Abstract
traçage clonale unique et analyse au niveau entier cardiaque peut déterminer le comportement des cellules progénitrices cardiaques et la différenciation au cours du développement cardiaque, et permettre l'étude de la base cellulaire et moléculaire de la morphogenèse cardiaque normale et anormale. Les technologies récentes émergentes d'analyses clonales simples rétrospectives rendent l'étude de la morphogenèse cardiaque à résolution cellulaire unique possible. Cependant, l'opacité des tissus et diffusion de la lumière du cœur comme la profondeur d'imagerie augmente l'imagerie entier coeur hinder à la résolution d'une seule cellule. Pour surmonter ces obstacles, un système de compensation entier embryon qui peut rendre le cœur très transparent à la fois l'éclairage et de détection doivent être développés. Heureusement, au cours des dernières années, de nombreuses méthodes pour les systèmes de compensation des organismes entiers tels que CLARITY, Sca le, SeeDB, ClearT, 3DISCO, CUBIC, DBE, BABB et PACT ont été rapportés. Ce laboratoire est intéressé par les mécanismes cellulaires et moléculaires de la cartemorphogenèse iac. Récemment, nous avons établi seule lignée cellulaire de traçage via le ROSA26-Cre ERT2; système ROSA26-Confetti pour marquer les cellules à faible densité au cours du développement cardiaque. Nous avons adapté plusieurs méthodes entières d'embryons de compensation , y compris le Sca et CUBES (, dégagée cocktails d'imagerie cérébrale claires et une analyse informatique) pour effacer l'embryon en combinaison avec toute coloration de montage à l' image des clones individuels à l' intérieur du cœur. Le cœur a été imagé avec succès à la résolution d'une seule cellule. Nous avons constaté que Sca le peut effacer le coeur embryonnaire, mais ne peut pas effacer efficacement le cœur postnatale, tandis que CUBIC peut effacer le coeur postnatale, mais endommage le coeur embryonnaire en dissolvant le tissu. Les méthodes décrites ici permettront l'étude de la fonction des gènes à une résolution de clone unique lors de la morphogenèse cardiaque, qui, à son tour, peut révéler la base moléculaire et cellulaire des malformations cardiaques congénitales.
Introduction
Morphogenèse cardiaque est un événement séquentiel qui nécessite l'organisation spatio - temporelle des quatre types de cellules progénitrices cardiaques différentes dans des secteurs distincts du coeur, et requiert également des réseaux de régulation génétiques multiples pour orchestrer ce processus pour former le 1,2 cardiaque fonctionnel. Cardiac spécification, la différenciation, la structuration et la chambre de maturation sont régies par des facteurs de transcription cardiogénique 3. Une mutation génétique ou une aberration post - transcriptionnelle de ces facteurs dans les cellules progénitrices cardiaques pourraient entraîner soit une létalité embryonnaire ou malformations cardiaques congénitales (CHD) 4. L'étude de la morphogenèse cardiaque nécessite une compréhension des détails inhérents structurels en trois dimensions (3D) et seule cardiaque lignée de cellules progénitrices marqué de traçage au cours du développement cardiaque favorisera la compréhension de la morphogenèse cardiaque. Un certain nombre de sections sur la base des méthodes de tomographie à haute résolution ont été développés en ee depuis quelques décennies à la structure 5,6 d'organes d'image; Cependant, ces méthodes nécessitent coûteuses, des instruments spécialisés, une vaste main - d'œuvre, et manquent de l' organisation structurelle détaillée à une résolution de cellule dans l' image 7,8 volumétrique finale reconstruite.
Imagerie volumétrique 3D au niveau de la cellule unique fournit un moyen pour étudier la différenciation des cellules progénitrices et le comportement cellulaire in vivo 7. Cependant, la diffusion de lumière de tissu reste le principal obstacle à l'imagerie des cellules et des structures en 3D en profondeur dans le cœur intact. Les lipides sont une source majeure de diffusion de la lumière, et l'élimination des lipides et / ou le réglage de la différence d'indice de réfraction entre les lipides et les zones environnantes sont les approches possibles pour accroître la transparence des tissus 8. Au cours des dernières années, un certain nombre de méthodes de compensation de tissus ont été développés, qui réduisent l'opacité des tissus et diffusion de la lumière, comme BABB (alcool benzylique et benzyle benzoatemélange e) et DBE (tétrahydrofuranne et dibenzylether); mais dans ces méthodes, la fluorescence reste un problème 8-10. Le solvant basé méthodes hydrophiles, tels que SeeDB (fructose / thioglycérol) et 3DISCO (dichlorométhane / dibenzylether), préserver des signaux fluorescents, mais ne rendent pas tout l' organe transparent 7,8,11. En comparaison, la méthode de dégagement du tissu CLARITY rend l'organe transparent, mais il a besoin d' un dispositif d'électrophorèse spécialisé pour éliminer les lipides 8,12, comme le fait PACT (technique de clarté passive), qui nécessite également un hydrogel enrobage 7,13. Pour des informations détaillées sur toutes les méthodes de tissus de compensation disponibles, reportez - vous au tableau 1 Richardson et Lichtman, et al. 7.
