Summary
Descriviamo un protocollo in vitro di co-coltura budello microbiome e villi intestinali per un periodo prolungato utilizzando un sistema umano intestino-on-a-chip microphysiological.
Abstract
Qui, descriviamo un protocollo per eseguire a lungo termine co-coltura di multi-specie intestino microbioma umano con villi intestinali microengineered in un dispositivo umano gut-on-a-chip microphysiological. Noi ricapitolare i intestinale interfaccia di tessuto lume-capillare in un dispositivo di microfluidica, dove deformazioni meccaniche fisiologiche e flusso di taglio fluido sono costantemente applicati per imitare la peristalsi. Nel microcanali lume, epiteliali intestinali Caco-2 cellule umane sono coltivate in modo da formare un epitelio villi 'germ-free' e rigenerare piccoli villi intestinali. cellule microbiche pre-coltivate vengono inoculati nel lato lume di stabilire un ecosistema host-microbo. Dopo che le cellule microbiche aderiscono alla superficie apicale dei villi, flusso di fluido e deformazioni meccaniche sono ripresi per produrre un microambiente stato stazionario in cui terreno fresco viene costantemente alimentato e batteri non legato (nonché scarti batteriche) sono continuamente rimossi. Dopo estesa co-coltura fgiorni o settimane rom, più microcolonie sono trovati per essere collocata in modo casuale tra i villi, ed entrambi microbica e cellule epiteliali rimangono vitali e funzionale per almeno una settimana in coltura. Il nostro protocollo co-coltura può essere adattato a fornire una piattaforma versatile per altri ecosistemi ospitanti-microbiome che si possono trovare in vari organi umani, che potrebbe agevolare studio in vitro del ruolo del microbioma umano nell'orchestrare la salute e la malattia.
Introduction
L'intestino umano ospita una gamma incredibilmente diversificata di specie microbiche (<1.000 specie) e un numero enorme di cellule microbiche (10 volte di più rispetto alle cellule ospiti umane) e geni (100 volte più del genoma umano) 1. Questi microbiomes umane giocano un ruolo chiave nel metabolismo di sostanze nutritive e xenobiotici, che regola le risposte immunitarie, e mantenere l'omeostasi intestinale 2. Non sorprende che, date queste diverse funzioni, l'intestino microbiome commensale modula ampiamente salute e la malattia 3. Così, la comprensione del ruolo del budello microbioma e host-microbo interazioni sono di grande importanza per promuovere gastrointestinale (GI) di salute e di esplorare nuove terapie per i disturbi intestinali 4. Tuttavia, esistenti in modelli intestinali in vitro (ad esempio, le culture statiche) limita host-microbiome co-coltura per un breve periodo di tempo (<1 giorno) perché le cellule microbiche invadere e compromettono barriera intestinaleFunzione 5. Modelli animali surrogati (ad esempio, di germi free 6 o tecniche di ingegneria genetica topi 7) sono, inoltre, non comunemente utilizzati per lo studio ospite-gut microbiome crosstalk perché la colonizzazione e il mantenimento stabile di microbioma intestinale umana sono difficili.
Per superare queste difficoltà, abbiamo recentemente sviluppato un essere umano biomimetico "Gut-on-a-Chip" sistema microphysiological (Figura 1A, a sinistra) per emulare le interazioni ospite-microbioma intestinale che si verificano nel vivere intestino umano 5,8. Il Microdevice gut-on-a-chip contiene due canali microfluidica parallele separate da un flessibile, porosa, matrice extracellulare (ECM) membrana Rivestiti fiancheggiata da epiteliali intestinali umane cellule Caco-2, imitando il intestinale lume-capillari interfaccia tessuto (Figura 1A , a destra) 9. ciclici deformazioni ritmiche sotto vuoto spinto inducono deformazioni meccaniche fisiologiche che simulano i cambiamenti normalmente Induccati da peristalsi (Figura 1A, a destra). È interessante notare che, quando cellule Caco-2 sono coltivate nell'intestino-on-a-chip per più di 100 ore, hanno spontaneamente forma tridimensionale (3D) villi intestinali con giunzioni strette, bordi pennello apicali, le cellule proliferative limitate a cripte basali, produzione di muco, una maggiore attività metabolizzare farmaci (ad esempio, citocromo P450 3A4, CYP3A4), e una maggiore glucosio ricaptazione 8. In questo microambiente 'privo di germi', è stato possibile co-cultura probiotico Lactobacillus GG rhamnosus o una formazione terapeutica di una miscela batterico probiotico con cellule epiteliali ospitante per due settimane 5,10.
