Summary
We beschrijven een in vitro protocol co-cultuur darm microbioom en darmvlokken voor een langere periode met een menselijke darm-on-a-chip microphysiological systeem.
Abstract
Hier beschrijven we een protocol om op lange termijn co-cultuur van multi-species menselijke darm microbiome voeren met microengineered darmvlokken in een menselijke darm-on-a-chip microphysiological apparaat. We herhalen het darmlumen-capillaire weefsel-interface in een microfluïdische apparaat, waar de fysiologische mechanische vervormingen en vloeistof shear stroming voortdurend worden toegepast op peristaltiek na te bootsen. In het lumen microkanaal, de menselijke darm epitheel Caco-2-cellen worden gekweekt om een 'kiemvrij' villus epitheel te vormen en te regenereren kleine darmvlokken. Pre-gekweekte microbiële cellen geënt in het lumen kant om een gastheer-microbe ecosysteem stellen. Na microbiële cellen zich aan het apicale oppervlak van de villi, vloeistofstroom en mechanische vervormingen worden hervat aan een stationair micro waarin vers kweekmedium constant toegevoerd en ongebonden bacteriën (evenals bacteriële afval) continu verwijderd produceren. Na uitgebreide co-cultuur from dagen tot weken, worden meerdere microkolonies totaal willekeurig worden geplaatst tussen de villi en zowel microbiële en epitheelcellen levensvatbaar blijven en functionele ten minste één week in kweek. De co-cultuur protocol kan worden aangepast om een veelzijdig platform voor andere gastheer-microbiome ecosystemen welke in diverse menselijke organen, die in vitro onderzoek van de rol van menselijke microbiome orkestreren gezondheid en ziekte kunnen vergemakkelijken.
Introduction
De menselijke darm herbergt een verbluffend uiteenlopende reeks microbiële species (<1000 soorten) en een enorm aantal microbiële cellen (10 keer meer dan het humane gastheercellen) en genen (100 keer meer dan het humane genoom) 1. Deze menselijke microbiomes spelen een sleutelrol bij het metaboliseren van voedingsstoffen en xenobiotica, reguleren immuunresponsen en onderhouden intestinale homeostase 2. Niet verrassend, gezien deze diverse functies, de commensal darm microbiome moduleert uitgebreid gezondheid en ziekte 3. Zo is het begrijpen van de rol van de darm microbioom en gastheer-microbe interacties zijn van groot belang voor gastro-intestinale (GI) gezondheid te bevorderen en nieuwe therapieën voor darmziekten 4. De bestaande in vitro modellen darm (bijvoorbeeld statische kweken) beperken gastheer-microbiome co-cultuur een korte periode (<1 dag) omdat microbiële cellen overgroeien en compromis darmwandfunctie 5. Surrogaat diermodellen (bv kiem-vrije 6 of genetisch gemanipuleerde muizen 7) zijn ook niet vaak gebruikt om te studeren gastheer-gut microbioom crosstalk omdat de kolonisatie en stabiele handhaving van de menselijke darm microbiome zijn moeilijk.
Om deze uitdagingen te overwinnen, ontwikkelden we onlangs een biomimetische mens "Gut-on-a-Chip" microphysiological systeem (Figuur 1A, links) op de host-darm microbiome interacties die plaatsvinden in de levende menselijke darm 5,8 emuleren. De darm-on-a-chip micro-inrichting bevat twee evenwijdige microkanalen gescheiden door een flexibel, poreus, extracellulaire matrix (ECM) beklede membraan bekleed met humane intestinale epitheliale Caco-2 cellen nabootsen het darmlumen-capillair weefsel-grensvlak (Figuur 1A , rechts) 9. Vacuüm gedreven cyclische ritmische vervormingen veroorzaken fysiologische mechanische vervormingen dat veranderingen normaal induc na te bootsened door peristaltiek (Figuur 1A, rechts). Interessant wanneer Caco-2-cellen worden gekweekt in de darm-on-a-chip voor meer dan 100 uur, vormen zij spontaan driedimensionale (3D) darmvlokken met tight junctions, apicale borstelzomen, proliferatieve cellen beperkt tot basale crypten, slijmproductie, toegenomen drug metaboliseren activiteit (bijvoorbeeld cytochroom P450 3A4, CYP3A4), en verbeterde glucose heropname 8. In deze "kiemvrij 'micromilieu, was het mogelijk om co-kweek het probioticum Lactobacillus rhamnosus GG of therapeutische vorming van een probiotische bacteriekweek mengsel met menselijke epitheelcellen gedurende twee weken 5,10.
In deze studie beschrijven we het gedetailleerd protocol host-gut microbiome co-kweek uitgevoerd in de darm-on-a-chip apparaat voor een langere periode. Daarnaast bespreken we kritieke problemen en mogelijke uitdagingen in aanmerking komen voor een brede toepassing van deze host-microbiome co-cultuur pROTOCOL.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Microfabricage van een Gut-on-a-chip-apparaat
Opmerking: De gut-on-a-chip is een microfluïdische apparaat door transparante, gasdoorlatende siliconenpolymeer (polydimethylsiloxaan, PDMS), die twee evenwijdige microkanalen (1 mm breed x 150 urn hoogte x 1 cm lengte) gescheiden door een flexibel poreuze (10 urn poriëndiameter, 25 urn afstand porie tot porie) PDMS membraan 5,9. Fabriceren de darm-on-a-chip (Figuur 1A, links) na de stappen.
