Summary
Описывается протокол в пробирке для совместного культивирования кишечной микробиомом и ворсинок кишечника в течение длительного периода , используя человеческую microphysiological систему кишка-на-чипе.
Abstract
Здесь мы опишем протокол для выполнения долгосрочного сотрудничества культуры нескольких видов человеческого кишечника микробиомом с microengineered кишечных ворсинок в кишечнике человека-на-чипе microphysiological устройства. Резюмируем просвете кишечника-капиллярные интерфейс ткани в микрожидком устройстве, где физиологические механические деформации и сдвигового течения жидкости постоянно применяются для имитации перистальтику. В просвете микроканалов, кишечные эпителиальные клетки Сасо-2 человека культивируют с образованием "стерилен" ворсинок эпителия и регенерации тонкого кишечника ворсинки. Предварительно культивированный микробные клетки инокулируют в сторону светового потока, чтобы установить хост-микробных экосистему. После того, как микробные клетки прилипают к апикальной поверхности ворсинок, поток текучей среды, и механические деформации возобновили производить стационарную микросреду, в котором свежая культуральная среда постоянно подается и несвязанные бактерии (а также бактериальные отходы), непрерывно удаляются. После длительного совместного культивирования FROM дней до нескольких недель, несколько микроколонии оказываются случайным образом расположены между ворсинками, и как микробный и эпителиальные клетки остаются жизнеспособными и функциональной в течение по крайней мере, одну неделю в культуре. Наш протокол совместного культивирования может быть адаптирована для обеспечения универсальную платформу для других хост-микробиомом экосистем , которые могут быть найдены в различных человеческих органов, которые могут способствовать в пробирке изучения роли человеческого микробиомом в оркестровки здоровья и болезни.
Introduction
Кишечник человека таит в себе потрясающе разнообразный спектр видов микроорганизмов (<1000 видов) и огромное количество микробных клеток ( в 10 раз больше , чем клеток - хозяев человека) и гены ( в 100 раз больше , чем в геноме человека) 1. Эти человеческие microbiomes играют ключевую роль в метаболизировать питательных веществ и ксенобиотиков, регуляции иммунных реакций и поддержание гомеостаза кишечника 2. Не удивительно, учитывая эти разнообразные функции, комменсальной кишечника микробиомом широко модулирует здоровье и болезни 3. Таким образом, понимание роли кишечника микробиомом и хост-микробных взаимодействий имеют большое значение для содействия желудочно - кишечного тракта (GI) здоровья и исследовать новые терапевтические средства для лечения кишечных расстройств 4. Тем не менее, существующие в пробирке моделях кишечника (например, статические культуры) ограничивают хост-микробиомом сокультуре на короткий период времени (<1 день) , так как микробные клетки разрастаются и скомпрометировать кишечного барьераФункция 5. Суррогатные модели на животных (например, стерилен 6 или генной инженерии мышей 7) также обычно не используется для изучения хост-кишечную микробиомом перекрестных помех , так как колонизация и стабильное поддержание кишечной микробиомом человека трудно.
Для преодоления этих проблем, недавно мы разработали Biomimetic человека "Gut-на-чипе" microphysiological системы (рис 1А, слева) , чтобы эмулировать микробиомом взаимодействия хост-кишечную , которые происходят в живом человеческом кишечнике 5,8. Микроприбор кишка-на-чипе содержит два параллельных микроканалов , разделенных гибкой пористой, внеклеточного матрикса (ЕСМ) -покрытие мембраны выстлана эпителия кишечника человеческого Сасо-2 клеток, имитируя просвете кишечника-капиллярные интерфейс ткани (рис 1A , справа) 9. Вакуумные управляемые циклические ритмические деформации вызывают физиологические механические деформации, которые имитируют изменения обычно inducред перистальтики (рис 1А, справа). Интересно, что когда клетки Сасо-2 выращивают в микросхеме кишка-на-для более чем 100 часов, они самопроизвольно образуют трехмерную (3D) ворсинок кишечника с плотными соединениями, верхушечных границ кисти, пролиферирующих ограничивается базальных крипт, производство слизи, повышение активности метаболизировать наркотиков (например, цитохром Р450 3А4, CYP3A4), и повышение уровня глюкозы обратного захвата 8. В этом "стерильном" микросреды, это было возможно совместное культивирование пробиотик лактобактерии рамнозус GG или терапевтическое образование пробиотической бактериальной смеси с хозяина эпителиальных клеток в течение двух недель 5,10.
В данном исследовании мы описываем подробный протокол для выполнения хост-кишечную микробиомом совместного культивирования в устройстве кишка-на-чипе в течение длительного периода. Кроме того, мы обсудим важнейшие вопросы и потенциальные проблемы, которые будут рассматриваться для широкого применения этого хозяина-микробиомом сокультуры рrotocol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. микротехнологий из устройства Gut-на-чипе
Примечание: а-чип кишки на это Микрожидкостных устройство, сделанное прозрачной, газопроницаемая силиконового полимера (полидиметилсилоксана, PDMS), содержащий два параллельных микроканалов (1 мм длина ширина х высота 150 мкм х 1 см), разделенных гибкой пористый (диаметром пор 10 мкм, 25 мкм , с расстоянием между порами до поры) PDMS мембраны 5,9. Изготовьте кишка-на-чипе (рисунок 1А, слева) , следуя инструкциям на странице .
