Summary
Se describe un protocolo in vitro de co-cultivo microbioma intestinal y vellosidades intestinales durante un periodo prolongado utilizando un sistema de microphysiological gut-on-a-chip humano.
Abstract
A continuación, se describe un protocolo para llevar a cabo a largo plazo co-cultivo de múltiples especies microbioma intestinal humano con vellosidades intestinales microconstruidos en un dispositivo microphysiological gut-on-a-chip humano. Nosotros recapitular la interfaz de tejido lumen capilar intestinal en un dispositivo de microfluidos, donde las deformaciones mecánicas y fisiológicas flujo de cizallamiento del fluido se aplican constantemente para imitar el peristaltismo. En el microcanal lumen, células epiteliales intestinales Caco-2 humanas se cultivan para formar un epitelio de las vellosidades 'libre de gérmenes' y regenerar pequeñas vellosidades intestinales. células microbianas Pre-cultivadas se inoculan en el lado del lumen para establecer un ecosistema huésped-microbio. Después de células microbianas se adhieren a la superficie apical de las vellosidades, flujo de fluido y deformaciones mecánicas se reanudan a producir un microambiente de estado estacionario en el que se suministra constantemente medio de cultivo fresco y las bacterias no unidas (así como los residuos bacterianos) se eliminan de forma continua. Después de co-cultivo prolongado fdía ROM a semanas, se encuentran varios microcolonias que se encuentra de forma aleatoria entre las vellosidades, y ambos microbiana y células epiteliales permanecen viables y funcional para al menos una semana en cultivo. Nuestro protocolo de co-cultivo se puede adaptar para proporcionar una plataforma versátil para otros ecosistemas huésped-microbioma que se pueden encontrar en diversos órganos humanos, que pueden facilitar el estudio in vitro de la función del microbioma humano en la organización de la salud y la enfermedad.
Introduction
El intestino humano alberga una matriz sorprendentemente diversa de especies microbianas (<1.000 especies) y un enorme número de células microbianas (10 veces más que las células huésped humanos) y genes (100 veces más que el genoma humano) 1. Estos microbiomas humanos juegan un papel clave en el metabolismo de nutrientes y xenobióticos, la regulación de la respuesta inmune, y el mantenimiento de la homeostasis intestinal 2. No es sorprendente, teniendo en cuenta estas diversas funciones, el microbioma intestinal comensal modula ampliamente la salud y la enfermedad 3. Por lo tanto, la comprensión del papel de microbioma intestinal y huésped-microbio interacciones son de gran importancia para promover la salud gastrointestinal (GI) y explorar nuevas terapias para los trastornos intestinales 4. Sin embargo, los modelos existentes en el intestino in vitro (por ejemplo, cultivos estáticos) restringir el co-cultivo de acogida-microbioma de un corto período de tiempo (<1 día) debido a un crecimiento excesivo de células microbianas y comprometen la barrera intestinalFunción 5. Modelos animales sustitutos (por ejemplo, libre de gérmenes 6 o ingeniería genética ratones 7) tampoco se utilizan comúnmente para estudiar anfitrión-gut microbioma diafonía porque la colonización y el mantenimiento estable del microbioma intestinal humana son difíciles.
Para superar estos desafíos, recientemente desarrollamos un ser humano biomimético "Gut-on-a-Chip" sistema de microphysiological (Figura 1A, izquierda) para emular las interacciones huésped-microbioma intestinal que se producen en el intestino humano vivo 5,8. El microdispositivo gut-on-a-chip contiene dos canales de microfluidos paralelas separadas por una, porosa, matriz extracelular flexible (ECM) de la membrana recubierta revestido por epitelio intestinal humano células Caco-2, imitando la interfaz de tejido lumen capilar intestinal (Figura 1A , derecha) 9. deformaciones rítmicos cíclicos de vacío impulsada inducen deformaciones mecánicas fisiológicos que imitan cambios normalmente Induccado por el peristaltismo (Figura 1A, derecha). Curiosamente, cuando se cultivan células Caco-2 en el a-chip gut-on-durante más de 100 horas, se forman espontáneamente en tres dimensiones (3D) vellosidades intestinales con uniones estrechas, bordes en cepillo apical, células proliferativas limitados a criptas basales, la producción de moco, aumento de la actividad de metabolización de fármaco (por ejemplo, el citocromo P450 3A4, CYP3A4), y la glucosa mejorada de la recaptación de 8. En este microambiente 'libre de gérmenes', fue posible co-cultivo el Lactobacillus rhamnosus GG probiótico o una formación terapéutico de una mezcla bacteriana probiótica con las células epiteliales de acogida para un máximo de dos semanas 5,10.
