Abstract
Enda klon spårning och analys på hela-heart nivå kan bestämma hjärt stamceller beteende och differentiering under hjärt utveckling, och göra det möjligt att studera cellulära och molekylära grunden för normal och onormal hjärt morfogenes. Nyligen framväxande teknologier retrospektiva enstaka klon analyser gör studiet av hjärt morfogenes i en enda cell upplösning möjligt. Dock är vävnads opacitet och ljusspridning av hjärtat som bilddjupet ökade hinder hel-hjärta avbildning på en enda cell upplösning. För att övervinna dessa hinder, en hel-embryo clearingsystem som kan göra hjärtat mycket transparent för både belysning och detektering måste utvecklas. Lyckligtvis i de senaste åren, många metoder för hela organismclearingsystem såsom klarhet, Sca le, SeeDB, ClearT, 3DISCO, kubisk, DBE, BABB och PACT har rapporterats. Denna labb är intresserad av de cellulära och molekylära mekanismer av kortiac morfogenes. Nyligen har vi etablerat enda cellinje spårning via ROSA26-Cre ERT2, ROSA26-Confetti systemet glest etikett celler under hjärt utveckling. Vi anpassade flera hela embryo-clearing metoder inklusive Sca le och kubiska (obehindrad hjärnavbildnings cocktails och beräknings analys) för att rensa embryot i kombination med hela montera färgning till bild enskilda kloner inne i hjärtat. Hjärtat lyckades avbildas på en enda cell upplösning. Vi fann att Sca le kan rensa embryonala hjärta, men kan inte på ett effektivt sätt rensa postnatal hjärta, medan CUBIC kan rensa postnatal hjärta, men skadar embryonala hjärta genom att lösa vävnaden. De metoder som beskrivs här kommer att tillåta studien av genfunktion vid en enda klon upplösning under hjärt morfogenes, vilket i sin tur, kan avslöja den cellulära och molekylära grunden för medfött hjärtfel.
Introduction
Cardiac morfogenes är en sekventiell händelse som kräver Spatiotemporal organisation av fyra olika typer av hjärt stamceller i olika sektorer av hjärtat, och kräver också flera genetiska regulatoriska nätverk för att iscensätta denna process för att bilda den funktionella hjärta 1,2. Hjärt specifikation, differentiering, mönstring och kammar mognad regleras av kardiogena transkriptionsfaktorer 3. Genetisk mutation eller posttranskriptionell aberration av dessa faktorer i hjärt progenitorceller kan leda till antingen embryonal dödlighet eller medfött hjärtfel (CHD) 4. Studiet av hjärt morfogenes kräver en förståelse av inneboende strukturella detaljer i tre dimensioner (3D) och enkelmärkt hjärt stamceller härstamning spårning under hjärt utveckling kommer att främja förståelsen av hjärt morfogenes. Ett antal högupplösta avsnitt baserad tomografi metoder har utvecklats i the senaste decennierna till bildorganstruktur 5,6; Men dessa metoder kräver dyra specialinstrument, omfattande arbete, och saknar detaljerade organisationsstruktur på en enda cell upplösning i den slutliga volymetriska rekonstruerade bild 7,8.
3D volymröntgen vid den enda cellnivå ger en möjlighet att studera stamceller differentiering och cellbeteende in vivo 7. Men fortfarande vävnad ljusspridning det främsta hindret för avbildning celler och strukturer i 3D djupt inne i intakta hjärtat. Lipider är en viktig källa till ljusspridning, och avlägsnandet av lipider och / eller justering av brytningsindexskillnaden mellan lipider och deras omgivning är potentiella metoder för att öka vävnads insyn 8. Under de senaste åren har ett antal vävnads clearing metoder utvecklats, som minskar vävnads opacitet och ljusspridning, som BABB (bensylalkohol och bensyl benzoate blandning) och DBE (tetrahydrofiiran och dibenzylether); men i dessa metoder, förblir fluorescensutsläckning ett problem 8-10. Den lösningsmedelsbaserade hydrofila metoder, såsom SeeDB (fruktos / tioglycerol) och 3DISCO (diklormetan / dibenzylether), bevara fluorescerande signaler, men inte göra hela organ transparent 7,8,11. I jämförelse, gör CLARITY vävnads clearing metod orgeln transparent, men det kräver en specialiserad elektroforesanordning för att avlägsna lipider 8,12, liksom PACT (passiv klarhet teknik), vilket också kräver hydrogel inbäddning 7,13. För detaljerad information om alla tillgängliga vävnads clearing metoder, se tabell 1 i Richardson och Lichtman, et al. 7.
