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Bioengineering

में Microengineered मानव आंत्र Villi साथ रहने का Microbiome के सह-संस्कृति एक आंत-ऑन-ए-चिप Microfluidic डिवाइस

Published: August 30, 2016 doi: 10.3791/54344
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2,3,4
1Department of Biomedical Engineering, The University of Texas at Austin, 2Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering at Harvard University, 3Vascular Biology Program, Boston Children's Hospital, Harvard Medical School, 4John A. Paulson School of Engineering and Applied Sciences, Harvard University

Summary

हम एक मानव आंत-ऑन-ए-चिप microphysiological प्रणाली का उपयोग करते हुए एक विस्तारित अवधि के लिए इन विट्रो प्रोटोकॉल के सह-संस्कृति पेट और आंतों Microbiome विल्ली का वर्णन है।

Abstract

यहाँ, हम एक मानव आंत-ऑन-ए-चिप microphysiological डिवाइस में microengineered आंतों विल्ली के साथ बहु प्रजातियों की लंबी अवधि के सह संस्कृति मानव आंत Microbiome प्रदर्शन करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है। हम एक microfluidic युक्ति है, जहां शारीरिक विकृतियों यांत्रिक और तरल पदार्थ कतरनी प्रवाह लगातार क्रमाकुंचन नकल करने के लिए लागू कर रहे हैं में आंतों लुमेन केशिका ऊतक इंटरफ़ेस पुनरावृत्ति। लुमेन microchannel में, मानव आंतों उपकला Caco -2 कोशिकाओं को एक 'रोगाणु-मुक्त' अंकुर उपकला के रूप में और छोटी आंतों विल्ली को पुनर्जीवित करने के लिए सुसंस्कृत हैं। पूर्व सुसंस्कृत माइक्रोबियल कोशिकाओं एक मेजबान के सूक्ष्म जीव पारिस्थितिकी तंत्र स्थापित करने के लिए लुमेन पक्ष में टीका कर रहे हैं। माइक्रोबियल कोशिकाओं विल्ली के शिखर सतह का पालन करने के बाद, द्रव का प्रवाह और यांत्रिक विकृतियों एक स्थिर राज्य microenvironment में जो ताजा संस्कृति के माध्यम से लगातार आपूर्ति की है और अपार बैक्टीरिया (जीवाणु के साथ ही कचरे) लगातार हटा रहे हैं उत्पादन करने के लिए फिर से शुरू कर रहे हैं। विस्तारित सह संस्कृति एफ के बादसप्ताह के दिनों ROM, कई microcolonies बेतरतीब ढंग से विल्ली के बीच स्थित हो पाए जाते हैं, और दोनों माइक्रोबियल और उपकला कोशिकाओं संस्कृति में कम से कम एक सप्ताह के लिए व्यवहार्य और कार्यात्मक रहते हैं। हमारे सह-संस्कृति प्रोटोकॉल अन्य मेजबान Microbiome पारिस्थितिक तंत्र विभिन्न मानव अंगों में पाया जा सकता है, जो स्वास्थ्य और रोग orchestrating में मानव Microbiome की भूमिका की इन विट्रो अध्ययन में सुविधा हो सकती है के लिए एक बहुमुखी मंच प्रदान करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

Introduction

मानव आंत माइक्रोबियल प्रजातियों में से एक आश्चर्यजनक विविध सरणी (<1,000 प्रजातियों) और माइक्रोबियल कोशिकाओं की भारी संख्या (मानव मेजबान कोशिकाओं की तुलना में 10 गुना अधिक) और जीन (मानव जीनोम की तुलना में 100 गुना अधिक) 1 बंदरगाहों। ये मानव microbiomes, पोषक तत्वों और xenobiotics metabolizing प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को विनियमित करने, और आंतों homeostasis 2 को बनाए रखने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। आश्चर्य नहीं कि इन विविध कार्यों को देखते हुए खानेवाला पेट Microbiome बड़े पैमाने पर स्वास्थ्य और रोग 3 modulates। इस प्रकार, पेट Microbiome और मेजबान सूक्ष्म जीव बातचीत की भूमिका को समझने जठरांत्र (सैनिक) स्वास्थ्य को बढ़ावा देने और पेट के रोगों 4 के लिए नई चिकित्सा विज्ञान का पता लगाने के लिए बहुत महत्व के हैं। हालांकि, इन विट्रो आंत मॉडल (जैसे, स्थिर संस्कृतियों) में मौजूदा समय की एक छोटी अवधि (<1 दिन) क्योंकि माइक्रोबियल कोशिकाओं ऊंचा हो जाना और आंत्र बाधा समझौता करने के लिए मेजबान Microbiome सह संस्कृति को प्रतिबंधितसमारोह 5। सरोगेट पशु मॉडल (जैसे, रोगाणु मुक्त 6 या अनुवांशिक इंजीनियर चूहों 7) भी नहीं आमतौर पर मेजबान पेट Microbiome crosstalk अध्ययन करने के लिए क्योंकि उपनिवेशवाद और मानव आंत Microbiome के स्थिर रखरखाव मुश्किल कर रहे हैं उपयोग किया जाता है।