En este estudio, se describe el protocolo detallado para llevar a cabo anfitrión-gut microbioma co-cultivo en el dispositivo gut-on-a-chip para un periodo prolongado. Además, se discuten los problemas y retos críticos potenciales para ser considerado para una amplia aplicación de este alojamiento microbioma-co-cultivo protocolo.
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Protocol
1. La microfabricación de un dispositivo Gut-on-a-chip
Nota: El a-chip gut-en-es un dispositivo de microfluidos hecho por, polímero de silicona permeable al gas transparente (polidimetilsiloxano, PDMS), que contiene dos microcanales paralelos (1 mm de ancho x 150 m de altura x 1 cm de longitud) separados por una flexibilidad porosa (10 micras de diámetro de poro, de 25 micras de poro de separación de poro) PDMS membrana de 5,9. Fabricar el (Figura 1A, izquierda) gut-on-a-chip siguiendo los pasos que se indican.
- Microfabricación Procedimiento del 5,9 Gut-on-a-chip.
- Preparar PDMS, desgasificados sin curar mezclando el prepolímero de PDMS y el agente de curado (15: 1 w / w), y colocarla en el desecador de vacío durante 30 minutos.
- Verter 30 g y 3 g de PDMS sin curar, se desgasificó en cada molde de silicona que tiene SU-8 micropatterns base de la pala y los micro-canales inferiores del intestino a-chip-on-, respectivamente. A continuación, el curado a 60 ° C en un horno seco durante al lal este de 4 horas.
- Desmoldar las capas PDMS superior e inferior de cada molde de silicona cortando alrededor de los bordes utilizando un bisturí quirúrgico. 6 perforar agujeros (dos entradas, dos salidas y dos cámaras de vacío) usando un golpeador biopsia (2,0 mm de diámetro del agujero).
- Prepare la membrana porosa vertiendo 10 g de PDMS sin curar y se desgasifica en una oblea de silicio silanizado que contiene las matrices de correos con columnas circulares (10 m de diámetro, 25 micras de altura) superpuestas con un piso, silanizada capa de soporte PDMS (15: 1, w / w; 1 cm de espesor). Coloque un prensatelas 3 kg de peso en la configuración y curar el polímero a 60 ° C durante 12 horas o más.
- Desmoldear la configuración de una membrana de PDMS poroso adherido a la losa de soporte de PDMS de la oblea de silicio levantando con cuidado la esquina de la losa de la oblea, y pelando hasta que la membrana de PDMS poroso está completamente separado de la oblea.
- Exponer el lado de canal de una capa superior (PDMS, 15: 1, w / w) y el lado de la membrana porosa a la plasma generada por un tratador de corona de mano durante 1 minuto, y 3 seg, respectivamente.
- Colocar las superficies tratadas con plasma de la membrana de PDMS porosa y la capa superior de microcanal en un contacto conforme colocando cada pieza en paralelo sin burbujas de aire.
- Incubar toda la configuración a 80 ° CO / N para la unión irreversible de las dos capas de PDMS.
- Despegar la capa de soporte de PDMS de la asamblea de una capa superior con una membrana porosa levantando con cuidado la esquina de la capa de soporte, y pelando hasta que la capa de soporte está completamente separado de la capa superior con la membrana.
- Corte las porciones de esta membrana situada sobre las cámaras de vacío (las dos cámaras situadas a cada lado del canal principal) utilizando unas pinzas de punta fina para hacer cámaras de vacío huecas.
- Exponer el lado de la membrana unida a la pieza superior y el lado con los canales grabados en la pieza inferior al plasma en una misma manera como se describe in paso 1.1.6 durante 1 minuto.
- Alinear la capa de microcanal superior con una membrana porosa y la capa inferior con un contacto conforme colocando cada pieza en paralelo sin burbujas de aire bajo un estereoscopio.
- Curar toda la configuración en un horno seco a 80 ° CO / N para producir una escala gut-on-a-chip dispositivo de microfluidos completo que contiene dos cámaras de vacío hueco al lado del canal de la célula de microfluidos.
- Conectar los tubos a la entrada y salida de cada puerto vinculada a la parte superior o inferior de los microcanales en un a-chip gut-on-a través de una aguja de acero inoxidable de extremos romos doblada 90 °.
- Conectar los tubos a los agujeros vinculados a las cámaras de vacío utilizando una aguja de acero inoxidable de extremos romos doblada 90 °.
- Esterilizar los microcanales y tubos por corrientes de etanol 70% (v / v) usando un 1 ml esterilizados jeringa desechable.
- Secar los microcanales y tubos en un horno a 60 ° C en seco O / N.
2. Crecimiento de micromotorEred intestinal Villi en el dispositivo Gut-on-a-chip
- Las células epiteliales intestinales de semillas (por ejemplo, células Caco-2BBE) en un 5,9 Microdevice Gut-on-a-Chip.