- Процедура микротехнологий от Gut-5,9 на чипе.
- Готовят неотвержденных дегазированного PDMS путем смешивания форполимера PDMS и отвердитель (15: 1 вес / вес), и поместите его в вакуумном эксикаторе в течение 30 мин.
- Залить 30 г и 3 г нелеченых, дегазированной PDMS на каждую силиконовум форму, которая имеет СУ-8 micropatterns на основе верхних и нижних микроканалы кишки-на-чипе, соответственно. Затем отверждение при 60 ° С в сушильном шкафу в течение по лвосток 4 ч.
- Выемки верхний и нижний слои PDMS из каждой кремниевой формы путем разрезания вокруг края с помощью хирургическим скальпелем. Удар 6 отверстий (два входа, два выхода и два вакуумных камер) с помощью перфоратора биопсии (2,0 мм в диаметре отверстия).
- Приготовьте пористую мембрану путем заливки 10 г нелеченых и дегазированной PDMS на силанизированном кремниевой пластины, содержащей почтовые массивы с круглыми столбами (10 мкм в диаметре, высотой 25 мкм), наложенной с плоской, силанизированы опорный слой PDMS (15: 1, W / вес, толщиной 1 см). Поместите 3 кг веса прижимного на установке и вулканизации полимера при 60 ° С в течение 12 часов или дольше.
- Выемки установку пористой мембраны PDMS приклеен к опорной плите PDMS из кремниевой пластины, осторожно поднимая угол плиты от пластины, и слезать, пока пористая мембрана PDMS полностью не отделяется от пластины.
- Выставляют сторону канала верхнего слоя (PDMS, 15: 1, вес / вес) и пористой стороне мембраны к плАсма генерируется портативном коронного пропиточной машине в течение 1 мин и 3 сек, соответственно.
- Поместите плазменной обработки поверхности пористой мембраны PDMS и верхний слой микроканалов в конформном контакте, помещая каждый фрагмент параллельно без каких-либо воздушных пузырьков.
- Выдержите всю установку при 80 ° CO / N для необратимого связывания двух PDMS слоев.
- Лупиться слоя поддержки PDMS из сборки верхнего слоя с пористой мембраной, осторожно поднимая угол опорного слоя, и отслаивание, пока опорный слой не будет полностью отделена от верхнего слоя с мембраной.
- Оторвите части этой мембраны, расположенной над вакуумными камерами (двумя камерами, расположенные по обе стороны от основного канала) с помощью тонкой кончик пинцетом, чтобы сделать полые вакуумные камеры.
- Выставляют сторону с мембраной, прикрепленной к верхней части и на стороне с каналами выгравированными на нижней части плазмы в таким же образом, как описано Iп шаг 1.1.6 в течение 1 мин.
- Выравнивание верхнего слоя микроканальной с пористой мембраной, а нижний слой с конформного контакта, помещая каждый фрагмент параллельно без каких-либо воздушных пузырьков под стереоскоп.
- Cure всю установку в сухой печи при 80 ° CO / N для получения полной шкалы кишки на чипе микрожидкостных устройство, содержащее два полых вакуумные камеры рядом с каналом микрожидком клеток.
- Подключение трубки к входному отверстию и на выходе из каждого порта, связанного с верхним или нижним микроканалы в кишечнике-на-чипе через 90 ° согнутой из нержавеющей стали с тупым концом иглы.
- Подключите трубку к отверстиям, связанных с использованием вакуумных камер 90 ° согнутую из нержавеющей стали тупым концом иглы.
- Стерилизация микроканалов и трубки пропусканием 70% (об / об) этанола с использованием 1 мл стерилизованные одноразовый шприц.
- Иссякнуть микроканалов и трубки в 60 ° C сухой печи O / N.
2. Рост микродвигательEred ворсинок кишечника в устройстве Gut-на-чипе
- Семенной эпителиальные клетки кишечника (например , Сасо-2BBE) на Gut-на-чипе микроустройство. 5,9
- Стерилизация устройство с 70% (об / об) этанола (этап 1.4) с использованием 1 мл стерилизованной одноразовый шприц с последующей сушкой в сушильном шкафу O 60 ° C / N (этап 1.5) до активации поверхности.
- Выставляют полную установку ТВО-на-чипе микросистемы (т.е. тело кишка-на-чипе , соединенного с трубкой) УФ - излучения (253,7 нм) и озона одновременно в течение 40 мин.
- Охладить прибор при комнатной температуре в течение 15 мин под УФ-светом в кабинете биологической безопасности (BSC).