Under 2011, Hama et al. Serendipitously upptäckte en hydrofil blandning "Sca le" (urea, glycerol och Triton X-100 blandning) som gör mushjärna och embryo transparensent medan fullständigt bevara fluorescerande signaler från märkta kloner 14. Detta gör det möjligt för avbildning av den intakta hjärnan på ett djup av flera millimeter och storskalig återuppbyggnad av neuronala populationer och prognoser på en subcellulär upplösning. Susaki et al. ytterligare förbättrad Sca le genom att lägga aminoalkoholer och utvecklat 'cubic' (obehindrad hjärnavbildnings cocktails och beräknings analys) vävnad clearing metod, som ökade fosfolipid solubilisering, minskad clearing tid, och fick för multi fluorescerande avbildning 8. I den aktuella studien var att dra nytta av Sca le och kubisk vävnads clearing tekniker och hög upplösning 3D optisk sektionering, individuella kloner i hjärtat under kardiogenes spåras med hjälp av Rosa26Cre ERT2 15, R26R-Confetti 16, αMHC-Cre 17 cTnT-Cre 18, Nfatc1-Cre 19, och ROSA26-mTmG (mTmG) 20 mus linjer. Kombinationen av hela berget färgning (WMS) som utvecklats tidigare 21,22 med vävnadsclearingmetoder ytterligare tillåtna för färgning av andra proteiner i märkta kloner och för att studera deras beteende i en 3D volyme sammanhang. Kombinationen av vävnad clearing och WMS möjliggör en bättre förståelse av de roller olika gener och proteiner under hjärt utveckling och etiologin av medfödda hjärtfel. Detta protokoll kan tillämpas för att studera andra progenitor celldifferentiering, cellbeteende, och organ morphogenesis händelser under utvecklingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) vid Albany Medical College och utfördes enligt NIH Guide för skötsel och användning av försöksdjur.
1. Solution Preparat
OBS! Rosa26Cre ERT2 15, R26R-Confetti 16, αMHC-Cre 17, och ROSA26-mTmG (mTmG) 20 mus linjer köptes kommersiellt cTnT-Cre 18 var en gåva från Dr. Jiao vid University of Alabama Nfatc1-Cre.. var en gåva från Dr. Bin Zhou vid Albert Einstein College of Medicine 19. Möss avlivades genom inhalation av koldioxid i en sluten kammare under minst 60 sekunder följt av fysiska medel döds kontroll genom bilaterala torakotomi, halshuggning eller halsdislokation.
- Förbereda Tamoxifen. Lös 10 mg tamoxifen i 10 ml av solrosfrö oil. När det väl är helt upplöst, alikvot och förvara vid -20 ° C.
- Förbereda fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Upplösa Na 2 HPO 4 (1,41960 g), KH 2 PO 4 (0,24496 g), NaCl (8,0669 g) och KCl (0,20129 g) i 1 L destillerat vatten och justera pH till 7,4.
- Förbereda PBST: 0,1% Tween-20-lösning i PBS genom att lösa upp 100 ul av Tween-20 i 100 ml PBS.
- Förbereda blockeringsbuffert. Göra 3% bovint serumalbumin (BSA) blockeringslösning genom upplösning av 3 g av BSA i 100 ml PBST innehållande 0,2% Tween-20.
- Förbereda CUBIC-1 (reagens 1). Blanda 25 vikt-% urea, 25 vikt% N, N, N ', N'-tetrakis (2-hydroxipropyl) etylendiamin och 15 vikt-% Triton X-100 i dH2O
- Förbereda CUBIC-2 (reagens 2). Blanda 50 vikt-% sackaros, 25 vikt-% urea, 10 vikt% 2, 2 ', 2' '- nitrilotriethanol och 0,1% (volym / volym) Triton X-100 i dH2O
- Förbereda Sca le A2: 4 M urea, 10% vikt / volym glycerol och 0,1% vikt / vol Triton X-100 i dH 2 O. Justera pH till 7,7.
- Förbereda Sca le B4: 8 M urea och 0,1% vikt / volym Triton X-100 i dH2O Justera pH till 8,7.
- Förbereda Sca le 70: 4 M urea, 70% vikt / volym glycerol och 0,1% vikt / volym Triton X-100 i dH2O
2. Tamoxifen Induktion, Embryo Isolering och Fixering
- Tamoxifen Induktion och Embrvoisolering
- Med hjälp av en krökt matningsrör godkänt protokoll (ACUP 13-12.007), sondmatning de kvinnliga R26Cre ERT2 Konfetti möss (inkopplad av R26Cre ERT2 hanmöss) med 10 mikrogram / g Tamoxifen på embryonala utvecklings dag E7.75 33. Vid embryonala dag 9,5 (E9.5) eller E10.5, avliva honmöss med CO2 och halsdislokation.
- Efter kontroll av döds mus (se avsnitt 1 Obs) öppnar musen bukhålan med sax och dissekera ut livmoderhornet, ta bort livmoder röret skikten med hjälp av sax och pincett, och återleasa embryon från livmoderröret 23,24.
- Överföra embryon till en petriskål innehållande PBS (pH 7,4). Enligt dissekera mikroskop, ta bort icke-embryonala skikten (chorion, gulesäcken och amnion) med hjälp av pincett.
- Använda pincett och sax, samla kvinnliga mus och embryo svans genotypningsprov som tidigare rapporterats 22. Med användning av en plastpipett, överföra varje embryo till en brunn i en 48 brunnars platta innehållande 1 ml av 1 x PBS.
