specifikke bundne primære antistof fra vævet.
- Fordyb embryo / hjerte i Alexa Fluor 647 ged anti-rotte sekundært antistof, fortyndet (1: 1000) i 1 ml blokerende buffer i 48 timer på plade ryster ved 4 ºC.
- Gentag trin 3.4 til at vaske det sekundære antistof.
- Post-fix embryo / hjerte med 4% PFA i 1 time ved stuetemperatur på pladeryster og vask to gange med PBS 5 min hver.
- Farv embryo / hjerte med den nukleare pletten 4 ', 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) (fortyndet i PBST ved en concentration på 0,01 mg / ml) i 10 min på pladeryster ved stuetemperatur. Følg med to gange vask med PBS af 5 minutter hver.
4. Embryo / hjerte Clearing med Sca l e eller CUBIC Metode
BEMÆRK: Efter hele mount farvning, er fosteret / hjerte udsat for enten Sca le eller CUBIC væv clearing metode. Valget af metode afhænger af vævet størrelse og embryonale alder. For E11.5 eller tidligere alder embryoner, brug Sca l e væv clearing metode, mens den for ældre embryoner eller postnatale hjerter foretrækkes den CUBIC væv clearing metode.
- Scale Tissue Clearing Method
- Inkubér embryo / hjerte med 1 ml Sca l e A2 løsning i et scintillationsglas (indpakket i aluminiumsfolie) med lejlighedsvis forsigtig omrystning (med hånden) i 48 timer ved 4 ° C.
- Efter Sca l e A2 inkubation inkuberes embryo / hjerte med 1 ml Sca l e B4 løsning ved 4 ° C i samme hætteglas med lejlighedsvis forsigtig omrystning for anothendes 48 timer.
- Inkuber embryo / hjerte for en anden 48 timer med 1 ml Sca l e 70 ved 4 ° C med lejlighedsvis forsigtig omrystning. Mount foster ved hjælp 90% glycerol (se afsnit 5.1).
- CUBIC Tissue Clearing Method
- For hele embryo / hjerte CUBIC clearing, fordybe hver embryo / hjerte i 1 ml CUBIC-1 med lejlighedsvis forsigtig omrystning i 48 timer ved 37 ºC 7. Efter 48 timer udskiftes opløsningen med det samme volumen af frisk CUBIC reagens 1, og inkubere prøven i yderligere 48 timer ved 37 ° C med lejlighedsvis omrystning med hånden.
- Vask CUBIC-1 behandlede hjerte / embryo med 1x PBS flere gange ved stuetemperatur med forsigtig rystning med hånden. Dette fjerner det overskydende CUBIC-1 løsning.
- Efter vask ud CUBIC-1 med PBS, fordybe embryoner / hjerter i CUBIC-2 opløsning (1 g pr embryo / hjerte) i 48 timer ved 37 ºC med lejlighedsvis forsigtig omrystning med hånden. Dette følger embryo / hjerte montage ved hjælp af glycerol (se afsnit 5.2).
5. Prøve Montering og Imaging
BEMÆRK: De ryddet embryoner eller organer i Sca l e 70 eller CUBIC-2 løsning kan afbildes direkte med Scale 70 og CUBIC-2 opløsning som det billeddannende medium, hhv. Men i betragtning af sårbarheden af de embryonale prøver clearing reagenser, hvis prøverne ikke skal afbildes straks, men opbevaret langsigtet, opbevare prøverne i 90% glycerol følge protokollen nedenfor.
- Direkte nedsænkes Sca le ryddet prøve i 1 ml 90% glycerol og opbevares ved 4 ° C indtil billeddannelse.
- Vask CUBIC behandlede prøve med 1x PBS to gange, 5 minutter hver og sekventielt inkubere prøven med 1 ml 30%, 50%, 70% og 90% glycerolopløsning hver i 30 minutter.
- Til billeddannelse, overføre prøven til glasbund petriskål med en minimal mængde af 90% glycerol og billed-kloner med et konfokalt mikroskop udstyret med to foton kapaciteter.