In questo studio, descriviamo il protocollo dettagliato per eseguire host-intestino microbiome co-coltura nel dispositivo gut-on-a-chip per un periodo prolungato. In aggiunta, discutiamo criticità e sfide potenziali da considerare per una vasta applicazione di questo host-microbiome co-coltura pROTOCOLLO.
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Protocol
1. Microfabbricazione di un dispositivo Gut-on-a-chip
Nota: L'intestino-on-a-chip è un dispositivo microfluidico fatta da, polimero siliconico gas-permeabile trasparente (polidimetilsilossano, PDMS), contenente due microcanali paralleli (1 mm larghezza lunghezza x 150 micron di altezza x 1 cm) separati da un flessibile poroso (10 micron di diametro dei pori, 25 micron di pori spaziatura a pori) PDMS membrana 5,9. Realizzare il (Figura 1A, a sinistra) gut-on-a-chip seguendo le istruzioni fornite.
- Microfabbricazione interno del 5,9 Gut-on-a-chip.
- Preparare non essiccate, PDMS degassati miscelando il prepolimero PDMS e il catalizzatore (15: 1 w / w), e posizionarlo in un essiccatore a vuoto per 30 minuti.
- Versare 30 ge 3 g di TDS, PDMS degassati su ogni stampo in silicone che ha SU-8 microdisegni base della tomaia e microcanali inferiori dell'intestino-on-a-chip, rispettivamente. Poi polimerizzare a 60 ° C in un forno asciugare per lest 4 ore.
- Sformatura le PDMS strati superiore ed inferiore di ogni stampo di silicone tagliando lungo il bordo utilizzando un bisturi chirurgico. Punch 6 fori (due ingressi, due uscite e due camere a vuoto) con un perforatore biopsia (2,0 mm di diametro del foro).
- Preparare la membrana porosa versando 10 g di PDMS non essiccate e degassati su un wafer di silicio silanizzata contenente array di pubblicare con pilastri circolari (10 micron di diametro, 25 micron di altezza), sovrapponendo con TV, silanizzato strato di supporto PDMS (15: 1, w / w; 1 cm di spessore). Mettere a 3 kg di peso premistoffa sulla configurazione e curare il polimero a 60 ° C per 12 ore o più.
- Sformatura la configurazione di un porosa membrane PDMS aderito alla lastra di supporto PDMS dal wafer di silicio con attenzione sollevando l'angolo della lastra dal wafer, e staccava fino membrana porosa PDMS è completamente staccato dal wafer.
- Esporre il lato del canale di uno strato superiore (PDMS, 15: 1, w / w) e il lato della membrana porosa al plasma generato da un trattamento corona palmare per 1 min e 3 sec, rispettivamente.
- Posizionare le superfici plasma trattato del porosa membrane PDMS e lo strato superiore microcanale in contatto conforme mettendo ogni pezzo in parallelo senza bolle d'aria.
- Incubare l'intero setup a 80 ° CO / N per legame irreversibile dei due strati PDMS.
- Staccare lo strato di supporto PDMS dal gruppo di uno strato superiore con una membrana porosa con attenzione sollevando l'angolo dello strato di supporto, e si staccava finché lo strato di supporto è completamente staccato dallo strato superiore con la membrana.
- Strappare le porzioni di questa membrana si trova sopra le camere a vuoto (le due camere situate su entrambi i lati del canale principale) utilizzando un fine-tip pinzette per rendere camere a vuoto vuoti.
- Esporre il lato con la membrana attaccata sul pezzo superiore e il lato con i canali incisi sul pezzo inferiore al plasma in uno stesso modo come i descritton passo 1.1.6 per 1 min.
- Allineate lo strato microcanali superiore con una membrana porosa e lo strato inferiore con un contatto conformazionale mettendo ogni pezzo in parallelo senza bolle d'aria sotto uno stereoscopio.
- Curare l'intero setup in un forno secco a 80 ° CO / N per produrre una scala dispositivo microfluidica completa gut-on-a-chip contenente due camere a vuoto cave accanto al canale cella microfluidica.
- Collegare tubo alla ingresso e uscita di ciascuna porta collegato alla tomaia o microcanali inferiori in un budello-on-a-chip con un 90 ° piegata in acciaio inox ago smussato-end.
- Collegare il tubo ai fori collegati alle camere a vuoto utilizzando un piegato acciaio inox ago smussato-end 90 °.
- Sterilizzare i microcanali e tubi fluendo etanolo al 70% (v / v) con un 1 ml sterilizzato siringa monouso.
- Asciugare i microcanali e tubi in un forno a 60 ° C asciutto O / N.
2. Crescita di MicroengineEred intestinale Villi nel dispositivo Gut-on-a-chip
- Seed cellule intestinali epiteliali (ad es Caco-2BBE) su un 5,9 Microdevice Gut-on-a-chip.