- Under ett fluorescerande mikroskop, identifiera de GFP / RFP / GFP positiva embryon via ett inverterat mikroskop med en kamera. Skala bort hjärtsäcken med pincett och rotera hjärtat / embryo med hjälp av böjda pincett för att bestämma antalet fluorescerande kloner på båda sidor av hjärtat med GFP / RFP / GFP filter. Det behövs inga nedskärningar.
- Efter att ha identifierat GFP / RFP / GFP positiva embryon snabbt tvätta embryona två gånger (2 min vardera) med 1x PBS i the 48 väl plattan på en tallrik shaker vid rumstemperatur (RT). Detta kommer att ta bort överskott av blod.
- Fäst embryo / embryonala hjärtat med hjälp av 4% paraformaldehyd (PFA) vid RT. Fixeringen Tiden beror på embryonala ålder och vävnads storlek. För E9.5 fixa embryot under 2 h vid RT. Den sena embryonala skede embryon kräver längre fixering tid, som även kan förlängas till 24 timmar för postnatal hjärta.
VARNING: Paraformaldehyd är giftigt, undvika kontakt med hud, ögon och slemhinnor. - Efter fixering, tvätta embryo / hjärta i 48 väl platta två gånger (10 min vardera) med 1x PBS på en tallrik shaker vid RT. Detta tar bort överskottet PFA från embryot / hjärta. Embryona sedan bearbetas vidare för hela berget färgning och vävnads clearing.
3. Hela Mount Färgning
OBS: Efter PFA fixering embryot / heart utsätts för hela berget färgning enligt följande.
- Permeabilize embryot / hjärta i en 48 väl plattan med en ml av 0,1% PBST under 2 h på plattskakanordning vid RT.
- Efter permeabilization, sänk embryot / hjärta i 1 ml blockeringsbuffert, under 2 timmar eller över natten på en tallrik shaker vid 4 ° C.
- Sänk embryot / hjärta till endotelcell-specifik antikropp PECAM (CD31), efter utspädning (1: 100) i 0,3 ml blockeringsbuffert under 48 timmar på tallriken shaker vid 4 ° C.
- Tvätta embryo / hjärtat med hjälp av PBST 5 gånger, 30 minuter vardera vid RT på tallriken shaker. Detta tar bort överskottet av icke-specifik bunden primär antikropp från vävnaden.
- Sänk embryot / hjärta i Alexa Fluor 647 get anti-råtta sekundär antikropp, utspädd (1: 1000) i 1 ml blockerande buffert under 48 timmar på tallriken shaker vid 4 ° C.
- Upprepa steg 3,4 för att tvätta den sekundära antikroppen.
- Post-fix embryot / hjärta med 4% PFA under 1 h vid RT på tallriken shaker och tvätta två gånger med PBS 5 minuter vardera.
- Färga embryo / hjärta med kärn fläcken 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) (utspätt i PBST vid en concentranson av 0,01 mg / ml) under 10 min på plattskakanordning vid RT. Följ med två PBS tvättar av 5 minuter vardera.
4. Embryo / heart Clearing med Sca l e eller kubisk metod
OBS: Efter hela montera färgning, är embryot / hjärta utsätts för antingen Sca le eller kubisk vävnadsclearing metod. Valet av metod beror på vävnadsstorleken och embryonal ålder. För E11.5 eller tidigare ålder embryon, användning Sca l e vävnad clearing metod, medan det för äldre embryon eller postnatal hjärtan kubisk vävnadsclearing metoden är att föredra.
- Skala Tissue Clearing Metod
- Inkubera embryot / hjärta med 1 ml Sca l e A2 lösning i en scintillationsflaska (inslagna i aluminiumfolie) med tillfällig försiktig skakning (för hand) under 48 timmar vid 4 ° C.
- Efter Sca l e A2 inkubation, inkubera embryot / hjärta med en ml Sca l e B4 lösning vid 4 ° C i samma flaska med tillfällig försiktig skakning under ANOThennes 48 h.
- Inkubera embryot / hjärta för en annan 48 h med 1 ml Sca l e 70 vid 4 ° C med tillfällig försiktig skakning. Mount embryo med hjälp av 90% glycerol (se avsnitt 5.1).
- CUBIC Tissue Clearing Metod
- För hela embryo / hjärta CUBIC clearing, sänk varje embryo / hjärta i 1 ml av kubiska-en med tillfällig försiktig skakning under 48 timmar vid 37 ° C 7. Efter 48 timmar, byta ut lösningen med samma volym färsk CUBIC reagens 1 och inkubera provet under ytterligare 48 timmar vid 37 ° C med tillfällig skakning med handen.
- Tvätta CUBIC-1 behandlade hjärta / embryo med 1x PBS flera gånger vid rumstemperatur med försiktig skakning med handen. Detta tar bort överskott av CUBIC-1-lösning.
