Summary
Vi beskriver en in vitro-protokoll for å ko-kultur gut mikrobiomer og tarmtottene i en lengre periode ved hjelp av et humant tarm-på-en-brikke microphysiological system.
Abstract
Her beskriver vi en protokoll for å utføre langsiktig co-kultur av multi-art menneskelige tarmen mikrobiomer med mikro-oppbygd tarmtottene i en menneskelig gut-on-a-chip microphysiological enhet. Vi rekapitulere tarm lumen-kapillære vev-grensesnitt i en microfluidic enhet, der fysiologiske mekaniske deformasjoner og væske skjærstrømmen blir stadig søkt å etterligne peristaltikk. I lumen microchannel, humane intestinale epitelceller Caco-2-celler dyrkes for å danne en "bakterie-fri" villus epitel og regenerere liten tarmtottene. Pre-dyrkede mikrobielle celler inokuleres inn i hulrommet side for å etablere en vert-mikrobe økosystem. Etter at mikrobielle celler holder seg til den apikale overflate av villi, blir fluidstrømningen og mekaniske deformasjoner gjenopptatt for å fremstille en stabil tilstand mikromiljø i hvilket friskt kulturmedium blir stadig tilføres og ubundet bakterier (så vel som bakterielle avfall) fjernes kontinuerlig. Etter lengre co-kultur fROM dager til uker, blir flere mikrokoloniene funnet å være tilfeldig plassert mellom villi, og både mikrobielle og epitelceller forblir levedyktig og funksjonell i minst en uke i kultur. Vår co-kulturen protokollen kan tilpasses for å gi en allsidig plattform for andre verts mikrobiomer økosystemer som finnes i ulike organer, som kan legge til rette for in vitro studie av hvilken rolle menneskelige mikrobiomer i orkestre helse og sykdom.
Introduction
Den menneskelige tarmen havner en utrolig variert utvalg av mikrobielle arter (<1000 arter) og en enorm rekke mikrobielle celler (10 ganger mer enn de menneskelige vertsceller) og gener (100 ganger mer enn det menneskelige genom) 1. Disse menneskelige microbiomes spille en nøkkelrolle i metabolizing næringsstoffer og xenobiotics, regulerer immunresponser, og opprettholde intestinal homeostase to. Ikke overraskende, gitt disse ulike funksjoner, den commensal gut mikrobiomer modulerer omfattende helse og sykdom 3. Dermed forstå rollen av tarmen mikrobiomer og vert-mikrobe interaksjoner er av stor betydning for å fremme gastrointestinal (GI) helse og utforske nye behandlingsformer for tarmsykdommer 4. Men eksisterende in vitro tarmen modeller (f.eks statiske kulturer) begrense host-mikrobiomer co-kultur til en kort periode (<1 dag) fordi mikrobielle celler overgrow og kompromiss intestinal barrierefunksjon 5. Surrogat dyremodeller (for eksempel bakteriefritt 6 eller genmodifisert mus 7) er heller ikke vanlig å studere host-gut mikrobiomer crosstalk fordi kolonisering og stabil vedlikehold av menneskelige tarmen mikrobiomer er vanskelig.
For å overvinne disse utfordringene, vi nylig utviklet en biomimetic menneskelige "Gut-on-a-chip" microphysiological system (figur 1A, venstre) for å emulere host-gut mikrobiomer interaksjoner som oppstår i levende menneske tarmen 5,8. Tarmen-on-a-chip microdevice inneholder to parallelle microfluidic kanaler adskilt av en fleksibel, porøs, ekstracellulære matrix (ECM) belagte membran omgitt av menneskets tarm epitel Caco-2 celler, etterligne intestinal lumen-kapillær vev-grensesnitt (figur 1A , høyre) 9. Vakuum-drevet sykliske rytmiske deformasjoner tale fysiologiske mekaniske deformasjoner som etterligner endringer normalt induced av peristaltikk (figur 1A, høyre). Interessant, da Caco-2 celler dyrkes i tarmen-on-a-chip for mer enn 100 timer, de spontant danne tredimensjonale (3D) tarmtottene med tett veikryss, apikale pensel grenser, proliferative celler begrenset til basale krypter, slimproduksjon, økt metaboliserende aktivitet (f.eks cytokrom P450 3A4, CYP3A4), og forbedret glukose reuptake 8. I denne "bakteriefritt" mikromiljøet, var det mulig å co-kulturen den probiotiske Lactobacillus rhamnosus GG eller en terapeutisk dannelsen av en probiotiske bakterier blanding med verts epitelceller i opptil to uker 5,10.
