Summary
Biz, insan bağırsak-on-a-chip microphysiological sistemi kullanılarak uzun bir süre için bir in vitro protokole ko-kültür bağırsak mikrobiyomları ve bağırsak villi açıklar.
Abstract
Burada, bir insan bağırsak-on-a-chip microphysiological cihazda microengineered bağırsak villi çoklu tür uzun süreli ko-kültür, insan bağırsak mikrobiyomları gerçekleştirmek için bir protokol açıklar. Biz fizyolojik, mekanik deformasyonlar ve sıvı kayma akışı sürekli peristalsis taklit uygulanır mikroakışkan bir cihaz, bağırsak lümen-kapiller doku arayüzü özetlemek. Lümen mikrokanal olarak, insan bağırsak epitel Caco-2 hücreleri, bir 'mikropsuz' villus epitel oluşturulması ve ince bağırsak villi yeniden oluşturmak için kültürlenmiştir. Önceden kültürlenmiş mikrobik hücreler, bir konak-mikrop ekosistem kurmak için lümen tarafına aşılanır. mikrobiyal hücreler villi apikal yüzeyine yapışmasını sonra sıvı akışı ve mekanik deformasyonlar bir kalıcı-hal, taze kültür vasatı sürekli olarak tedarik edildiği mikro-ve bağlanmamış bakterileri (bakterial atıklar) sürekli kaldırılır üretilmesi için devam edilir. Genişletilmiş ko-kültür f sonrasıhaftaya ROM gün birden mikrokoloniler rastgele tüyleri arasında yer tespit edilmiştir ve mikrobik ve epitel hücreleri hem de kültür içinde, en az bir hafta boyunca sürekli ve işlevsel kalır. Bizim eş-kültür protokolü sağlık ve hastalık olayını insan mikrobiyomu rolü in vitro çalışmada kolaylaştırabilir çeşitli insan organ bulunabilir diğer host-mikrobiyomları ekosistemlere için çok yönlü bir platformu sağlamak için adapte edilebilir.
Introduction
İnsan bağırsak mikrobiyal türlerin şaşırtıcı çeşitli bir dizi (<1.000 tür) ve muazzam bir mikrobiyal hücrelerin sayısını (insan konakçı hücrelere göre 10 kat daha fazla) ve gen (insan genomu 100 kat daha fazla) 1 barındırır. Bunlar insan microbiomes, besin ve xenobiotik metabolize bağışıklık tepkilerini düzenleyen ve intestinal homeostasis 2 korumada önemli bir rol oynamaktadır. Beklendiği gibi, bu farklı fonksiyonlar verilmiş, ortakçı bağırsak mikrobiyomları yoğun sağlık ve hastalık 3 modüle eder. Böylece, bağırsak mikrobiyomları ve konak-mikrop etkileşimlerinin rolünü anlamak gastrointestinal (GI) sağlığı teşvik ve bağırsak bozuklukları 4 için yeni tedavi ajanlarının keşfetmek için büyük önem taşımaktadır. Bununla birlikte, nitro bağırsak modellerinde (örneğin, statik kültürler) mevcut kısa bir süre (<1 gün) mikrobiyal hücreleri aşırı büyütmesi ve bağırsak bariyeri tehlikeye çünkü ana-mikrobiyomları ko-kültür kısıtlamafonksiyonu 5. Yedek hayvan modelleri (örn mikropsuz 6 ya da genetik mühendisliği farenin 7), genel olarak kolonizasyon ve insan bağırsak mikrobiyomu stabil bakımı zordur, çünkü ana-bağırsak mikrobiyomları karışma çalışma için kullanılmaz.
Bu zorlukların üstesinden gelmek için, biz son zamanlarda yaşayan insan bağırsağında meydana gelen 5,8 konak-bağırsak mikrobiyomları etkileşimleri taklit "Gut-on-a-Chip" microphysiological sistemi (sol Şekil 1A) bir biomimetic insan geliştirdi. Gut-on-a-chip mikrovasıta esnek, gözenekli, hücre dışı matrisin (ECM) insan bağırsak epitel Caco-2 hücreleri ile kaplı -kaplı membran, bağırsak lumen kapiler doku arabirimi (Şekil 1A taklit mesafeyle ayrılmış iki paralel mikroakışkan kanal içerir sağ) 9. Vakum odaklı halkalı ritmik deformasyonlar normalde induc değişiklikleri taklit fizyolojik mekanik deformasyonlara neden(sağ Şekil 1A) peristaltizm ile ed. İlginç bir şekilde, Caco-2 hücreleri 100'den saat bağırsak-on-a-çipte yetiştirilen, kendiliğinden sıkış kesişmeler, apikal fırça sınır bazal kript sınırlı proliferatif hücreleri ile üç boyutlu (3D), bağırsak villi oluşturur, mukus üretimi, artan ilaç metabolize aktivite (örneğin, sitokrom P450 3A4, CYP3A4) ve geliştirilmiş glukoz alım 8. Bu 'mikropsuz' mikro olarak, probiyotik Lactobacillus rhamnosus GG veya en fazla iki hafta içinde 5,10 host epitel hücreleri ile bir probiyotik bakteri karışımının terapötik oluşumu için ortak-kültür mümkündü.