- Введем 100 мкл ЕСМ покрытия находить оптимальные решения в смесь 50 мкг / типа мл коллагена и 300 мкг / мл внеклеточного матрикса смеси разведенной в бессывороточной среде Игла в модификации Дульбекко (DMEM), - в верхней и нижней микроканалов с помощью одноразового использования , стерильный шприц емкостью 1 мл.
- Инкубаторыт.е всю установку в 37 ° C увлажняются 5% CO 2 инкубаторе в течение 1 ч.
- Дега 50 мл подогретого (37 ° С) полной культуральной среде (DMEM, 20%, об / об, фетальной бычьей сыворотки (ФБС), 100 ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина; на аликвоты в 3 мл одноразовый шприц) с использованием системы фильтрации 50 мл (0,45 мкм размер пор) в КБС в течение 1 мин.
- Пропускают подогретого среды через систему фильтрации и нажмите аккуратно на фильтруемой среды в течение 1 мин для удаления пузырьков воздуха или газа, растворенного в среде.
- Поместите аликвоты дегазированной полной среды в 3 мл одноразовый шприц и инкубировать при 37 ° С увлажненного 5% CO 2 инкубаторе в течение 1 ч.
- Подключить два 3 мл одноразовые шприцы, содержащие дегазированной, предварительно нагретом полной культуральной среде верхней и нижней микроканалов.
- Поток Дегазированную полная среда для культивирования клеток в верхнюю микроканале с помощью шприцевого насоса в объемномскорость 30 мкл / ч потока (эквивалент напряжения сдвига на 0,02 дин / см 2) при 37 ° C увлажняются 5% CO 2 инкубатор O / N.
- Формирование Microengineered Сасо-2 в Вилли Gut-на-чипе.
- Использование клеток Сасо-2BBE с числом пассажей в диапазоне от 50 до 65 лет.
- Рост клеток Сасо-2 в Т75 колбу , содержащую полную культуральную среду в 37 ° C увлажненный 5% CO 2 инкубаторе в течение 4-5 дней , чтобы получить полностью вырожденные клетки.
- Добавьте 10 мл Ca 2+ и Mg 2+ -бесплатно PBS , чтобы полностью сливающихся клеток Сасо-2 выращивали в колбе Т75, промыть клетки, а затем аспирата из PBS. Повторите этот шаг дважды.
- Добавьте 1 мл 0,05% раствора трипсин / ЭДТА и инкубировать в 37 ° C увлажняются 5% CO 2 инкубаторе в течение 5 мин.
- Ресуспендируют диссоциированных клеток с 10 мл подогретого полная среда для культивирования клеток (с FBS) с помощью пипетки вверх и вниз от трех до пяти раз.
- Спин вниз клеточной суспензии на сentrifugation при 500 мкг в течение 5 минут, затем удалите супернатант.
- Ресуспендируют снова с 1 мл предварительно нагретого полной среды для регулирования плотности клеток в ~ 1,5 × 10 5 клеток / см 2 в устройстве. С помощью гемоцитометра для оценки плотности клеток.
- Настоять 100 мкл ресуспендировали клеток Сасо-2, в верхней микроканале (Просвет сторона), помещая 1 мл шприц одноразового прикрепленный к 25 G5 / 8 иглы на выходе из трубки соединена с верхним микроканала.
- Зажмите все входы и выходы из трубки, соединенные с верхними и нижними микроканалов с использованием связующих клипов.
- Инкубируют всю установку в 37 ° C, увлажненного 5% CO 2 инкубаторе в течение 1 часа , чтобы дать диссоциированных клеток Сасо-2 , чтобы прилипать к поверхности пористой мембраны.
- Удалить зажимы и возобновить подачу культуральной среды только к верхней микроканале при 30 мкл / час при помощи шприца до тех пор, пока клетки не образуют интактный монослой в течение 24-36 часов. Использование фазовых контраст или дифференциальный интерференционный контраст (DIC) микроскопии для подтверждения межклеточных соединений в клетке монослоя.
- Когда клетки образуют монослой, обрызгивать культуральной среды в обоих верхних (просвет) и нижней (капилляра) микроканалов при той же скорости потока 30 мкл / ч.
- Применение механических деформаций , имитирующих перистальтику подобных движений 5,9.
- Включите вакуумный насос, снабженный натяжного оборудования.
- Соедините вакуумные камеры с вакуумным контроллером с помощью трубки с разъемом из нержавеющей стали.
- Установить растяжку движение 10% среднего клеточного штамма на частоте 0,15 Гц с режимом циклической синусоидальной функцией от управляющего программного обеспечения вакуума, а затем нажмите кнопку "Пуск".
- Поддержание постоянного потока культуральной среды (30 мкл / ч), в верхней и нижней микроканалов к вырожденным Сасо-2 монослоя под действием механических деформаций (10%, 0,15 Гц) в течение ~ 100 ч.
Примечание: Сасо-2 клетки Sponновременно подвергаются ворсинок формообразование с волнистой 3D проекции , оказанный просвет эпителиальной микроканале 5,8-10.