- Sterilizzare il dispositivo con il 70% (v / v) etanolo (vedere fase 1.4) utilizzando un 1 ml siringa monouso sterilizzato seguito da essiccazione a 60 ° C forno secca O / N (vedere fase 1.5) prima della attivazione della superficie.
- Esporre la configurazione completa di un microsistema budello-on-a-chip (cioè, un corpo dell'intestino-on-a-chip collegato al tubo) a luce UV (253,7 nm) e ozono simultaneamente per 40 min.
- Raffreddare il dispositivo a temperatura ambiente per 15 minuti sotto la luce UV in un armadio biosicurezza (BSC).
- Introdurre 100 ml di rivestimento ECM soluzione- una miscela di 50 mg / tipo ml collagene e 300 ug / ml di miscela matrice extracellulare diluita nella esente da siero di Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) - in entrambi i microcanali superiore e inferiore utilizzando un monouso , siringa sterile da 1 ml.
- incubaTe l'intero setup a 37 ° C umidificata al 5% CO 2 incubatore per 1 ora.
- Degas 50 ml di pre-riscaldato (37 ° C) terreno di coltura completo (DMEM, 20%, v / v, siero bovino fetale (FBS), 100 unità / ml di penicillina, e 100 mg / streptomicina ml; aliquotati in 3 ml siringa monouso) utilizzando un sistema di filtrazione 50 ml (0,45 micron di dimensione dei pori) nel BSC per 1 min.
- Passare il supporto pre-riscaldato attraverso il sistema di filtrazione e toccare delicatamente sul mezzo filtrata per 1 min per rimuovere eventuali bolle o gas disciolto nel mezzo.
- Posizionare la aliquota di terreno completo degasata in una siringa monouso ml 3 e incubare a 37 ° C umidificata al 5% CO 2 incubatore per 1 ora.
- Collegare due 3 siringhe monouso ml contenente degasate, medio pre-riscaldato completo di coltura per i microcanali superiori e inferiori.
- Flusso del mezzo di coltura cellulare completa degasata in microcanali superiore utilizzando una pompa a siringa al volumetricoportata di 30 microlitri / hr (equivalente alla tensione tangenziale a 0.02 dyne / cm 2) a 37 ° C umidificata al 5% CO 2 incubatore O / N.
- Formazione di Microengineered Caco-2 Villi nel Gut-on-a-chip.
- Utilizzare le cellule Caco-2BBE con il numero di passaggio tra il 50 e il 65.
- Grow cellule Caco-2 in un pallone T75 contenente terreno di coltura completo in un 37 ° C umidificata al 5% CO 2 incubatore per 4-5 giorni per ottenere cellule completamente confluenti.
- Aggiungere 10 ml di Ca 2+ e Mg 2+-free PBS a pieno confluenti Caco-2 cellule coltivate in un pallone T75, lavare le cellule, poi Aspirare PBS. Ripetere questa operazione due volte.
- Aggiungere 1 ml di tripsina soluzione 0,05% / EDTA e incubare a 37 ° C umidificata al 5% CO 2 incubatore per 5 min.
- Risospendere le cellule dissociate con 10 ml di mezzo di coltura cellulare completo pre-riscaldato (con FBS) pipettando su e giù tre a cinque volte.
- Centrifugare la sospensione cellulare da centrifugation a 500 xg per 5 minuti, quindi rimuovere il surnatante.
- Risospendere nuovo con 1 ml preriscaldata mezzo completo per regolare la densità delle cellule a ~ 1,5 x 10 5 cellule / cm 2 nel dispositivo. Utilizzare emocitometro per stimare la densità cellulare.
- Infondere 100 pl delle risospeso cellule Caco-2 nella microcanali superiore (lato lumen) posizionando un 1 ml siringa monouso collegata ad un 25 G5 / 8 ago sull'uscita del tubo collegato al microcanali superiore.
- Bloccare tutte le entrate e le uscite di tubi collegati ai microcanali superiore e inferiore con clip legante.
- Incubare l'intera configurazione a 37 ° C, umidificata al 5% CO 2 incubatore per 1 ora per consentire dissociato cellule Caco-2 per aderire alla superficie della membrana porosa.
- Rimuovere i morsetti e riprendere il flusso di terreno di coltura solo al microcanali superiore al 30 microlitri / hr utilizzando una pompa a siringa fino cellule formano un monostrato intatto per 24-36 ore. Utilizzare i contras faset o microscopia a contrasto di interferenza differenziale (DIC) per confermare giunzioni cellula-cellula in un monostrato di cellule.