En 2011, Hama et coll. Serendipitously découvert un mélange hydrophile 'Sca le' ( l' urée, le glycérol et le Triton X-100 du mélange) qui rend le cerveau de souris et de l' embryon transpaent tout en préservant totalement des signaux fluorescents provenant des clones étiquetés 14. Ceci permet l'imagerie du cerveau intacte à une profondeur de quelques millimètres et la reconstruction à grande échelle des populations neuronales et les projections à une résolution subcellulaire. Susaki et al. encore amélioré Sca le en ajoutant aminoalcools et développé le 'cubic' (, dégagée cocktails clairs d'imagerie cérébrale et une analyse informatique) méthode de compensation des tissus, qui ont augmenté solubilisation phospholipides, la réduction du temps de compensation, et a permis multicolore fluorescent imagerie 8. Dans la présente étude, en profitant de la Sca le et les techniques de compensation des tissus CUBES et haute résolution tronçonnage optique 3D, des clones individuels à l' intérieur du coeur pendant cardiogenèse ont été retracés en utilisant Rosa26Cre ERT2 15, R26R-Confetti 16, αMHC-Cre 17, cTnT-Cre 18, NFATc1-Cre 19 et Rosa26-MTMG (MTMG) 20 Les lignées de souris. La combinaison de la méthode toute coloration de montage (WMS) développé précédemment 21,22 avec des méthodes de compensation des tissus plus autorisés pour la coloration d'autres protéines dans les clones étiquetés et pour l'étude de leur comportement dans un contexte volumétrique 3D. La combinaison de la compensation des tissus et WMS permet une meilleure compréhension des rôles des différents gènes et des protéines au cours du développement cardiaque, et l'étiologie des malformations cardiaques congénitales. Ce protocole peut être appliqué à d'autres études de différenciation des cellules progénitrices, le comportement cellulaire, et les événements de morphogenèse d'organes au cours du développement.
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Protocol
Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvés par le Comité institutionnel des animaux soin et l'utilisation (IACUC) à Albany Medical College et effectué selon le Guide du NIH pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire.
1. Préparation de la solution
NOTE: Le Rosa26Cre ERT2 15, R26R-Confetti 16, αMHC-Cre 17 et Rosa26-MTMG (MTMG) 20 lignées de souris ont été achetés dans le commerce cTnT-Cre 18 était un don du Dr Jiao à l' Université de l' Alabama NFATc1-Cre.. était un don du Dr Bin Zhou Albert Einstein College of Medicine 19. Les souris ont été euthanasiés par inhalation de dioxyde de carbone dans une chambre fermée pendant au moins 60 secondes, suivi par des moyens physiques de vérification de la mort par thoracotomie bilatérale, la décapitation ou la dislocation cervicale.
- Préparer Tamoxifène. Dissolvez 10 mg de tamoxifène dans 10 ml d'oi de graines de tournesoll. Une fois qu'il est complètement dissous, aliquote et conserver à -20 ° C.
- Préparer une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Dissoudre Na 2 HPO 4 (1,41960 g), du KH 2 PO 4 (0,24496 g), du NaCl (8,0669 g) et de KCl (0,20129 g) dans 1 litre d'eau distillée et d' ajuster le pH à 7,4.
- Préparer PBST: 0,1% de Tween-20 dans du PBS solution en dissolvant 100 pi de Tween-20 dans 100 ml de PBS.
- Préparer un tampon de blocage. Faire 3% d'albumine de sérum bovin (BSA) à une solution de blocage en dissolvant 3 g de BSA dans 100 ml de PBST contenant 0,2% de Tween-20.
- Préparer CUBIC-1 (réactif 1). Mélanger 25% en poids d' urée, 25% en poids de N, N, N ', N'-tétrakis (2-hydroxypropyl) éthylène - diamine et 15% en poids de Triton X-100 dans dH 2 O.
- Préparer CUBIC-2 (réactif 2). Mélanger 50% en poids de saccharose, 25% en poids d' urée, 10% en poids de 2, 2 ', 2' '- Nitrilotriéthanol et 0,1% (v / v) de Triton X-100 dans dH 2 O.
- Préparer le Sca A2: 4 M d' urée, 10% p / v de glycérol et 0,1% p / v de Triton X-100 dans dH 2 O. Ajuster le pH à 7,7.
- Préparer Sca le B4: 8 M d' urée et 0,1% p / v de Triton X-100 dans dH 2 O. Ajuster le pH à 8,7.
- Préparer Sca le 70: 4 M d' urée, 70% p / v de glycérol et 0,1% p / v de Triton X-100 dans dH 2 O.