- Microfabricage orde van de Gut-on-a-chip 5,9.
- Bereid uitgeharde, ontgaste PDMS door mengen van de PDMS-prepolymeer en hardingsmiddel (15: 1 w / w) en plaats deze in het vacuüm exsiccator gedurende 30 minuten.
- Giet 30 g en 3 g uitgeharde, ontgaste PDMS op elk siliconenmal dat SU-8 micropatterns basis van de boven- en microkanalen van de darm-on-a-chip, respectievelijk. harden daarna bij 60 ° C in een droogoven gedurende loosten 4 uur.
- Demold de bovenste en onderste PDMS lagen van elkaar siliconenmal door het snijden langs de rand met een chirurgische scalpel. Punch 6 holes (twee ingangen, twee uitgangen en twee vacuümkamers) met behulp van een biopsie puncher (2,0 mm in diameter gat).
- Bereid de poreus membraan door het gieten van 10 g onverhard en ontgast PDMS op een gesilaniseerd silicium wafer met paal arrays met ronde pilaren (10 micrometer in doorsnede, 25 pm hoog) bedekken met een platte, gesilaniseerd PDMS steunlaag (15: 1, w / w; 1 cm dik). Plaats een 3 kg gewicht presser de installatie en harden van het polymeer bij 60 ° C gedurende 12 uur of langer.
- Demold het opzetten van een poreus PDMS membraan gehecht aan de drager PDMS plaat van de siliciumwafel door voorzichtig optillen van de hoek van de plaat van de wafel, en afpellen tot poreuze PDMS membraan volledig wordt losgemaakt van de wafel.
- Maak de kanaalzij van een bovenlaag (PDMS, 15: 1, w / w) en het poreuze membraan kant van de plasma gegenereerd door een draagbare corona behandelingsinrichting gedurende 1 minuut en 3 seconden respectievelijk.
- Plaats de plasma behandelde oppervlakken van de poreuze PDMS membraan en bovenste microkanaal laag in een conforme contact door het plaatsen van elk stuk in parallel zonder luchtbellen.
- Incubeer de gehele opzet bij 80 ° CO / N voor irreversibele binding van de twee PDMS lagen.
- Trek het PDMS dragerlaag van het samenstel van een bovenlaag met een poreus membraan door voorzichtig optillen van de hoek van de steunlaag en afpellen tot de steunlaag volledig losgemaakt van de bovenlaag van het membraan.
- Scheur de gedeelten van het membraan zich via vacuümkamers (de twee kamers aan weerszijden van het hoofdkanaal) met een fijne pincet tip holle vacuümkamers maken.
- Maak de kant met het membraan bevestigd aan het bovenste stuk en de kant met de kanalen gegraveerd op het onderste stuk plasma op dezelfde wijze als beschreven in stap 1.1.6 gedurende 1 min.
- Lijn de bovenste microkanaal laag met een poreus membraan en de onderste laag met een conforme contact door het plaatsen van elk stuk in parallel zonder luchtbellen onder een stereoscoop.
- Hard de hele opstelling in een droge oven bij 80 ° CO / N om een volledig gamma gut-on-a-chip microfluïdische apparaat met twee holle vacuümkamers naast het microfluïde kanaal cel te produceren.
- Sluit slang aan de inlaat en uitlaat van elke poort verbonden met de bovenste of onderste microkanalen in een darm-on-a-chip via een 90 ° gebogen roestvrijstalen stomp einde voorziene naald.
- Sluit de slang aan de gaten in verband met de vacuümkamers met een 90 ° gebogen roestvrijstalen stomp einde voorziene naald.
- Steriliseer de microkanalen leidingen door stromend 70% (v / v) ethanol onder toepassing van een 1 ml gesteriliseerd wegwerpspuit.
- Uitdrogen van de microkanalen en slangen in een 60 ° C droge oven O / N.
2. Groei micromachineEred darmvlokken in de Gut-on-a-chip-apparaat
- Seed darmepitheelcellen (bv Caco-2BBE) op een Gut-on-a-chip microdevice 5,9.
- Steriliseer het apparaat met 70% (v / v) ethanol (zie stap 1,4) met een 1 ml gesteriliseerde wegwerpspuit gevolgd door drogen in een 60 ° C droge oven O / N (zie stap 1,5) voorafgaand aan de activering oppervlak.
- Expose de complete opstelling van een gut-on-a-chip microsysteem (dat wil zeggen, een orgaan van de darm-on-a-chip is aangesloten op slangen) aan UV-licht (253,7 nm) en ozon gelijktijdig gedurende 40 min.
- Afkoelen van het apparaat bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten onder UV-licht in een bioveiligheid kast (BSC).