- Для имитации функций органа на уровне живого человеческого кишечника с просветом капилляра интерфейс ткани в кишечнике-на-чипе 10, выполните следующие действия , как описано.
- Grow microengineered Сасо-2 ворсинки, повторяя шаги от 2,1 до 2,2.
- Поток предварительно подогретой совместно культуральной среды (смесь полного Сасо-2 клеточной культуральной среды и полной HMVECs культуральной среды, 1: 1 об / об) к верхней и нижней микроканалов при 30 мкл / ч.
- Представьте 100 мкл диссоциированных нормальных человеческих капиллярная микрососудистых эндотелиальных клеток (HMVECs конечна плотность клеток, ~ 5,0 × 10 5 клеток / см 2) в нижнее микроканале по идентичным способом , описанным в шагах от 2.2.3 до 2.2.9.
- Поместите отвержденного прямоугольный кусок PDMS (0,5 см х 1 см х 1 см, ширина х высота х длина; 15: 1, ш/ вес эластомера: отвердитель) на верхней части устройства кишка-на-чипе, затем переверните установку устройства весь вниз головой (то есть, верхняя Микроканал лица к нижней стороне, а нижняя Микроканал лица к верху).
- Выдержите установки в 37 ° C, увлажненного 5% CO 2 инкубаторе в течение 1 часа , чтобы позволить Диссоцииро- HMVECs прилипать к поверхности пористой мембраны , в нижней части микроканала.
- Выньте всю установку из CO 2 инкубатора и переворачивания установку снова.
- Поток подогретого совместно культуральной среды (смесь полного Сасо-2 клеточной культуральной среды и полной HMVECs культуральной среды, 1: 1 об / об) в верхней и нижней микроканалов при 30 мкл / ч с механическим простирающихся движений ( 10%, 0,15 Гц) в течение не менее трех дней, чтобы сформировать межклеточных сочленений эндотелиальной монослоя.
3. Хост-выпотрошить микробиомом Совместное культивирование в микроустройство Gut-на-чипе
- Выполнение предварительной культуры ое бактериальные клетки, как следует взаимодействовать культуры синантропных кишечника микробиомом на microengineered ворсинок кишечника.
- Ресуспендируют лиофилизированный пробиотический бактериальный порошкообразной смеси в 10 мл смеси (1: 1, об / об) автоклавного лактобацилл MRS бульоном и Обогащенную среду клостридий.
- Регулировка конечной плотности клеток приблизительно до 0,2 единиц оптической плотности (при 600 нм) путем добавления соответствующего количества среды, а затем аликвоты 3 мл микробной клеточной суспензии в 10 мл одноразовой стерильной пробирке.
- Место пробирки, содержащие ресуспендировали микробных клеток в анаэробном контейнере. Добавьте две пачки анаэробного газогенерирующей саше в контейнере. Закройте крышку контейнера плотно и инкубировать установку контейнера без встряхивания при 37 ° C увлажняются 5% СО 2 инкубатора O / N.
- Прививка микробиомом и Co-культуры с эпителиальные клетки кишечника 5,10.
- Подготовьте 3 мл одноразовые шприцы, содержащие дегазированной antibiotiC-свободной среда для культивирования клеток (т.е. DMEM с 20% FBS). См 2.1.6 для процедуры дегазации культуральной среды.
- Выньте всю установку устройства кишка-на-чипе , содержащем microengineered ворсинки из СО 2 инкубатора, а затем перейти к шкафу биологической безопасности.
- Удалить шприцы, подключенные трубок, связаны с верхним и нижним микроканалов. Подключите шприцы , подготовленные в разделе 3.2.1 к устройству, чтобы вернуть к CO 2 инкубаторе, а затем течет этот антибиотик культуральной среды в течение 12 ч до посева микробиомом.
- Спином вниз предварительно культивированных клеток пробиотических бактерий смесь (см действия, описанные в разделе 3.1) при 10000 мкг в течение 5 мин. Отберите из надосадочной жидкости с использованием вакуума, а затем вновь суспендируют в антибиотической свободной DMEM среде (конечная плотность клеток, ~ 1,0 × 10 7 КОЕ / мл).
- Настаивать суспензии клеток в просвете сторону микроканала, содержащего "стерилен" кишечные ворсинки с использованием 1 мл шприц одноразового присоединенный к 25G5 / 8 иглы. Разрешить адгезию микробных клеток к апикальной поверхности кишечных ворсинок в течение ~ 1,5 ч без потока с помощью зажима, чтобы полностью конца насосно-компрессорных труб.
- Заливать подогретого антибиотику культуральной среды в верхней и нижней микроканалов при 40 мкл / ч с циклическими ритмических деформаций (10%, 0,15 Гц).
- Для совместного культивирования зеленого белка флуоресценции (GFP) меченных E. coli (GFP E.coli; Непатогенные DH5-альфа кишечной палочки хозяева) 10,11 клетки с microengineered ворсинок, предварительно культивируют Е. GFP Клетки палочки в среде LB автоклавного при 37 ° C при встряхивании условию (200 оборотов в минуту) в течение 12 ч. Повторите процедуру , начиная с 3.2.5 до 3.2.6 осуществлять совместное культивирование E. GFP Клетки палочки с microengineered ворсинок.