2. Tamoxifen Induction, Embryon Isolement et fixation
- Tamoxifen Induction et Embryo Isolation
- En utilisant un protocole tube d'alimentation courbe approuvé (ACUP 13-12007), gavage des souris R26Cre ERT2 Confetti femelles (obturé par des souris mâles R26Cre ERT2) avec 10 pg / g de tamoxifène au jour de développement embryonnaire E7.75 33. Au jour embryonnaire 9,5 (de E9.5) ou E10.5, euthanasier les souris femelles avec du CO 2 et la dislocation cervicale.
- Après vérification de la mort de la souris (voir la section 1 Note), ouvrir la cavité abdominale de souris avec des ciseaux et disséquer la corne utérine, enlever les couches de tubes de l'utérus à l'aide de ciseaux et des pinces, et relouer les embryons du 23,24 tube utérin.
- Transférer les embryons dans une boîte de Pétri contenant du PBS (pH 7,4). Sous le microscope de dissection, enlever les couches non-embryonnaires (chorion, jaune sac et amnios) avec l'aide de pinces.
- Utilisation de pinces et ciseaux, prélever les échantillons de souris et de l' embryon de queue femelle pour le génotypage comme indiqué précédemment 22. En utilisant une pipette en plastique, transférer chaque embryon vers un puits d'une plaque à 48 puits contenant 1 ml de 1 x PBS.
- Sous un microscope à fluorescence, identifier les GFP / RFP / embryons positifs PCP via un microscope inversé avec un appareil photo. Décollez le péricarde en utilisant des pinces et tourner le coeur / embryon avec l'aide de pinces incurvées pour déterminer le nombre de clones fluorescents sur les deux côtés du cœur avec les filtres GFP / RFP / CFP. Aucune réduction sont nécessaires.
- Après avoir identifié GFP / RFP / embryons positifs de la PCP, lavez rapidement les embryons deux fois (2 min chacun) avec 1x PBS the 48 bien-plaque sur un agitateur de plaque à la température ambiante (RT). Cela permettra d'éliminer l'excès de sang.
- Fixer l'embryon / coeur embryonnaire en utilisant 4% de paraformaldehyde (PFA) à température ambiante. Le temps de fixation dépend de l'âge et du tissu taille embryonnaire. Pour E9.5 fixer l'embryon pendant 2 heures à la température ambiante. Les embryons au stade embryonnaire fin nécessitent plus de temps de fixation, qui peut même être prolongé à 24 heures pour le coeur postnatale.
ATTENTION: paraformaldéhyde est toxique, éviter tout contact avec la peau, les yeux et les muqueuses. - Après fixation, laver l'embryon / coeur dans le bien-plaque 48 deux fois (10 min chacun) avec 1x PBS sur un agitateur de plaque à la température ambiante. Cela supprime l'excès PFA de l'embryon / coeur. Les embryons sont ensuite traités pour toute coloration de montage et de compensation des tissus.
3. Tout le mont Coloration
NOTE: Après PFA fixation de l'embryon / coeur est soumis à l'ensemble de la coloration de montage comme suit.
- Perméabiliser l'embryon / coeur dans un puits de plaque 48, en utilisant 1 ml de 0,1% PBST pendant 2 heures sur la plaque agitateur à température ambiante.
- Après perméabilisation, immergez l'embryon / coeur dans 1 ml de tampon de blocage, pendant 2 heures ou toute la nuit sur un agitateur de plaque à 4 ºC.
- Immerger l'embryon / cœur à l'endothélium anticorps PECAM spécifique des cellules (CD31), dilué (1: 100) dans 0,3 ml de tampon de blocage pendant 48 heures sur la plaque agitateur à 4 ºC.
- Laver l'embryon / coeur en utilisant PBST 5 fois, 30 min chacune à la température ambiante sur la plaque shaker. Cela supprime l'excès anticorps primaire lié non spécifique du tissu.
- Immerger l'embryon / coeur dans Alexa Fluor 647 anticorps secondaire de chèvre anti-rat, dilué (1: 1000) dans 1 ml de tampon de blocage pendant 48 heures sur la plaque agitateur à 4 ºC.
- Répétez l'étape 3.4 pour laver l'anticorps secondaire.
- Post-fixer l'embryon / coeur avec 4% de PFA pendant 1 heure à température ambiante sur la plaque shaker et laver deux fois avec PBS 5 min chacune.
- Colorer l'embryon / coeur avec la tache nucléaire 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) (dilué dans du PBST à une concentration de 0,01 mg / mL) pendant 10 min sur la plaque agitateur à température ambiante. Suivez avec deux lavages PBS 5 min chacune.
4. Embryo / Clearing cardiaque avec Sca l e ou méthode CUBIC
NOTE: Après toute coloration de montage, l'embryon / coeur est soumis soit à la Sca le ou CUBIC méthode de compensation des tissus. Le choix de la méthode dépend de la taille et de l'âge du tissu embryonnaire. Pour E11.5 ou antérieures embryons d'âge, l' utilisation Sca l e méthode de compensation des tissus, tandis que pour les embryons âgés ou coeurs postnatales la méthode de compensation des tissus CUBIC est préféré.