I denne studien, beskriver vi detaljert protokoll for å utføre vert-gut mikrobiomer ko-kultur i tarm-på-en-brikke anordning for en lengre periode. I tillegg diskuterer vi kritiske spørsmål og potensielle utfordringer for å bli vurdert for en bred anvendelse av denne host-mikrobiomer co-kultur protocol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. microfabrication av en Gut-on-a-chip enhet
Merk: gut-på-en-brikke er et mikrofluid enhet laget av gjennomsiktig gass-permeabel silikonpolymer (polydimetylsiloksan, PDMS), inneholdende to parallelle mikrokanaler (1 mm bredde x 150 pm høyde x 1 cm lengde) adskilt av en fleksibel porøs (10 mikrometer i pore diameter, 25 mikrometer i avstand pore å pore) PDMS membran 5,9. Dikte gut-on-a-chip (figur 1A, venstre) å følge trinnene.
- Microfabrication Prosedyre for Gut-on-a-chip 5,9.
- Forbered uherdet, avgassede PDMS ved å blande PDMS prepolymer og herder (15: 1 w / w), og legg den i eksikkator i 30 min.
- Hell 30 g og 3 g av uherdet, avgassede PDMS på hver silikonformen som har SU-8-baserte micropatterns av den øvre og den nedre microchannels i tarmen-på-en-brikke, respektivt. Deretter herde ved 60 ° C i en tørr ovn for ved løst 4 timer.
- Form-uttak de øvre og nedre PDMS lag fra hvert silisiumstøpeformen ved å kutte rundt kanten ved hjelp av en kirurgisk skalpell. Punch 6 hull (to innganger, to utsalgssteder, og to vakuumkammer) ved hjelp av en biopsi puncher (2,0 mm i hulldiameter).
- Fremstille den porøse membranen ved å helle 10 g av uherdet og avgassede PDMS på en silanert silisiumskive som inneholder legg matriser med sirkulære søyler (10 um i diameter, 25 mikrometer i høyde) legges over hverandre med en flat, silanisert PDMS bærelaget (15: 1, w / w; 1 cm tykk). Plasser en 3 kg vekt presser på oppsett og kurere polymer ved 60 ° C i 12 timer eller lenger.
- Form-uttak oppsettet av en porøs PDMS membran følges til PDMS støtte skive fra silikonplaten ved å løfte forsiktig opp hjørnet av skive fra leiv og peeling av før den porøse PDMS membranen er helt løsrevet fra wafer.
- Utsette kanalsiden av et øvre lag (PDMS, 15: 1, v / v) og den porøse membranen side til plasma generert av en håndholdt koronabehandlings i 1 minutt, og 3 sekunder, respektivt.
- Plasser plasma-behandlede overflater av den porøse PDMS membran og øvre micro lag i en konforme kontakt ved å plassere hver brikke i parallell uten luftbobler.
- Inkuber hele oppsettet ved 80 ° CO / N for irreversibel binding av de to PDMS lag.
- Skrelle av PDMS støttelaget fra sammenstillingen av et øvre lag med en porøs membran ved forsiktig å løfte opp hjørne av bærelaget, og å trekke av til støttelaget er fullstendig frigjort fra det øvre sjikt med membranen.
- Riv av de deler av denne membran plassert over vakuumkamrene (de to kamre på hver side av hovedkanalen) ved hjelp av en fin-tip pinsett for å lage hule vakuumkamre.
- Eksponere side med membranen festet på toppstykket og side med kanalene inngravert på det nedre stykket til plasma i en samme måte som beskrevet in trinn 1.1.6 i 1 min.
- Juster øvre microchannel lag med en porøs membran og det nederste laget med en konforme kontakt ved å plassere hver brikke i parallell uten luftbobler under ett stereoskop.
- Herde hele oppsettet i en tørr ovn ved 80 ° CO / N for å fremstille en fullstendig skala gut-på-en-brikke mikrofluid enhet som inneholder to hule vakuumkamrene ved siden av mikrofluidcellen kanalen.
- Koble slangen til innløpet og utløpet av hver port koblet til den øvre eller nedre microchannels i en gut-på-en-brikke via en 90 ° bøyet rustfritt stål butt-ende-nål.
- Koble slangen til hullene knyttet til vakuumkamrene ved hjelp av et 90 ° bøyd rustfritt stål butt-ende-nål.
- Sterilisere microchannels og rør ved å føre 70% (v / v) etanol under anvendelse av en 1 ml sterilt engangssprøyte.
- Tørke ut microchannels og rør i en 60 ° C tørr ovnen O / N.
2. Vekst av Mikroket tarmtotter i Gut-on-a-chip enhet
- Seed intestinale epitelceller (f.eks Caco-2BBE) på en Gut-on-a-chip Microdevice 5,9.
- Sterilisere anordningen med 70% (v / v) etanol (se trinn 1.4) ved anvendelse av en 1 ml sterilisert engangssprøyte, etterfulgt av tørking i en 60 ° C tørr ovn O / N (se trinn 1.5) før overflaten aktivering.
- Expose komplett oppsett av en gut-on-a-chip mikrosystem (dvs. en kropp av gut-on-a-chip koblet til slangen) for UV-lys (253,7 nm) og ozon samtidig i 40 min.
- Kjøl ned enheten ved RT i 15 minutter under UV-lys i en biosikkerhet kabinett (BSC).