- Esterilizar el dispositivo con 70% (v / v) de etanol (véase el paso 1.4), utilizando una jeringa desechable esterilizado 1 ml seguido de secado en un horno seco O 60 ° C / N (véase el paso 1.5) antes de la activación de la superficie.
- Exponer la configuración completa de un microsistema gut-on-a-chip (es decir, un cuerpo de la tripa-on-a-chip conectado a la tubería) a la luz UV (253,7 nm) y el ozono de forma simultánea durante 40 minutos.
- Enfriar el dispositivo a temperatura ambiente durante 15 minutos bajo luz UV en un gabinete de seguridad biológica (BSC).
- Introducir 100 l de la capa de ECM Solución una mezcla de 50 g / ml Tipo de colágeno I y 300 mg / ml de mezcla de matriz extracelular diluido en la modificación de Dulbecco de Eagle medio libre de suero (DMEM) - en los dos microcanales superior e inferior utilizando un desechable , jeringa de 1 ml estéril.
- Incubadorasdel te todo el montaje en un 37 ° C 5% humidificado incubadora de CO 2 durante 1 hora.
- Degas 50 ml de pre-calentado (37 ° C) medio de cultivo completo (DMEM, 20%, v / v, suero fetal bovino (FBS), 100 unidades / ml de penicilina, y 100 mg / ml de estreptomicina; alícuotas en un 3 ml jeringa desechable) utilizando un sistema de filtración de 50 ml (0,45 micras de tamaño de poro) en el BSC para 1 min.
- Pasar el medio pre-calentado a través del sistema de filtración y golpear suavemente en el medio se filtró durante 1 minuto para eliminar las burbujas de gas o disuelto en el medio.
- Coloque la alícuota de medio completo desgasificado en una jeringa desechable de 3 ml y se incuba en un 37 ° C al 5% humidificada de CO 2 incubadora durante 1 hr.
- Conectar dos jeringas desechables 3 ml que contiene desgasificaron, medio de cultivo completo pre-calentado a los microcanales superior e inferior.
- El flujo del medio de cultivo celular completo desgasificado en el microcanal superior utilizando una bomba de jeringa en el volumétricavelocidad de 30 l / h de flujo (equivalente al esfuerzo cortante en 0,02 dinas / cm2) en un 37 ° C 5% humidificado incubadora de CO 2 O / N.
- Microconstruidos formación de células Caco-2 en el Villi un chip Gut-on-Sea.
- Utilice células Caco-2BBE con el número de pases entre 50 y 65.
- Crecer células Caco-2 en un matraz T75 que contiene medio de cultivo completo en un 37 ° C 5% humidificado incubadora de CO 2 durante 4-5 días para obtener células completamente confluentes.
- Añadir 10 ml de Ca 2+ y Mg 2 + libre de PBS para completamente confluentes Caco-2 células cultivadas en un matraz T75, se lavan las células, a continuación, Aspirar PBS. Repita este paso dos veces.
- Añadir 1 ml de solución de tripsina / EDTA al 0,05% y se incuba en un 37 ° C al 5% humidificada de CO 2 incubadora durante 5 min.
- Resuspender las células disociadas con 10 ml de medio de cultivo celular completo pre-calentado (con FBS) pipeteando arriba y abajo tres a cinco veces.
- Centrifugar la suspensión celular por centrifugation a 500 xg durante 5 minutos, luego retire el sobrenadante.
- Resuspender de nuevo con 1 ml pre-calentado medio completo para ajustar la densidad celular en ~ 1,5 x 10 5 células / cm 2 en el dispositivo. Utilice hemocitómetro para estimar la densidad celular.
- Infundir 100 l de las células resuspendidas Caco-2 en el microcanal superior (lumen lateral) mediante la colocación de una jeringa de 1 ml desechable unido a un 25 G5 / 8 de la aguja en la salida del tubo conectado a la microcanal superior.
- Sujetar todas las entradas y salidas de los tubos conectados a los micro-canales superior e inferior utilizando clips de la carpeta.
- Incubar toda la instalación en un 37 ° C, 5% humidificado incubadora de CO 2 durante 1 hora para permitir disociarse células Caco-2 se adhiera a la superficie de la membrana porosa.
- Retire las abrazaderas y reanudar el flujo de medio de cultivo sólo para el microcanal superior a 30 l / hr utilizando una bomba de jeringa hasta que las células forman una monocapa intacta de 24 a 36 hr. Usa los contras de faseT o microscopía de contraste de interferencia diferencial (DIC) para confirmar las uniones célula-célula en una monocapa de células.