- Introduceren 100 gl van de ECM coating oplossingsgericht een mengsel van 50 ug / ml type I collageen en 300 ug / ml extracellulaire matrix verdund in serumvrij Dulbecco's Gemodificeerd Eagle Medium (DMEM) - in zowel bovenste en onderste microkanalen met een wegwerpbare , steriele 1 ml spuit.
- IncubatE de hele opstelling in een 37 ° C bevochtigde 5% CO2 incubator gedurende 1 uur.
- Ontgas 50 ml voorverwarmde (37 ° C) volledig kweekmedium (DMEM, 20% v / v foetaal runderserum (FBS), 100 eenheden / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine, in hoeveelheden verdeeld in een 3 ml wegwerpspuit) met een 50 ml filtersysteem (0,45 urn poriegrootte) in de BSC gedurende 1 min.
- Passeer de voorverwarmde medium door het filtersysteem en tik zachtjes op de gefilterde medium voor 1 min om eventuele luchtbellen of opgelost gas in het medium te verwijderen.
- Plaats het monster van compleet medium ontgast in een 3 ml wegwerpspuit en incuberen in een 37 ° C bevochtigde 5% CO2 incubator gedurende 1 uur.
- Verbinden twee 3 ml wegwerpspuiten bevattende ontgast, voorverwarmd compleet cultuurmedium aan de bovenste en onderste microkanalen.
- Stromen de volledige ontgast celkweekmedium in het bovenste microkanaal met een injectiespuit pomp met het volumetrischestroomsnelheid van 30 pl / uur (overeenkomend met de schuifspanning van 0,02 dyne / cm 2) in een 37 ° C bevochtigde 5% CO2 incubator O / N.
- Vorming van Microengineered Caco-2 Villi in de Gut-on-a-chip.
- Gebruik Caco-2BBE cellen na verloop getal tussen 50 en 65.
- Kweek Caco-2-cellen in een T75 kolf die compleet cultuurmedium in een 37 ° C bevochtigde 5% CO2 incubator gedurende 4-5 dagen volledig confluente cellen te verkrijgen.
- Voeg 10 ml Ca2 + en Mg2 + -vrij PBS volledig confluente Caco-2-cellen gekweekt in een T75 fles, wassen cellen, dan zuigen uit PBS. Herhaal deze stap twee keer.
- Voeg 1 ml van 0,05% trypsine / EDTA-oplossing en incuberen in een 37 ° C bevochtigde 5% CO2 incubator gedurende 5 min.
- Resuspendeer de cellen gedissocieerd met 10 ml voorverwarmd volledig celkweekmedium (met FBS) door op en neer pipetteren 3-5 keer.
- Spin down de cel schorsing door centrifugation bij 500 xg gedurende 5 minuten en verwijder het supernatant.
- Resuspendeer opnieuw met 1 ml voorverwarmd compleet medium om celdichtheid passen bij ~ 1,5 x 10 5 cellen / cm2 in het apparaat. Gebruik hemocytometer om de celdichtheid te schatten.
- Infundeer 100 ul van de geresuspendeerde Caco-2-cellen in de bovenste microkanaal (lumen zijde) door een 1 ml wegwerpspuit bevestigd aan een 25 G5 / 8 naald op de uitgang van slang verbonden met het bovenste microkanaal.
- Klem alle inlaten en uitlaten van de slang verbonden met het bovenste en onderste microkanalen gebruik bindmiddel clips.
- Incubeer de hele opstelling in een 37 ° C bevochtigde 5% CO2 incubator gedurende 1 uur tot toestaan gedissocieerde Caco-2 cellen te hechten aan het oppervlak van het poreuze membraan.
- Verwijder de klemmen en hervat de stroom kweekmedium alleen de bovenste microkanaal bij 30 ul / uur via een injectiepomp tot cellen vormen een intacte monolayer van 24-36 uur. Gebruik de fase contrast of differentiële interferentie contrast (DIC) microscopie tot cel-cel contacten in een cel monolaag te bevestigen.
- Wanneer cellen vormen een monolaag, perfuseren het kweekmedium in zowel de bovenste (lumen) en onderste (capillaire) microkanalen op dezelfde stroomsnelheid van 30 gl / uur.
- Toepassing van mechanische vervormingen nabootsen peristaltiek-achtige bewegingen 5,9.
- Schakel de vacuümpomp met de spanning apparatuur.
- Sluit de vacuümkamers de vacuümregelaar via buis met een roestvrij stalen connector.
- Stel de stretching beweging van 10% gemiddelde cellijn met een frequentie van 0,15 Hz met de cyclische sinusfunctie modus op de vacuüm het beheersen van software en klik op 'Start'.
- Handhaaf de constante stroom kweekmedium (30 gl / uur) in zowel bovenste en onderste microkanaal de confluente Caco-2 monolagen onder mechanische vervormingen (10%, 0,15 Hz) gedurende ~ 100 uur.
Let op: Caco-2-cellen sponkertijd ondergaan villus morfogenese met gegolfde 3D-projecties uitgebreid in de richting van het lumen van de epitheliale microkanaal 5,8-10.