- Introduser 100 ul av den ECM belegg løsnings- en blanding av 50 ug / ml type I kollagen og 300 ug / ml ekstracellulær matriks blandingen fortynnet i serumfritt Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM) - inn i både øvre og nedre mikrokanaler ved hjelp av en engangs , sterile 1 ml sprøyte.
- Incubate hele oppsettet i en 37 ° C fuktet 5% CO 2 inkubator for en time.
- Degas 50 ml forvarmet (37 ° C) fullstendig dyrkningsmedium (DMEM, 20%, vol / vol, føtalt bovint serum (FBS), 100 enheter / ml penicillin og 100 ug / ml streptomycin, alikvotert i en 3 ml engangssprøyte) ved anvendelse av en 50 ml filtreringssystem (0,45 um porestørrelse i) i nevnte BSC i 1 min.
- Før forvarmet medium gjennom filtreringssystem og trykk forsiktig på den filtrerte medium for 1 min for å fjerne eventuelle bobler eller oppløst gass i mediet.
- Plasser delmengde av avgasset komplett medium i en 3 ml engangssprøyte og inkuberes i et 37 ° C fuktet 5% CO2 inkubator i 1 time.
- Koble to 3 ml engangssprøyter som inneholder avgasset, forvarmet komplett kultur medium til de øvre og nedre microchannels.
- Strømme avgasset fullstendig cellekulturmedium inn i den øvre microchannel ved anvendelse av en sprøytepumpe ved den volumetriskestrømningshastighet på 30 ul / time (tilsvarende den skjærspenning på 0,02 dyn / cm 2) i et 37 ° C fuktet 5% CO2-inkubator O / N.
- Dannelse av mikro-oppbygd Caco-2 Villi i Gut-on-a-chip.
- Bruk Caco-2BBE celler med passasjen tall mellom 50 og 65.
- Grow Caco-2-celler i en T75-kolbe inneholdende komplett kulturmedium i et 37 ° C fuktet 5% CO2-inkubator i 4-5 dager for å oppnå fullt ut sammenflytende celler.
- Tilsett 10 ml av Ca 2+ og Mg2 + -fri PBS for å full konfluente Caco-2-celler dyrket i en T75-kolbe, vask celler, og deretter suge ut PBS. Gjenta dette trinnet to ganger.
- Tilsett 1 ml av 0,05% trypsin / EDTA-løsning og inkuberes i et 37 ° C fuktet 5% CO2 inkubator i 5 min.
- Suspender dissosierte cellene med 10 ml forvarmet komplett cellekulturmedium (med FBS) ved å pipettere opp og ned tre til fem ganger.
- Spinne ned cellesuspensjonen ved centrifugation ved 500 xg i 5 min, og deretter fjerne supernatanten.
- Suspender igjen med 1 ml forvarmet komplett medium for å justere celletetthet på ~ 1,5 x 10 5 celler / cm 2 i enheten. Bruk hemocytometer for å beregne celletetthet.
- Tilfører 100 ul av de resuspenderte Caco-2-celler i det øvre microchannel (lumen) ved å plassere en 1 ml engangssprøyte festet til en 25 G5 / 8 nål på utløpet av røret forbundet med den øvre microchannel.
- Klem alle innløp og utløp av rør som er koblet til de øvre og nedre microchannels bruker bindemiddel klipp.
- Inkuber hele oppsettet i en 37 ° C, fuktig 5% CO 2 inkubator for en time for å tillate dissosiert Caco-2 celler til å holde fast på overflaten av den porøse membran.
- Fjern klemmene og gjenoppta strømmen av kulturmediet bare til øvre microchannel på 30 mL / t ved hjelp av en sprøytepumpe inntil cellene danner en intakt enkeltlag for 24-36 timer. Bruk fase Contrast eller differensialinterferenskontrast (DIC) mikroskopi for å bekrefte celle-celle kryss i en celle monolag.
- Når cellene danner et monolag, perfuse kulturmediet til både øvre (lumen) og nedre (kapillær) mikrokanaler ved den samme strømningshastighet på 30 mL / time.
- Bruk av mekaniske deformasjoner ligne peristaltikk-lignende bevegelser 5,9.
- Slå på vakuumpumpen er utstyrt med spenningen utstyr.
- Koble vakuumkamrene til vakuumkontrolleren via rør med en rustfritt stål kontakt.
- Sett strekker bevegelse på 10% gjennomsnittlig cellestamme med en frekvens på 0,15 Hz med den sykliske sinusfunksjonen modus på vakuum kontrollere programvaren, klikk på "Start".
- Opprettholde den konstante strømmen av kulturmedium (30 pl / t) på både øvre og nedre microchannel til den konfluente Caco-2-monolaget i henhold til mekaniske deformasjoner (10%, 0,15 Hz) for ~ 100 timer.
Merk: Caco-2 celler Spontomme samtidig gjennomgå villus morphogenesis med undulated 3D anslag forlenget mot lumen av epitel microchannel 5,8-10.