- Cuando las células forman una monocapa, perfundir el medio de cultivo en ambos superiores (lumen) y microcanales (capilares) inferiores a la misma velocidad de flujo de 30 l / hr.
- La aplicación de deformaciones mecánicas que imitan los movimientos peristálticos-como 5,9.
- Encienda la bomba de vacío equipado con el equipo de la tensión.
- Conectar las cámaras de vacío al controlador de vacío a través de la tubería con un conector de acero inoxidable.
- Establecer el movimiento de estiramiento de la cepa de células media del 10% a una frecuencia de 0,15 Hz con el modo de función sinusoidal cíclica por el software de control de vacío, a continuación, haga clic en "Inicio".
- Mantener el flujo constante de medio de cultivo (30 l / h) en ambos microcanal superior e inferior para la confluencia Caco-2 monocapa bajo deformaciones mecánicas (10%, 0,15 Hz) para ~ 100 hr.
Nota: Las células Caco-2 Sponneamente someterse a la morfogénesis de las vellosidades con proyecciones en 3D onduladas extendidos hacia el lumen del microcanal epitelial 5,8-10.
- Para emular las funciones a nivel de órganos del intestino humano vivo con interfaz tejido-lumen capilar en el intestino-on-a-chip 10, siga los pasos descritos.
- Microconstruidos crecer células Caco-2 vellosidades repitiendo los pasos de 2.1 a 2.2.
- El flujo del medio pre-calentado de co-cultivo (una mezcla de medio de cultivo celular completo Caco-2 y el medio completo de cultivo HMVECs, 1: 1 v / v) a los microcanales superior e inferior en 30 l / hr.
- Introducir 100 l de células disociadas normales microvasculares capilar humana endoteliales (HMVECs; densidad celular final, ~ 5,0 x 10 5 células / cm 2) en el microcanal inferior por el método idéntico descrito en los pasos de 2.2.3 a 2.2.9.
- Coloque un pedazo rectangular de PDMS curado (0,5 cm x 1 cm x 1 cm; ancho x largo x; 15: 1, w/ w elastómero: agente de curado) en la parte superior del dispositivo gut-on-a-chip, y luego la vuelta a toda la configuración del dispositivo al revés (es decir, el microcanal superior se enfrenta a la baja, y el microcanal menor se enfrenta al alza).
- Incubar la instalación en un 37 ° C, humidificado 5% de CO 2 incubadora durante 1 hora para permitir HMVECs disociadas a que se adhieran a la superficie de la membrana porosa en el microcanal inferior.
- Saque toda una configuración de la incubadora de CO 2, y voltear la configuración de nuevo.
- Flujo de medio de co-cultivo pre-calentado (una mezcla de medio de cultivo celular completo Caco-2 y el medio completo de cultivo HMVECs, 1: 1 v / v) en los dos microcanales superior e inferior en 30 l / hr con movimientos de estiramiento mecánico ( 10%, 0,15 Hz) durante al menos tres días para formar uniones célula-célula de una monocapa endotelial.
3. Host-gut microbioma Co-cultivo en un Microdevice Gut-on-a-chip
- Realizar pre-cultivo of las células bacterianas de la siguiente manera para co-cultivo microbioma comensal intestinal de las vellosidades intestinales en microconstruidos.
- Resuspender la mezcla en polvo bacteriano probiótico liofilizado en 10 ml de la mezcla (1: 1, v / v) de autoclave Lactobacilli MRS Broth y reforzado clostridial Medium.
- Ajuste la densidad final de células de aproximadamente 0,2 unidades de densidad óptica (a 600 nm) mediante la adición de la cantidad apropiada de medio, a continuación, parte alícuota de 3 ml de suspensión de células microbianas en un tubo estéril desechable de 10 ml.
- Se colocan los tubos que contienen volvieron a suspender las células microbianas en el recipiente anaeróbico. Añadir dos paquetes de anaeróbico bolsita de generación de gas en el recipiente. Cierre la tapa del recipiente bien e incubar la configuración del contenedor sin agitación en un 37 ° C 5% humidificado incubadora de CO 2 O / N.
- La inoculación de microbioma y co-cultivo con células intestinales epiteliales 5,10.
- Preparar 3 ml jeringas desechables que contienen antibioti desgasificada-c libre de medio de cultivo celular (es decir, DMEM con 20% FBS). Ver 2.1.6 para el procedimiento de desgasificación del medio de cultivo.
- Saque toda una configuración del dispositivo gut-on-a-chip que contiene vellosidades microconstruidos de la incubadora de CO 2, a continuación, pasar a la cabina de bioseguridad.