- Quando le cellule formano un monostrato, profumato il terreno di coltura in entrambi superiori (lumen) e inferiore microcanali (capillari) alla stessa velocità di flusso di 30 ml / h.
- L'applicazione di deformazioni meccaniche che mimano peristalsi-come movimenti 5,9.
- Accendere la pompa a vuoto equipaggiato con l'apparecchiatura tensione.
- Collegare le camere a vuoto per il controllore di vuoto tramite tubi con un connettore in acciaio inox.
- Impostare il moto allungamento del 10% ceppo cellulare medio ad una frequenza di 0,15 Hz con la modalità funzione seno ciclico sul software di controllo del vuoto, quindi scegliere "Start".
- Mantenere il flusso costante di terreno di coltura (30 ml / h) in entrambi i microcanali superiore e inferiore al confluente Caco-2 monostrato sotto deformazioni meccaniche (10%, 0,15 Hz) per ~ 100 ore.
Nota: cellule Caco-2 sponneamente subire morfogenesi dei villi con le proiezioni in 3D ondulati estesi verso il lume del microcanali epiteliale 5,8-10.
- Per emulare le funzioni a livello di organo dell'intestino umano vivente con interfaccia tessuto lumen-capillare nell'intestino-on-a-chip 10, seguire la procedura descritta.
- Grow microengineered Caco-2 villi ripetendo i passaggi 2,1-2,2.
- Flusso pre-riscaldato a medio co-coltura (una miscela di completo mezzo di coltura cellulare Caco-2 e la HMVECs mezzo completo di coltura, 1: 1 v / v) per i microcanali superiore e inferiore a 30 microlitri / hr.
- Introdurre 100 ml di cellule normali dissociate capillare microvascolari umane endoteliali (HMVECs; densità cellulare finale, ~ 5.0 x 10 5 cellule / cm 2) nel microcanali in basso con il metodo identico descritto ai punti da 2.2.3 a 2.2.9.
- Posizionare un pezzo rettangolare PDMS curato (0,5 centimetri x 1 cm x 1 cm, larghezza x lunghezza x altezza; 15: 1, w/ w elastomero: induritore) sulla parte superiore del dispositivo gut-on-a-chip, poi capovolgere l'intera configurazione del dispositivo a testa in giù (vale a dire, il microcanali superiore volti al ribasso, e la più bassa microcanali volti al rialzo).
- Incubare la configurazione a 37 ° C, umidificata al 5% CO 2 incubatore per 1 ora per consentire HMVECs dissociati per aderire alla superficie della membrana porosa in microcanali inferiore.
- Estrarre un intero setup dal termostato di CO 2, e capovolgere l'impostazione più volte.
- Flusso medio co-coltura pre-riscaldato (una miscela di completo mezzo di coltura cellulare Caco-2 e la HMVECs mezzo completo di coltura, 1: 1 v / v) in entrambi i microcanali superiore e inferiore a 30 microlitri / hr con movimenti di stretching meccanici ( 10%, 0,15 Hz) per almeno tre giorni per formare giunzioni cellula-cellula di un monostrato endoteliale.
3. Host-Gut Microbiome Co-cultura in un Microdevice Gut-on-a-chip
- Eseguire pre-cultura of le cellule batteriche come segue per co-coltura commensale dell'intestino microbiome sul villi intestinali microengineered.
- Risospendere il composto in polvere batterica probiotici liofilizzati in 10 ml della miscela (1: 1, v / v) di autoclavato lattobacilli MRS brodo e rinforzato da clostridi Medium.
- Regolare la densità cellulare finale a circa 0,2 unità di densità ottica (a 600 nm) l'aggiunta di adeguate quantità di mezzo, poi un'aliquota 3 ml di sospensione cellulare microbica in una provetta sterile monouso da 10 ml.
- Porre le provette contenenti risospese cellule microbiche nel contenitore anaerobica. Aggiungere due confezioni di anaerobica bustina generatore di gas nel contenitore. Chiudere il coperchio del contenitore e incubare la configurazione del contenitore senza agitazione a 37 ° C umidificata al 5% di CO 2 incubatore O / N.
- Inoculazione di Microbiome e co-coltura con cellule epiteliali intestinali 5,10.
- Preparare 3 ml siringhe monouso contenenti antibioti degassatoc privo terreno di coltura cellulare (cioè, DMEM con 20% FBS). Vedere 2.1.6 per la procedura di degassificazione del mezzo di coltura.
- Estrarre tutta una messa a punto del dispositivo gut-on-a-chip contenente villi microengineered dal termostato di CO 2, per poi passare al mobile biosicurezza.