- For å emulere organ-nivå funksjoner i levende menneske tarmen med lumen-kapillær vev grensesnittet i gut-on-a-chip 10, følger du fremgangsmåten som er beskrevet.
- Grow mikro-oppbygd Caco-2 villi ved å gjenta trinn 2,1 til 2,2.
- Strømnings den forvarmede ko-kulturmedium (en blanding av det komplette Caco-2-cellekulturmedium og den komp HMVECs dyrkningsmedium, 1: 1 v / v) til de øvre og nedre mikrokanaler på 30 mL / time.
- Introduser 100 ul av dissosierte normale humane kapillær mikrovaskulære endotelceller (HMVECs; endelige celletetthet, ~ 5,0 x 10 5 celler / cm 2) i den nedre microchannel ved den samme metode som er beskrevet i trinn fra 2.2.3 til 2.2.9.
- Plasser en herdet rektangulært PDMS stykket (0,5 cm x 1 cm x 1 cm, bredde x lengde x høyde, 15: 1, w/ w elastomer: herder) på toppen av gut-on-a-chip enhet, deretter snu hele enhetskonfigureringen opp ned (dvs. vender mot øvre microchannel til nedsiden, og den nedre microchannel ansikter på oppsiden).
- Inkuber oppsettet i en 37 ° C, fuktig 5% CO 2 inkubator for en time for å tillate dissosierte HMVECs å holde fast på overflaten av den porøse membran i nedre microchannel.
- Ta ut en hele oppsettet fra CO 2 inkubator, og snu oppsettet på nytt.
- Strømnings forvarmet ko-kulturmedium (en blanding av det komplette Caco-2-cellekulturmedium og den komp HMVECs dyrkningsmedium, 1: 1 v / v) i både øvre og nedre mikrokanaler på 30 mL / t med mekaniske strekkbevegelser ( 10%, 0,15 Hz) i minst tre dager for dannelse av celle-celle kryss av en endotelial monolag.
3. Host-gut mikrobiomer Co-kultur i et Gut-on-a-chip Microdevice
- Utfør pre-kultur of bakteriecellene som følger til co-kultur commensal gut mikrobiomer på mikro-oppbygd tarmtottene.
- Resuspender den frysetørkede probiotiske bakteriepulverblandingen i 10 ml av blanding (1: 1, v / v) av autoklaveres Lactobacilli MRS-buljong og forsterket clostridial Medium.
- Juster den endelige celletettheten til ca. 0,2 enheter for optisk densitet (ved 600 nm) ved tilsetning av passende mengde medium, deretter alikvot 3 ml mikrobiell cellesuspensjonen i et 10 ml sterilt rør.
- Plasser rørene inneholdende mikrobielle celler resuspendert i den anaerobe beholderen. Legg til to pakker av anaerobe gassdannende pose i beholderen. Lukk beholderen lokket tett og inkuber beholderen oppsett uten risting i en 37 ° C fuktet 5% CO 2 inkubator O / N.
- Inokulering av mikrobiomer og Co-kultur med intestinale epitelceller 5,10.
- Forbered 3 ml engangssprøyter som inneholder avgasset antibiotika, natuc fritt cellekulturmedium (dvs. DMEM med 20% FBS). Se 2.1.6 for avgassing fremgangsmåten i kulturmediet.
- Ta ut en hel oppsett av gut-on-a-chip enhet som inneholder mikro-oppbygd villi fra CO 2 inkubator, og deretter flytte til biosikkerhet kabinettet.
- Fjern sprøyter som er koblet til produksjonsrøret er knyttet til de øvre og nedre mikrokanaler. Koble sprøyter utarbeidet i 3.2.1 til enheten, bringe tilbake til CO 2 inkubator, deretter strømme dette antibiotika fritt kulturmedium i 12 timer før såing av mikrobiomer.
- Spinn ned pre-dyrkede probiotiske bakterie blanding celler (se trinnene i 3.1) ved 10 000 xg i 5 min. Aspirer ut supernatanten ved hjelp av vakuum, deretter suspender på antibiotika-fritt DMEM-medium (sluttcelletetthet, ~ 1,0 x 10 7 cfu / ml).
- Sette mot cellesuspensjonen inn i hulrommet side av microchannel inneholdende den "bakterie-frie" tarmtotter anvendelse av en 1 ml engangssprøyte festet til en 25-G5 / 8 nål. Tillate tilslutning av mikrobielle celler til den apikale overflate av tarmtottene i ~ 1,5 timer uten strømning ved klemming til alle produksjonsrøret ende.
- Perfuse den forvarmede antibiotika-fritt kulturmedium inn i både øvre og nedre mikrokanaler på 40 ul / time med sykliske rytmiske deformasjoner (10%, 0,15 Hz).
- For co-kulturen i grønn fluorescens protein (GFP) -merket E. coli (GFP E. coli, ikke-patogene DH5-Alpha E. coli verts) 10,11 celler med mikro-oppbygd villi, pre-dyrke GFP E. coli-celler i autoklavert LB-medium ved 37 ° C under rysting tilstand (200 rpm) i 12 timer. Gjenta prosedyren fra 3.2.5 til 3.2.6 for å gjennomføre co-kultur av GFP E. coli-celler med mikro-oppbygd villi.