- Efter tvättning ut CUBIC-1 med PBS, sänk embryona / hjärtan i CUBIC-2-lösning (1 g per embryo / hjärta) under 48 timmar vid 37 ° C med tillfällig försiktig skakning med handen. Detta följer embryo / hjärta montering med hjälp av glycerol (se avsnitt 50,2).
5. Prov Montering och Imaging
OBS: De raderade embryon eller organ i Sca l e 70 eller kubisk-2 lösning kan avbildas direkt med Scale 70 och CUBIC-2 lösning som bildmedium, respektive. Men med tanke på sårbarheten i de embryonala prover till clearing reagens, om proverna inte avbildas direkt, men lagras långsiktigt lagra prover i 90% glycerol efter protokollet nedan.
- Direkt nedsänka Sca le rensas provet i 1 ml 90% glycerol och förvaras vid 4 ° C tills avbildning.
- Tvätta CUBIC behandlade provet med 1 x PBS två gånger, 5 min vardera och sekventiellt inkubera provet med 1 ml 30%, 50%, 70% och 90% glycerollösning varje för 30 min.
- För avbildning, överföra provet till glaset botten petriskål med en minimal mängd av 90% glycerol och bild kloner med ett konfokalt mikroskop utrustat med två foton kapacitet.
- Bild hjärtat eller embryo i glycerol med en 10X / 0.3 NA 25x / 0.8 NA nedsänkning, eller en 40X / 1.2 NA vatten korrigerande objektiv. Bild DAPI användning av 2-foton-excitation från en sammanhängande titan: safir kameleont laser. Valet av mikroskop och objektivlinsen kommer att bero på syftet med experimenten, t.ex. för superupplösning, kan ett ljus ark fluorescerande mikroskop utnyttjas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Avbildning av rensas embryonala hjärta
Ryggradsdjur hjärta bildning är en spatiotemporally regleras morfogen process och beror på organisation och differentiering av stamceller från fyra olika källor 1. Celler från den första hjärtområdet hjärt månskäran kommer att lägga sig mot den ventrala mittlinjen för att bilda en linjär hjärta tub. Cellerna från den andra hjärtområdet, som ursprungligen är bosatta dorsomedially till den första hjärt fältet, därefter translokera till svalg och splanchnicus mesoderm, varifrån de migrera till den tidigare existerande byggnadsställning av den linjära hjärta tub. Cellerna i andra hjärtområdet kommer att bidra till den högra ventrikeln, utflöde (OFT) hjärtmuskeln och i viss endokardium 25-28. Hjärt neurallist-celler (CNCC), med ursprung från postotic rhombomeres 6, 7 och 8, kommer att migrera till den näst sista svalget och bidra signifiligt till den glatta muskulaturen skiktet och endokardiella kuddar i OFT. De bidrar också till bildandet av aorticopulmonary septum 29,30. Den fjärde befolkning består av epikardiella celler som härrör från pro-epikardiella organ (PEO), och bidrar till fibroblaster, glatta muskelceller och eventuellt andra hjärtcelltyper 31. Epikardium reglerar koronar vaskulär utveckling, hjärttillväxt och morfogenes 21.
Det viktigaste konceptet om hjärt morfogenes är att under hjärta utveckling, onormal cellmigration / differentiering av fyra stamcellspopulationer resulterar i missbildningar eller medfött hjärtfel 4,22,32, vilket är den främsta orsaken till fosterskador i världen . Fastställande mekanismerna för hjärt morfogenes på cellulär och molekylär nivå är ett viktigt steg mot att förbättra diagnos och potentiella behandlingar för CHDs.Därför är det viktigt att bilden processen av hjärt morfogenes i hela hjärtat i nivå med en enda cell upplösning. För att uppnå detta, märkt vi kardiomyocyter genom att korsa Cre linje under kontroll av hjärt specifik troponin T (cTnT), som specifikt uttrycks i kardiomyocyter 18, med mTmG reporter linje. De embryon vid E8.5 skördades och färgades för PECAM att skilja endokardiell och endotelceller från kardiomyocyter. Embryona därefter rensas av Sca le och hjärtat avbildades. Hjärtmuskeln märktes genom GFP grund av cTnT drivna Cre-medierad rekombination av mTmG reporter och endokardiet märktes med PECAM (figur 1A och kompletterande Movie 1). Kardiomyocyterna kan observeras vid en enda cell upplösning (Figur 1A). Hjärt strukturer avbildas delen, såsom den primitiva ventrikeln och OFT tydligt kan identifieras efter 3D-rekonstruktion med hjälp av 3D-rekonstruktion programvara (Figur 1B och kompletterande Movie 2).