- Billede hjertet eller embryo i glycerol med en 10X / 0,3 NA, en 25X / 0.8 NA fordybelse, eller en 40X / 1.2 NA vand korrigerende objektiv. Billede DAPI hjælp 2-foton excitation fra en sammenhængende titan: safir kamæleon laser. Valget af mikroskop og objektivlinsen vil afhænge af formålet med forsøgene, fx til super-opløsning, kunne en lys ark fluorescensmikroskop anvendes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Imaging den ryddet embryonale hjerte
Hvirveldyr hjerte dannelse er en spatiotemporally reguleret morfogen proces og afhænger af organisering og differentiering af stamceller fra fire forskellige kilder 1. Celler fra den første hjerte på hjertets halvmåne vil folde mod den ventrale midterlinjen for at danne en lineær hjerte rør. Cellerne fra den anden hjerte felt, der oprindeligt er bosiddende dorsomedially til det første hjerte felt, efterfølgende translokere til svælg og splanknisk mesoderm, hvorfra de vandrer til den allerede eksisterende stillads af den lineære hjerte røret. Cellerne i andet hjerte område vil bidrage til højre hjertekammer, udstrømning tarmkanalen (OFT) myokardiet og til en vis endocardium 25-28. Hjerte neurale crest-celler (CNCC), der stammer fra postotic rhombomeres 6, 7 og 8, vil migrere til caudale svælget og bidrage signifigrad til den glatte muskulatur lag og endokardiale hynder i OFT. De bidrager også til dannelsen af den aorticopulmonary skillevæggen 29,30. Den fjerde population består af epikardiale celler afledt fra den pro-epikardiale organ (PEO), og bidrager til fibroblaster, glatte muskelceller og potentielt andre hjerte- celletyper 31. Epicardiet regulerer koronar vaskulær udvikling, cardiac vækst og morfogenese 21.
Det vigtigste begreb om hjerte-morfogenese er, at under hjerte udvikling, unormal cellemigration / differentiering af de fire stamceller populationer vil resultere i misdannelser eller medfødte hjertefejl 4,22,32, som er den største årsag til fosterskader i verden . Bestemmelse mekanismerne i hjerte-morfogenese på det cellulære og molekylære niveau er et vigtigt skridt i retning af at forbedre diagnose og potentielle behandlinger for CHDs.Derfor er det kritisk for billedet processen med hjerte morfogenese på hele hjerteniveau med enkelt celle opløsning. For at opnå dette, vi mærkede de cardiomyocytter ved at krydse Cre streg under kontrol af hjerte-specifik troponin T (cTnT), som er specifikt udtrykt i cardiomyocytter 18, med mTmG reporter linje. Embryonerne på E8.5 blev høstet og farvet for PECAM at skelne endokardiale og endotelceller fra cardiomyocytter. Embryonerne blev derefter godkendt af Sca le og hjertet blev afbildet. Myocardium blev mærket ved GFP skyldes cTnT-drevet Cre-medieret rekombination af mTmG reporter, og endokardiet blev mærket med PECAM (figur 1A og supplerende Movie 1). Kardiomyocytterne kan observeres ved en enkelt celle opløsning (figur 1A). Hjertet strukturer af det afbildede del, såsom den primitive ventrikel og OFT klart kan identificeres efter 3D-rekonstruktion ved hjælp 3D rekonstruktion software (figur 1B og supplerende Movie 2).
Imaging enkelte kloner af ryddet embryonale hjerte
Cardiac morfogenese afhænger cardiac afstamning differentiering og individuel celle organisation på hele hjertet niveau 22 og således, er det vigtigt at billedet enkelt kardial progenitorcelle differentiering til forskellige hjerte- celletyper og også billede cellemorfologi på enkelt celle opløsning. For at opnå dette blev Rosa26Cre ERT2 15 krydset med R26R-Confetti 16, og den gravide kvinde blev tvangsfodret med Tamoxifen ved en lav koncentration. Efter 48 timer blev embryo høstet ved E9.5, og hele mount farvet for PECAM, og så er hele hjerte afbildet. Vi fandt, at der kun var en klynge af celler, lokaliseret til OFT, og denne klon havde 8 celler baseret on det rekonstruerede billede og konsekutive sektioner (figur 2A, 2B og supplerende Movie 3), hvilket indikerer, at disse celler er afledt fra en enkelt progenitorcelle. Den cellulære morfologi og cellulære adfærd såsom cellulær proliferation og migrering kan udledes den endelige positionering af cellerne (figur 2A). Vi anvendte også den CUBIC metode at rydde embryoniske hjerte ved E9.5 og E10.5, og fandt, at selv efter kun 24 timers inkubation med reagens 1 blev embryonerne subtilt opløst og vævet struktur blev negativt påvirket (data ikke vist ).