- Retire las jeringas conectadas a un tubo vinculado a los micro-canales superior e inferior. Conectar las jeringas preparadas en 3.2.1 en el dispositivo, traer de vuelta a la incubadora de CO 2, entonces el flujo de este medio de cultivo libre de antibióticos durante 12 horas antes de la siembra del microbioma.
- Centrifugar las células bacterianas probióticas mezcla pre-cultivadas (consulte los pasos de 3.1) a 10.000 xg durante 5 min. Aspirar el sobrenadante usando vacío, a continuación, volver a suspender en medio DMEM libre de antibióticos (densidad celular final, ~ 1,0 x 10 7 CFU / ml).
- Infundir la suspensión de células en el lado del lumen del microcanal que contiene las vellosidades intestinales "libres de gérmenes" utilizando una jeringa desechable de 1 ml conectada a un 25G5 / 8 aguja. Permitir la adherencia de las células microbianas a la superficie apical de las vellosidades intestinales de ~ 1,5 hr sin flujo por apriete a todo el extremo del tubo.
- Perfundir el medio de cultivo libre de antibióticos pre-calentado en ambos microcanales superior e inferior a 40 l / hr con deformaciones rítmicos cíclicos (10%, 0,15 Hz).
- Para el co-cultivo de la proteína fluorescente verde (GFP) marcado con E. coli (E. coli GFP; no patógena DH5-alfa de E. coli huésped) 10,11 células con vellosidades microconstruidos, pre-GFP cultivar E. células de E. coli en medio LB en autoclave a 37 ° C bajo condiciones (200 rpm) con agitación durante 12 h. Repita el procedimiento desde 3.2.5 a 3.2.6 para llevar a cabo el co-cultivo de GFP E. células de E. coli con vellosidades microconstruidos.
- Las células de imagen 5,8-10
- Realizar DIC, epifluorescencia, o de barrido láser microscopía confocal para la grabación microbiana y epitelial morfología 5,8,10.
- Para la formación de imágenes DIC, disponer de un microsistema configuración del intestino-on-a-chip de la incubadora de CO 2, coloque la configuración del dispositivo en el escenario de un microscopio, a continuación, registrar la morfología celular.
- Para imágenes de fluorescencia de epitelio de las vellosidades, fluir PBS para el lavado de las células en 100 l / h durante 10 min.
- Fijar vellosidades con 4% (w / v) de paraformaldehído durante 15 min. Entonces fluir PBS para el lavado de las células en 100 l / h durante 10 min.
- Permeabilizar las vellosidades con 0,3% (v / v) de Triton X-100 diluido en PBS que contiene 2% (w / v) de albúmina de suero bovino (BSA) durante 10 min. Entonces fluir PBS para el lavado de las células en 100 l / h durante 10 min.
- células de bloques con 2% (w / v) de BSA en PBS durante 1 hr. Entonces fluir PBS para el lavado de las células en 100 l / h durante 10 min.
- Añadir 300 nM de 4 ', solución de dihidrocloruro de 6-diamino-2-fenilindol (DAPI) diluido en PBS para la tinción nuclear bajo la protección de la luz.
- Añadir 25 unidades / ml de faloidina fluorescente(Conjugado faloidina-CF647) disuelto en PBS para la tinción de actina F bajo la protección de la luz.
- grabar imágenes de las células teñidas con fluorescencia utilizando un microscopio confocal de barrido láser.
Nota: Un objetivo 25X se aplicó con zoom óptico apropiado durante la microscopía confocal. En la Figura 3B, se utilizó aproximadamente magnificación 525x.
- Realizar DIC, epifluorescencia, o de barrido láser microscopía confocal para la grabación microbiana y epitelial morfología 5,8,10.
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Representative Results
Para emular el ecosistema anfitrión-microbioma intestinal humano in vitro, es necesario desarrollar un protocolo experimental para reconstituir el estable a largo plazo co-cultivo de las bacterias intestinales y células epiteliales intestinales humanas en condiciones fisiológicas como la mecánica peristaltismo similar y el flujo de fluido. Aquí, utilizamos un microdispositivo biomimético gut-on-a-chip (Figura 1A) para co-cultivo de células microbianas en contacto directo viviendo con la vida humana vellosidades por períodos de una semana o más in vitro. Las células epiteliales intestinales forman espontáneamente vellosidades bien diferenciado cuando se cultivan en un lado de una membrana porosa ECM-recubierto en un canal de un dispositivo para microfluidos de 2-canal en la presencia de flujo de fluido fisiológicamente relevante y deformaciones mecánicas cíclicas 5. Las vellosidades microconstruidos replican estructuras y funciones de pequeñas vellosidades intestinales humanas, incluyendo formatien las células epiteliales cilíndricas alineadas por un borde en cepillo apical, criptas proliferativas basales con la migración y diferenciación de las células hijas que progresan de la cripta a la punta de las vellosidades, los altos niveles de producción de moco, la actividad de metabolización de medicamentos mejorada, y el aumento de la recaptación de la glucosa 8. Células endoteliales vivos pueden ser cultivadas en el lado opuesto de la misma membrana para volver a crear la interfaz de tejido tejido de la pared intestinal, y las células inmunes se pueden cultivar en el sistema, así 10. Para validar la función de protección de las células epiteliales intestinales, apretado barrera unión de las vellosidades intestinales formadas en una-a-chip gut-On es intermitente se cuantificó mediante la medición de la resistencia eléctrica transepitelial (TEER) 5,10,12. Es necesaria la monitorización de rutina de valor TEER para estimar la integridad de una monocapa de células o las vellosidades intestinales en cada momento (por ejemplo, antes de añadir las bacterias en el lumen).