Bu çalışmada, bir süre için bağırsak-on-a-yongalara ana bilgisayar bağırsak mikrobiyomları ko-kültür gerçekleştirmek için ayrıntılı protokol açıklar. Ayrıca, kritik konuları ve potansiyel zorlukları tartışmak bu konak-mikrobiyomları ko-kültür p geniş bir uygulama için dikkat edilmesi gerekenrotocol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bir Gut-on-a-chip Cihazının 1. Mikro ve
Not: bağırsak-on-a-çip esnek mesafeyle ayrılmış iki paralel mikrokanallar (1 mm genişlik x 150 mm yükseklik x 1 cm uzunluğunda) ihtiva eden saydam, gaz geçirgen, silikon polimer (polidimetilsiloksan, PDMS) tarafından yapılan bir mikroakışkan cihazdır gözenekli (gözenek çapı 10 mikron, aralık gözenek 25 mikron gözenek) membran 5,9 PDMS. Sağlanan adımları izleyerek gut-on-a-chip (sol Şekil 1A) Üretiyor.
- Gut-on-a-chip 5,9 mikroimalat Prosedürü.
- PDMS prepolimer ve pişirme amilinin karıştırılması ile vulkanize edilmemiş, gazı alınmış PDMS hazırlama (15: ağırlık / ağırlık olarak 1) ve 30 dakika süre ile, vakum desikatörde yerleştirin.
- 30 g sırasıyla, SU-8, üst tabanlı micropatterns ve bağırsak-on-a-chip alt mikrokanallar olan her silikon kalıp üzerine vulkanize edilmemiş, gazı alınmış PDMS, 3 g dökün. Daha sonra lt kuru fırında 60 ° C'de tedavidoğu 4 saat.
- Cerrahi bir neşter kullanılarak kenarı etrafında kesim her silikon kalıp üst ve alt PDMS katmanları Çekiç yerine. biyopsi zımba (delik çapı 2.0 mm) kullanılarak 6 delik (iki girişleri, iki çıkışları ve iki vakum odaları) Punch.
- w 1: Düz ile bindirilirken yuvarlak sütunlar (çapı 10 mikron, yüksekliği 25 mm) ile yazılan dizileri içeren bir Silanlanmış silikon gofret sertleşmemiş ve gazı alınmış PDMS 10 g dökerek gözenekli membran hazırlayın, PDMS destek katmanı (15 Silanlanmış / a; 1 cm kalınlığında). kurulum 3 kg ağırlık baskı ayağı yerleştirin ve 12 saat veya daha uzun süre 60 ° C'de polimer tedavi.
- dikkatle gofret slab köşesini yukarı kaldırarak ve gözenekli PDMS membran tamamen gofret ayrılmış kadar soyulması ile silikon gofret PDMS destek levha yapıştırılmış bir gözenekli PDMS membran kurulumu Çekiç yerine.
- PL ve gözenekli membran kısım: bir üst tabaka kanalı Side (1 w / w PDMS, 15) açığaasma sırasıyla 1 dakika ve 3 saniye için bir el korona işlemci tarafından üretilen.
- herhangi bir hava kabarcığı olmadan paralel olarak her parçası koyarak bir konformal temas gözenekli PDMS membran ve üst mikrokanal tabakasının plazma tedavi yüzeyler yerleştirin.
- İki PDMS katmanları geri dönüşümsüz bağlanma 80 ° CO / N de tüm kurulum kuluçkaya yatmaktadır.
- dikkatle destek katmanı köşesini yukarı kaldırarak ve destek tabakası tamamen membran ile üst tabakadan ayrılır kadar soyulması ile bir gözenekli zar ile bir üst tabakanın montaj PDMS destek katmanı soyulabilir.
- içi boş vakum odalarına yapmak için bir ucu ince cımbız kullanarak vakum odaları (ana kanalın iki tarafında yer alan iki bölme) üzerinde bulunan bu zarın kısımlarını koparın.
- i tarif edildiği gibi üst parçası ve aynı şekilde plazma alt parçasının üzerine kazınmış kanallı tarafında takılı membran ile yan Açığan, 1 dakika boyunca 1.1.6 aşama.
- Bir Stereoskop altında herhangi bir hava kabarcığı olmadan paralel olarak her parçası koyarak bir konformal kişiyle gözenekli zar ile üst mikrokanallı katmanı ve alt tabaka hizalayın.
- mikroakışkan hücre kanalına önümüzdeki iki içi boş vakum odaları içeren eksiksiz bir ölçek gut-on-a-chip mikroakışkan cihaz üretmek için 80 ° CO / N kuru bir fırında tüm kurulum Cure.
- 90 ° bükülmüş paslanmaz çelik künt uç iğne yoluyla gut-on-a-chip üst veya alt mikrokanallar bağlantılı her port girişine ve çıkışına hortumu bağlayın.
- 90 ° bükülmüş paslanmaz çelik künt uç iğne kullanarak vakum odalarına bağlantılı deliklere hortumu bağlayın.
- Tek kullanımlık şırınga steril 1 ml ile% 70 (h / h) etanol akan mikrokanallar ve tüp sterilize edin.
- 60 ° C kuru fırın O / N mikrokanallar ve boruyu kurur.
Microengine 2. BüyümeGut-on-a-chip Aygıt mada kullanılabilir Bağırsak Villi
- Bir Gut-on-a-chip microdevice 5,9 Tohum Bağırsak Hücrelerine (örn Caco-2BBE).
- % 70 ile 60 ° C kuru fırında O kurutmayla 1 ml steril bir şırınga kullanılarak (hacim / hacim) etanol (adım 1.4) ürünü sterilize / N yüzey aktivasyonu öncesinde (adım 1.5).
- Bağırsak-on-a-chip Microsystem'ait tam setup Açığa (yani, vücut bağırsak-on-a-chip boru bağlı) aynı anda 40 dakika boyunca UV ışığı (253.7 nm), ve ozona.