- Méthode de compensation échelle tissulaire
- Incuber l'embryon / coeur avec 1 ml de solution e A2 Sca l dans un flacon de scintillation (enveloppés dans une feuille d'aluminium) avec agitation douce occasionnelle (à la main) pendant 48 heures à 4 ° C.
- Après Sca l e A2 incubation, incuber l'embryon / coeur avec 1 ml de solution e B4 Sca l à 4 ° C dans le même flacon avec occasionnelle agitation douce pour anotsa 48 h.
- Incuber l'embryon / coeur pour un autre 48 heures avec 1 ml Sca l e 70 à 4 ° C avec agitation douce occasionnelle. embryon mont en utilisant 90% de glycérol (voir rubrique 5.1).
- Méthode de compensation de tissus CUBIC
- Pour l' ensemble de l' embryon / coeur compensation CUBIC, immerger chaque embryon / coeur dans 1 ml de CUBIC-1 avec occasionnelle agitation douce pendant 48 heures à 37 ° C 7. Après 48 heures, remplacer la solution avec le même volume de réactif frais CUBIC 1, et incuber l'échantillon pour un 48 heures supplémentaires à 37 ° C en agitant de temps en temps avec la main.
- Laver le CUBIC-1 traité coeur / embryon 1x PBS plusieurs fois à la température ambiante en agitant doucement avec la main. Cela supprime l'excès CUBIC-1 solution.
- Après lavage CUBIC-1 avec du PBS, plonger les embryons / coeurs en solution CUBIC-2 (1 g par embryon / coeur) pendant 48 heures à 37 ° C avec agitation douce occasionnelle avec la main. Cela fait suite à l'embryon / coeur de montage en utilisant du glycérol (voir la section 5.2).
5. Montage de l'échantillon et d'imagerie
NOTE: Les embryons ou des organes défrichées dans Sca l e 70 ou CUBIC-2 solution peuvent être visualisés directement avec échelle 70 et CUBIC-2 solution comme le moyen d'imagerie, respectivement. Toutefois, compte tenu de la vulnérabilité des échantillons embryonnaires à des réactifs de compensation, si les échantillons ne sont pas imager immédiatement, mais stockées à long terme, de stocker les échantillons dans 90% de glycérol en suivant le protocole ci-dessous.
- Directement immerger le Sca le dégagé échantillon dans 1 ml de 90% de glycérol et conserver à 4 ° C jusqu'à ce que l' imagerie.
- Laver l'échantillon traité cubique avec 1 x PBS deux fois, 5 minutes à chaque fois de manière séquentielle et laisser incuber l'échantillon avec 1 ml de 30%, 50%, 70% et une solution de glycerol à 90% pendant 30 minutes chacun.
- Pour la formation d'image, transférer l'échantillon à fond de verre boîte de Petri avec une quantité minimale de 90% de glycérol et de l'image de clones avec un microscope confocal équipé de deux capacités de photons.
- Image du cœur ou de l'embryon dans le glycérol avec un 10X / 0,3 NA, NA immersion 25X / 0,8, ou un objectif de correction 40X / 1.2 NA de l'eau. Image DAPI utilisant 2-photon excitation d'un titane cohérent: saphir laser caméléon. Le choix du microscope et objectif dépendra de la fin des expériences, par exemple pour de super-résolution, un microscope à fluorescence de nappe de lumière pourrait être utilisé.
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Representative Results
Imagerie du coeur embryonnaire autorisé
La formation de coeur vertébré est un processus morphogénétique réglementé spatiotemporellement et dépend de l'organisation et la différenciation des cellules progénitrices de quatre sources différentes 1. Les cellules de la première zone de coeur du croissant cardiaque se replient vers la ligne médiane ventrale pour former un tube de coeur linéaire. Les cellules du deuxième champ cardiaque, résidant initialement dorsomedially au premier champ cardiaque, translocation puis au pharynx et splanchnique mésoderme, d'où ils migrent vers l'échafaud pré-existante du tube cardiaque linéaire. Les cellules du deuxième champ cardiaque contribueront au ventricule droit, sortie des voies (OFT) myocardique et dans une certaine endocarde 25-28. Cardiaques cellules de la crête neurale (CNCC), provenant de rhombomères postotic 6, 7 et 8, vont migrer vers le pharynx caudale et contribuer signifificativement à la couche de muscle lisse et les coussins endocardiques dans l'OFT. Ils contribuent également à la formation de la cloison aorticopulmonary 29,30. La quatrième population est constituée de cellules épicardiques dérivées de l'organe pro-épicardique (PEO) et contribue à des fibroblastes, des cellules musculaires lisses et potentiellement d' autres types 31 de cellules cardiaques. L'épicarde régule le développement vasculaire coronaire, la croissance et la morphogenèse cardiaque 21.