7 UFC / ml) se inoculó en el lumen del microcanal epitelial (Figura 1B, "inoculación"). Después de células microbianas se adhieren en la superficie apical de las vellosidades en la ausencia de flujo para ~ 1,5 hr (Figura 1B, "Anexo"), el flujo fisiológico (40 l / h) se reanuda a través de ambos canales con deformaciones mecánicas cíclicas (10% de deformación en 0,15 Hz) para eliminar las bacterias intestinales no consolidados y suministrar nutrientes a las células epiteliales tanto bacterianas y las vellosidades (Figura 1B, "Co-cultura"). Este protocolo de co-cultivo permite la colonización estable de múltiples especies de bacterias probióticas en el espacio intervillus, con microcolonias de bacterias viables se mantuvieron durante hasta dos semanas en co-cultivo (Figuras 2A, 2B). En este estudio, un coformulación probiótica mmercial que contiene una población mixta de 8 diferente anaerobio facultativo u obligar a, las cepas probióticas de Bifidobacterium breve, B. longum, B. infantis, Lactobacillus acidophilus, L. plantarum, L. paracasei, L. bulgaricus y Streptococcus termófilos se utiliza.
Este método de co-cultivo puede ser aplicado ampliamente para emular el ecosistema huésped-microbio intestinal humano. Por ejemplo, no patógena GFP E. coli puede ser co-cultivadas en la superficie de las vellosidades intestinales cultivadas en un dispositivo gut-on-a-chip. Basado en el mismo protocolo descrito anteriormente, se adhirió GFP E. coli células en las vellosidades crecen a partir de células individuales en 1 hr a múltiples microcolonias con 3 días (Figura 3A, 1 hr vs. 72 hr) que localizan en los espacios intervillus (Figura 3B, 1 hr vs. 72 hr) cuando se cultivan bajo goteo fluir (40 l /hr) en presencia de deformaciones peristalsis similar (10%, 0,15 Hz).
Figura 1. El intestino-on-a-chip Gut-on-a-Chip humana microphysiological sistema de huésped-microbioma intestinal co-cultivo. (A) Una fotografía (izquierda) y un esquema (derecha) de un 2 canales, dispositivo de microfluidos. Las flechas indican la dirección del flujo de medio de cultivo (azul, parte superior de microcanal; rojo microcanal, abajo). (B) Diagramas esquemáticos del procedimiento de acogida-gut microbioma co-cultivo en el intestino de un chip-on-Sea. Después de las células epiteliales intestinales forman vellosidades (~ 100 horas), se introducen las células microbianas se resuspendieron en el medio de cultivo celular para el microcanal lumen (inoculación), entonces el flujo de medio de cultivo se suspende por ~ 1,5 hr (Anexo). Después de células microbianas se adhieren a la superficie apical de las vellosidades intestinales, el flujo se reanudó (Co -cultura). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Co-cultivo de múltiples bacterias probióticas con vellosidades intestinales en el intestino a-chip-on-. (A) Un diferencial de contraste de interferencia micrografía muestra un microcolonias de células bacterianas probióticas que crecen entre las vellosidades en el chip intestino. (B) Una vista de aumento de potencia más alto de A (un cuadrado de puntos negro) que muestra la microcolonias de células bacterianas probióticas (una flecha roja). V, vellosidades; Barra de escala = 20 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 3. Co-cultura de la no patógena, GFP-etiquetados E. coli con vellosidades intestinales en el intestino de un chip-on-Sea. (A) y la fluorescencia Overlaid DIC imágenes microscópicas tomadas en 1 y 72 horas, mostrando la colonización de GFP E. coli en las vellosidades intestinales cultivadas en el intestino de un chip-on-Sea. (B) vistas magnificación de alta energía de micrografías confocales de fluorescencia superpuesto tomadas en 1 y 72 hr que muestra el crecimiento de E. GFP marcado coli de una sola célula (una flecha roja) a un microcolonias (una flecha blanca). Azul, los núcleos; magenta, F-actina; Barra de escala = 30 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La comprensión de las interacciones huésped-microbioma es fundamental para el avance de la medicina; Sin embargo, los modelos de cultivo celular tradicionales realizadas en un plato de plástico o una placa estática no apoyan la estable co-cultivo de células intestinales humanas con microbios intestinales vida de más de 1-2 días porque las células microbianas en su mayoría crecen en exceso las células de mamífero in vitro. La población microbiana overgrowing consume rápidamente oxígeno y nutrientes, produciendo posteriormente cantidad excesiva de desechos metabólicos (por ejemplo, ácidos orgánicos), que comprometen seriamente las funciones de la barrera intestinal y provocan la muerte de las células epiteliales intestinal. Por lo tanto, la prevención de la proliferación microbiana que causa el agotamiento de los nutrientes y la acumulación de residuos microbianos es crucial para el mantenimiento de la convivencia host-microbioma viable durante un período prolongado (de días a semanas) en el microambiente de co-cultivo.