- Image Клетки 5,8-10
- Выполните DIC, эпифлуоресцентной или лазерной сканирующей конфокальной микроскопии для записи микробные и эпителиальной морфологии 5,8,10.
- Для визуализации DIC, вынимают установку кишка-на-чипе микросистемы из CO 2 инкубатора, место установки устройства на этапе микроскопа, а затем запись морфологии клеток.
- Для флуоресцентной визуализации ворсинок эпителия, поток PBS для промывания клеток в количестве 100 мкл / ч в течение 10 мин.
- Закрепить ворсинки с 4% (вес / объем) параформальдегидом в течение 15 мин. Затем поток PBS для промывания клеток в количестве 100 мкл / ч в течение 10 мин.
- Проницаемыми ворсинки с 0,3% (об / об) Тритона X-100 в PBS, разбавленный, содержащей 2% (вес / об) альбумина бычьей сыворотки (BSA) в течение 10 мин. Затем поток PBS для промывания клеток в количестве 100 мкл / ч в течение 10 мин.
- Блокбоксов с помощью 2% (вес / объем) раствора БСА в PBS в течение 1 часа. Затем поток PBS для промывания клеток в количестве 100 мкл / ч в течение 10 мин.
- Добавьте 300 нМ 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндол дигидрохлорид раствор (DAPI), разведенного в PBS для ядерного окрашивания под действием света защиты.
- Добавьте 25 ед / мл флуоресцентного фаллоидином(Фаллоидином-CF647 конъюгат), растворенного в PBS для F-актина окрашивания под легкой защитой.
- Запись изображений флуоресцентно окрашенных клеток с использованием лазерной сканирующей конфокальной микроскопии.
Примечание: Цель 25X была применена с соответствующим оптическим зумом во время конфокальной микроскопии. На фигуре 3B, использовали около 525x увеличения.
- Выполните DIC, эпифлуоресцентной или лазерной сканирующей конфокальной микроскопии для записи микробные и эпителиальной морфологии 5,8,10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Для имитации человеческого кишечника хозяина-микробиомом экосистемы в пробирке, то Необходимо разработать экспериментальный протокол для восстановления стабильного долгосрочного сотрудничества культуры кишечных бактерий и эпителиальных клеток кишечника человека в физиологических условиях, таких как перистальтика типа механики и потока жидкости. Здесь мы используем Биомиметический кишки на-чипе микроустройство (Рисунок 1А) для совместного культивирования живых микробных клеток в непосредственном контакте с живой человеческой ворсинки в течение периодов недели или более в пробирке. Кишечные эпителиальные клетки спонтанно образуют хорошо дифференцированный ворсинки при культивировании на одной стороне пористой мембраны ЕСМ покрытием в одном канале 2-канального микрожидком устройства в присутствии физиологически соответствующего потока жидкости и циклических механических деформаций 5. В microengineered ворсинки реплицировать структуры и функции тонкого кишечника ворсинок человека, в том числе Formatiна столбчатых эпителиальных клеток , выстланных верхушечного щеточной каймы, базальной пролиферативных крипт с миграцией и дифференциации дочерних клеток прогрессирующих из склепа до ворсинок наконечника, высокий уровень производства слизи, повышение активности метаболизирующего наркотиков и увеличение обратного захвата глюкозы 8. Живые эндотелиальные клетки можно культивировать на противоположной стороне той же мембраны , чтобы воссоздать интерфейс тканевого ткани кишечной стенки, и иммунные клетки можно культивировать в системе , а также 10. Чтобы проверить защитную функцию эпителиальных клеток кишечника, плотных соединений барьера кишечных ворсинок , образующихся в кишечнике-на-чипе прерывисто количественному путем измерения электрического сопротивления трансэпителиальный (Тир) 5,10,12. Текущий мониторинг стоимости Teer требуется оценить целостность монослоя клеток или кишечных ворсинок на каждом этапе (например, перед добавлением бактерий в просвет).
7 КОЕ / мл) инокулируют в просвет эпителиальной микроканале (Фигура 1В, "прививка"). После того, как микробные клетки прилипать на апикальной поверхности ворсинок в отсутствие потока в течение ~ 1,5 ч (рис 1B, "Приложение"), физиологический поток (40 мкл / ч) возобновляется через оба канала с циклическими механических деформаций (10% деформации при 0,15 Гц) для удаления несвязанных бактерии кишечника и поставляют питательные вещества к обоим бактериальными и ворсинок эпителиальных клеток (рис 1B, "Co-культура»). Этот протокол совместного культивирования позволяет стабильной колонизацию нескольких видов пробиотических бактерий в intervillus пространстве, с жизнеспособные бактериальные микроколонии поддерживается в течение двух недель в совместной культуре (Фигуры 2А, 2В). В этом исследовании, совместноmmercial пробиотический препарат , который содержит смешанную популяцию 8 различных факультативных или ассигнованию анаэробной, пробиотические штаммы Bifidobacterium Breve, B. лонгум, Б. infantis, Lactobacillus ацидофилин, L. Plantarum, L. paracasei, Л. Bulgaricus и Streptococcus термофилы используется.