- Rimuovere siringhe collegati al tubo collegato a microcanali superiori e inferiori. Collegare siringhe preparate in 3.2.1 per il dispositivo, riportare al incubatore CO 2, poi sfociare questo terreno di coltura privo di antibiotici per 12 ore prima di semina di microbioma.
- Spin giù le cellule probiotici miscela batteriche pre-coltura (vedere i passi in 3.1) a 10.000 xg per 5 min. Aspirare il surnatante usando il vuoto, poi risospendere in terreno DMEM antibiotico-free (densità cellulare finale, ~ 1.0 x 10 7 CFU / ml).
- Infondere la sospensione cellulare nel lato lume del microcanali che contiene i villi intestinali "germ-free" con un 1 ml siringa monouso collegata ad un 25G5 / 8 ago. Consentire l'adesione delle cellule microbiche alla superficie apicale della villi intestinali per ~ 1,5 ore senza flusso mediante serraggio a tutte le estremità del tubo.
- Profumato terreno di coltura privo di antibiotici pre-riscaldato in entrambi i microcanali superiore e inferiore a 40 ml / h con deformazioni ritmiche ciclici (10%, 0,15 Hz).
- Per la co-coltura di proteina fluorescente verde (GFP) -labeled E. coli (E. coli GFP; non patogeno DH5-Alpha E. coli ospitanti) 10,11 cellule con villi microengineered, pre-coltivare GFP E. coli in terreno LB autoclave a 37 ° C sotto agitazione condizione (200 rpm) per 12 ore. Ripetere la procedura da 3.2.5 a 3.2.6 per effettuare co-coltura di GFP E. coli con villi microengineered.
- Celle di immagine 5,8-10
- Eseguire DIC, epifluorescenza, o scansione laser microscopia confocale per la registrazione microbica e epiteliale morfologia 5,8,10.
- Per la formazione immagine DIC, prendere una configurazione di microsistemi gut-on-a-chip dal termostato di CO 2, posizionare la configurazione del dispositivo sul palco di un microscopio, quindi registrare la morfologia cellulare.
- Per l'imaging di fluorescenza di villi dell'epitelio, il flusso di PBS per lavare le cellule a 100 l / h per 10 min.
- Fissare villi con 4% (w / v) paraformaldeide per 15 min. Poi il flusso di PBS per lavare le cellule a 100 ml / h per 10 min.
- Permeabilize villi con 0,3% (v / v) Triton X-100 diluito in PBS contenente 2% (w / v) di albumina di siero bovino (BSA) per 10 min. Poi il flusso di PBS per lavare le cellule a 100 ml / h per 10 min.
- cellule di blocco con 2% (w / v) di BSA in PBS per 1 ora. Poi il flusso di PBS per lavare le cellule a 100 ml / h per 10 min.
- Aggiungere 300 Nm di 4 ', 6-dicloridrato diamidino-2-phenylindole soluzione (DAPI) diluito in PBS per la colorazione nucleare sotto protezione dalla luce.
- Aggiungere 25 unità / ml di falloidina fluorescente(Falloidina-CF647 coniugato) disciolto in PBS per la colorazione F-actina sotto protezione dalla luce.
- registrare le immagini di cellule fluorescente colorate utilizzando una scansione laser microscopio confocale.
Nota: Un obiettivo 25X è stato applicato con zoom ottico appropriato durante la microscopia confocale. Nella Figura 3B, è stato utilizzato circa 525X ingrandimento.
- Eseguire DIC, epifluorescenza, o scansione laser microscopia confocale per la registrazione microbica e epiteliale morfologia 5,8,10.
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Representative Results
Per emulare il intestinale ecosistema host-microbioma umano in vitro, è necessarie per sviluppare un protocollo sperimentale per ricostituire la stabilità a lungo termine co-coltura di batteri intestinali e le cellule epiteliali intestinali umane in condizioni fisiologiche come la meccanica peristalsi-simili e flusso del fluido. Qui, utilizziamo un biomimetico Microdevice gut-on-a-chip (Figura 1A) per co-coltura cellule microbiche a diretto contatto giorno con soggiorno villi umano per periodi di una settimana o più in vitro. Le cellule epiteliali intestinali spontaneamente formano villi ben differenziato quando coltivate su un lato di una membrana ECM rivestite porosa in un canale di un dispositivo microfluidico 2 canali in presenza di flusso di fluido fisiologicamente rilevanti e ciclici deformazioni meccaniche 5. I villi microengineered replicano le strutture e le funzioni dei piccoli villi intestinali umani, tra cui Formatisu di cellule epiteliali colonnari fiancheggiate da un bordo pennello apicale, cripte proliferative basali con la migrazione e la differenziazione delle cellule figlie progressione dalla cripta di punta dei villi, alti livelli di produzione di muco, una maggiore attività di metabolizzazione di droga, e l'aumento della ricaptazione della glicemia 8. Living cellule endoteliali possono essere coltivate sul lato opposto della stessa membrana di ricreare l'interfaccia tessuto tessuto della parete intestinale, e le cellule immunitarie possono essere coltivate in sistema nonché 10. Per convalidare la funzione protettiva delle cellule epiteliali intestinali, stretto raccordo barriera dei villi intestinali formate in un budello-on-a-chip è intermittente quantificato misurando la resistenza elettrica transepiteliale (TEER) 5,10,12. Monitoraggio di routine del valore TEER è necessaria per stimare l'integrità di un monostrato di cellule o villi intestinali in ogni frangente (ad esempio, prima di aggiungere batteri nel lume).