- Bilde Cells 5,8-10
- Utfør DIC, epifluorescence, eller laser scanning konfokalmikroskopi for opptak mikrobiell og epitelial morfologi 5,8,10.
- For DIC bildebehandling, ta ut et oppsett av gut-on-a-chip mikro fra CO 2 inkubator, plasser enheten setup på scenen av et mikroskop, og ta opp cellen morfologi.
- For fluorescens avbildning av villus epitel, strømnings PBS for vasking av cellene ved 100 pl / t i 10 min.
- Fiks villi med 4% (w / v) paraformaldehyd i 15 min. Da strømme PBS for vasking av cellene ved 100 pl / t i 10 min.
- Permeabilize villi med 0,3% (v / v) Triton X-100 fortynnet i PBS inneholdende 2% (vekt / volum) bovint serumalbumin (BSA) i 10 min. Da strømme PBS for vasking av cellene ved 100 pl / t i 10 min.
- Blokk-celler med 2% (w / v) BSA-oppløsning i PBS i 1 time. Da strømme PBS for vasking av cellene ved 100 pl / t i 10 min.
- Tilsett 300 nM 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol-dihydroklorid (DAPI) oppløsning fortynnet i PBS for nukleær farging under lett beskyttelse.
- Legg 25 enheter / ml fluorescerende phalloidin(Phalloidin-CF647 konjugat) oppløst i PBS for F-aktin flekker under lett beskyttelse.
- Rekord bilder av fluorescens-fargede celler ved hjelp av en laser scanning konfokalmikroskop.
Merk: En 25X objektiv ble brukt med passende optisk zoom under konfokalmikroskopi. I figur 3B, ble ca. 525X forstørrelse anvendt.
- Utfør DIC, epifluorescence, eller laser scanning konfokalmikroskopi for opptak mikrobiell og epitelial morfologi 5,8,10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å etterligne den menneskelige tarm host-mikrobiomer økosystem in vitro, er det nødvendig å utvikle en forsøksprotokoll for å rekonstituere den stabile langtids ko-kultur av tarmbakterier og humane intestinale epitelceller under fysiologiske betingelser slik som peristaltikk lignende mekanikk og fluidstrømmen. Her benytter vi et biomimetic gut-on-a-chip microdevice (Figur 1A) til co-kultur levende mikrobielle celler i direkte kontakt med levende menneske villi i perioder på en uke eller mer i vitro. Den intestinale epitelceller spontant danne godt differensiert villi når de dyrkes på den ene side av en porøs ECM-belagt membran i en kanal av en 2-kanals mikrofluidanordning i nærvær av fysiologisk relevante fluidstrømning og sykliske mekaniske deformasjoner 5. De mikro-oppbygd villi replikere strukturer og funksjoner av menneskelige små tarmtotter, inkludert formingpå av søyle epitelceller omgitt av en apikal børstesømmen, basal proliferative krypter med migrasjon og differensiering av dattercellene utvikler seg fra krypten til villus spissen, høye nivåer av slimproduksjon, økt narkotika metabolizing aktivitet, og økt glukose reuptake 8. Levende endotelceller kan dyrkes på den motsatte side av den samme membran for å gjenskape den vev-vev grensesnitt i tarmveggen, og immunceller kan dyrkes i systemet, så vel 10. For å validere den beskyttende funksjon av intestinale epitelceller, tight junction barriere av tarmtottene dannet i en gut-on-a-chip er midlertidig kvantifiseres ved å måle transepitelial elektrisk motstand (Teer) 5,10,12. Rutinemessig overvåkning av teer verdi er nødvendig for å estimere integriteten til en celle monolag eller tarmtottene ved hvert tidspunkt (for eksempel før tilsetning bakterier inn i hulrommet).
7 cfu / ml) blir inokulert i lumen av epiteliale microchannel (figur 1 B, «Inokulasjon"). Etter at mikrobielle celler holder seg på den apikale overflate av villi i fravær av strømningen for ~ 1,5 timer (figur 1 B, «Attachment"), fysiologisk strøm (40 pl / t) blir gjenopptatt gjennom begge kanaler med sykliske mekaniske deformasjonene (10% tøyning ved 0.15 Hz) for å fjerne ubundne tarmbakterier og forsynings næringsstoffer til både bakterie- og Haug av epitelceller (figur 1B, "Co-kultur"). Dette co-kulturen protokollen tillater stabil kolonisering av flere arter av probiotiske bakterier i intervillus plass, med levedyktige bakteriemikrokoloniene opprettholdes i opptil to uker i co-kultur (Tall 2A, 2B). I denne studien ble en commercial probiotiske formulering som inneholder en blandet befolkning på åtte forskjellige fakultativ eller forplikte anaerob, probiotiske stammer av Bifidobacterium breve, B. Longum, B. infantis, Lactobacillus acidophilus, L. plantarum, L. paracasei, L. bulgaricus og Streptococcus termofiler blir brukt.