- Om het orgel-level functies van het levende menselijke darm na te bootsen met lumen-capillaire weefsel-interface in de darm-on-a-chip 10, volg de aanwijzingen zoals hiervoor beschreven.
- Grow microengineered Caco-2 villi door herhalen van de stappen 2,1-2,2.
- Flow de voorverwarmde co-kweekmedium (een mengsel van de volledige Caco-2 celcultuurmedium en totale HMVECs cultuurmedium, 1: 1 v / v) om de bovenste en onderste microkanalen bij 30 ul / uur.
- Introduceren 100 pl gedissocieerde humane normale capillaire microvasculaire endotheelcellen (HMVECs; uiteindelijke celdichtheid, ~ 5,0 x 10 5 cellen / cm2) in de onderste microkanaal door de identieke werkwijze beschreven in stappen van 2.2.3 tot 2.2.9.
- Plaats een uitgeharde PDMS rechthoekig stuk (0,5 cm x 1 cm x 1 cm, breedte x lengte x hoogte; 15: 1, w/ w elastomeer: verharder) op de top van de darm-on-a-chip apparaat, dan draait u de hele setup-apparaat op zijn kop (dat wil zeggen, de bovenste microkanaal gezichten aan de andere kant, en de lagere microkanaal gezichten aan de bovenkant).
- Incubeer de opstelling in een 37 ° C bevochtigde 5% CO2 incubator gedurende 1 uur om gedissocieerde HMVECs te hechten aan het oppervlak van het poreuze membraan in de onderste microkanaal.
- Neem een hele setup van de CO 2 incubator, en draai de setup opnieuw.
- Flow voorverwarmd co-kweekmedium (een mengsel van de volledige Caco-2 celcultuurmedium en totale HMVECs cultuurmedium, 1: 1 v / v) in zowel bovenste en onderste microkanalen bij 30 ul / uur met mechanische stretching bewegingen ( 10%, 0,15 Hz) gedurende ten minste drie dagen tot cel-cel contacten van een endotheel monolaag vormen.
3. Host-gut Microbiome Co-cultuur in het Gut-on-a-chip microdevice
- Voer pre-cultuur of de bacteriële cellen als volgt samen te cultuur commensal gut microbiome op de microengineered darmvlokken.
- Resuspendeer de gevriesdroogde probiotische bacteriekweek poedervormige mengsel in 10 ml van het mengsel (1: 1, v / v) geautoclaveerd Lactobacilli MRS bouillon en Reinforced Clostridium Medium.
- Pas de uiteindelijke celdichtheid ongeveer 0,2 eenheden optische dichtheid (bij 600 nm) door toevoeging van geschikte hoeveelheid drager, vervolgens 3 ml aliquot van microbiële celsuspensie in een 10 ml steriele wegwerpbare buis.
- Plaats de buisjes bevattende microbiële cellen geresuspendeerd in de anaërobe container. Voeg twee pakjes anaërobe gasvormende sachet in de container. Het vat deksel stevig en incubeer de container opgezet zonder schudden in een 37 ° C bevochtigde 5% CO2 incubator O / N.
- Enten van Microbiome en Co-cultuur met darmepitheelcellen 5,10.
- Bereid 3 ml wegwerp spuiten met ontgast antibiotic-vrij celkweekmedium (dat wil zeggen, DMEM met 20% FBS). Zie 2.1.6 voor het ontgassen procedure van het kweekmedium.
- Neem een hele opzet van de darm-on-a-chip apparaat met microengineered villi van de CO 2 incubator, ga dan naar de bioveiligheid kast.
- Verwijderen injectiespuiten verbonden Tubing gekoppeld aan de bovenste en onderste microkanalen. Sluit spuiten bereid in 3.2.1 om het apparaat terug te brengen naar de CO 2 incubator, dan vloeien dit antibioticum-vrij kweekmedium gedurende 12 uur voorafgaand aan het zaaien van microbiome.
- Spin down de voorgekweekt probiotische bacteriële mengsel cellen (zie stappen van 3,1) bij 10.000 g gedurende 5 min. Aspireren de supernatant middels vacuüm, vervolgens resuspenderen in een antibiotisch-vrij DMEM medium (uiteindelijke celdichtheid, ~ 1,0 x 10 7 CFU / ml).
- Infuseren de celsuspensie in het lumen van het microkanaal met de "kiemvrij" darmvlokken met een 1 ml wegwerpspuit bevestigd aan een 25G5 / 8 naald. Kan de hechting van microbiële cellen aan de apicale oppervlak van de darmvlokken van ~ 1,5 uur zonder stroom door klemming alle buiseinde.
- Perfuseren de voorverwarmde antibiotica-vrij kweekmedium in zowel de bovenste en onderste microkanalen bij 40 gl / uur met cyclische ritmische vervormingen (10%, 0,15 Hz).
- Voor de co-cultuur van groene fluorescentie eiwit (GFP) -gemerkte E. coli (E. coli GFP, niet-pathogene DH5-alfa E. coli gastheer) cellen met 10,11 microengineered villi, pre-kweken GFP E. coli-cellen in geautoclaveerd LB-medium bij 37 ° C onder schudden voorwaarde (200 rpm) gedurende 12 uur. Herhaal de procedure van 3.2.5 naar 3.2.6 co-cultuur van GFP E. uit te voeren coli-cellen met microengineered villi.