Billeddannelse af blokerede postnatal og sene embryonale hjerter
Vi anvendte både Sca l e og CUBIC at rydde postnatal hjerter. P2 hjerter med genotypen af αMHC-Cre; mTmG (αMHC-Cre udtrykkes specifikt i cardiomyocytter <sup> 17) blev ryddet med Sca l e for 48 timer, men ikke vise nogen mere gennemsigtighed end hjerter behandlet med PBS kun (data ikke vist), hvilket indikerer, at Sca l e clearing ikke er effektiv til postnatal hjerter. Da P2 hjerter blev ryddet med CUBIC reagens 1 for 48 timer, og reagens 2 i 96 timer, de var meget mere gennemsigtige end hjerter ryddet med reagens 1 for 48 timer og reagens 2 for 48 timer. Den billeddannende dybde blev signifikant øget med 96 timers reagens 2 inkubation (Supplerende Film 4 og 5), hvilket indikerer, at længere inkubation med CUBIC reagenser fremmer gennemsigtigheden og giver en stigning i billedbehandling dybde. Formen og størrelsen af hver cardiomyocyte kan identificeres ved membranen lokaliseret GFP (figur 3A), som kan anvendes til at identificere hypertrofi.
Vi ryddet også Nfatc1-Cre; Confetti (Konfetti kvindelige sluttet med Nfatc1Cre mandlige) E17.5 hjerter (Nfatc1-Cre udtrykkes i hjerte-endokardiale celler 19) med CUBIC reagens 1 for 48 timer og reagens 2 for 48 timer. Hjerterne er gennemsigtige, og fluorescerende proteiner, herunder GFP, YFP, den fælles fiskeripolitik og RFP forventedes at mærke de endokardiale celler og deres afledte celler; kunne dog kun GFP og YFP skal afbildes gennem hele hjerte (figur 3B, 3C og supplerende film 6 og 7), og kunne ikke påvises den fælles fiskeripolitik og RFP (data ikke vist). Den farvning for PECAM (Alexia Fluor 647) også kunne ikke påvises (data ikke vist), hvilket tyder på, at den CUBIC reagens slukker den fælles fiskeripolitik, RFP og antistof konjugeret fluoroforen i denne protokol.
Figur 1:. Imaging Sac / e ryddet embryonale hjerte (A) En optiske skive en E8.75 hjerte (cTnT-Cre, mTmG) vises. V: ventrikel; OFT: outflow-tarmkanalen. (B) viser rekonstruerede hjerte struktur af 93 på hinanden følgende optiske skiver med en samlet dybde på 110,4 um. Scale bar = 20 um i A. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Billedbehandling enkelt klon af Sca / e ryddet embryonale hjerte (A) En optisk sektion af en klon fra en E9.5 hjerte med genotypen af ROSA26-Cre ERT2;. ROSA26-Confetti. Pilen peger på en cellulær fremspring af en cardiomyocyte. (B) viser den rekonstruerede klon i OFT region af E9.5 hjerte med 10 optiske skiver og 36 um total dybde. Scale bar = 20 um i A. Klik her for at se en større version af dette tal.
. Figur 3: Imaging CUBIC blokerede postnatal og sene embryonale hjerte (A) viser en optisk snit af en P2 hjerte med genotypen af αMHC-Cre; mTmG; alle de optiske sektioner er vist i supplerende Movie 5. (B) viser en sektion af en E17.5 hjerte med genotypen af Nfatc1-Cre; ROSA26-Konfetti. (C) viser den rekonstruerede hjerte struktur fra 106 optiske skiver med en samlet dybde på 630 um. Skalalinjen = 20 pm i A og er 100 um i B. Klik her for at se en større version af dette tal.