- Bir biyo-güvenlik kabini (BSC) UV ışık altında 15 dakika boyunca oda sıcaklığında cihazın soğumasına.
- tek kullanımlık bir ile üst ve alt mikro halinde - I kolajen 50 ug / ml tip ve serumsuz Dulbecco Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı (DMEM) içinde seyreltilmiş 300 ng / ml hücre dışı matris karışımı bir karışımı, çözüm ECM kaplamanın 100 ul tanıtılması steril 1 ml şırınga.
- doğmuş iyileşmesini37 ° C'de tüm ayar te 1 saat boyunca% 5 CO2 inkübatöründe nemlendirilmiş.
- Gazını önceden ısıtılmış (37 ° C) tam kültür ortamında (DMEM,% 20, h / h, fetal sığır serumu (FBS), 100 birim / ml penisilin ve 100 ug / ml streptomisin, 50 mi; 3 ml bölünüp 1 dakika için BSC 50 mi filtrasyon sistemi ile (gözenek büyüklüğü 0.45 um) kullanılarak tek kullanımlık şırınga).
- filtrasyon sistemi ile önceden ısıtılmış orta geçmek ve 1 dakika orta kabarcıkları veya çözünmüş gaz çıkarmak için filtrelenmiş ortamda yavaşça dokunun.
- 37 ° C'de 3 ml tek kullanımlık şırınga içinde gazı alınmış tam orta kısım koyun ve inkübe 1 saat boyunca% 5 CO2 inkübatöründe nemlendirilmiş.
- Üst ve alt mikrokanallarla, iki 3 ml'lik tek kullanımlık şırıngalar gazdan arındırılmış içeren önceden ısıtılmış tam kültür ortamı bağlayın.
- hacimsel bir şırınga pompası kullanılarak, üst mikrokanal içinde gazı alınmış tam hücre kültürü ortam akış37 ° C (0.02 din / cm2'de kesme stresi eşdeğer), 30 ul / saat akış hızı ile O / N,% 5 CO2 inkübatöründe nemlendirilmiş.
- Gut-on-a-chip içinde Microengineered Caco-2 Villi oluşumu.
- 50 ile 65 arasında geçiş sayısı ile Caco-2BBE hücreleri kullanır.
- 37 ° C kadar tam kültür ortamı ihtiva eden bir T75 şişesi içinde, Caco-2 hücreleri büyütün tamamen konfluent hücreler elde etmek için 4-5 gün boyunca% 5 CO2 inkübatöründe nemlendirilmiş.
- Tam bir T75 şişesi içinde yetiştirilen birleşen Caco-2 hücreleri, daha sonra, hücrelerin yıkayın PBS dışarı aspire PBS içermeyen 2+ Ca 2 + ve Mg 10 ml ekleyin. İki kez bu adımı yineleyin.
- 37 ° C'de% 0.05 tripsin / EDTA solüsyonu 1 ml ilave edilir ve kuluçkaya 5 dakika boyunca,% 5 CO2 inkübatöründe nemlendirilmiş.
- yukarı pipetleme ve üç beş kez aşağı (FBS) ile önceden ısıtılmış tam hücre kültür ortamı 10 ml ayrışmış hücreleri tekrar süspansiyon.
- c hücre süspansiyonu aşağı Spin5 dakika boyunca 500 xg'de entrifugation sonra supernatant çıkarın.
- Yine 1 ml cihazda ~ 1.5 x 10 5 hücre / cm 2 hücre yoğunluğunu ayarlamak için tam orta önceden ısıtılmış süspanse edin. hücre yoğunluğu tahmin etmek hemasitometre kullanın.
- Üst mikrokanal bağlı boru çıkışına 25 G5 / 8 iğneye bağlanmış bir 1 ml tek kullanımlık şırınga yerleştirilerek üst mikrokanal (lümen taraf) olarak yeniden süspansiyon haline getirildi, Caco-2 hücrelerinin 100 ul infüze.
- bağlayıcı klipleri kullanarak üst ve alt Mikrokanallardaki bağlı tüm giriş ve boru çıkışları kelepçe.
- 1 saat boyunca 37 ° C, nemlendirilmiş bir% 5 CO2 inkübatörü içinde inkübe tüm kurulum gözenekli membran yüzeyine yapışması Caco-2 hücreleri kesilerek izin verilmesi.
- kelepçeleri çıkarın ve hücreleri 24-36 st için sağlam bir tek tabaka oluşturacak kadar bir şırınga pompası kullanılarak, sadece 30 ul / saat üst mikrokanal kültür ortamının akışı devam ettirir. Faz contras kullanınT veya diferansiyel girişim kontrast (DIC) mikroskopi, bir hücre bir tek tabaka hücre-hücre kavşaklar teyit etmek için.
- Hücreler bir tek tabaka oluşturur, 30 ul / saat aynı akış hızında hem üst (lümen) içerisine kültür ortamı ve alt (kılcal tüp) mikrokanallar serpmek.
- Peristaltizmin benzeri hareketleri 5,9 taklit mekanik deformasyonlar uygulanması.
- gerilim ekipmanları ile donatılmış vakum pompası açın.
- paslanmaz çelik bir konektör ile boru vasıtasıyla vakum kontrolöre elektrik ölçme cihazı.
- Vakum kontrol yazılım üzerinde döngüsel sinüs fonksiyonu modu ile 0.15 Hz frekansta% 10 ortalama hücre suşu germe hareketi ayarlayın ve ardından "Başlat" a tıklayın.
- ~ 100 saat için mekanik deformasyonlar altında birleşik Caco-2 tek katman için üst ve alt mikrokanal kültür ortamının sabit akış (30 ul / saat) (% 10, 0.15 Hz) tutun.