इन चुनौतियों पर काबू पाने के लिए, हम हाल ही में एक biomimetic मानव "पेट-ऑन-ए-चिप" microphysiological प्रणाली (चित्रा 1 ए, बाएं) मेजबान पेट Microbiome बातचीत है कि जीवित मानव आंत में पाए जाते हैं 5,8 अनुकरण करने के लिए विकसित की है। पेट-ऑन-ए-चिप microdevice एक लचीला, झरझरा, बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) लेपित झिल्ली मानव आंतों उपकला Caco-2 कोशिकाओं से अटे, आंतों लुमेन केशिका ऊतक इंटरफ़ेस (चित्रा 1 ए नकल उतार द्वारा अलग दो समानांतर microfluidic चैनल शामिल , दाएं) 9। वैक्यूम संचालित चक्रीय तालबद्ध विकृतियों शारीरिक विकृतियों यांत्रिक कि सामान्य रूप से induc परिवर्तन की नकल के लिए प्रेरितक्रमाकुंचन द्वारा एड (चित्रा 1 ए, दाएं)। दिलचस्प है, जब Caco-2 कोशिकाओं 100 से अधिक घंटे के लिए पेट पर एक चिप में बड़े हो रहे हैं, वे अनायास तीन आयामी (3 डी) आंतों विल्ली तंग जंक्शनों, शिखर ब्रश सीमाओं, proliferative कोशिकाओं बेसल तहखाने तक ही सीमित के साथ फार्म, बलगम उत्पादन में वृद्धि हुई, दवा metabolizing गतिविधि (जैसे, साइटोक्रोम P450 3A4, CYP3A4), और बढ़ाया ग्लूकोज अवरोध 8। इस 'रोगाणु-मुक्त' microenvironment में, यह संभव था सह-संस्कृति प्रोबायोटिक लैक्टोबैसिलस rhamnosus जी जी या अप करने के लिए दो सप्ताह 5,10 के लिए मेजबान उपकला कोशिकाओं के साथ एक प्रोबायोटिक बैक्टीरिया के मिश्रण का एक चिकित्सीय गठन।

इस अध्ययन में, हम एक विस्तारित अवधि के पेट पर एक चिप डिवाइस में मेजबान पेट Microbiome सह संस्कृति प्रदर्शन करने के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन है। इसके अलावा, हम महत्वपूर्ण मुद्दों और संभावित चुनौतियों पर चर्चा इस मेजबान Microbiome सह संस्कृति पी के एक व्यापक आवेदन के लिए विचार कियाrotocol।

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Protocol

1. एक आंत-ऑन-ए-चिप डिवाइस के Microfabrication

नोट: पेट-ऑन-ए-चिप एक microfluidic युक्ति पारदर्शी, गैस पारगम्य सिलिकॉन बहुलक (polydimethylsiloxane, PDMS) द्वारा किए गए दो समानांतर microchannels (1 मिमी चौड़ाई x 150 माइक्रोन ऊंचाई एक्स 1 सेमी लंबाई) एक लचीला द्वारा अलग से युक्त है झरझरा (ताकना व्यास में 10 माइक्रोन, रिक्ति ताकना में 25 माइक्रोन ताकना) झिल्ली 5.9 PDMS। पेट-ऑन-ए-चिप (चित्रा 1 ए, बाएं) प्रदान की चरणों का पालन बनाना।