. Supplerende Movie 1: Billedbehandling af Sca le ryddet embryonale hjerte (Højreklik for at downloade) Movie 1 viser optiske sektioner af en Sca le behandlet E8.75 hjerte (cTnT-Cre, mTmG) fra hjerte overflade til hjerte lumen. Dybden er 110,4 um, og der er 93 skiver i alt.
Supplerende Movie 2:. Imaging af Sca le ryddet embryonale hjerte (Højreklik for at downloade) Movie 2 viser 3D overflade billede af det rekonstruerede hjerte i Movie 1, genopbygningented via 3D-rekonstruktion software. Gul markerer PECAM udtryk og grønne etiketter alle cardiomyocytter.
Supplerende Movie 3: Billedbehandling en enkelt klon af Sca le ryddet embryonale hjerte (Højreklik for at downloade). Movie 3 viser sektioner af en klon fra en E9.5 hjerte med genotypen af ROSA26-Cre ERT2.
Supplerende Movie 4: Billedbehandling de CUBIC ryddet postnatale hjerter (Højreklik for at downloade). Movie 4 viser sektioner af en CUBIC behandlet P2 hjerte (& #945; MHC-Cre; mTmG) fra hjertet overflade til hjerte lumen. Denne P2 hjerte blev ryddet med CUBIC reagens 1 for 48 timer, og CUBIC reagens 2 i 96 timer.
Supplerende Movie 5: Billedbehandling de CUBIC ryddet postnatale hjerter (Højreklik for at downloade). Movie 5 viser et hjerte, der blev ryddet med reagens CUBIC 1 for 48 timer og reagens CUBIC 2 for 48 timer. Dybden er 136 um med 6 um pr afsnit i filmen 4 og tykkelsen er 76 um med 6 um pr afsnit i filmen fem.
Supplerende Movie 6: Billedbehandling den CUBIC ryddet sent EmbryONIC hjerte (Højreklik for at downloade) Movie 6 viser sektioner af en CUBIC behandlet E17.5 hjerte (Nfatc1-Cre; ROSA26-Konfetti). fra hjerte overflade til hjerte lumen. Dybden er 630 um med 6 um per afsnit.
Supplerende Movie 7: Billedbehandling den CUBIC ryddet sene embryonale hjerte (Højreklik for at downloade). Movie 7 viser 3D overflade billede af hjertet i Movie 6, rekonstrueret via 3D-rekonstruktion software.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Embryo isolation er en meget kritisk trin. E9.5 embryoer er meget skrøbelige og lille i størrelse, så ekstra pleje skal tages på ikke at beskadige embryo / hjerte strukturer under isolation. De ikke-embryonale ekstra lag omsluttende embryo / hjerte bør fjernes omhyggeligt, især når billeddannelse hele embryo. Dette giver mulighed for blanding antistof og clearing penetration dybt inde i de embryonale væv, og også hjælper med at fjerne baggrunden signal, når billeddannelse. Flere antistoffer, herunder antistoffer mod PECAM, acetyleret α-tubulin og integrin β1 blev undersøgt, og alle lykkedes påvist (data ikke vist) 33. Dette viser, at den molekylære integritet blev cellulær integritet og antigen kompatibilitet ikke forstyrres under denne clearingprocessen.
Overfør embryo / hjerte ved hjælp af en bred mund transfer pipette (klippe spidsen). Herved undgås beskadigelse under håndtering. GFP / YFP / RFP / CFP ekspressionsmønster og nsortjord af kloner bør omhyggeligt registreres i hjertet for at bestemme den passende dosis til at mærke en klon pr hjerte eller andre organer. På grund af den lave dosis af Tamoxifen (10 ug / g), undertiden hjertet indeholder ingen kloner eller er vanskelig at opdage eventuelle kloner. Derfor anbefales det at anvende blommesækken at afgøre, om embryoet har nogen GFP / YFP / RFP / FFP kloner.