7 CFU / ml) vengono inoculate nel lume del microcanali epiteliale (Figura 1B, "inoculazione"). Dopo che le cellule microbiche aderiscono sulla superficie apicale villi in assenza di flusso per ~ 1,5 ore (Figura 1B, "Allegato"), flusso fisiologica (40 ml / h) viene ripreso attraverso entrambi i canali con deformazioni meccaniche ciclici (10% deformazione a 0,15 Hz) per rimuovere batteri intestinali non legati e sostanze nutritive di alimentazione ad entrambe le cellule epiteliali batteriche e villi (Figura 1B, "Co-cultura"). Questo protocollo co-coltura permette la colonizzazione stabile di più specie di batteri probiotici nello spazio intervillus, con vitali microcolonie batteriche mantenute per un massimo di due settimane in co-coltura (Figure 2A, 2B). In questo studio, un commercial formulazione probiotico che contiene una popolazione mista di 8 diversi anaerobi facoltativi o di obbligare, ceppi probiotici di Bifidobacterium breve, B. longum, B. infantis, Lactobacillus acidophilus, L. plantarum, L. paracasei, L. bulgaricus e Streptococcus termofili viene utilizzato.
Questo metodo di co-coltura può essere ampiamente applicato per emulare il intestinale ecosistema host-microbo umana. Per esempio, non patogeni GFP E. coli può essere co-coltivate sulla superficie dei villi intestinali coltivate in un dispositivo budello-on-a-chip. Basato sullo stesso protocollo descritto sopra, aderito GFP E. coli cellule sulla villi crescono da singole cellule in 1 ora a più microcolonie con 3 giorni (Figura 3a, 1 hr vs 72 hr) che individuano negli spazi intervillus (figura 3B, 1 hr vs. 72 ore) quando coltivate in gocciolando FLOW (40 ml /hr) in presenza di deformazioni peristalsi simile (10%, 0,15 Hz).
Figura 1. Il Gut-on-a-Chip umane del sistema microphysiological per Host-gut microbiome co-coltura. (A) Una fotografia (sinistra) e uno schema (a destra) di un 2-canali, gut-on-a-chip dispositivo di microfluidica. Le frecce indicano la direzione del flusso del mezzo di coltura (blu, top microcanali, rosso, microcanali basso). (B) Diagrammi di massima la procedura di host-intestinale microbiome co-coltura nell'intestino-on-a-chip. Dopo che le cellule epiteliali intestinali formano villi (~ 100 hr), cellule microbiche risospese nel mezzo di coltura cellulare vengono introdotti al lume microcanali (inoculazione), allora il flusso del mezzo di coltura viene sospeso per ~ 1,5 ore (allegato). Dopo che le cellule microbiche aderiscono alla superficie apicale dei villi intestinali, flusso viene ripreso (Co -Culture). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Co-coltura di batteri probiotici multipli con villi intestinali nell'intestino-on-a-chip. (A) A micrografia contrasto interferenziale differenziale mostra una microcolonia di cellule batteriche probiotiche crescenti tra la villi nel chip nell'intestino. (B) Un elevato vista Potere di ingrandimento di A (un quadrato tratteggiato nero) che mostra il microcolonia di cellule batteriche probiotiche (una freccia rossa). V, villi; Barra di scala = 20 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura 3. Co-cultura della non patogeno, GFP-etichettata E. coli con villi intestinali nell'intestino-on-a-chip. (A) di fluorescenza sovrapposti e DIC immagini microscopiche prese a 1 e 72 ore, visualizzando la colonizzazione di GFP E. coli sui villi intestinali coltivate nell'intestino-on-a-chip. (B) viste di ingrandimento ad alta potenza di fluorescenza sovrapposti micrografie confocale prese a 1 e 72 ore che mostrano la crescita di GFP-etichettata E. coli da una singola cellula (una freccia rosso) ad una microcolonia (una freccia bianca). Blu, nuclei; magenta, F-actina; Barra di scala = 30 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Capire interazioni ospite-microbiome è fondamentale per far progredire la medicina; tuttavia, tradizionali modelli di coltura cellulare eseguiti in un piatto di plastica o di una piastra ben statica non supportano la stalla co-coltura di cellule intestinali umane con microbi intestinali vivere per più di 1-2 giorni, perché le cellule microbiche soprattutto invadere le cellule di mammifero in vitro. La popolazione microbica overgrowing consuma rapidamente ossigeno e sostanze nutritive, in seguito la produzione di quantità eccessiva di scorie metaboliche (ad esempio, acidi organici), che compromettono seriamente le funzioni di barriera intestinale e causano la morte delle cellule intestinali epiteliali. Quindi, impedendo la proliferazione microbica che causa l'esaurimento delle sostanze nutritive e l'accumulo di rifiuti microbici è cruciale per sostenere vitali coesistenza host-microbiome per un periodo prolungato (da giorni a settimane) nel microambiente co-coltura.