Dette co-kulturen metoden kan grovt brukes for å etterligne den menneskelige tarm host-mikrobe økosystem. For eksempel er ikke-patogent GFP E. coli kan ko-dyrket på overflaten av tarmtotter dyrket i en gut-på-en-brikke-enhet. Basert på den samme protokollen som er beskrevet ovenfor, følges GFP E. coli celler på villi vokse fra enkeltceller i en time til flere mikrokolonier med 3 dager (figur 3A, 1 t kontra 72 timer) som finner i intervillus områder (figur 3B, 1 t kontra 72 timer) når dyrket med sildrende flyte (40 mL /time) i nærvær av peristaltikk liknende deformasjoner (10%, 0,15 Hz).
Figur 1. Den menneskelige Gut-on-a-Chip microphysiological system for host-gut mikrobiomer co-kultur. (A) Et fotografi (til venstre) og en skjematisk (til høyre) av en 2-kanals, gut-on-a-chip microfluidic enhet. Pilene viser retningen kulturbærer (blå, topp microchannel, rød, bunn microchannel). (B) Skjematisk diagrammer av fremgangsmåten i verts-gut mikrobiomer ko-kultur i tarm-på-en-brikke. Etter intestinale epitelceller danne tottene (~ 100 timer), er mikrobielle celler resuspendert i cellekulturmedium innføres i lumen microchannel (Inokulering), og strømmen av kulturmediet er suspendert ~ 1,5 timer (vedlegg). Etter mikrobielle celler holder seg til den apikale overflaten av tarmtottene, er flyten opptas (Co -Kultur). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Ko-kulturen av flere probiotiske bakterier med tarmtottene i tarmen-på-en-brikke. (A) En differensialinterferenskontrastmikroskopibilde viser en microcolony av probiotiske bakterieceller som vokser mellom villi i tarmen brikken. (B) En høyere makt forstørrelse visning av A (en svart stiplet firkant) viser microcolony av probiotiske bakterieceller (rød pil). V, villi; Scale bar = 20 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
ure 3 "src =" / files / ftp_upload / 54344 / 54344fig3.jpg "/>
Figur 3. Ko-kulturen av ikke-patogene, GFP-merket E. coli med tarmtottene i tarmen-on-a-chip. (A) Overlappende fluorescens og DIC mikroskopiske bilder tatt på en og 72 timer, viser koloniseringen av GFP E. coli på tarmtottene dyrket i tarmen-på-en-brikke. (B) Høy effekt forstørrelse utsikt over kledde fluorescens confocal mikroskopi tatt på en og 72 timer som viser vekst av GFP-merket E. coli fra en enkelt celle (en rød pil) til en microcolony (en hvit pil). Blå, kjerner; magenta, F-aktin; Scale bar = 30 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Forstå verts mikrobiomer interaksjoner er avgjørende for å fremme medisin; imidlertid ikke tradisjonelle cellekultur modeller utført i en plastskål eller en statisk brønn plate støtter ikke stabil co-kultur av humane tarmceller med levende gut mikrober i mer enn 1-2 dager fordi mikrobielle celler hovedsakelig overgrow pattedyrceller in vitro. Den gjengroing mikrobiell befolkning forbruker raskt oksygen og næringsstoffer, deretter produsere overdreven bruk av metabolske avfall (f.eks, organiske syrer), som alvorlig kompromittere tarmbarrierefunksjoner og forårsake intestinal epitel celledød. Derfor hindrer mikrobiell overvekst som forårsaker nedbryting av næringsstoffer og akkumulering av mikrobielle avfall er avgjørende for å opprettholde levedyktige vert-mikrobiomer sameksistens i en lengre periode (fra dager til uker) i ko-kulturen mikromiljøet.
For å overvinne disse utfordringene, en microphysiologicalgut-på-en-brikke-enhet 5,8 har blitt utviklet for å danne fullt differensierte humane tarmtottene og for å opprettholde den steady-state mikromiljøet av tarmlumen in vitro. Design og funksjonelle enheter (f.eks microfluidic flyt cellekammerene, vakuum-drevet sykliske deformasjoner) av en gut-on-a-chip microfluidic enhet er endret til nettopp etterligne den fysiologiske, fysiske og kjemiske mikromiljøet for mikrobiell co-kultur 5, 10. Skjærspenningen tilføres i tarmen-på-en-brikke mikrofluid kulturen ble bestemt ved fysiologiske området av luminal strømning i den humane tarmen 5,13. For verts-mikrobe co-kultur, opprettholde "steady-state" av tarmfloraen i luminal microchannel av gut-on-a-chip er avgjørende i å støtte kjemisk og ernæringsmessig gjennomførbare forhold. I tarm-på-en-brikke mikrosystem, er det mulig å estimere den intra-luminale steady-state i tarm-på-en-brikke ved measuring av pH i kulturmediet, og den mikrobielle celletetthet. Fordi friskt kulturmedium kontinuerlig strømmer gjennom mikrokanaler, trenger både mikrobielle og epitelceller ikke gjennomgår næringsutarming når den første såing tettheten av mikrobielle celler, og den volumetriske strømningshastighet av kulturmediet er optimalisert. Det kondisjonerte medium som passerer gjennom microchannel strømmer ut ved et definert volumetrisk strømningshastighet (her, 40 ul / time), så metabolske avfall (for eksempel organiske syrer) samt cellulære secretomes (f.eks cytokiner) blir fortløpende fjernet fra ko- kultur mikromiljøet. Således kan det gut-på-en-brikke anordning bli betraktet som en "kontinuerlig bioreaktor" med en steady-state mikro nødvendig og tilstrekkelig til effektivt å vaske ut ikke-bundne eller overgrodde mikrobielle celler fra lumen av intestinal microchannel, noe som letter generering av en stabil mikrobiell nisje innen 2-3 dager.