Embryonet eller hjerte fiksering er et kritisk trin, som over-fiksering vil resultere i en høj baggrund, mens under-fiksering vil resultere i dårlig farvning. Det anbefales at fiksere E8.5-E10.5 hele embryo i 2 timer ved stuetemperatur på en pladeryster. Mens for E11.5-E15.5 embryoer, anbefalingen er at omhyggeligt isolere hjerte og ordne det med 4% PFA i 2 timer ved stuetemperatur. Efter at have sikret at fjerne lagene omgiver hjertet, hvis behandlingen af hele embryo kan E11.5- E13,5 embryoner også fastsættes for 3-4 timer ved stuetemperatur, men det kræver øget væv clearing tid. Den E16.5-P1 (postnataldag 1) hjerter er fastsat i 3-4 timer ved stuetemperatur på en pladeryster. Ved fastsættelsen hele embryo, bør for- og bagben fjernes, da de hindrer hjerte billeddannelse.
Prøverne skal behandles med CUBIC og Sca le i scintillationsglas at minimere prøve tørring. Vi har observeret bedre rydning af prøverne med CUBIC væv clearing metode ved 37 ° C, mens Sca le clearing er optimalt udført ved 4 ° C. Efter billeddannelse, kan prøverne opbevares kortsigtet i CUBIC-2 eller Sca le 70. Prøverne skal altid være dækket med alufolie for at forhindre fluorescens blegning.
Embryonale væv og organer har mindre lipid og deponering af ekstracellulær matrix, hvilket resulterer i mindre clearing tid. På den anden side, de er mere sårbare over for clearing reagenser. De clearing reagenser kan påvirke integriteten af vævet struktur og antigen, hvilket resulterer i quenching af den fælles fiskeripolitik, RFP og antistof conjugated fluorophor. Derfor kan længere fikseringstidspunkter forhindre quenching. Quenching af de fluorescerende proteiner kan også skyldes deres følsomhed over for kemikalier og pH som tidligere rapporteret 34. Andre kemiske opskrifter, pH, fikseringsmidler, og inkubation længde bør undersøges for at minimere quenching af de fluorescerende proteiner.
Metoden til hele organ transparentizing eller væv clearing har revolutioneret volumetrisk 3D billedbehandling. Den forrige billedbehandling metode til hjerte-morfogenese, som involverede manuel 2D eller 3D-rekonstruktion af serielle snit, er tidskrævende og instrument krævende 5,6. Høj opløsning episcopic mikroskopi (HREM), sammenholdt med 3D-modellering kan anvendes til studiet af morfogenese af muse hjerte og tilvejebringer fremragende anatomisk beskrivelse af det trabekulære arkitektur i udviklingslandene muse embryo 35. Men HREM ikke tillader identifikation af fluorescerent protein mærkede celler eller antistof-farvede celler fra resten af celler 35. Brug den nuværende protokol, med en minimal indsats og høj omkostningseffektivitet, har vi med succes bevaret de fluorescerende signaler i embryonale hjerte hjælp Sca le eller CUBIC væv clearing metoder (Figur 1 - 3). Kombineret med en lav dosis (10 ug / g) af Tamoxifen at inducere Cre rekombinationsbegivenheder og generere et par kloner inden i hele embryoner og i hjertet, kan dette system anvendes til at spore og studere enkelt kardial progenitorcelle differentiering og cellulære adfærd i vivo (figur 2A) 33. Derudover kombineret med Cre-medieret gendeletion eller overekspression og Cre-medieret enkelt celle mærkning, denne billeddannende system kan anvendes til at studere genetiske tab af funktion eller forstærkningen af funktionen på progenitorcelle differentiering og cellulære adfærd under cardiac morfogenese, og tilvejebringer således en robust værktøj til study ætiologien af medfødte hjertefejl.