Le concept le plus important à propos de la morphogenèse cardiaque est que pendant le développement du cœur, la migration cellulaire anormale / différenciation des populations de cellules quatre progénitrices se traduira par des malformations ou des malformations cardiaques congénitales 4,22,32, qui est la première cause de malformations congénitales dans le monde . Déterminer les mécanismes de la morphogenèse cardiaque au niveau cellulaire et moléculaire est une étape essentielle vers l'amélioration du diagnostic et des traitements potentiels pour les CHD.Par conséquent, il est essentiel à l'image du processus de morphogenèse du cœur à l'ensemble du niveau du cœur à la résolution d'une seule cellule. Pour ce faire, nous avons appelé les cardiomyocytes en franchissant la ligne Cre sous le contrôle de la troponine cardiaque spécifique T (cTnT), qui est exprimé spécifiquement dans les cardiomyocytes 18, avec MTMG ligne de journaliste. Les embryons à E8.5 ont été récoltées et colorées pour PECAM de distinguer les cellules endocardiques et endothéliales de cardiomyocytes. Les embryons ont ensuite été éliminés par Sca le et le cœur a été imagés. Le myocarde a été marquée par la GFP due à la recombinaison cTnT-driven Cre-médiation de la journaliste MTMG, et l'endocarde a été marqué avec PECAM (figure 1A et Movie supplémentaire 1). Les cardiomyocytes peuvent être observées à une résolution à une seule cellule (figure 1A). Les structures cardiaques de la partie imagée, comme le ventricule primitif et OFT peuvent être clairement identifiés après la reconstruction 3D à l'aide re 3Dlogiciel de construction (figure 1B et complémentaire Movie 2).
Imagerie clones individuels du cœur embryonnaire effacé
Morphogenèse cardiaque dépend de la différenciation de la lignée cardiaque et l' organisation des cellules individuelles à l'ensemble du niveau du cœur 22, et donc, il est essentiel de la différenciation des cellules progénitrices cardiaques d'image unique à différents types de cellules cardiaques et à également l' image morphologie des cellules à une résolution de la cellule unique. Pour ce faire, Rosa26Cre ERT2 15 a été croisée avec R26R-Confetti 16, et la femme enceinte a été gavage avec le tamoxifène à une faible concentration. Après 48 heures, l'embryon a été récolté à E9.5, et toute la montagne colorée pour PECAM, puis tout le cœur a été imagée. Nous avons constaté qu'il n'y avait qu'un seul groupe de cellules, localisée à l'OFT, et ce clone avait o 8 cellules à basen l'image reconstruite et sections consécutives (Figures 2A, 2B et complémentaire du film 3), indiquant que ces cellules sont dérivées d'une cellule souche unique. La morphologie cellulaire et le comportement cellulaire tels que la prolifération cellulaire et la migration peuvent être déduites à partir de la position finale des cellules (Figure 2A). Nous avons également appliqué la méthode CUBIC pour effacer le coeur embryonnaire à E9.5 et E10.5, et a constaté que, même après seulement 24 heures d'incubation avec le réactif 1, les embryons ont été subtilement dissous et la structure des tissus a été affectée (données non présentées ).
Imagerie des postnatale défriché et fin cœurs embryonnaires
Nous avons appliqué les deux Sca l e et CUBIC pour effacer les coeurs postnatales. coeurs P2 avec le génotype de αMHC-Cre; MTMG (αMHC-Cre est exprimée spécifiquement dans les cardiomyocytes <sup> 17) ont été déminés avec Sca l e pendant 48 heures, mais ne pas afficher plus de transparence que les coeurs traités avec du PBS seulement (données non présentées), ce qui indique que Sca l e compensation est pas efficace pour les cœurs postnatales. Lorsque les cœurs P2 ont été effacés avec le réactif CUBIC 1 pendant 48 heures, et le réactif 2 pendant 96 heures, ils étaient beaucoup plus transparents que les coeurs défrichées avec le réactif 1 pendant 48 heures et le réactif 2 pendant 48 heures. La profondeur d'imagerie a été significativement augmentée avec 96 h de réactif 2 incubation (Films supplémentaires 4 et 5), ce qui indique que plus l' incubation avec les réactifs CUBES favorise la transparence et prévoit une augmentation de la profondeur d'imagerie. La forme et la taille de chacun des cardiomyocytes peuvent être identifiés par la membrane GFP localisée (figure 3A), qui peut être utilisé pour identifier l' hypertrophie.