Det er avgjørende factors som må vurderes som feilsøking for vellykket co-kultur av mikrobielle celler på tarmtottene. For det første er det nødvendig å bestemme den optimaliserte inkubasjonstiden som kreves for de mikrobielle cellene å feste seg til overflaten av villi fordi mikrobiell adhesjon kan variere mellom mikrobielle arter. For eksempel probiotiske bakterier, som for eksempel Lactobacillus rhamnosus GG 5, krever generelt ~ 1,0-1,5 timer for å feste, men andre mikrobielle arter kan kreve kortere (for eksempel patogene mikrober) eller lengre tid, avhengig av deres vedheft kinetikk 14. For det andre, bør den initielle seeding tettheten av de mikrobielle celler bli identifisert fordi overdreven mikrobielle celleantall kan føre til utvekst av bakterier i den tidlige fasen av ko-kultur, som kan interferere med oppnåelse av en stabil likevekt. For å optimalisere denne poding tetthet, er det anbefalt å karakterisere vekstprofil av målet mikrobiell belastning i antibiotisk-fritt celledyrkningsmedium ved forskjellige pode tettheter. Endelig kan justering av den volumetriske strømningshastighet være nødvendig, avhengig av mikrobielle arter. For eksempel vil økte strømningsmengder være nødvendig hvis de mikrobielle celler spre meget raskt. Det ble eksperimentelt bekreftet at strømningshastigheter opp til 300 ul / t (0,2 dyn / cm 2) ikke kompromittere barrierefunksjon og celle morfologi av mikro-oppbygd villi (data ikke vist). Selv om Lactobacillus rhamnosus GG 5, over-the-counter probiotiske blandingen, VSL # 3, ikke-patogen lab-stamme E. coli, så vel som sykdomsfremkallende enteroinvasive E. coli stamme 10 ble vellykket anvendt for den langsiktige co-kultur i gut-on-a-chip, er det fortsatt nødvendig å teste en rekke mikrobielle arter fra commensal gut microbiota til patogene smittsomme mikroorganismer. Den cultivability av mikrobielle celler in vitro bør overveies i nærvær eller fraværav vertsceller i sammenheng med symbiose og evolusjon, hvor testen av å dyrke unculturable gut mikrobiomer er en spennende utfordring. Endelig en robust protokoll for co-kulturen i både aerobe og anaerobe mikrober i tarmen-on-a-chip er en viktig udekket behov for å bli oppdaget i fremtiden.
Det er skritt som kan tas for å ytterligere forbedre modellen, som for eksempel bruk av primære intestinal epitel eller udifferensierte stamceller fra individuelle mennesker som har spesielle gastrointestinale sykdommer som Crohns sykdom eller tykktarmskreft; eller induserte pluripotente stamceller (iPSCs). Men med den voksende interessen i rollen som menneskelig mikrobiomer i orkestre menneskers helse og sykdom, har vår vert-mikrobiomer co-kultur metoden en enorm betydning og potensial til å bli brukt for å etterligne andre verts mikrobiomer økosystemer som finnes i menneskekroppen (f.eks , munnhulen 15, hud 16, eller urogenitale tRACT 17). Endelig kan dette samarbeidet dyrkingsmetoden innovere den konvensjonelle stoffet utviklingsprosessen ved å forbedre forutsigbarheten i forhold til hvordan gut mikrobiomer påvirkninger på biotilgjengeligheten, effekt og toksisitet av nye medikamenter forbindelser. Til sammen kan det gut-on-a-chip microphysiological system gir en robust plattform for å etablere et stabilt steady-state intestinal mikromiljøet som kan brukes til å rekonstituere verts mikrobiomer økosystem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) containing 25 mM glucose and 25 mM HEPES | Gibco | 10564-011 | Warm it up at 37 °C in a water bath. |
| Difco Lactobacilli MRS broth | BD | 288120 | Run autoclave at 121 °C for 15 min. |
| Poly(dimethylsiloxane) | Dow Corning | 3097358-1004 | 15:1 (w/w), PDMS : cureing agent |
| Caco-2BBE human colorectal carcinoma line | Harvard Digestive Disease Center | Human colorectal adenocarcinoma | |
| Heat-inactivated FBS | Gibco | 10082-147 | 20% (v/v) in DMEM |
| Penicillin-streptomycin-glutamine | Gibco | 10378-016 | 1/100 dilution in DMEM |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Molecular Probes | D1306 | Nuclei staining |
| Phalloidin-CF647 conjugate (25 units/ml) | Biotium | 00041 | F-actin staining |