Para superar estos desafíos, un microphysiologicalGut-on-a-chip se ha desarrollado 5,8 dispositivo para formar completamente diferenciada villi intestinal humano y para mantener el microambiente de estado estacionario de la luz intestinal in vitro. Las unidades de diseño y funcionales (por ejemplo, las cámaras de la celda de flujo de microfluidos, deformaciones cíclicas impulsado por el vacío) de una tripa-on-a-chip se modifican dispositivo de microfluidos para emular con precisión el fisiológica, física y microambiente químico para el microbiana co-cultivo de 5, 10. El esfuerzo de corte aplicado en el cultivo de microfluidos gut-on-a-chip fue determinado por el rango fisiológico del flujo luminal en el intestino humano 5,13. Para el huésped-microbio de co-cultivo, el mantenimiento de la "estado estacionario" de la población microbiana en el microcanal luminal de la a-chip gut-on-es crítico en el apoyo químicamente y nutricionalmente condiciones factibles. En el microsistema gut-on-a-chip, es posible estimar el estado estacionario intraluminal en el intestino-on-a-chip por measuring el pH del medio de cultivo y la densidad celular microbiana. Debido a medio de cultivo fresco fluye continuamente a través de los microcanales, tanto las células microbianas y epiteliales no se someten a agotamiento de los nutrientes cuando la densidad de siembra inicial de las células microbianas y la tasa de flujo volumétrico del medio de cultivo se optimizan. El medio acondicionado que pasa a través del microcanal fluye hacia fuera a una velocidad definida volumétrica de flujo (aquí, 40 l / h), por lo que los desechos metabólicos (por ejemplo, ácidos orgánicos), así como secretomas celulares (por ejemplo, citoquinas) se eliminan continuamente de la co- microambiente cultura. Así, el dispositivo gut-on-a-chip puede ser considerada como un "biorreactor continuo" con un microambiente de estado estacionario necesaria y suficiente para lavar eficazmente células microbianas no unidos o demasiado grandes desde el lumen del microcanal intestinal, lo que facilita la generación de un nicho microbiana estable dentro de 2-3 días.
Hay fa fundamentalctors que deben ser considerados como la solución de problemas para el éxito de co-cultivo de células microbianas en las vellosidades intestinales. En primer lugar, es necesario determinar el tiempo de incubación óptimo requerido para las células microbianas para unir a la superficie de las vellosidades porque la adhesión microbiana puede variar entre especies microbianas. Por ejemplo, las bacterias probióticas, como Lactobacillus rhamnosus GG 5, generalmente requieren ~ 1,0-1,5 hr para unir, pero algunas otras especies microbianas pueden requerir más cortos (por ejemplo, microbios patógenos) o más veces, dependiendo de su cinética de adhesión 14. En segundo lugar, la densidad de siembra inicial de las células microbianas se debe identificar porque los números excesivos de células microbianas pueden dar lugar a la consecuencia de las bacterias en la etapa inicial de co-cultivo, que puede interferir con la consecución de un estado de equilibrio estable. Para optimizar esta densidad de siembra, se recomienda para caracterizar el perfil de crecimiento de la cepa microbiana objetivo en el antibimedio de cultivo celular-ótica gratuita en varias densidades de siembra. Por último, el ajuste de la velocidad de flujo volumétrico puede ser necesaria dependiendo de las especies microbianas. Por ejemplo, habrá que incrementar los caudales si las células microbianas proliferan muy rápidamente. Se confirmó experimentalmente que las tasas de flujo de hasta 300 l / hr (0,2 dinas / cm 2) no ponen en peligro la función de barrera y la morfología celular de las vellosidades microconstruidos (datos no mostrados). Aunque rhamnosus GG 5 Lactobacillus, over-the-counter mezcla de probióticos, VSL # 3, no patógena cepa de laboratorio E. coli, así como el patógeno E. enteroinvasiva coli cepa 10 se aplica con éxito en el largo plazo co-cultivo en el intestino de un chip-on-, todavía se requiere para poner a prueba una variedad de especies microbianas de la microbiota intestinal comensal a microorganismos patógenos infecciosos. El cultivabilidad de células microbianas in vitro debe contemplarse en la presencia o la ausenciade células huésped en el contexto de la simbiosis y la evolución, donde la prueba de cultivar el microbioma intestinal unculturable es un reto interesante. Por último, un protocolo robusto para el co-cultivo de ambos microbios aerobios y anaerobios en el un chip intestino en una necesidad crítica insatisfecha por descubrir en el futuro.