Этот метод совместного культивирования может широко применяться для имитации человеческого кишечника хозяина-микробную экосистему. Например, непатогенные GFP Е. палочка может быть совместно культивируют на поверхности кишечных ворсинок , выращенных в устройстве кишка-на-чипе. На основании того же протокола описано выше, придерживалась E. GFP палочки клетки на ворсинки растут из одиночных клеток в 1 ч до нескольких микроколониями с 3 -х дней (рис 3А, 1 ч против 72 ч) , что требуется найти в intervillus пространствах (рис 3B, 1 ч против 72 ч) при культивировании в капельный расход (40 мкл /ч) в присутствии перистальтики подобных деформаций (10%, 0,15 Гц).
Рисунок 1. человек Gut-на-чипе microphysiological системы для хост-кишечной микробиомом сокультивирования. (A) фотография (слева) и схема (справа) из 2-канала, кишка-на-чипе микрожидкостных устройство. Стрелки указывают направление потока культуральной среды (синий, верхний микроканале; красный, нижний микроканал). (B) Принципиальные схемы процедуры хост-кишечной микробиомом сокультивирования в кишечнике-на-чипе. После того, как эпителиальные клетки кишечника образуют ворсинки (~ 100 ч), микробные клетки вновь суспендируют в среде для культивирования клеток введены в просвете микроканале (Прививка), то поток питательной среды подвешен в течение ~ 1,5 ч (приложение). После того, как микробные клетки прилипают к апикальной поверхности кишечных ворсинок, поток возобновляется (Со -Культура). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Совместное культивирование нескольких пробиотические бактерии с кишечных ворсинок в кишечнике-на-чипе. (А) Дифференциальная интерференционного контраста микрофотография показывает микроколония пробиотических бактериальных клеток , растущих между ворсинками в микросхеме кишечнике. (Б) выше , вид степень увеличения А (черная пунктирная квадрат) , показывающий микроколония пробиотических бактериальных клеток (красная стрелка). V, ворсинки; Шкала бар = 20 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Юр 3 "SRC =" / файлы / ftp_upload / 54344 / 54344fig3.jpg "/>
Рисунок 3. Совместное культивирование непатогенных, GFP-меченных E. палочка с ворсинок кишечника в кишечнике-на-чипе. (A) Overlaid флуоресценции и ДИК микроскопические снимки , сделанные на 1 и 72 ч, отображающий колонизацию E. GFP палочки на кишечных ворсинок , выращенных в кишечнике-на-чипе. (В) вид на высокой мощности увеличения наложенного флуоресцентных конфокальных микрофотографиях , принятых на 1 и 72 ч , показывающие рост GFP-меченных E. палочка из одной клетки (красная стрелка) на микроколонии (белая стрелка). Синий, ядра; пурпурного, F-актина; Шкала бар = 30 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Понимание хост-микробиомом взаимодействия имеет решающее значение для продвижения медицины; Тем не менее, традиционные модели клеточных культур , выполненные в пластиковом блюде или статичным луночного планшета не поддерживают стабильное совместное культивирование клеток кишечника человека с живой кишки микробами в течение более 1-2 дней , потому что микробные клетки в основном перерастают клетки млекопитающих в пробирке. Зарастание микробная популяция быстро поглощает кислород и питательные вещества, впоследствии производить чрезмерное количество метаболических отходов (например, органические кислоты), которые серьезно скомпрометировать кишечные барьерные функции и вызывают кишечную эпителиальную клеточную гибель. Таким образом, предотвращая микробное разрастание, который вызывает истощение питательных веществ и накопление микробной отходов имеет решающее значение для поддержания жизнеспособных хост-микробиомом сосуществованию в течение длительного периода (от нескольких дней до нескольких недель) в совместной культуре микросреды.