Not: Caco-2 hücreleri Sponspontan olarak epitel mikrokanal 5,8-10 lümenine doğru uzatılmış dalgalı 3D projeksiyonlar villus morfolojilerinden tabi tutulurlar.
- , Gut-on-a-chip 10 lümen-kapiller doku arayüzü ile yaşayan insan bağırsağında organ düzeyinde fonksiyonlarını taklit anlatıldığı gibi adımları izleyin.
- 2.1 ila 2.2 adımları yineleyerek microengineered Caco-2 villuslar büyütün.
- Önceden ısıtılmış ko-kültür ortam akış (komple Caco-2 hücre kültür ortamı ve tam HMVECs kültür ortamında oluşan bir karışım, 1: 1 hacim / hacim), 30 ul / saat sonra, üst ve alt mikrokanallarla.
- Ayrışmış normal insan kılcal mikrovasküler endotel hücreleri, 100 ul ilave edilmiştir (HMVECs, nihai hücre yoğunluğu, ~ 5.0 x 10 5 hücre / cm2) 2.2.3 den 2.2.9 adımları tarif benzer yöntemle düşük mikrokanalın içine.
- iyileştirilmiş bir dikdörtgen PDMS parça yerleştirin (0.5 cm x 1 cm x 1 cm, genişlik x uzunluk x yükseklik, 15: 1, B/ elastomer w: sertleştirici) gut-on-a-chip cihazının üst kısmındaki, sonra baş aşağı tüm cihaz kurulum çevirmek (), yani üst mikrokanallı olumsuz karşı karşıya ve alt mikrokanal yukarı doğru bakmaktadır.
- Ayrışmış HMVECs düşük mikrokanal gözenekli membran yüzeyine yapışma sağlamak için 1 saat boyunca 37 ° C, nemlendirilmiş bir% 5 CO2 inkübatörü içinde setup inkübe edin.
- CO 2 inkübatör bir bütün kurulum dışarı atın ve tekrar kurulum çevirin.
- mekanik germe hareketleri ile 30 ul / saat, her iki üst ve alt mikro halinde ((1 h / h 1 tam Caco-2 hücre kültür ortamı ve tam HMVECs kültür ortamında oluşan bir karışım), önceden ısıtılmış ko-kültür ortam akış en az üç gün boyunca% 10, 0.15 Hz), endotel tek tabaka hücre-hücre bağlantı yerleri meydana getirmek.
3. Bir Gut-on-a-chip microdevice mikrobiyomu Co-kültür Konak-gut
- o kültür öncesi gerçekleştirinf bakteriyel hücreler microengineered bağırsak villus üzerinde için birlikte kültür ortakçı gut mikrobiyomları aşağıdaki gibi.
- otoklava Laktobasil MRS bulamacında ve Güçlendirilmiş Klostridial Orta (1, hac / hac 1) karışımın 10 ml dondurularak kurutuldu probiyotik bakteri ve toz halindeki karışımı yeniden süspanse edin.
- 10 ml'lik atılabilir steril bir tüp içinde olan kan daha sonra, mikrobiyal hücre süspansiyonu 3 ml ortam içinde uygun bir miktarının ilave edilmesi ile (600 nm), yaklaşık olarak 0.2 optik yoğunluk birimi nihai hücre yoğunluğu ayarlayın.
- Tüpler anaerobik kap içinde mikrobik hücreler yeniden süspansiyon haline getirilmiş içeren. kap içinde anaerobik gaz üreten poşet iki paket ekleyin. 37 ° C sallayarak olmadan konteyner kurulumu sıkıca konteyner kapağını kapatın ve inkübe% 5 CO 2 inkübatör O / N nemlendirilmelidir.
- Bağırsak Hücrelerine 5,10 ile mikrobiyomları ve Co-kültür aşılama.
- gazı alınmış antibioti ihtiva eden 3 mi atılabilir şırıngalar hazırlanmasıCı içermeyen hücre kültür ortamı (yani,% 20 FBS bulunan DMEM). Kültür ortamının gaz giderme prosedürü için 2.1.6 bakınız.
- CO 2 inkübatör microengineered villuslar içeren gut-on-a-chip cihazının bütün bir kurulum dışarı atın, sonra biyogüvenlik kabini taşıyın.
- Üst ve alt Mikrokanallardaki bağlantılı boru bağlı şırınga çıkarın. Daha sonra, önceki mikrobiyomu tohumlanmasından 12 saat için antibiyotik içermeyen kültür ortamı, akış geri CO2 inkübatör getirmek cihaza 3.2.1 hazırlanan şırınga bağlayın.
- 5 dakika boyunca 10.000 xg'de öncesi kültüre probiyotik bakteri karışımı hücreleri (3.1 adımlara bakın) aşağı doğru döndürün. Vakum kullanılarak süpernatan üzerinden aspire, daha sonra (~, nihai hücre yoğunluğu 1.0 x 10 7 cfu / ml), antibiyotik içermeyen DMEM ortamı içinde yeniden süspanse edin.
- Bir 25 bağlı bir 1 ml tek şırınga kullanarak "germ-free" bağırsak villus içeren Mikrokanallı lümen tarafında içine hücre süspansiyonu demlenmeyeG5 / 8 iğne. için bağırsak villus apikal yüzeyinde mikrobiyal hücrelerin yapışmasını izin ~ tüm boru sonuna kadar sıkma yoluyla akışı olmadan 1.5 saat.