Nous avons également éclairci NFATc1-Cre; Confetti (Confetti femelle branché avec Nfatc1Cre mâles) E17.5 coeurs (NFATc1-Cre est exprimée dans les cellules endocardiques cardiaques 19) avec le réactif CUBIC 1 pendant 48 heures et le réactif 2 pendant 48 heures. Les cœurs sont transparents, et les protéines fluorescentes, y compris la GFP, YFP, CFP et RFP devaient marquer les cellules endocardiques et leurs cellules dérivées; cependant, seulement GFP et YFP pourraient être visualisés à travers tout coeur (figures 3B, 3C et films supplémentaires 6 et 7), et la PCP et DP ne pouvaient pas être détectés (données non présentées). La coloration pour PECAM (Alexia Fluor 647) également ne pouvait pas être détectée (données non présentées), ce qui suggère que le réactif CUBIC désaltère la PCP, DP et l'anticorps conjugué fluorophore dans ce protocole.
Figure 1:. Imagerie du Sac / e autorisé coeur embryonnaire (A) Une optranche tical d'un cœur E8.75 (cTnT-Cre; MTMG) est affiché. V: ventricule; OFT: sortie des voies. (B) montre la structure du cœur reconstruit de 93 tranches optiques consécutives avec une profondeur totale de 110,4 um. Barre d'échelle = 20 pm A. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Imagerie clone unique de Sca / e autorisé coeur embryonnaire (A) Une section optique d'un clone d'un cœur de E9.5 avec le génotype de ROSA26-Cre ERT2;. ROSA26-Confetti. La flèche pointe vers une saillie cellulaire d'un cardiomyocytes. (B) Indique le clone reconstruit dans la région OFT du cœur de E9.5 avec 10 tranches optiques et 36 um profondeur totale. Barre d'échelle = 20 pm A. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
. Figure 3: Imagerie postnatal autorisé CUBIC et tardifs coeurs embryonnaires (A) montre une section optique d'un coeur de P2 avec le génotype de αMHC-Cre; MTMG; toutes les sections optiques sont présentés dans le film supplémentaire 5. (B) montre une section d'un coeur de E17.5 avec le génotype de NFATc1-Cre; ROSA26-Confetti. (C) montre la structure de coeur reconstruite à partir de 106 tranches optiques avec une profondeur totale de 630 um. La barre d'échelle = 20 pm A et est de 100 um B. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
. Film supplémentaire 1: Imagerie du Sca le coeur effacé embryonnaire (clic droit pour télécharger) Film 1 montre des coupes optiques d'un Sca le coeur traités E8.75 (cTnT-Cre; MTMG) de la surface du cœur à la lumière du cœur. La profondeur est de 110,4 um et il y a 93 tranches au total.
Film complémentaire 2:. Imagerie du Sca le coeur effacé embryonnaire (clic droit pour télécharger) Movie 2 montre l'image de surface 3D du cœur reconstruit dans Movie 1, reconsted via le logiciel de reconstruction 3D. marques jaunes l'expression de PECAM et étiquettes vertes tous les cardiomyocytes.
Film supplémentaire 3: Imagerie un seul clone de la Sca le coeur effacé embryonnaire (clic droit pour télécharger). Film 3 montre des sections d'un clone d'un cœur de E9.5 avec le génotype de ROSA26-Cre ERT2.
Film supplémentaire 4: Imagerie les cœurs postnatales défrichées CUBES (clic droit pour télécharger). Film 4 montre des sections d'un coeur P2 traité CUBIC (& #945; MHC-Cre; MTMG) de la surface du cœur à la lumière du cœur. Ce cœur P2 a été autorisé avec le réactif CUBIC 1 pendant 48 heures, et le réactif CUBIC 2 pendant 96 heures.
Film supplémentaire 5: Imagerie les cœurs postnatales défrichées CUBES (clic droit pour télécharger). Film 5 montre un coeur qui a été effacé avec le réactif CUBIC 1 pendant 48 heures et le réactif CUBIC 2 pendant 48 heures. La profondeur est de 136 um à 6 um par section dans le film 4 et l'épaisseur est de 76 um à 6 um par section dans le film 5.
Film supplémentaire 6: Imagerie du embry fin dégagé CUBICcoeur onic (clic droit pour télécharger) Film 6 montre sections d'un cœur CUBIC traité de E17.5 (NFATc1-Cre; ROSA26-Confettis). de la surface du coeur à la lumière du cœur. La profondeur est de 630 um avec 6 pm par section.
Film supplémentaire 7: Imagerie du coeur embryonnaire tardif dégagé CUBIC (clic droit pour télécharger). Film 7 montre l'image de surface 3D du cœur dans Movie 6, reconstruite par l'intermédiaire du logiciel de reconstruction 3D.