De to-tissue clearingsystemer Sca / e og CUBIC anvendt i denne undersøgelse viste forskellige clearing effektiviteten, hvilket yderligere adskiller de systemer, baseret på embryonisk alder, væv tykkelse og varigheden af væv clearing tid. For tidligt stadie embryoner E9.5-E10.5, den Sca / e system, ikke kun gjorde vævet klar, men også beskyttet embryo morfologi og bevarede de fluorescerende signaler, mens den CUBIC behandling resulterede i opløsning embryo. Dette kan være resultatet af yderligere aminoalkoholer og en højere koncentration af Triton X-100 i de kubiske opløsninger 8. For ældre hjerter, den Sca / e-system undladt at rydde vævet helt selv med en længere inkubationstid. CUBIC clearing løsning gjorde den ældre væv klar (figur 3). Men øget inkubationstid medførte svagere signaler og kun beskyttede endogene GFP, mens RFP, CFP og antistof konjugeret signalergik tabt. Af denne grund, ville en mere optimeret opskrift af clearing reagenser og bedre inkubationstid være forpligtet til at volumetrisk billede hjerter eller organer med en større spektrum af fluorescerende markører.
Denne undersøgelse viste, at man kan mærke, spor, og image enkelt kardiale kloner i kombination med en hel mount farvning af endokardiale / endotelcelle markør PECAM af det udviklende hjerte. Hele mount farvning af PECAM og DAPI i dette system hjælper ikke blot at identificere celletyper og cellemorfologi af de mærkede celler inde i et hjerte, men giver også mulighed for studiet af den klonale mønster, migration og adfærd under kardial morfogenese. I figur 2A observerede vi en klon med 8 celler i OFT. Under anvendelse af antallet af celler til stede i denne klon med henvisning til mærkning tid, kan cellen proliferationshastighed let beregnes. I en anden undersøgelse ved anvendelse af denne samme system identificerede vi den orienterede celledeling mønster og migration mønster af enkelt cardiomyocyte under trabeculation proces 33. Anvendelsen af denne protokol til at undersøge virkningerne af genetisk tab af funktion eller gevinst på funktion spatiotemporally på det mærkede cardiac stamcelle differentiering, klonal mønster og cellulære adfærd er mulig, og vil hjælpe med undersøgelser af ætiologien af medfødte hjertefejl på genetiske og molekylært niveau i en 3D sammenhæng. Derudover kan denne protokol anvendes til at studere af morfogenese i andre organsystemer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,2′,2′’-nitrilotriethanol | Sigma Aldrich | 90279 | |
| 4% Paraformaldehyde in PBS | Affymetrix | 19943 | |
| BSA | Fischer Scientific | BP16000 | |
| N,N,N’,N’-tetrakis(2-hydroxypropyl) ethylenediamine | Sigma Aldrich | 122262 | |
| Phosphate Buffer Saline | Sigma Aldrich | P5368-10PAK | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U-1250 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | 84097 | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G8773 | |
| Tamoxifen | Sigma Aldrich | T5648 | |
| Sunflower seed oil | Sigma Aldrich | S5007 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
| PECAM (CD31) | BD Pharmingen | 550274 | |
| Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21247 | |
| DAPI nuclear stain | Sigma Aldrich | D9542 | |
| 37oC Incubator | Thermoscientific Fischer | Heratherm, Compact Microbiological Incubators | |
| 48 well plates | Cell Treat | 229148 | |
| Analytical Balance | Metler Toledo | PB153-S/FACT | |
| Confocal microscope | Zeiss | Zeiss 510 confocal microscope | |
| Disecting Microscope | Unitron | Z850 | |
| Fluorescent microscope | Zeiss | Observer. Z1 | |
| Germinator 500 Glass Bead Sterilizer | CellPoint Scientific | GER-5287-120V | |
| Light Source | SCHOTT | ACE I | |
| Pair of Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Petri dish 60 mm x15 mm | TPP Techno Plastic Products AG | 93060 | |
| Rocker II Platform Rocker | Boekel Scientific | 260350 | |
| Scintillating tubes | Fischer Scientific | 03-337-26 | |
| Transfer pipette | Samco Scientific | 202 | |
| Tweezers | Fine Science Tools | 11251-20 |
References
- Vincent, S. D., Buckingham, M. E. How to make a heart: the origin and regulation of cardiac progenitor cells. Curr Top Dev Biol. 90, 1-41 (2010).