Imaging enskilda kloner av rensas embryonala hjärta
Hjärt morfogenes beror på hjärt härstamning differentiering och enskild cell organisation på hela hjärtat nivå 22, och därför är det viktigt att bilden enda hjärt stamceller differentiering till olika hjärtcelltyper och även bild cellmorfologi på en enda cell upplösning. För att uppnå detta, var Rosa26Cre ERT2 15 korsade till R26R-Confetti 16, och den gravida honan sondmatades med tamoxifen vid en låg koncentration. Efter 48 timmar var embryot skördades vid E9.5, och hela berget färgas för PECAM, och sedan hela hjärtat avbildades. Vi fann att det fanns bara ett kluster av celler, lokaliserade till OFT, och denna klon hade 8 celler baserade on rekonstruerade bilden och på varandra följande sektioner (figurerna 2A, 2B och kompletterande Movie 3), vilket indikerar att dessa celler härrör från en enda ursprungscell. Det cellulära morfologi och cellbeteende såsom celldelning och migration kan härledas från den slutliga placeringen av cellerna (Figur 2A). Vi tillämpade också CUBIC metod för att rensa embryonala hjärta på E9.5 och E10.5, och fann att även efter bara 24 timmar av inkubation med reagens 1 var embryona subtilt upplöst och vävnadsstrukturen påverkades negativt (Data visas inte ).
Avbildning av rensas postnatal och sena embryonala hjärtan
Vi tillämpas både Sca l e och CUBIC att rensa postnatal hjärtan. P2 hjärtan med genotyp αMHC-Cre; mTmG (αMHC-Cre är specifikt uttryckt i kardiomyocyter <sup> 17) godkändes med Sca l e under 48 timmar, men inte visa någon större öppenhet än hjärtan som behandlats med PBS enbart (data visas ej), vilket tyder på att Sca l e clearing är inte effektiv för postnatal hjärtan. När P2 hjärtan rensades med cubic reagens 1 för 48 timmar, och reagens 2 för 96 timmar, de var mycket mer transparent än hjärtan rensas med reagens 1 under 48 timmar och reagens 2 under 48 timmar. Den bilddjupet ökade signifikant med 96 timmar av reagens 2 inkubation (Kompletterande filmer 4 och 5), vilket tyder på att längre inkubation med den kubiska reagenser främjar transparens och ger en ökning av bilddjupet. Formen och storleken av varje cardiomyocyte kan identifieras genom membranet lokaliserad GFP (figur 3A), som kan användas för att identifiera hypertrofi.
Vi rensade också Nfatc1-Cre, konfetti (Confetti hona ansluten med Nfatc1Cre manliga) E17.5 hjärtan (Nfatc1-Cre uttrycks i hjärt endokardiell celler 19) med cubic reagens 1 under 48 timmar och reagens 2 under 48 timmar. Hjärtan är transparenta och fluorescerande proteiner inklusive GFP, YFP, GFP och RFP förväntades märka endokardiell celler och deras härledda celler; kunde dock endast GFP och YFP avbildas genom hela hjärtat (figurerna 3B, 3C och tilläggs filmer 6 och 7), och den gemensamma fiskeripolitiken och RFP kunde inte detekteras (data visas ej). Färgningen för PECAM (Alexia Fluor 647) också kunde inte detekteras (data visas ej), vilket tyder på att CUBIC reagens släcker GFP, RFP och antikroppen konjugerad fluoroforen i detta protokoll.
Figur 1:. Imaging Sac / e rensas embryonala hjärta (A) En optisk skiva av en E8.75 hjärta (cTnT-Cre, mTmG) visas. V: ventrikel; OFT: utflöde. (B) visar den rekonstruerade hjärtstruktur 93 på varandra följande optiska skivor med ett totalt djup av 110,4 pm. Skalstreck = 20 | im i A. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Imaging enda klon av SCA / e rensas embryonala hjärta (A) En optisk del av en klon från en E9.5 hjärta med genotyp ROSA26-Cre ERT2;. ROSA26-konfetti. Pilen pekar på en cellulär utsprång av en cardiomyocyte. (B) visar den rekonstruerade klon i OFT regionen av E9.5 hjärtat med 10 optiska skivor och 36 um totalt djup. Skalstreck = 20 | im i A. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
. Figur 3: Bildåtergivning CUBIC rensas postnatal och sena embryonala hjärtan (a) visar en optisk sektion av en P2 hjärta med genotypen för αMHC-Cre; mTmG; alla optiska sektioner visas i Kompletterande Movie 5. (B) visar en sektion av en E17.5 hjärta med genotypen för Nfatc1-Cre; ROSA26-konfetti. (C) visar den rekonstruerade hjärtstrukturen från 106 optiska skivor med ett totalt djup av 630 nm. Skala bar = 20 um i A och är 100 nm i B. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
. Kompletterande Movie 1: Imaging Sca le rensas embryonala hjärta (Högerklicka för att ladda ner) Film 1 visar optiska sektioner av en Sca le behandlas E8.75 hjärta (cTnT-Cre, mTmG) från hjärtat yta till hjärt lumen. Djupet är 110,4 pm och det finns 93 skivor totalt.
Kompletterande Movie 2:. Imaging Sca le rensas embryonala hjärta (Högerklicka för att ladda ner) Film 2 visar 3D-yta bild av den rekonstruerade hjärtat i Movie 1, återuppted via 3D-rekonstruktion programvara. Gula markerar PECAM uttryck och gröna etiketter alla cardiomyocytes.