Hay medidas que pueden adoptarse para mejorar aún más el modelo, tales como el uso de epitelio intestinal primaria o células madre indiferenciadas procedentes de sujetos humanos individuales que tienen enfermedades gastrointestinales específicas tales como la enfermedad de Crohn o cáncer colorrectal; o células madre pluripotentes inducidas (iPS). Sin embargo, con el creciente interés en el papel del microbioma humano en la organización de la salud humana y las enfermedades, nuestro método de co-cultivo de acogida-microbioma tiene una enorme importancia y el potencial de ser aplicado para imitar otros ecosistemas huésped-microbioma se encuentran en el cuerpo humano (por ejemplo, , cavidad oral 15, 16 de la piel, o t urogenitalract 17). Por último, este método de co-cultivo puede innovar en el proceso de desarrollo de fármacos convencionales, mejorando la previsibilidad en términos de cómo las influencias microbioma intestinal sobre la biodisponibilidad, eficacia y toxicidad de los nuevos compuestos de la droga. En conjunto, el sistema microphysiological gut-on-a-chip puede proporcionar una plataforma sólida para establecer un microambiente intestinal de estado estacionario estable que puede ser utilizado para reconstituir ecosistema host-microbioma.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) containing 25 mM glucose and 25 mM HEPES | Gibco | 10564-011 | Warm it up at 37 °C in a water bath. |
| Difco Lactobacilli MRS broth | BD | 288120 | Run autoclave at 121 °C for 15 min. |
| Poly(dimethylsiloxane) | Dow Corning | 3097358-1004 | 15:1 (w/w), PDMS : cureing agent |
| Caco-2BBE human colorectal carcinoma line | Harvard Digestive Disease Center | Human colorectal adenocarcinoma | |
| Heat-inactivated FBS | Gibco | 10082-147 | 20% (v/v) in DMEM |
| Penicillin-streptomycin-glutamine | Gibco | 10378-016 | 1/100 dilution in DMEM |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Molecular Probes | D1306 | Nuclei staining |
| Phalloidin-CF647 conjugate (25 units/ml) | Biotium | 00041 | F-actin staining |
| Flexcell FX-5000 tension system | Flexcell International Corporation | FX5K | Peristalsis-like stretcing motion (10% cell strain, 0.15 Hz frequency) |
| Inverted epifluorescence microscope | Zeiss | Axio Observer Z1 | Imaging, DIC |
| Scanning confocal microscope | Leica | DMI6000 | Imaging, Fluorescence |
| UVO Cleaner | Jelight Company Inc | 342 | Surface activation of the gut-chip |
| Type I collagen | Gibco | A10483-01 | Extracellular matrix component for cell culture into the chip |
| Matrigel | BD | 354234 | Extracellular matrix component for cell culture into the chip |
| 1 ml disposable syringe | BD | 309628 | Cell and media injection stuff |
| 25 G 5/8 needle | BD | 329651 | Cell and media injection stuff |
| Syringe pump | Braintree Scientific Inc. | BS-8000 | Injection equipment into the chip |
| VSL#3 | Sigma-Tau Pharmaceuticals | 7-45749-01782-6 | A formulation of 8 different commensal gut microbes |
| Reinforced Clostridial Medium | BD | 218081 | Anaerobic bacteria culture medium |
| GasPak EZ Anaerobe Container System with Indicator | BD | 260001 | Anaerobic gas generating sachet |
| 4% paraformaldehyde | Electron Microscopy Science | 157-4-100 | Fixing the cells for staining |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Permeabilizing the cells |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | Blocking agent for staining of the cells |
| Corona treater | Electro-Technic Products | BD-20AC | Plasma generator for fabrication of the chip |
| Steriflip | Millipore | SE1M003M00 | Degasing the complete culture medium |
| Disposable hemocytometer | iNCYTO | DHC-N01 | For manual cell counting |
References
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