- 40 ul / siklik ritmik deformasyonlarla saat (% 10, 0.15 Hz), her iki üst ve alt mikro içine önceden ısıtılmış antibiyotik içermeyen kültür ortamı serpmek.
- Yeşil floresan protein ko-kültürü (GFP) E. -etiketli için E. coli (GFP E.coli, Sigara patojenik DH5-Alpha E. Coli konak) microengineered villus ile 10,11 hücreleri, ön yetiştirmek GFP E. 12 saat boyunca durum (200 rpm) çalkalama altında 37 ° C'de otoklavda muamele LB ortamında coli hücreleri. GFP E. co-kültür yürütmek için 3.2.5 den 3.2.6 için prosedürü tekrarlayın microengineered villi olan E. coli hücreleri.
- Görüntü Hücreler 5,8-10
- Mikrobik ve epitel morfolojisi 5,8,10 kayıt için DIC, Epifloresans veya lazer tarama konfokal mikroskopi gerçekleştirin.
- DIC görüntüleme için CO 2 inkübatör gut-on-a-chip Mikrosistem bir kurulum çıkarmak mikroskop sahnede cihaz kurulumu koyun, daha sonra hücre morfolojisi kaydedin.
- villus epitel flüoresan görüntüleme için, 10 dakika boyunca 100 ul / saat hücreleri yıkamak için PBS akar.
- % 4, 15 dakika boyunca (ağırlık / hacim) paraformaldehid villi sabitleyin. Daha sonra 10 dakika boyunca 100 ul / saat hücreleri yıkamak için PBS akar.
- % 0,3 ile villi geçirgenliği (h / h) Triton X-100, PBS, 10 dakika boyunca büyükbaş hayvan serum albümini (BSA) (ağ / hac)% 2 ihtiva eden seyreltilmiştir. Daha sonra 10 dakika boyunca 100 ul / saat hücreleri yıkamak için PBS akar.
- % 2 blok hücreler 1 saat süreyle PBS içinde BSA çözeltisi (w / v). Daha sonra 10 dakika boyunca 100 ul / saat hücreleri yıkamak için PBS akar.
- 4 300 nM 'ışık koruması altında nükleer boyama süreyle PBS içinde seyreltilmiş 6-diamidino-2-fenilindol dihidroklorür (DAPI) çözeltisi ekleyin.
- floresan Phalloidin 25 ünite / ml ekleIşık koruma altında F-aktin boyanması için PBS içinde çözülmüş (Phalloidin-CF647 konjuge).
- Bir lazer tarama konfokal mikroskop kullanılarak floresan lekeli hücrelerin rekor görüntüler.
Not: Bir 25X objektif konfokal mikroskopi sırasında uygun optik zoom ile uygulanmıştır. Şekil 3B'de, yaklaşık 525X büyütme kullanılmıştır.
- Mikrobik ve epitel morfolojisi 5,8,10 kayıt için DIC, Epifloresans veya lazer tarama konfokal mikroskopi gerçekleştirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In vitro olarak insan bağırsak ana-mikrobiyomları ekosistem taklit etmek için, bunun gerektiğinde bu peristalsis gibi mekanik ve sıvı akışı gibi, fizyolojik koşullar altında bağırsak bakteri ve insan bağırsak epitel hücrelerinin istikrarlı, uzun vadeli ko-kültür tekrar oluşturmak için bir deney protokolü geliştirmektir. Burada, bir biomimetic gut-on-a-chip microdevice kullanmak (Şekil 1A), in vitro olarak bir hafta boyunca ya da daha fazla insan villi oturma ile doğrudan temas içinde mikrobik canlı hücreler-kültür co. Bağırsak epitelial hücreler kendiliğinden iyi diferansiye villi oluşturduklarında fizyolojik olarak uygun sıvı akışı ve siklik mekanik deformasyonlar 5 mevcudiyetinde bir 2 kanallı mikroakışkan cihazın bir kanalda bir gözenekli ECM ile kaplanmış bir zarın bir tarafı üzerinde kültürlenmiştir. microengineered villus insan ince bağırsak villus dahil olmak üzere biçimlendirme yapılarını ve fonksiyonlarını çoğaltmakapikal fırça sınırı ile kaplı sütunlu epitel hücrelerinde, göç ve villus ucu, mukus üretimi, gelişmiş ilaç metabolize aktivite ve artan glikozun geri kazanımının 8 yüksek seviyede crypt ilerleyen kızı hücrelerin farklılaşması ile bazal proliferatif kript üzerinde. Oturma endotel hücreleri, bağırsak duvarının doku doku arayüzü yeniden aynı zarın karşı tarafında kültürlenebilir ve bağışıklık hücrelerinin yanısıra 10 sistemde kültürlenebilir. Bağırsak epitel hücreleri, bağırsak-on-a-chip oluşan bağırsak villi sıkı birleşim bariyer koruma fonksiyonu doğrulamak için aralıklı transepitelyal elektrik direnci (TEER) 5,10,12 ölçülerek hesaplanır. TEER değerinin rutin izleme her noktada bir hücre tek tabaka veya bağırsak villus bütünlüğünü tahmin etmek gereklidir (örneğin, lümenine bakteri eklemeden önce).