- Olson, E. N. A decade of discoveries in cardiac biology. Nat Med. 10, 467-474 (2004).
- Olson, E. N. Gene regulatory networks in the evolution and development of the heart. Science. 313, 1922-1927 (2006).
- Bruneau, B. G. The developmental genetics of congenital heart disease. Nature. 451, 943-948 (2008).
- Mohun, T. J., Weninger, W. J. Embedding embryos for high-resolution episcopic microscopy (HREM). Cold Spring Harb Protoc. , 678-680 (2012).
- Soufan, A. T., et al. Three-dimensional reconstruction of gene expression patterns during cardiac development. Physiol Genomics. 13, 187-195 (2003).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W.
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157, 726-739 (2014).
- Becker, K., Jahrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains. PLoS One. 7, e33916 (2012).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158, 945-958 (2014).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
- Badea, T. C., Wang, Y., Nathans, J. A noninvasive genetic/pharmacologic strategy for visualizing cell morphology and clonal relationships in the mouse. J Neurosci. 23, 2314-2322 (2003).
- Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450, 56-62 (2007).
- Agah, R., et al. Gene recombination in postmitotic cells. Targeted expression of Cre recombinase provokes cardiac-restricted, site-specific rearrangement in adult ventricular muscle in vivo. J Clin Invest. 100, 169-179 (1997).
- Jiao, K., et al. An essential role of Bmp4 in the atrioventricular septation of the mouse heart. Genes Dev. 17, 2362-2367 (2003).
- Wu, B., et al. Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling. Cell. 151, 1083-1096 (2012).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
- Wu, M., et al. Epicardial spindle orientation controls cell entry into the myocardium. Dev Cell. 19, 114-125 (2010).
- Zhao, C., et al. Numb family proteins are essential for cardiac morphogenesis and progenitor differentiation. Development. 141, 281-295 (2014).
- Kaufman, M. H., Kaufman, M. H. The atlas of mouse development. , Academic Press. London. (1992).
- Nagy, A. Manipulating the mouse embryo : a laboratory manual. , 3rd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2003).
- Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nat Rev Genet. 6, 826-835 (2005).
- Kelly, R. G., Buckingham, M. E. The anterior heart-forming field: voyage to the arterial pole of the heart. Trends Genet. 18, 210-216 (2002).
- Verzi, M. P., McCulley, D. J., De Val, S., Dodou, E., Black, B. L. The right ventricle, outflow tract, and ventricular septum comprise a restricted expression domain within the secondary/anterior heart field. Dev Biol. 287, 134-145 (2005).
- Ward, C., Stadt, H., Hutson, M., Kirby, M. L. Ablation of the secondary heart field leads to tetralogy of Fallot and pulmonary atresia. Dev Biol. 284, 72-83 (2005).
- Echelard, Y., Vassileva, G., McMahon, A. P. Cis-acting regulatory sequences governing Wnt-1 expression in the developing mouse CNS. Development. 120, 2213-2224 (1994).
- Jiang, X., Rowitch, D. H., Soriano, P., McMahon, A. P., Sucov, H. M.
- Viragh, S., Challice, C. E. The origin of the epicardium and the embryonic myocardial circulation in the mouse. Anat Rec. 201, 157-168 (1981).
- Wu, M., Li, J. Numb family proteins: novel players in cardiac morphogenesis and cardiac progenitor cell differentiation. Biomolecular concepts. 6, 137-148 (2015).
- Li, J., et al. Single-Cell Lineage Tracing Reveals that Oriented Cell Division Contributes to Trabecular Morphogenesis and Regional Specification. Cell reports. 15, 158-170 (2016).
- Alkaabi, K. M., Yafea, A., Ashraf, S. S. Effect of pH on thermal- and chemical-induced denaturation of GFP. Appl Biochem Biotechnol. 126, 149-156 (2005).
- Captur, G., et al. Morphogenesis of myocardial trabeculae in the mouse embryo. J Anat. , (2016).