- Afbeelding Cellen 5,8-10
- Voer DIC, epifluorescentie, of een laser scanning confocale microscopie voor het opnemen van microbiële en epitheliale morfologie 5,8,10.
- Voor de DIC imaging, neem een setup van gut-on-a-chip microsysteem van de CO 2 incubator, plaatst u het setup-apparaat op het podium van een microscoop, dan nemen de cel morfologie.
- Voor fluorescentie beeldvorming van villus epitheel stroom PBS wassen van de cellen met 100 pl / uur gedurende 10 minuten.
- Fix villi met 4% (w / v) paraformaldehyde gedurende 15 min. vloeien dan PBS wassen van de cellen met 100 pl / uur gedurende 10 minuten.
- Permeabilize de villi met 0,3% (v / v) Triton X-100 verdund in PBS dat 2% (w / v) runderserumalbumine (BSA) gedurende 10 min. vloeien dan PBS wassen van de cellen met 100 pl / uur gedurende 10 minuten.
- Blok cellen met 2% (w / v) BSA oplossing in PBS gedurende 1 uur. vloeien dan PBS wassen van de cellen met 100 pl / uur gedurende 10 minuten.
- Voeg 300 nM 4 ', 6-diamidino-2-fenylindool dihydrochloride (DAPI) verdund in PBS voor de nucleaire kleuring onder bescherming tegen licht.
- Voeg 25 eenheden / ml van fluorescente phalloidin(Phalloidin-CF647 conjugaat), opgelost in PBS voor de F-actine kleuring onder lichte bescherming.
- Beelden opnemen van de fluorescent gekleurde cellen met een laser scanning confocale microscoop.
Opmerking: Een 25X doelstelling is tijdens de confocale microscopie met de juiste optische zoom toegepast. In figuur 3B werd ongeveer 525X vergroting gebruikt.
- Voer DIC, epifluorescentie, of een laser scanning confocale microscopie voor het opnemen van microbiële en epitheliale morfologie 5,8,10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Aan de menselijke darm gastheer-microbiome ecosysteem in vitro na te bootsen, is het moet een experimenteel protocol bij de stabiele lange termijn co-cultuur van darmbacteriën en menselijke darmepitheelcellen reconstitueren onder fysiologische omstandigheden zoals peristaltiek-achtige mechanica en fluïdumstroming ontwikkelen. Hier maken we gebruik van een biomimetische gut-on-a-chip microdevice (Figuur 1A) co-kweek levende microbiële cellen in direct contact met levende menselijke villi voor een periode van een week of meer in vitro. De intestinale epitheliale cellen vormen spontaan goed gedifferentieerd villi wanneer gekweekt op een zijde van een poreuze ECM beklede membraan in een kanaal van een 2-kanaals microfluïdische apparaat in de aanwezigheid van fysiologisch relevante fluïdumstroming en cyclische mechanische vervormingen 5. De microengineered villi repliceren structuren en functies van het menselijk kleine darmvlokken, waaronder Formatiop van zuilvormige epitheelcellen omzoomd door een apicale brush border, basale proliferatieve crypten met migratie en differentiatie van dochtercellen vorderen van de crypte naar villus tip, hoge niveaus van slijmproductie, verbeterde geneesmiddel metaboliserende activiteit, en verhoogde glucose heropname 8. Levende endotheelcellen worden gekweekt aan de andere kant van dezelfde membraan naar het weefsel-weefsel-grensvlak van de darmwand ontspannen en immuuncellen kunnen worden gekweekt in het systeem en 10. Om de beschermende werking van darmepitheelcellen, tight junction barrière darmvlokken gevormd in een darm-on-a-chip valideren intermitterend gekwantificeerd door het meten van de transepitheliale elektrische weerstand (TEER) 5,10,12. Routinematige controle van TEER waarde vereist om de integriteit van een cel monolaag of darmvlokken schatten op elk moment (bijvoorbeeld, voorafgaand aan het toevoegen bacteriën in het lumen).
7 CFU / ml) geënt in het lumen van de epitheliale microkanaal (Figuur 1B, "inoculatie"). Na microbiële cellen hechten aan het apicale oppervlak van villi in de afwezigheid van stroom voor ~ 1,5 uur (Figuur 1B, "Bevestigen"), fysiologische stroming (40 gl / uur) wordt voortgezet door beide kanalen met cyclische mechanische vervormingen (10% rek bij 0,15 Hz) om ongebonden darmbacteriën en leveren voedingsstoffen verwijderen zowel bacteriële als villus epitheliale cellen (Figuur 1B, "Co-kweek"). Deze co-cultuur protocol kan de stabiele kolonisatie van verschillende soorten probiotische bacteriën in de intervillus ruimte met levensvatbare bacteriële microkolonies wordt gehandhaafd tot twee weken in co-kweek (figuren 2A, 2B). In deze studie, een commercial probiotische formulering die een gemengde populatie van 8 verschillende facultatieve of obligate anaerobe bevat, probiotische stammen van Bifidobacterium breve, B. longum, B. infantis, Lactobacillus acidophilus, L. plantarum, L. paracasei, L. bulgaricus en Streptococcus thermofielen gebruikt.