7 cfu / ml X) epitel mikrokanalın lümenine aşılanır (Şekil 1B, "Aşılama"). Mikrobiyal hücrelerin ~ 1.5 saat akışının olmaması (Şekil 1B, "Ek"), fizyolojik akışı (40 ul / saat) olarak villus apikal yüzeyinde yapışır sonra (siklik mekanik deformasyonlar hem kanallardan% 10 suşu devam edilir 0.15 Hz) hem bakteriyel ve villus epitel hücreleri (Şekil 1B, "Co-kültür") ile ilişkisiz bağırsak bakteri ve tedarik besinleri kaldırmak için. Canlı bakteriyel mikrokoloniler ko-kültür iki haftaya kadar (Şekil 2A, 2B) için muhafaza edilir, bu ko-kültür protokolü intervillus alanı probiyotik bakterilerin çok türlerin sabit kolonizasyonu sağlar. Bu çalışmada, bir ko8 farklı fakültatif veya zorunlu anaerobik oluşan karışık bir nüfus içeren mmercial probiyotik formülasyonu, Bifidobacterium breve, B. probiyotik suşları longum, B. infantis Lactobacillus acidophilus, L. plantarum, Lactobacillus paracasei, L. bulgaricus, Streptococcus Termofiller kullanılır.
Bu ko-kültür yöntemi geniş insan bağırsak konak-mikrop ekosistemini taklit etmek uygulanabilir. Örneğin, patojenik olmayan GFP E. E. coli ortak-kültürlenir olabilir bağırsak-on-a-yongalara yetiştirilen bağırsak villi yüzeyi üzerinde. Aynı protokolüne dayanan GFP E. yapıştırılır, yukarıda açıklanan coli villus üzerindeki hücreler intervillus alanlarda damlatmalı altında iken kültür (Şekil 3B, 1 saat vs 72 saat) bulmak 3 gün ile birden mikrokoloniler (Şekil 3A, 1 saat vs 72 saat) 1 saat sonra tek hücre büyür akış (40 ul /peristaltizmin benzeri deformasyonların mevcudiyetinde saat) (% 10, 0.15 Hz).
Şekil 1. İnsan Gut-on-a-Chip konak-bağırsak mikrobiyomları ko-kültür için microphysiological sistemi. (A) fotoğraf (solda) ve 2-kanal şematik (sağda), gut-on-a-chip mikroakışkan cihaz. Oklar kültür ortamı akışının yönünü gösterir (mavi, üst mikrokanalda, kırmızı, alt Mikrokanallı). (B), bağırsak-on-a-chip ana bilgisayar bağırsak mikrobiyomları ko-kültür prosedürü şematik diyagramlardır. Bağırsak epitelial hücreler villi (~ 100 saat) meydana sonra hücre kültür ortamı içinde yeniden süspansiyon haline getirildi mikrobiyal hücreler, lümen mikrokanal (aşılama) kişiye, daha sonra kültür ortamının akış ~ 1.5 saat (Ek) askıya alındı. mikrobiyal hücrelerin bağırsak villus apikal yüzeyine yapışmasını sonra, akış (Co devam eder -Kültür). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Gut-on-a-chip bağırsak villi çoklu probiyotik bakterilerin Şekil 2. Co-kültür. (A), farklılık belirleyici kontrast mikrografı bağırsak chip tüyleri arasında artan probiyotik bakteri hücreleri bir microcolony göstermektedir. Probiyotik bakteri hücrelerinin microcolony (kırmızı ok) gösteren (B) A'nın yüksek güç büyütme görünümü (siyah noktalı kare). V, villus; Ölçek çubuğu = 20 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
ure 3 "src =" / files / ftp_upload / 54344 / 54344fig3.jpg "/>
Patojenik olmayan, GFP-etiketli E. Şekil 3. Co-kültür gut-on-a-chip bağırsak villus ile E. coli. (A) Kaplanmış floresan ve DIC mikroskobik görüntüleri GFP E. kolonizasyonu görüntüleyen 1 ve 72 saatte alınan gut-on-a-chip yetişen bağırsak villuslarda üzerinde coli. (B) GFP etiketli E. büyümesini gösteren 1 ve 72 saatte alınan Kaplanmış floresan konfokal mikrograflar Yüksek güç büyütme görünümleri Bir microcolony için tek bir hücre (kırmızı ok) E. coli (beyaz ok). Mavi, çekirdekler; Eflatun, F-aktin; Ölçek çubuğu = 30 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
konak-mikrobiyomları etkileşimleri anlamak tıp ilerleyen için kritik öneme sahiptir; mikrobiyal hücreler, çok in vitro memeli hücreleri aşırı büyütmesi Ancak, plastik bir kaba veya bir statik oyuklu bir plaka içerisinde gerçekleştirilebilir, geleneksel hücre kültürü modelleri fazla 1-2 gün bağırsak mikrop yaşayan insan bağırsak hücrelerinin kararlı ko-kültür desteklemez. Overgrowing mikrobiyal popülasyon hızlı, daha sonra ciddi şekilde intestinal bariyer fonksiyonları aşmasına ve intestinal epitelyal hücre ölümüne sebep metabolik atıkları (örneğin, organik asitler), aşın miktarda üretilmesi, oksijen ve besin tüketir. Bu nedenle, besin tüketilmesine neden olur mikrobiyal büyüme durdu ve mikrobiyal atıkların birikmesini önlemek ko-kültür mikro-ortamında (hafta gün) uzun bir süre için uygun bir konak-mikrobiyomları bir birliktelik sürdürülmesi için çok önemlidir.