Per superare queste sfide, un microphysiologicalgut-on-a-chip 5,8 dispositivo è stato sviluppato per formare completamente differenziata villi intestinali umane e di mantenere il microambiente stato stazionario del lume intestinale in vitro. Le unità di progettazione e funzionali (ad esempio, microfluidici camere di cella di flusso, sottovuoto guidato deformazioni cicliche) di un intestino-on-a-chip dispositivo microfluidico vengono modificati per emulare con precisione il fisiologiche, fisiche e microambiente chimico per l'microbica co-coltura 5, 10. Lo sforzo di taglio applicato nella cultura microfluidica intestino-on-a-chip è stato determinato dal range fisiologico di flusso luminale nell'intestino umano 5,13. Per la co-coltura ospite-microbo, mantenendo il "stato stazionario" della popolazione microbica nel microcanali luminale dell'intestino-on-a-chip è fondamentale nel sostenere chimicamente e nutrizionalmente condizioni possibili. In microsistema intestino-on-a-chip, è possibile stimare stato stazionario intraluminale nell'intestino-on-a-chip Gamma di misurazioneng il pH del terreno di coltura e la densità cellulare microbica. Poiché terreno fresco fluisce continuamente attraverso i microcanali, sia le cellule microbiche e epiteliali non subiscono depauperamento quando la densità di semina iniziale di cellule microbiche e la portata volumetrica del terreno di coltura sono ottimizzati. Il terreno condizionato che passa attraverso il microcanali sgorga ad una velocità definita volumetrica di flusso (qui, 40 microlitri / ora), quindi rifiuti metabolici (ad esempio, acidi organici) e secretomes cellulari (per esempio, citochine) sono continuamente rimossi dalla cooperazione cultura microambiente. Così, il dispositivo intestino-on-a-chip può essere considerato come un "bioreattore continuo" con un microambiente stato stazionario necessaria e sufficiente per lavare efficacemente le cellule microbiche non legato o ricoperte dal lume del microcanale intestinale, che facilita la generazione di una nicchia microbica stabile nel giro di 2-3 giorni.
Ci sono cruciali factors che devono essere considerati come risoluzione dei problemi per il successo di co-coltura di cellule microbiche sulla villi intestinali. In primo luogo, è necessario determinare il tempo di incubazione ottimale richiesto per le cellule microbiche per attaccarsi alla superficie dei villi perché adesione microbica può variare tra specie microbiche. Per esempio, batteri probiotici, come Lactobacillus rhamnosus GG 5, generalmente richiedono ~ 1.0-1.5 hr attaccare, ma alcune altre specie microbiche possono richiedere più brevi (ad esempio, microbi patogeni) o più volte, a seconda delle loro cinetiche di adesione 14. In secondo luogo, la densità di semina iniziale delle cellule microbiche deve essere identificato perché i numeri di cellule microbiche eccessive può portare alla conseguenza di batteri nella fase di co-coltura, che possono interferire con il raggiungimento di uno stato stazionario stabile. Per ottimizzare questa densità di semina, si raccomanda di caratterizzare il profilo di crescita del ceppo di destinazione microbica nel antibimezzo di coltura cellulare otic-libero a varie densità di semina. Infine, la regolazione della portata volumetrica può essere richiesta a seconda delle specie microbiche. Ad esempio, un aumento dei tassi di flusso saranno necessari se le cellule microbiche proliferano molto rapidamente. E 'stato sperimentalmente confermato che le portate fino a 300 ml / h (0,2 dyne / cm 2) non compromettere la funzione di barriera e la morfologia delle cellule dei villi microengineered (dati non riportati). Anche se Lactobacillus rhamnosus GG 5, over-the-counter miscela probiotica, VSL # 3, non patogeno ceppo di laboratorio E. coli così come il patogeno enteroinvasive E. coli ceppo 10 sono state applicate con successo per il lungo termine co-coltura nell'intestino-on-a-chip, è ancora necessario per testare una varietà di specie microbiche da commensale microbiota intestinale di microrganismi infettivi patogeni. Il coltivabilità di cellule microbiche in vitro deve essere contemplata in presenza o assenzadelle cellule ospiti nel contesto di simbiosi e di evoluzione, in cui il test di coltivare la microbioma intestinale non coltivabile è una sfida intrigante. Infine, un protocollo robusto per la co-coltura delle due microbi aerobici e anaerobici nell'intestino-on-a-chip è una necessità insoddisfatte critica da scoprire in futuro.