Deze co-kweekmethode kan breed worden toegepast op de menselijke darm gastheer-microbe ecosysteem emuleren. Bijvoorbeeld, niet-pathogene E. GFP coli samen worden gekweekt op het oppervlak van intestinale villi gekweekt in een darm-on-a-chip apparaat. Gebaseerd op hetzelfde hierboven beschreven protocol, gehecht GFP E. coli cellen op de villi groeien van enkele cellen in 1 uur tot meerdere microkolonies van 3 dagen (Figuur 3A, 1 uur versus 72 uur) die vinden in de intervillus ruimten (figuur 3B, 1 uur versus 72 uur) indien gekweekt onder druppelen stroom (40 gl /h) in aanwezigheid van peristaltiek-achtige vervormingen (10%, 0,15 Hz).
Figuur 1. De menselijke darm-on-a-Chip microphysiological voor gastheer-darm microbiome co-kweek. (A) Een foto (links) en een schema (rechts) van een 2-kanaals, gut-on-a-chip microfluïdische apparaat. Pijlen geven de richting van kweekmedium flow (blauw, top microkanaal, rood, onderaan microkanaal). (B) Schematische diagrammen van de procedure van gastheer-darm microbiome co-cultuur in de darm-on-a-chip. Na darmepitheelcellen vormen villi (~ 100 uur), zijn microbiële cellen opnieuw gesuspendeerd in het celkweekmedium geïntroduceerd in het lumen microkanaal (enting) en de stroming van kweekmedium wordt geschorst ~ 1,5 uur (bijlage). Na microbiële cellen zich aan het apicale oppervlak van de darmvlokken, wordt stroom voortgezet (Co -cultuur). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Co-cultuur van meerdere probiotische bacteriën met intestinale villi in de darm-on-a-chip. (A) Een differentiële interferentie contrast microfoto toont een microkolonie probiotische bacteriële cellen groeien tussen de villi in de darm chip. (B) Een hogere vermogenvergroting van A (zwart gestippeld vierkant) waarop de microkolonie probiotische bacteriële cellen (rode pijl). V, villi; Schaal bar = 20 pm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
ure 3 "src =" / files / ftp_upload / 54344 / 54344fig3.jpg "/>
Figuur 3. Co-cultuur van pathogene, GFP-gelabelde E. coli met intestinale villi in de darm-on-a-chip. (A) Bedekte fluorescentie en DIC microscopische opnamen met 1 en 72 uur, tonen de kolonisatie van GFP E. coli op de darmvlokken gekweekt in de darm-on-a-chip. (B) bekeken Krachtige vergroting van overlappende fluorescentie confocale micrografische genomen op 1 uur en 72 tonen de toename van GFP-gelabelde E. coli van een enkele cel (rode pijl) om een microkolonie (witte pijl). Blauw, kernen; magenta, F-actine; Schaal bar = 30 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Inzicht in gastheer-microbiome interacties is van cruciaal belang voor het bevorderen van de geneeskunde; Echter, traditionele celkweekmodellen uitgevoerd in een plastic schaal of een statische wells plaat ondersteunt de stabiele co-kweek van menselijke intestinale cellen met levende darmorganismen langer dan 1-2 dagen vanwege microbiële cellen meestal overgroeien de zoogdiercellen in vitro. De overgrowing microbiële populatie snel verbruikt zuurstof en voedingsstoffen, daarna overmatige hoeveelheid van metabole afval (bijvoorbeeld organische zuren), die darmwand functies ernstig kan beschadigen en veroorzaken intestinale epitheliale celdood. Derhalve voorkomen de microbiële overgroei dat de uitputting van nutriënten veroorzaakt en de accumulatie van microbiële afval is essentieel voor het behoud van levensvatbare gastheer-microbiome coëxistentie gedurende langere tijd (van dagen of weken) in de co-kweek micromilieu.