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Discussion
L'isolement de l'embryon est une étape très critique. embryons E9.5 sont très fragiles et de petite taille, de sorte que des précautions supplémentaires doivent être prises pour ne pas endommager les structures embryon / coeur lors de l'isolement. Les couches supplémentaires non embryonnaires enveloppant l'embryon / cardiaque doivent être soigneusement enlevées en particulier lorsque l'imagerie de l'embryon entier. Ceci permet la pénétration du mélange d'anticorps et de compensation de profondeur à l'intérieur des tissus embryonnaires, et contribue également à éliminer le bruit de fond lors de l'imagerie. Plusieurs anticorps comprenant des anticorps contre la PECAM, acétylée α-tubuline et β1 des intégrines ont été examinés et ont tous été détectés avec succès (données non représentées) 33. Cela démontre que l'intégrité moléculaire, l'intégrité cellulaire et la compatibilité de l'antigène n'a pas été perturbé pendant ce processus de compensation.
Transférer l'embryon / coeur en utilisant une grande pipette de transfert de la bouche (couper la pointe). Cela permet d'éviter les dommages lors de la manutention. La GFP / YFP / RFP / motif d'expression CFP et nmbre de clones doivent être soigneusement enregistrés dans le cœur afin de déterminer le dosage approprié à étiqueter un clone par coeur ou d'autres organes. En raison de la faible dose de tamoxifène (10 mg / g), parfois le coeur ne contient pas de clones ou est difficile à détecter tous les clones. Par conséquent, il est recommandé d'utiliser le sac jaune pour déterminer si l'embryon a des GFP / YFP / DP / clones CFP.
L'embryon ou le cœur de fixation est une étape critique, car plus-fixation se traduira par un bruit de fond élevé tandis que sous-fixation se traduira par une mauvaise coloration. Il est recommandé de fixer le E8.5-E10.5 embryon entier pendant 2 heures à la température ambiante sur un agitateur de plaque. Alors que pour les embryons E11.5-E15.5, la recommandation est d'isoler soigneusement le cœur et le fixer avec 4% de PFA pendant 2 heures à la température ambiante. Après s'être assuré d'enlever les couches entourant le cœur, si le traitement de l'ensemble de l'embryon, les embryons E11.5- E13.5 peuvent également être fixés pour 3-4 heures à température ambiante, mais qui exige une augmentation du temps de compensation des tissus. Le E16,5-P1 (post-nataljour 1) coeurs sont fixés pour 3-4 heures à température ambiante sur un agitateur de plaque. Lors de la fixation tout embryon, l'avant et les membres postérieurs doivent être enlevés car ils entravent l'imagerie cardiaque.
Les échantillons doivent être traités avec CUBIC et Sca le dans des flacons de scintillation pour réduire au minimum le séchage de l' échantillon. Nous avons observé une meilleure compensation des échantillons avec la méthode de compensation des tissus CUBIC à 37 ° C, tandis que Sca le dégagement est parfaitement fait à 4 ° C. Après l' imagerie, les échantillons peuvent être conservés à court terme dans CUBIC-2 ou Sca le 70. Les échantillons doivent toujours être recouverts d'une feuille d'aluminium pour empêcher la fluorescence de blanchiment.
des tissus et des organes embryonnaires ont moins de lipides et le dépôt de matrice extracellulaire, ce qui résulte en moins de temps de compensation. D'autre part, ils sont plus vulnérables aux réactifs de compensation. Les réactifs de compensation pourraient affecter l'intégrité de la structure des tissus et de l'antigène, ce qui entraîne l'extinction de la CFP, RFP et de l'anticorps Conjufluorophore gated. Par conséquent, de plus longues durées de fixation pourraient empêcher l'extinction. La trempe des protéines fluorescentes pourrait également être due à leur sensibilité aux produits chimiques et le pH comme indiqué précédemment 34. Autres recettes chimiques, pH, fixatifs, et la durée d'incubation doivent être explorées pour réduire au minimum la trempe des protéines fluorescentes.
La méthode de transparentisante d'organe entier ou de compensation de tissu a révolutionné l'imagerie 3D volumétrique. Procédé d'imagerie précédent pour la morphogenèse cardiaque, qui implique la reconstruction 2D ou 3D manuelle des coupes en série, prend du temps et exige l' instrument 5,6. Épiscopique microscopie à haute résolution (HREM) conjointement avec une modélisation en 3D peut être appliquée à l'étude de la morphogenèse du cœur de souris et prévoit une excellente description de l'architecture anatomique trabéculaire chez l'embryon de souris en développement 35. Cependant, HREM ne permet pas l'identification de l'Déesscellules de protéine de ent marqués ou marqués par l' anticorps des cellules du reste des cellules 35. En utilisant le protocole actuel, avec un minimum d' effort et de l' efficacité élevée des coûts, nous avons réussi à préserver les signaux fluorescents dans le coeur embryonnaire en utilisant Sca le ou les méthodes de compensation des tissus CUBES (figures 1 - 3). Combiné avec une faible dose (10 ug / g) du tamoxifène pour induire des événements de recombinaison Cre et générer quelques clones à l' intérieur de l'ensemble de l' embryon et dans le cœur, ce système peut être utilisé pour suivre et étudier la différenciation des cellules progénitrices cardiaques simples et comportements cellulaires dans vivo (figure 2A) 33. En outre, combinée avec une délétion du gène Cre médiation ou la surexpression et la Cre médiation par l'étiquetage d'une cellule unique, ce système d'imagerie peut être utilisé pour étudier la perte génétique de la fonction ou le gain de fonction sur la différenciation des cellules progénitrices et le comportement cellulaire au cours de la morphogenèse cardiaque et fournit ainsi un solide outil pour stUdy l'étiologie des malformations cardiaques congénitales.