Bir microphysiological bu zorlukların üstesinden gelmek içingut-on-a-chip cihaz 5,8 tamamen farklılaşmış insan bağırsak villuslar oluşturmak ve in vitro bağırsak lümen kararlı durum mikro korumak için geliştirilmiştir. Tasarım ve fonksiyonel birimler (örneğin, mikroakışkan akış hücresi odaları, vakum tahrikli halkalı deformasyonlar) mikroakışkan cihaz tam mikrobiyal ko-kültür 5 fiziksel fizyolojik ve kimyasal mikro taklit etmek için modifiye edilmiş gut-on-a-chip bir, 10. Gut-on-a-chip mikroakışkan kültür, uygulanan kesme stresi, insan bağırsak 5,13 luminal akış fizyolojik aralığı ile belirlenmiştir. konak-mikrop ko-kültür için, gut-on-a-chip lümen mikrokanalda mikrobiyal nüfusun "kararlı duruma" korumak, kimyasal ve besin uygun koşulların destekleyici önemlidir. gut-on-a-chip Microsystem'ait olarak, içi lümen, sabit-duruma tahmin etmek mümkündür bağırsak-on-a-chip measuri göreKültür ortamı ve mikrobiyal hücre yoğunluğu pH ng. Taze kültür ortamı sürekli mikro akar için mikrobik hücre Başlangıç tohum yoğunluğu ve kültür ortamının hacimsel akış hızı için optimize edilmiş olduğunda, mikrobik ve epitel hem hücreler besin tüketme uğramaz. Mikrokanal geçen koşullandırılmış ortam şekilde metabolik atıkları (örneğin, organik asitler) ve hücresel secretomes (örneğin, sitokinler) sürekli CO- çıkarılır tanımlanmış bir hacimsel akış hızı (burada, 40 ul / saat) dışarı akar kültür mikroçevresinin. Böylece, gut-on-a-chip cihazı üretilmesini kolaylaştırır gerekli ve etkili bağırsak mikrokanal lümeni ilişkisiz veya büyümüş mikrobiyal hücrelerin yıkamak için yeterli bir kararlı durum mikroçevresinin, bir "sürekli biyoreaktör" olarak kabul edilebilir 2-3 gün içinde istikrarlı bir mikrobiyal niş.
önemli fa vardırbağırsak villus mikrobiyal hücrelerin başarılı ko-kültür için sorun giderme olarak kabul edilmelidir vektörlerin içine klonlanabilir. İlk olarak, mikrobiyal eklemleme mikrop türleri arasında değişebilir, çünkü villi yüzeyine bağlamak için mikrobiyal hücreler için gerekli olan bir inkübasyon süresi belirlemek gereklidir. Örneğin, bu tür Lactobacillus rhamnosus GG 5 olarak probiyotik bakteriler, genellikle eklemek için ~ 1.0-1.5 saat gerektirir, ancak diğer bazı mikrobik türler yapışma kinetik 14 bağlı kez daha kısa (örneğin, patojenik mikroplar) gerektirebilir veya daha uzun olabilir. Aşırı mikrobiyal hücre sayıları kararlı kararlı duruma ulaşılması engelleyebilir ko-kültür erken evrede bakteri akıbet, yol açabilir, çünkü İkincisi, mikrobiyal hücrelerin ilk ekim yoğunluğu belirlenmelidir. Bu tohum yoğunluğu arttırmak, antibi hedef mikrobiyal soyun büyümesi profilini karakterize etmek için önerilmektedirÇeşitli ekme yoğunluğunun-otic serbest hücre kültürü ortamı. Son olarak, hacimsel akış oranının ayarlanması mikrobiyal türüne bağlı olarak gerekli olabilir. mikrobiyal hücreler, çok hızlı bir şekilde çoğalan, örneğin, yüksek akış hızları gerekecektir. Deneysel olarak 300 ul / saat (0.2 din / cm2) bariyer fonksiyonu ve microengineered villi hücre morfolojisi ödün vermeyen kadar bu akış oranları teyit edilmiştir (veriler gösterilmemiştir). Her ne kadar Lactobacillus rhamnosus GG 5, over-the-counter probiyotik karışım, VSL # 3, patojenik olmayan laboratuar suşu E. coli hem de patojenik enteroinvaziv E. olarak E. coli suşu 10 başarılı bir şekilde bağırsak-on-a-chip uzun süreli ko-kültür uygulanmıştır, hala patojen enfeksiyon mikroorganizmalara ortakçı bağırsak Mikrobiyota mikrobiyal türlerin çeşitli test etmek için gereklidir. In vitro olarak, mikrobiyal hücre cultivability varlığında veya yokluğunda, düşünülmelidirKültüre edilemeyen bağırsak mikrobiyomları yetiştirilmesi testi ilginç bir sorundur simbiyoz ve evrimi bağlamında, konakçı hücrelerin. Son olarak, gut-on-a-chip hem aerobik hem de anaerobik mikropların ko-kültür için sağlam bir protokol gelecekte keşfedilecek kritik bir karşılanmamış ihtiyaç olduğunu.