Для преодоления этих проблем, в microphysiologicalвыпотрошить-на-чипе было разработано устройство 5,8 с образованием полностью дифференцированный ворсинок кишечника человека и для поддержания устойчивого состояния микросреду просвета кишечника в лабораторных условиях . Конструкция и функциональные блоки (например, микрофлюидальные камеры ячейки потока, вакуумные управляемые циклические деформации) ТВО-на-чипе Микрожидкостных устройства модифицированы , чтобы точно имитировать физиологические, физические и химические микросреду для микробного сокультивирования 5, 10. Напряжение сдвига применяется в кишечнике-на-чипе микрожидком культуры определяли с помощью физиологического диапазона потока просвету в кишечнике человека 5,13. Для хост-микроба сокультивирования, поддержания «устойчивого состояния» микробной популяции в просвете микроканале кишки-на-чипе имеет решающее значение в поддержании химически и питательно выполнимые условия. В микросистемы кишка-на-чипе, можно оценить внутрисетевой просветная стационарного состояния в кишечнике-на-чипе measuriнг рН культуральной среды и плотность клеток микроорганизмов. Поскольку свежую культуральную среду непрерывно протекает через микроканалы, как микробные и эпителиальные клетки не истощение питательных веществ, когда начальная плотность засева микробных клеток и объемная скорость потока культуральной среды оптимизированы. Кондиционированная среда , проходящая через микроканалов вытекает при определенной объемной скорости потока (здесь, 40 мкл / ч), так что метаболические отходы (например, органические кислоты) , а также пустотелые secretomes (например, цитокины) непрерывно удаляют из СО- культура микросреда. Таким образом, устройство кишка-на-чипе можно рассматривать как "непрерывный биореактора" с стационарному микросреды необходимого и достаточного для эффективного вымывания несвязанных или заросшие микробных клеток из просвета кишечника микроканалов, что облегчает генерацию стабильная микробная ниша в течение 2-3 дней.
Есть важно Ф.А.ctors, которые должны рассматриваться в качестве поиска неисправностей для успешного совместного культивирования микробных клеток на ворсинок кишечника. Во-первых, необходимо определить, оптимизированное время инкубации, необходимого для микробных клеток, чтобы прикрепить к поверхности ворсинок, так как микробная адгезия может варьироваться от видов микроорганизмов. Например, пробиотические бактерии, такие как лактобактерии рамнозус GG 5, как правило , требуют ~ 1,0-1,5 ч , чтобы прикрепить к нему, но и некоторые другие виды микроорганизмов могут потребоваться более короткие (например, патогенные микроорганизмы) или более раз, в зависимости от их адгезионных кинетики 14. Во-вторых, начальная плотность засева микробных клеток должны быть идентифицированы, поскольку чрезмерное микробные число клеток может привести к разрастание бактерий на ранней стадии совместной культуры, которые могут помешать достижению стабильного устойчивого состояния. Для оптимизации этой плотности посева, рекомендуется, чтобы охарактеризовать профиль роста штамма целевой микробов в antibiушные свободной средой для культивирования клеток при различных плотностях высева. И, наконец, регулировка скорости объемного расхода может потребоваться в зависимости от вида микробов. Например, увеличение скорости потока будут необходимы, если микробные клетки пролиферируют очень быстро. Экспериментально подтверждено , что скорость потока до 300 мкл / ч (0,2 дин / см 2) не ставят под угрозу функцию барьера и морфологии клеток от microengineered ворсинок (данные не показаны). Хотя лактобактерии рамнозус GG 5, более-счетчик пробиотические смеси, VSL # 3, непатогенные лаборатория штамм E. палочки, а также патогенной Энтероинвазивная Е. штамм E.coli 10 были успешно применены для долгосрочного совместного культивирования в кишечнике-на-чипе, он по - прежнему требуется , чтобы испытать разнообразие видов микробов из синантропных микрофлоры кишечника к патогенным инфекционных микроорганизмов. Cultivability микробных клеток в пробирке должны быть рассмотрены в присутствии или в отсутствиеклеток-хозяев в контексте симбиоза и эволюции, где испытание культивирования unculturable кишечника микробиомом является интригующей проблемой. И, наконец, надежный протокол для совместной культуры аэробных и анаэробных микроорганизмов в кишечнике-на-чипе является критическим неудовлетворенная потребность быть обнаружены в будущем.
Есть шаги, которые могут быть приняты для дальнейшего совершенствования модели, такие как использование первичного эпителия кишечника или недифференцированных стволовых клеток из отдельных человеческих субъектов, имеющих специфические желудочно-кишечные заболевания, такие как болезнь Крона или колоректального рака; или индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (иПСК). Тем не менее, с бурным ростом интереса к роли человеческого микробиомом в оркестровки для здоровья человека и болезней, наш хозяин-микробиомом метод совместного культивирования имеет огромное значение и потенциал , чтобы быть применены , чтобы имитировать другие хост-микробиомом экосистем , найденные в человеческом организме (например , , ротовой полости 15, кожа 16, или урогенитальный тRACT 17). И, наконец, этот метод совместного культивирования может вводить новшества обычный процесс разработки лекарств за счет повышения предсказуемости с точки зрения того, как кишка микробиомом влияний на биологическую доступность, эффективность и токсичность новых лекарственных соединений. Взятые вместе, система microphysiological кишки на чипе может обеспечить надежную платформу для создания стабильного кишечную микросреду стационарную, который может использоваться для восстановления хост-микробиомом экосистему.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) containing 25 mM glucose and 25 mM HEPES | Gibco | 10564-011 | Warm it up at 37 °C in a water bath. |