Les deux tissus systèmes de compensation Sca / e et CUBIC utilisé dans cette étude ont montré des rendements différents de compensation, ce qui différencie encore les systèmes basés sur l'âge embryonnaire, l'épaisseur du tissu et de la durée du temps de compensation des tissus. Pour les embryons précoces de stade E9.5-E10.5, le système / e de Sca non seulement rendu le tissu clair, mais également protégé la morphologie de l'embryon et préservé les signaux fluorescents, tandis que le traitement CUBIC a donné lieu à l'embryon dissolution. Cela pourrait être dû à des aminoalcools supplémentaires et une plus grande concentration de Triton X-100 dans les solutions CUBES 8. Des cœurs plus anciens, le système / e Sca n'a pas réussi à éliminer complètement le tissu, même avec un temps d'incubation plus longue. La solution de compensation CUBIC a rendu le plus vieux tissu clair (Figure 3). Cependant, l'augmentation du temps d'incubation a donné lieu à des signaux plus faibles et GFP endogène seulement protégée, tandis que DP, CFP et des signaux d'anticorps conjuguésétaient perdus. Pour cette raison, une recette plus optimisée des réactifs de compensation et une meilleure durée d'incubation serait nécessaire pour volumétriquement des cœurs ou des organes d'image avec un plus grand éventail de marqueurs fluorescents.
Cette étude a démontré que l'on peut étiqueter, trace, et les clones cardiaques simples d'image en combinaison avec toute une coloration monture de l'endocarde / endothéliale marqueur de cellules PECAM du cœur en développement. Toute coloration montagne de PECAM et DAPI dans ce système permet non seulement d'identifier les types de cellules et la morphologie cellulaire des cellules marquées à l'intérieur d'un coeur, mais permet également l'étude du motif clonale, la migration et le comportement au cours de la morphogenèse cardiaque. Dans la figure 2A , nous avons observé un clone avec 8 cellules OFT. En utilisant le nombre de cellules présentes dans ce clone avec référence au temps de marquage, le taux de prolifération cellulaire peut être facilement calculée. Dans une autre étude utilisant ce même système, nous avons identifié le motif et migr orientée division cellulairemotif ation du seul cardiomyocytes au cours du processus de trabéculation 33. L'application de ce protocole pour étudier les effets de la perte génétique de fonction ou gain de fonction spatiotemporellement sur la différenciation des cellules progénitrices cardiaques marqué, modèle clonale et le comportement cellulaire est possible, et aidera dans les études sur l'étiologie des malformations cardiaques congénitales chez génétique et niveau moléculaire dans un contexte 3D. Par ailleurs, ce protocole peut être appliqué à l'étude de la morphogenèse dans d'autres systèmes d'organes.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,2′,2′’-nitrilotriethanol | Sigma Aldrich | 90279 | |
| 4% Paraformaldehyde in PBS | Affymetrix | 19943 | |
| BSA | Fischer Scientific | BP16000 | |
| N,N,N’,N’-tetrakis(2-hydroxypropyl) ethylenediamine | Sigma Aldrich | 122262 | |
| Phosphate Buffer Saline | Sigma Aldrich | P5368-10PAK | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U-1250 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | 84097 | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G8773 | |
| Tamoxifen | Sigma Aldrich | T5648 | |
| Sunflower seed oil | Sigma Aldrich | S5007 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
| PECAM (CD31) | BD Pharmingen | 550274 | |
| Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21247 | |
| DAPI nuclear stain | Sigma Aldrich | D9542 | |
| 37oC Incubator | Thermoscientific Fischer | Heratherm, Compact Microbiological Incubators | |
| 48 well plates | Cell Treat | 229148 | |
| Analytical Balance | Metler Toledo | PB153-S/FACT | |
| Confocal microscope | Zeiss | Zeiss 510 confocal microscope | |
| Disecting Microscope | Unitron | Z850 | |
| Fluorescent microscope | Zeiss | Observer. Z1 | |
| Germinator 500 Glass Bead Sterilizer | CellPoint Scientific | GER-5287-120V | |
| Light Source | SCHOTT | ACE I | |
| Pair of Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Petri dish 60 mm x15 mm | TPP Techno Plastic Products AG | 93060 | |
| Rocker II Platform Rocker | Boekel Scientific | 260350 | |
| Scintillating tubes | Fischer Scientific | 03-337-26 | |
| Transfer pipette | Samco Scientific | 202 | |
| Tweezers | Fine Science Tools | 11251-20 |
References
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