Böyle primer intestinal epitel ya da Crohn hastalığı veya kolorektal kanser gibi belirli sindirim hastalıkları bireysel insan konulardan farklılaşmamış kök hücrelerin kullanımı gibi daha modeli geliştirmek için alınabilecek adımlar vardır; veya uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSCs). Insan vücudunda bulunan diğer konak-mikrobiyomları ekosistemleri taklit uygulanacak Ancak, insan sağlığı ve hastalığı düzenlediğini insan mikrobiyomları rolü filizlenen ilgi ile, bizim ana-mikrobiyomları ko-kültür yöntemi muazzam önemini ve potansiyelini vardır (örneğin , ağız boşluğu 15, deri, 16 veya ürogenital tract 17). Son olarak, bu ko-kültür yöntemi yeni ilaç bileşiklerinin biyolojik, etkinlik ve toksisite nasıl gut mikrobiyomları etkiler açısından öngörülebilirliği geliştirerek geleneksel ilaç geliştirme sürecini yenilik olabilir. Birlikte ele alındığında, bağırsak-on-a-chip microphysiological sistemi ana-mikrobiyomları ekosistem yeniden oluşturmak için kullanılabilecek bir sabit kalıcı-hal barsak mikro-kurmak için sağlam bir yapı sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) containing 25 mM glucose and 25 mM HEPES | Gibco | 10564-011 | Warm it up at 37 °C in a water bath. |
| Difco Lactobacilli MRS broth | BD | 288120 | Run autoclave at 121 °C for 15 min. |
| Poly(dimethylsiloxane) | Dow Corning | 3097358-1004 | 15:1 (w/w), PDMS : cureing agent |
| Caco-2BBE human colorectal carcinoma line | Harvard Digestive Disease Center | Human colorectal adenocarcinoma | |
| Heat-inactivated FBS | Gibco | 10082-147 | 20% (v/v) in DMEM |
| Penicillin-streptomycin-glutamine | Gibco | 10378-016 | 1/100 dilution in DMEM |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Molecular Probes | D1306 | Nuclei staining |
| Phalloidin-CF647 conjugate (25 units/ml) | Biotium | 00041 | F-actin staining |
| Flexcell FX-5000 tension system | Flexcell International Corporation | FX5K | Peristalsis-like stretcing motion (10% cell strain, 0.15 Hz frequency) |
| Inverted epifluorescence microscope | Zeiss | Axio Observer Z1 | Imaging, DIC |
| Scanning confocal microscope | Leica | DMI6000 | Imaging, Fluorescence |
| UVO Cleaner | Jelight Company Inc | 342 | Surface activation of the gut-chip |
| Type I collagen | Gibco | A10483-01 | Extracellular matrix component for cell culture into the chip |
| Matrigel | BD | 354234 | Extracellular matrix component for cell culture into the chip |
| 1 ml disposable syringe | BD | 309628 | Cell and media injection stuff |
| 25 G 5/8 needle | BD | 329651 | Cell and media injection stuff |
| Syringe pump | Braintree Scientific Inc. | BS-8000 | Injection equipment into the chip |
| VSL#3 | Sigma-Tau Pharmaceuticals | 7-45749-01782-6 | A formulation of 8 different commensal gut microbes |
| Reinforced Clostridial Medium | BD | 218081 | Anaerobic bacteria culture medium |
| GasPak EZ Anaerobe Container System with Indicator | BD | 260001 | Anaerobic gas generating sachet |
| 4% paraformaldehyde | Electron Microscopy Science | 157-4-100 | Fixing the cells for staining |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Permeabilizing the cells |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | Blocking agent for staining of the cells |
| Corona treater | Electro-Technic Products | BD-20AC | Plasma generator for fabrication of the chip |
| Steriflip | Millipore | SE1M003M00 | Degasing the complete culture medium |
| Disposable hemocytometer | iNCYTO | DHC-N01 | For manual cell counting |
References
- Turnbaugh, P. J., et al. An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest. Nature. 444, 1027-1031 (2006).
- Tremaroli, V., Backhed, F. Functional interactions between the gut microbiota and host metabolism. Nature. 489, 242-249 (2012).
- Sekirov, I., Russell, S. L., Antunes, L. C. M., Brett Finlay, B. Gut Microbiota in Health and Disease. Physiol. Rev. 90, 859-904 (2010).
- Turnbaugh, P. J., et al. The human microbiome project. Nature. 449, 804-810 (2007).
- Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow. Lab Chip. 12, 2165-2174 (2012).
- Round, J. L., Mazmanian, S. K. The gut microbiota shapes intestinal immune responses during health and disease. Nat Rev Immunol. 9, 313-323 (2009).
- Garrett, W. S., et al. Communicable ulcerative colitis induced by T-bet deficiency in the innate immune system. Cell. 131, 33-45 (2007).
- Kim, H. J., Ingber, D. E. Gut-on-a-Chip microenvironment induces human intestinal cells to undergo villus differentiation. Integr Biol. 5, 1130-1140 (2013).
- Huh, D., Kim, H. J., et al. Microfabrication of human organs-on-chips. Nat Protoc. 8, 2135-2157 (2013).
- Kim, H. J., Li, H., Collin, J. J., Ingber, D. E. Contributions of microbiome and mechanical deformation to intestinal bacterial overgrowth and inflammation in a human gut-on-a-chip. Proc. Natl. Acad. Sci. 113, E7-E15 (2016).
- Miller, W. G., Lindow, S. E. An improved GFP cloning cassette designed for prokaryotic transcriptional fusions. Gene. 191, 149-153 (1997).
- Odijk, M., et al. Measuring direct current trans-epithelial electrical resistance in organ-on-a-chip microsystems. Lab Chip. 15, 745-752 (2015).
- Lentle, R. G., Janssen, P. W. Physical characteristics of digesta and their influence on flow and mixing in the mammalian intestine: a review. J Comp Physiol B. 178, 673-690 (2008).
- Granato, D., et al. Cell surface-associated lipoteichoic acid acts as an adhesion factor for attachment of Lactobacillus johnsonii La1 to human enterocyte-like Caco-2 cells. Appl Environ Microbiol. 65, 1071-1077 (1999).
- Dewhirst, F. E., et al. The human oral microbiome. J Bacteriol. 192, 5002-5017 (2010).
- Grice, E. A., Segre, J. A. The skin microbiome. Nat Rev Microbiol. 9, 244-253 (2011).
- Hay, P. E., et al. Abnormal bacterial colonisation of the genital tract and subsequent preterm delivery and late miscarriage. Br Med J. 308, 295-298 (1994).