Kompletterande Movie 3: Bildåtergivning en enda klon av Sca le rensas embryonala hjärta (Högerklicka för att ladda ner). Movie 3 visar sektioner av en klon från en E9.5 hjärta med genotyp ROSA26-Cre ERT2.
Kompletterande Movie 4: Imaging den kubiska rensas postnatal hjärtan (Högerklicka för att ladda ner). Movie 4 visar delar av en kubisk behandlas P2 hjärta (& #945; MHC-Cre, mTmG) från hjärtat yta till hjärt lumen. Denna P2 hjärta rensades med cubic reagens 1 för 48 timmar, och kubisk reagens 2 för 96 timmar.
Kompletterande Movie 5: Imaging den kubiska rensas postnatal hjärtan (Högerklicka för att ladda ner). Movie 5 visar ett hjärta som rensades med reagens CUBIC en under 48 timmar och reagens CUBIC 2 under 48 timmar. Djupet är 136 pm med 6 pm per avsnitt i filmen 4 och tjockleken är 76 pm med 6 pm per avsnitt i filmen 5.
Kompletterande Movie 6: Imaging CUBIC rensas sen EmbryONIC hjärta (Högerklicka för att ladda ner) Film 6 visar delar av en kubisk behandlas E17.5 hjärta (Nfatc1-Cre, ROSA26-Confetti). från hjärtat yta till hjärta lumen. Djupet är 630 pm med 6 pm per avsnitt.
Kompletterande Movie 7: Imaging CUBIC rensas sent embryonala hjärta (Högerklicka för att ladda ner). Movie 7 visar 3D-yta bild av hjärtat i filmen 6, rekonstrueras via 3D-rekonstruktion programvara.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Embryot isolering är ett mycket viktigt steg. E9.5 embryon är mycket bräcklig och små i storlek, så extra försiktighet bör iakttas inte skada embryot / hjärtstrukturer under isolering. De icke-embryonala extra lager omsluter embryot / hjärta ska tas bort noggrant, särskilt när avbildning av hela embryot. Detta möjliggör antikropp och clearing blandning penetration djupt inne i embryonala vävnader, och även hjälper till att ta bort bakgrundssignal när avbildning. Flera antikroppar inklusive antikroppar mot PECAM, acetylerade α-tubulin och grin β1 undersöktes och alla var framgångsrikt detekteras (data visas ej) 33. Detta visar att den molekylära integritet, var cellulär integritet och antigen kompatibilitet inte störs under clearingprocessen.
Överför embryo / hjärtat med hjälp av en bred mun pipett (skär spetsen). Detta undviker skador under hantering. GFP / YFP / RFP / CFP uttrycksmönster och numbra av kloner bör noga registreras i hjärtat att bestämma lämplig dos för att märka en klon per hjärta eller andra organ. Grund av den låga dosen av Tamoxifen (10 | j, g / g), ibland hjärtat inte innehåller några kloner eller är svår att upptäcka eventuella kloner. Därför är det rekommenderat att använda gulesäcken för att avgöra om embryot har några GFP / YFP / RFP / GFP-kloner.
Embryot eller hjärtfixering är ett kritiskt steg, som över fixering resulterar i en hög bakgrunden medan under fixering resulterar i dålig färgning. Det rekommenderas att fixera E8.5-E10.5 hela embryo under 2 h vid RT på en tallrik shaker. Även för E11.5-E15.5 embryon, är rekommendationen att noggrant isolera hjärtat och fixera den med 4% PFA under 2 h vid RT. När du har kontrollerat att ta bort lager som omger hjärtat om att bearbeta hela embryot, kan E11.5- E13.5 embryon också fastställas för 3-4 timmar vid rumstemperatur, men som kräver ökad vävnad clearing tid. Den E16.5-P1 (födseldag 1) hjärtan fastställs för 3-4 timmar vid RT på en tallrik shaker. Vid fastställandet hela embryot, bör i förgrunden och bakbenen tas bort eftersom de hindrar hjärtat avbildning.
Proverna ska behandlas med cubic och Sca le i scintillationskärl för att minimera provtorkning. Vi har observerat bättre clearing av prover med kubisk vävnads clearing metoden vid 37 ° C, medan Sca le clearing optimalt sker vid 4 ° C. Efter bildbehandling, kan proverna förvaras kortsiktig CUBIC-2 eller Sca le 70. Proverna ska alltid täckas med aluminiumfolie för att förhindra fluorescens blekning.
Embryonala vävnader och organ har mindre lipid och extracellulär matrixdeposition, vilket resulterar i mindre avfärgningstiden. Å andra sidan, de är mer sårbara för clearing reagens. Clearing reagens kan påverka integriteten av vävnadsstruktur och antigen, vilket resulterar i släckning av GFP, RFP och antikropps conjugated fluorofor. Därför kan längre fixering gånger förhindra släckning. Släckningen av de fluorescerande proteinerna kan också bero på deras känslighet för kemikalier och pH som tidigare rapporterats 34. Andra kemiska recept, pH, fixativ och inkubation längd bör undersökas för att minimera utsläckning av de fluorescerande proteiner.