| Difco Lactobacilli MRS broth | BD | 288120 | Run autoclave at 121 °C for 15 min. |
| Poly(dimethylsiloxane) | Dow Corning | 3097358-1004 | 15:1 (w/w), PDMS : cureing agent |
| Caco-2BBE human colorectal carcinoma line | Harvard Digestive Disease Center | Human colorectal adenocarcinoma | |
| Heat-inactivated FBS | Gibco | 10082-147 | 20% (v/v) in DMEM |
| Penicillin-streptomycin-glutamine | Gibco | 10378-016 | 1/100 dilution in DMEM |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Molecular Probes | D1306 | Nuclei staining |
| Phalloidin-CF647 conjugate (25 units/ml) | Biotium | 00041 | F-actin staining |
| Flexcell FX-5000 tension system | Flexcell International Corporation | FX5K | Peristalsis-like stretcing motion (10% cell strain, 0.15 Hz frequency) |
| Inverted epifluorescence microscope | Zeiss | Axio Observer Z1 | Imaging, DIC |
| Scanning confocal microscope | Leica | DMI6000 | Imaging, Fluorescence |
| UVO Cleaner | Jelight Company Inc | 342 | Surface activation of the gut-chip |
| Type I collagen | Gibco | A10483-01 | Extracellular matrix component for cell culture into the chip |
| Matrigel | BD | 354234 | Extracellular matrix component for cell culture into the chip |
| 1 ml disposable syringe | BD | 309628 | Cell and media injection stuff |
| 25 G 5/8 needle | BD | 329651 | Cell and media injection stuff |
| Syringe pump | Braintree Scientific Inc. | BS-8000 | Injection equipment into the chip |
| VSL#3 | Sigma-Tau Pharmaceuticals | 7-45749-01782-6 | A formulation of 8 different commensal gut microbes |
| Reinforced Clostridial Medium | BD | 218081 | Anaerobic bacteria culture medium |
| GasPak EZ Anaerobe Container System with Indicator | BD | 260001 | Anaerobic gas generating sachet |
| 4% paraformaldehyde | Electron Microscopy Science | 157-4-100 | Fixing the cells for staining |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Permeabilizing the cells |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | Blocking agent for staining of the cells |
| Corona treater | Electro-Technic Products | BD-20AC | Plasma generator for fabrication of the chip |
| Steriflip | Millipore | SE1M003M00 | Degasing the complete culture medium |
| Disposable hemocytometer | iNCYTO | DHC-N01 | For manual cell counting |
References
- Turnbaugh, P. J., et al. An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest. Nature. 444, 1027-1031 (2006).
- Tremaroli, V., Backhed, F. Functional interactions between the gut microbiota and host metabolism. Nature. 489, 242-249 (2012).
- Sekirov, I., Russell, S. L., Antunes, L. C. M., Brett Finlay, B. Gut Microbiota in Health and Disease. Physiol. Rev. 90, 859-904 (2010).
- Turnbaugh, P. J., et al. The human microbiome project. Nature. 449, 804-810 (2007).
- Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow. Lab Chip. 12, 2165-2174 (2012).
- Round, J. L., Mazmanian, S. K. The gut microbiota shapes intestinal immune responses during health and disease. Nat Rev Immunol. 9, 313-323 (2009).
- Garrett, W. S., et al. Communicable ulcerative colitis induced by T-bet deficiency in the innate immune system. Cell. 131, 33-45 (2007).
- Kim, H. J., Ingber, D. E. Gut-on-a-Chip microenvironment induces human intestinal cells to undergo villus differentiation. Integr Biol. 5, 1130-1140 (2013).
- Huh, D., Kim, H. J., et al. Microfabrication of human organs-on-chips. Nat Protoc. 8, 2135-2157 (2013).
- Kim, H. J., Li, H., Collin, J. J., Ingber, D. E. Contributions of microbiome and mechanical deformation to intestinal bacterial overgrowth and inflammation in a human gut-on-a-chip. Proc. Natl. Acad. Sci. 113, E7-E15 (2016).
- Miller, W. G., Lindow, S. E. An improved GFP cloning cassette designed for prokaryotic transcriptional fusions. Gene. 191, 149-153 (1997).
- Odijk, M., et al. Measuring direct current trans-epithelial electrical resistance in organ-on-a-chip microsystems. Lab Chip. 15, 745-752 (2015).
- Lentle, R. G., Janssen, P. W. Physical characteristics of digesta and their influence on flow and mixing in the mammalian intestine: a review. J Comp Physiol B. 178, 673-690 (2008).
- Granato, D., et al. Cell surface-associated lipoteichoic acid acts as an adhesion factor for attachment of Lactobacillus johnsonii La1 to human enterocyte-like Caco-2 cells. Appl Environ Microbiol. 65, 1071-1077 (1999).
- Dewhirst, F. E., et al. The human oral microbiome. J Bacteriol. 192, 5002-5017 (2010).
- Grice, E. A., Segre, J. A. The skin microbiome. Nat Rev Microbiol. 9, 244-253 (2011).
- Hay, P. E., et al. Abnormal bacterial colonisation of the genital tract and subsequent preterm delivery and late miscarriage. Br Med J. 308, 295-298 (1994).