| Flexcell FX-5000 tension system | Flexcell International Corporation | FX5K | Peristalsis-like stretcing motion (10% cell strain, 0.15 Hz frequency) |
| Inverted epifluorescence microscope | Zeiss | Axio Observer Z1 | Imaging, DIC |
| Scanning confocal microscope | Leica | DMI6000 | Imaging, Fluorescence |
| UVO Cleaner | Jelight Company Inc | 342 | Surface activation of the gut-chip |
| Type I collagen | Gibco | A10483-01 | Extracellular matrix component for cell culture into the chip |
| Matrigel | BD | 354234 | Extracellular matrix component for cell culture into the chip |
| 1 ml disposable syringe | BD | 309628 | Cell and media injection stuff |
| 25 G 5/8 needle | BD | 329651 | Cell and media injection stuff |
| Syringe pump | Braintree Scientific Inc. | BS-8000 | Injection equipment into the chip |
| VSL#3 | Sigma-Tau Pharmaceuticals | 7-45749-01782-6 | A formulation of 8 different commensal gut microbes |
| Reinforced Clostridial Medium | BD | 218081 | Anaerobic bacteria culture medium |
| GasPak EZ Anaerobe Container System with Indicator | BD | 260001 | Anaerobic gas generating sachet |
| 4% paraformaldehyde | Electron Microscopy Science | 157-4-100 | Fixing the cells for staining |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Permeabilizing the cells |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | Blocking agent for staining of the cells |
| Corona treater | Electro-Technic Products | BD-20AC | Plasma generator for fabrication of the chip |
| Steriflip | Millipore | SE1M003M00 | Degasing the complete culture medium |
| Disposable hemocytometer | iNCYTO | DHC-N01 | For manual cell counting |
References
- Turnbaugh, P. J., et al. An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest. Nature. 444, 1027-1031 (2006).
- Tremaroli, V., Backhed, F. Functional interactions between the gut microbiota and host metabolism. Nature. 489, 242-249 (2012).
- Sekirov, I., Russell, S. L., Antunes, L. C. M., Brett Finlay, B. Gut Microbiota in Health and Disease. Physiol. Rev. 90, 859-904 (2010).
- Turnbaugh, P. J., et al. The human microbiome project. Nature. 449, 804-810 (2007).
- Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow. Lab Chip. 12, 2165-2174 (2012).
- Round, J. L., Mazmanian, S. K. The gut microbiota shapes intestinal immune responses during health and disease. Nat Rev Immunol. 9, 313-323 (2009).
- Garrett, W. S., et al. Communicable ulcerative colitis induced by T-bet deficiency in the innate immune system. Cell. 131, 33-45 (2007).
- Kim, H. J., Ingber, D. E. Gut-on-a-Chip microenvironment induces human intestinal cells to undergo villus differentiation. Integr Biol. 5, 1130-1140 (2013).
- Huh, D., Kim, H. J., et al. Microfabrication of human organs-on-chips. Nat Protoc. 8, 2135-2157 (2013).
- Kim, H. J., Li, H., Collin, J. J., Ingber, D. E. Contributions of microbiome and mechanical deformation to intestinal bacterial overgrowth and inflammation in a human gut-on-a-chip. Proc. Natl. Acad. Sci. 113, E7-E15 (2016).
- Miller, W. G., Lindow, S. E. An improved GFP cloning cassette designed for prokaryotic transcriptional fusions. Gene. 191, 149-153 (1997).
- Odijk, M., et al. Measuring direct current trans-epithelial electrical resistance in organ-on-a-chip microsystems. Lab Chip. 15, 745-752 (2015).
- Lentle, R. G., Janssen, P. W. Physical characteristics of digesta and their influence on flow and mixing in the mammalian intestine: a review. J Comp Physiol B. 178, 673-690 (2008).
- Granato, D., et al. Cell surface-associated lipoteichoic acid acts as an adhesion factor for attachment of Lactobacillus johnsonii La1 to human enterocyte-like Caco-2 cells. Appl Environ Microbiol. 65, 1071-1077 (1999).
- Dewhirst, F. E., et al. The human oral microbiome. J Bacteriol. 192, 5002-5017 (2010).
- Grice, E. A., Segre, J. A. The skin microbiome. Nat Rev Microbiol. 9, 244-253 (2011).
- Hay, P. E., et al. Abnormal bacterial colonisation of the genital tract and subsequent preterm delivery and late miscarriage. Br Med J. 308, 295-298 (1994).