Metoden för hela organ transparentizing eller vävnad clearing har revolution volymetriska 3D-bilder. Den tidigare avbildningsmetod för hjärt morfogenes, vilket innebar den manuella 2D eller 3D-rekonstruktion av seriesnitt, är tidskrävande och instrument kräver 5,6. Hög upplösning episcopic mikroskopi (HREM) jämförd med 3D-modellering kan appliceras på studien av morfogenes av musen hjärtat och åstadkommer utmärkt anatomisk beskrivning av det trabekulära arkitekturen i framkallnings musembryo 35. Däremot HREM inte möjligt att identifiera fluorescerent protein märkta celler eller antikropps färgade celler från resten av celler 35. Använda det nuvarande protokollet, med minimal ansträngning och hög kostnadseffektivitet, har vi framgångsrikt bevarat de fluorescerande signaler i embryonala hjärtat med hjälp av Sca le eller kubisk vävnadsclearingmetoder (figurerna 1 - 3). I kombination med en låg dos (10 mikrogram / g) av Tamoxifen att inducera Cre rekombinationshändelser och generera några kloner inne i hela embryot och i hjärtat, kan detta system användas för att spåra och studera enstaka hjärt stamceller differentiering och cellulära beteenden i vivo (Figur 2A) 33. Dessutom, i kombination med Cre-medierad gendeletion eller överexpression och Cre-medierad enda cellmärkning, detta avbildningssystemet kan tillämpas för att studera genetisk förlust av funktion eller funktionsökning på progenitor celldifferentiering och cellbeteende under hjärt morfogenes, och sålunda ger en robust verktyg för att stUdy etiologin av medfödda hjärtfel.
De två vävnadsclearingsystem Sca / e och kubisk användes i denna studie visade olika clearing effektivitet, vilket ytterligare särskiljer de system baserade på embryonala ålder, vävnadstjocklek och varaktighet av vävnad clearing tid. För tidigt stadium embryon E9.5-E10.5, Sca / e-systemet inte bara återges vävnaden klar men också skyddade embryot morfologi och bevarade fluorescerande signaler, medan CUBIC behandling resulterade i embryo upplösning. Detta kan vara ett resultat av ytterligare aminoalkoholer och en högre koncentration av Triton X-100 i de kubiska lösningar 8. För äldre hjärtan, misslyckades Sca / e systemet för att rensa vävnaden helt även med en längre inkubationstid. Den kubiska clearing lösning framförde äldre vävnad klar (Figur 3). Resulterade emellertid ökad inkubationstid på svagare signaler och endast skyddade endogena GFP, medan RFP, GFP och antikropp konjugerad signalervar vilse. Av denna anledning skulle en mer optimerad recept av clearing reagenser och bättre inkubationstid krävas för att volumetriskt bild hjärtan eller organ med en större spektrum av fluorescerande etiketter.
Denna studie visade att man kan märka, spåra, och bild enskilda hjärt kloner i kombination med en hela berget färgning av endokardiell / endotelceller markör PECAM av utvecklings hjärtat. Hela montera färgning av PECAM och DAPI i detta system hjälper inte bara att identifiera celltyper och cellmorfologin av de märkta cellerna inuti ett hjärta, men också tillåter studiet av klon mönster, migration och beteende under hjärt morfogenes. I figur 2A observerade vi en klon med 8 celler i OFT. Genom att använda det antal cell närvarande i denna klon med hänvisning till tidsmärkning, kan den på cellproliferationsgrad lätt beräknas. I en annan studie med denna samma system identifierade vi den orienterade celldelningsmönster och migration mönster av enstaka cardiomyocyte under trabeculation processen 33. Tillämpningen av detta protokoll för att studera effekterna av genetisk förlust av funktion eller funktionsökning spatiotemporally på den märkta hjärt stamceller differentiering är möjlig klonal mönster och cellulära beteende, och kommer att bidra till studier av etiologi av medfödda hjärtfel på genetisk och molekylär nivå i en 3D-sammanhang. Dessutom kan detta protokoll användas för att studera av morfogenes i andra organsystem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,2′,2′’-nitrilotriethanol | Sigma Aldrich | 90279 | |
| 4% Paraformaldehyde in PBS | Affymetrix | 19943 | |
| BSA | Fischer Scientific | BP16000 | |
| N,N,N’,N’-tetrakis(2-hydroxypropyl) ethylenediamine | Sigma Aldrich | 122262 | |
| Phosphate Buffer Saline | Sigma Aldrich | P5368-10PAK | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U-1250 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | 84097 | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G8773 | |
| Tamoxifen | Sigma Aldrich | T5648 | |
| Sunflower seed oil | Sigma Aldrich | S5007 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
| PECAM (CD31) | BD Pharmingen | 550274 | |
| Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21247 | |
| DAPI nuclear stain | Sigma Aldrich | D9542 | |
| 37oC Incubator | Thermoscientific Fischer | Heratherm, Compact Microbiological Incubators | |
| 48 well plates | Cell Treat | 229148 | |
| Analytical Balance | Metler Toledo | PB153-S/FACT | |
| Confocal microscope | Zeiss | Zeiss 510 confocal microscope | |
| Disecting Microscope | Unitron | Z850 | |
| Fluorescent microscope | Zeiss | Observer. Z1 | |
| Germinator 500 Glass Bead Sterilizer | CellPoint Scientific | GER-5287-120V | |
| Light Source | SCHOTT | ACE I | |
| Pair of Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Petri dish 60 mm x15 mm | TPP Techno Plastic Products AG | 93060 | |
| Rocker II Platform Rocker | Boekel Scientific | 260350 | |
| Scintillating tubes | Fischer Scientific | 03-337-26 | |
| Transfer pipette | Samco Scientific | 202 | |
| Tweezers | Fine Science Tools | 11251-20 |
References
- Vincent, S. D., Buckingham, M. E. How to make a heart: the origin and regulation of cardiac progenitor cells. Curr Top Dev Biol. 90, 1-41 (2010).