Om deze uitdagingen te overwinnen, een microphysiologicalgut-on-a-chip inrichting 5,8 is ontwikkeld om volledig gedifferentieerde menselijke darm villi vormen en de steady-state micromilieu van het darmlumen in vitro. Het ontwerp en functionele eenheden (bijvoorbeeld microfluïdische stroom celkamers, vacuüm aangedreven cyclische vervorming) van een darm-on-a-chip microfluïdische apparaat gemodificeerd nauwkeurig bootsen de fysiologische, fysische en chemische micro-omgeving voor de microbiële co-cultuur 5, 10. De schuifspanning toegepast in de darm-on-a-chip microfluïdische kweek werd bepaald door het fysiologische bereik van luminale stroming in de menselijke darm 5,13. De gastheer-microbe co-cultuur, het handhaven van de "steady-state" van microbiële populatie in het luminale microkanaal van de darm-on-a-chip is cruciaal bij het ondersteunen chemisch en voedingsoogpunt haalbaar omstandigheden. In de darm-on-a-chip microsysteem, is het mogelijk om de intra-luminale steady-state schatten in de darm-on-a-chip van measuring de pH van het kweekmedium en de microbiële celdichtheid. Doordat vers kweekmedium continu stroomt door de microkanalen, hebben zowel microbiële en epitheelcellen niet tekort aan nutriënten ondergaan wanneer de initiële zaaidichtheid van microbische cellen en de volumetrische stroomsnelheid van het kweekmedium worden geoptimaliseerd. Het geconditioneerde medium door het microkanaal stroomt bij een bepaalde volumetrische stroomsnelheid (hier, 40 gl / uur), dus metabolisch afval (bijvoorbeeld, organische zuren) en cellulaire secretomen (bijvoorbeeld cytokinen) wordt continu uit de co verwijderd cultuur micro-omgeving. Aldus kan de darm-on-a-chip inrichting worden beschouwd als een "continue bioreactor" met een stationair micro noodzakelijk en voldoende om te spoelen gebonden of overwoekerd microbiële cellen uit het lumen van de darm microkanaal, waarin generatie vergemakkelijkt van een stabiele microbiële niche binnen 2-3 dagen.
Er zijn cruciaal factors dat als het oplossen van problemen voor de succesvolle co-cultuur van microbiële cellen op de darmvlokken moet worden beschouwd. Ten eerste is het noodzakelijk om de optimale incubatietijd vereist voor de microbiële cellen te hechten aan het oppervlak van villi omdat microbiële adhesie varieert tussen microbiële determineren. Bijvoorbeeld probiotische bacteriën zoals Lactobacillus rhamnosus GG 5, vereisen in het algemeen ~ 1,0-1,5 uur hechten, maar andere microbiële soort korter (bijvoorbeeld pathogene microben) keer vereisen of langer, afhankelijk van de hechting kinetiek 14. Ten tweede moet de initiële zaaidichtheid van de microbiële cellen worden geïdentificeerd omdat overmatige microbiële cel nummers kunnen leiden tot de uitgroei van bacteriën in de vroege fase van co-cultuur, die kunnen interfereren met het bereiken van een stabiele steady-state. Om dit te zaaien dichtheid te optimaliseren, is het raadzaam om het groeiprofiel van de doelgroep microbiële stam te karakteriseren in de antibiotic-vrij celkweekmedium bij verschillende seeding dichtheden. Tenslotte kan een aanpassing van de volumetrische stroomsnelheid afhankelijk van de microbiële species vereist. Bijvoorbeeld, verhoogde stroomsnelheden vereist indien de microbiële cellen zeer snel prolifereren. Experimenteel is bevestigd dat capaciteiten tot 300 ul / uur (0,2 dyne / cm 2) kan de barrièrefunctie van de celmorfologie microengineered villi niet beschadigen (gegevens niet getoond). Hoewel Lactobacillus rhamnosus GG 5, over-the-counter probiotische mengsel VSL # 3, niet-pathogene lab stam E. coli alsook de pathogene enteroinvasieve E. coli-stam 10 werd met succes toegepast voor de lange termijn co-cultuur in de darm-on-a-chip, is het nog steeds nodig om verschillende microbiële species van commensale darmflora besmettelijke pathogene micro-organismen te testen. De cultivability van microbiële cellen in vitro worden overwogen in de aanwezigheid of afwezigheidgastheercellen in het kader van symbiose en effectieve, test van het kweken cultiveerbare darm microbiome is een intrigerende uitdaging. Tenslotte een robuust protocol voor de co-cultuur van zowel aerobe als anaerobe bacteriën in de darm-on-a-chip is een kritische onvervulde behoefte te ontdekken in de toekomst.