Ci sono passi che possono essere adottate per migliorare ulteriormente il modello, come ad esempio l'uso di epiteliale intestinale primaria o le cellule staminali indifferenziate da singoli soggetti umani che hanno malattie gastrointestinali specifici come il morbo di Crohn o cancro colorettale; o cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs). Tuttavia, con l'interesse crescente nel ruolo di microbioma umano nell'orchestrare la salute umana e la malattia, il nostro metodo di co-coltura host-microbiome ha un enorme significato e potenziale da applicare per simulare altri ecosistemi host microbiome trovati nel corpo umano (ad esempio, , cavità orale 15, pelle 16, o urogenitale tRACT 17). Infine, questo metodo di co-coltura può innovare il processo di sviluppo dei farmaci convenzionali, migliorando la prevedibilità in termini di come le influenze intestino microbiome sulla biodisponibilità, l'efficacia e la tossicità di nuovi composti di droga. Nel loro insieme, il sistema microphysiological intestino-on-a-chip può fornire una piattaforma robusta per stabilire un microambiente intestinale stabile stato stazionario che può essere usato per ricostituire ecosistema host-microbiome.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) containing 25 mM glucose and 25 mM HEPES | Gibco | 10564-011 | Warm it up at 37 °C in a water bath. |
| Difco Lactobacilli MRS broth | BD | 288120 | Run autoclave at 121 °C for 15 min. |
| Poly(dimethylsiloxane) | Dow Corning | 3097358-1004 | 15:1 (w/w), PDMS : cureing agent |
| Caco-2BBE human colorectal carcinoma line | Harvard Digestive Disease Center | Human colorectal adenocarcinoma | |
| Heat-inactivated FBS | Gibco | 10082-147 | 20% (v/v) in DMEM |
| Penicillin-streptomycin-glutamine | Gibco | 10378-016 | 1/100 dilution in DMEM |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Molecular Probes | D1306 | Nuclei staining |
| Phalloidin-CF647 conjugate (25 units/ml) | Biotium | 00041 | F-actin staining |
| Flexcell FX-5000 tension system | Flexcell International Corporation | FX5K | Peristalsis-like stretcing motion (10% cell strain, 0.15 Hz frequency) |
| Inverted epifluorescence microscope | Zeiss | Axio Observer Z1 | Imaging, DIC |
| Scanning confocal microscope | Leica | DMI6000 | Imaging, Fluorescence |
| UVO Cleaner | Jelight Company Inc | 342 | Surface activation of the gut-chip |
| Type I collagen | Gibco | A10483-01 | Extracellular matrix component for cell culture into the chip |
| Matrigel | BD | 354234 | Extracellular matrix component for cell culture into the chip |
| 1 ml disposable syringe | BD | 309628 | Cell and media injection stuff |
| 25 G 5/8 needle | BD | 329651 | Cell and media injection stuff |
| Syringe pump | Braintree Scientific Inc. | BS-8000 | Injection equipment into the chip |
| VSL#3 | Sigma-Tau Pharmaceuticals | 7-45749-01782-6 | A formulation of 8 different commensal gut microbes |
| Reinforced Clostridial Medium | BD | 218081 | Anaerobic bacteria culture medium |
| GasPak EZ Anaerobe Container System with Indicator | BD | 260001 | Anaerobic gas generating sachet |
| 4% paraformaldehyde | Electron Microscopy Science | 157-4-100 | Fixing the cells for staining |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Permeabilizing the cells |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | Blocking agent for staining of the cells |
| Corona treater | Electro-Technic Products | BD-20AC | Plasma generator for fabrication of the chip |
| Steriflip | Millipore | SE1M003M00 | Degasing the complete culture medium |
| Disposable hemocytometer | iNCYTO | DHC-N01 | For manual cell counting |
References
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