- Olson, E. N. A decade of discoveries in cardiac biology. Nat Med. 10, 467-474 (2004).
- Olson, E. N. Gene regulatory networks in the evolution and development of the heart. Science. 313, 1922-1927 (2006).
- Bruneau, B. G. The developmental genetics of congenital heart disease. Nature. 451, 943-948 (2008).
- Mohun, T. J., Weninger, W. J. Embedding embryos for high-resolution episcopic microscopy (HREM). Cold Spring Harb Protoc. , 678-680 (2012).
- Soufan, A. T., et al. Three-dimensional reconstruction of gene expression patterns during cardiac development. Physiol Genomics. 13, 187-195 (2003).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W.
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157, 726-739 (2014).
- Becker, K., Jahrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains. PLoS One. 7, e33916 (2012).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158, 945-958 (2014).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
- Badea, T. C., Wang, Y., Nathans, J. A noninvasive genetic/pharmacologic strategy for visualizing cell morphology and clonal relationships in the mouse. J Neurosci. 23, 2314-2322 (2003).
- Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450, 56-62 (2007).
- Agah, R., et al. Gene recombination in postmitotic cells. Targeted expression of Cre recombinase provokes cardiac-restricted, site-specific rearrangement in adult ventricular muscle in vivo. J Clin Invest. 100, 169-179 (1997).
- Jiao, K., et al. An essential role of Bmp4 in the atrioventricular septation of the mouse heart. Genes Dev. 17, 2362-2367 (2003).
- Wu, B., et al. Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling. Cell. 151, 1083-1096 (2012).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
- Wu, M., et al. Epicardial spindle orientation controls cell entry into the myocardium. Dev Cell. 19, 114-125 (2010).
- Zhao, C., et al. Numb family proteins are essential for cardiac morphogenesis and progenitor differentiation. Development. 141, 281-295 (2014).
- Kaufman, M. H., Kaufman, M. H. The atlas of mouse development. , Academic Press. London. (1992).
- Nagy, A. Manipulating the mouse embryo : a laboratory manual. , 3rd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2003).
- Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nat Rev Genet. 6, 826-835 (2005).
- Kelly, R. G., Buckingham, M. E. The anterior heart-forming field: voyage to the arterial pole of the heart. Trends Genet. 18, 210-216 (2002).
- Verzi, M. P., McCulley, D. J., De Val, S., Dodou, E., Black, B. L. The right ventricle, outflow tract, and ventricular septum comprise a restricted expression domain within the secondary/anterior heart field. Dev Biol. 287, 134-145 (2005).
- Ward, C., Stadt, H., Hutson, M., Kirby, M. L. Ablation of the secondary heart field leads to tetralogy of Fallot and pulmonary atresia. Dev Biol. 284, 72-83 (2005).
- Echelard, Y., Vassileva, G., McMahon, A. P. Cis-acting regulatory sequences governing Wnt-1 expression in the developing mouse CNS. Development. 120, 2213-2224 (1994).
- Jiang, X., Rowitch, D. H., Soriano, P., McMahon, A. P., Sucov, H. M.
- Viragh, S., Challice, C. E. The origin of the epicardium and the embryonic myocardial circulation in the mouse. Anat Rec. 201, 157-168 (1981).
- Wu, M., Li, J. Numb family proteins: novel players in cardiac morphogenesis and cardiac progenitor cell differentiation. Biomolecular concepts. 6, 137-148 (2015).
- Li, J., et al. Single-Cell Lineage Tracing Reveals that Oriented Cell Division Contributes to Trabecular Morphogenesis and Regional Specification. Cell reports. 15, 158-170 (2016).
- Alkaabi, K. M., Yafea, A., Ashraf, S. S. Effect of pH on thermal- and chemical-induced denaturation of GFP. Appl Biochem Biotechnol. 126, 149-156 (2005).
- Captur, G., et al. Morphogenesis of myocardial trabeculae in the mouse embryo. J Anat. , (2016).