Er zijn stappen die genomen kunnen worden om het model te verbeteren, zoals het gebruik van primaire intestinale epitheliale of ongedifferentieerde stamcellen van individuele proefpersonen die specifieke gastro-intestinale aandoeningen zoals de ziekte van Crohn of colorectale kanker; of geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs). Echter, met de groeiende belangstelling in de rol van menselijke microbiome orkestreren menselijke gezondheid en ziekte, de gastvrouw-microbiome co-kweekmethode heeft grote betekenis en potentieel om te worden toegepast op andere gastheer-microbiome ecosystemen in het menselijk lichaam na te bootsen (bv , mondholte 15, 16 huid of urogenitale tract 17). Tenslotte kan deze samenwerking kweekmethode conventionele ontwikkelingsproces van geneesmiddelen vernieuwen door het verbeteren van de voorspelbaarheid in termen van hoe de darm microbiome invloed op de biologische beschikbaarheid, efficiëntie en toxiciteit van nieuwe geneesmiddelverbindingen. Samengevat kan de darm-on-a-chip microphysiological systeem een robuust platform om een stabiele steady-state intestinale micro die kunnen worden gebruikt om gastheer-reconstitueren microbiome ecosysteem vestigen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) containing 25 mM glucose and 25 mM HEPES | Gibco | 10564-011 | Warm it up at 37 °C in a water bath. |
| Difco Lactobacilli MRS broth | BD | 288120 | Run autoclave at 121 °C for 15 min. |
| Poly(dimethylsiloxane) | Dow Corning | 3097358-1004 | 15:1 (w/w), PDMS : cureing agent |
| Caco-2BBE human colorectal carcinoma line | Harvard Digestive Disease Center | Human colorectal adenocarcinoma | |
| Heat-inactivated FBS | Gibco | 10082-147 | 20% (v/v) in DMEM |
| Penicillin-streptomycin-glutamine | Gibco | 10378-016 | 1/100 dilution in DMEM |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Molecular Probes | D1306 | Nuclei staining |
| Phalloidin-CF647 conjugate (25 units/ml) | Biotium | 00041 | F-actin staining |
| Flexcell FX-5000 tension system | Flexcell International Corporation | FX5K | Peristalsis-like stretcing motion (10% cell strain, 0.15 Hz frequency) |
| Inverted epifluorescence microscope | Zeiss | Axio Observer Z1 | Imaging, DIC |
| Scanning confocal microscope | Leica | DMI6000 | Imaging, Fluorescence |
| UVO Cleaner | Jelight Company Inc | 342 | Surface activation of the gut-chip |
| Type I collagen | Gibco | A10483-01 | Extracellular matrix component for cell culture into the chip |
| Matrigel | BD | 354234 | Extracellular matrix component for cell culture into the chip |
| 1 ml disposable syringe | BD | 309628 | Cell and media injection stuff |
| 25 G 5/8 needle | BD | 329651 | Cell and media injection stuff |
| Syringe pump | Braintree Scientific Inc. | BS-8000 | Injection equipment into the chip |
| VSL#3 | Sigma-Tau Pharmaceuticals | 7-45749-01782-6 | A formulation of 8 different commensal gut microbes |
| Reinforced Clostridial Medium | BD | 218081 | Anaerobic bacteria culture medium |
| GasPak EZ Anaerobe Container System with Indicator | BD | 260001 | Anaerobic gas generating sachet |
| 4% paraformaldehyde | Electron Microscopy Science | 157-4-100 | Fixing the cells for staining |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Permeabilizing the cells |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | Blocking agent for staining of the cells |
| Corona treater | Electro-Technic Products | BD-20AC | Plasma generator for fabrication of the chip |
| Steriflip | Millipore | SE1M003M00 | Degasing the complete culture medium |
| Disposable hemocytometer | iNCYTO | DHC-N01 | For manual cell counting |
References
- Turnbaugh, P. J., et al. An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest. Nature. 444, 1027-1031 (2006).
- Tremaroli, V., Backhed, F. Functional interactions between the gut microbiota and host metabolism. Nature. 489, 242-249 (2012).
- Sekirov, I., Russell, S. L., Antunes, L. C. M., Brett Finlay, B. Gut Microbiota in Health and Disease. Physiol. Rev. 90, 859-904 (2010).
- Turnbaugh, P. J., et al. The human microbiome project. Nature. 449, 804-810 (2007).
- Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow. Lab Chip. 12, 2165-2174 (2012).
- Round, J. L., Mazmanian, S. K. The gut microbiota shapes intestinal immune responses during health and disease. Nat Rev Immunol. 9, 313-323 (2009).
- Garrett, W. S., et al. Communicable ulcerative colitis induced by T-bet deficiency in the innate immune system. Cell. 131, 33-45 (2007).
- Kim, H. J., Ingber, D. E. Gut-on-a-Chip microenvironment induces human intestinal cells to undergo villus differentiation. Integr Biol. 5, 1130-1140 (2013).
- Huh, D., Kim, H. J., et al. Microfabrication of human organs-on-chips. Nat Protoc. 8, 2135-2157 (2013).
- Kim, H. J., Li, H., Collin, J. J., Ingber, D. E. Contributions of microbiome and mechanical deformation to intestinal bacterial overgrowth and inflammation in a human gut-on-a-chip. Proc. Natl. Acad. Sci. 113, E7-E15 (2016).
- Miller, W. G., Lindow, S. E. An improved GFP cloning cassette designed for prokaryotic transcriptional fusions. Gene. 191, 149-153 (1997).
- Odijk, M., et al. Measuring direct current trans-epithelial electrical resistance in organ-on-a-chip microsystems. Lab Chip. 15, 745-752 (2015).
- Lentle, R. G., Janssen, P. W. Physical characteristics of digesta and their influence on flow and mixing in the mammalian intestine: a review. J Comp Physiol B. 178, 673-690 (2008).
- Granato, D., et al. Cell surface-associated lipoteichoic acid acts as an adhesion factor for attachment of Lactobacillus johnsonii La1 to human enterocyte-like Caco-2 cells. Appl Environ Microbiol. 65, 1071-1077 (1999).
- Dewhirst, F. E., et al. The human oral microbiome. J Bacteriol. 192, 5002-5017 (2010).
- Grice, E. A., Segre, J. A. The skin microbiome. Nat Rev Microbiol. 9, 244-253 (2011).
- Hay, P. E., et al. Abnormal bacterial colonisation of the genital tract and subsequent preterm delivery and late miscarriage. Br Med J. 308, 295-298 (1994).