  1. आंत-ऑन-ए-चिप 5.9 की microfabrication प्रक्रिया।
    1. PDMS prepolymer और इलाज के एजेंट के मिश्रण से uncured, degassed PDMS तैयार (15: 1 डब्ल्यू डब्ल्यू /), और 30 मिनट के लिए वैक्यूम desiccator में जगह है।
    2. 30 ग्राम और प्रत्येक सिलिकॉन मोल्ड ऊपरी SU-8 आधारित micropatterns और पेट पर एक चिप के निचले microchannels, क्रमशः है उस पर uncured, degassed PDMS की 3 जी डालो। तो एल पर के लिए एक सूखी ओवन में 60 डिग्री सेल्सियस पर इलाजपूर्व 4 घंटा।
    3. एक शल्य छुरी का उपयोग कर किनारे के आसपास काटने से प्रत्येक सिलिकॉन मोल्ड से ऊपरी और निचले PDMS परतों Demold। 6 छेद (दो inlets, दो दुकानों, और दो वैक्यूम कक्षों) एक बायोप्सी पंचर (छेद व्यास में 2.0 मिमी) का उपयोग पंच।
    4. परिपत्र खंभे (व्यास में 10 माइक्रोन, ऊंचाई में 25 माइक्रोन) एक फ्लैट के साथ overlaying के साथ पोस्ट सरणियों युक्त एक silanized सिलिकॉन वेफर पर uncured और degassed PDMS की 10 ग्राम गिरने से झरझरा झिल्ली तैयार करें, silanized PDMS समर्थन परत (15: 1, w / डब्ल्यू, 1 सेमी मोटी)। स्थापना पर एक 3 किलो वजन कोल्हू की जगह और 12 घंटा या उससे अधिक समय के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर बहुलक का इलाज।
    5. एक झरझरा PDMS झिल्ली ध्यान वेफर से स्लैब के कोने उठाकर और बंद छीलने तक झरझरा PDMS झिल्ली पूरी तरह से वेफर से अलग है द्वारा सिलिकॉन वेफर से PDMS समर्थन स्लैब से पालन की स्थापना Demold।
    6. पी एल के लिए और झरझरा झिल्ली पक्ष: एक ऊपरी परत के चैनल की ओर (1, डब्ल्यू / डब्ल्यू PDMS, 15) का पर्दाफाशअस्मा 1 मिनट, और 3 सेकंड के लिए क्रमश: एक हाथ में प्रभामंडल treater द्वारा उत्पन्न।
    7. किसी भी हवाई बुलबुले के बिना समानांतर में प्रत्येक टुकड़ा रखकर जगह झरझरा PDMS झिल्ली और एक conformal संपर्क में ऊपरी परत microchannel के प्लाज्मा इलाज सतहों।
    8. दो PDMS परतों के अपरिवर्तनीय संबंधों के लिए 80 डिग्री सीओ / एन पर पूरे सेटअप को सेते हैं।
    9. ध्यान से समर्थन परत के कोने उठाकर और बंद छीलने तक समर्थन परत पूरी तरह से झिल्ली के साथ ऊपरी परत से अलग है द्वारा एक झरझरा झिल्ली के साथ एक ऊपरी परत की विधानसभा से PDMS समर्थन परत छील।
    10. इस निर्वात कक्षों (दो मुख्य चैनल के दोनों तरफ स्थित कक्षों) एक ठीक-टिप चिमटी का उपयोग कर खोखला निर्वात कक्षों बनाने के लिए पर स्थित झिल्ली के कुछ भागों आंसू।
    11. के रूप में मैं वर्णित झिल्ली शीर्ष टुकड़ा और चैनलों के एक ही रास्ते में प्लाज्मा को कम टुकड़े पर उत्कीर्ण के साथ कंधे पर संलग्न के साथ कंधे का पर्दाफाशn 1 मिनट के लिए 1.1.6 कदम।
    12. एक स्टिरियोस्कोप के तहत किसी भी हवाई बुलबुले के बिना समानांतर में प्रत्येक टुकड़ा रखकर ऊपरी microchannel एक conformal संपर्क के साथ निचली परत एक झरझरा झिल्ली के साथ परत और संरेखित करें।
    13. 80 डिग्री सीओ / एन पर एक सूखी ओवन में पूरे सेटअप इलाज के लिए एक पूर्ण पैमाने पेट-ऑन-ए-चिप microfluidic युक्ति microfluidic सेल चैनल के लिए अगले दो खोखले निर्वात कक्षों युक्त उत्पादन करने के लिए।
  2. एक 90 डिग्री तुला हुआ स्टेनलेस स्टील कुंद अंत सुई के माध्यम से प्रवेश और एक आंत-ऑन-ए-चिप में ऊपरी या निचले microchannels से जुड़े एक बंदरगाह के आउटलेट के लिए ट्यूबिंग कनेक्ट करें।
  3. एक 90 डिग्री तुला हुआ स्टेनलेस स्टील कुंद अंत सुई का उपयोग निर्वात कक्षों से जुड़े छेद करने के लिए ट्यूबिंग कनेक्ट करें।
  4. 70% (v / v) इथेनॉल डिस्पोजेबल सिरिंज निष्फल 1 मिलीलीटर का उपयोग कर बहने से microchannels और ट्यूबिंग जीवाणुरहित।
  5. microchannels और एक 60 डिग्री सेल्सियस सूखी ओवन हे / एन में ट्यूबिंग बाहर सूखी।

2. Microengine की वृद्धिआंत-ऑन-ए-चिप डिवाइस में जुटी आंतों Villi

  1. एक आंत-ऑन-ए-चिप microdevice 5.9 पर बीज आंतों उपकला कोशिकाओं (जैसे Caco-2BBE)।
    1. (V / v) इथेनॉल (1.4 कदम देखें) 1 मिलीलीटर निष्फल डिस्पोजेबल सिरिंज एक 60 डिग्री सेल्सियस सूखी ओवन हे में सुखाने के द्वारा पीछा का उपयोग कर 70% के साथ डिवाइस जीवाणुरहित / एन सतह सक्रियण से पहले (1.5 कदम देखें)।
    2. एक आंत-ऑन-ए-चिप माइक्रोसिस्टम का पूरा सेटअप बेनकाब (यानी, की एक संस्था पेट-ऑन-ए-चिप ट्यूबिंग से जुड़े) पराबैंगनी प्रकाश (253.7 एनएम) और ओजोन 40 मिनट के लिए एक साथ करने के लिए।
    3. एक जैव सुरक्षा कैबिनेट (बीएससी) में पराबैंगनी प्रकाश के तहत 15 मिनट के लिए आरटी पर डिवाइस शांत हो जाओ।
    4. एक डिस्पोजेबल का उपयोग करते हुए दोनों ऊपरी और निचले microchannels में - 50 माइक्रोग्राम / एमएल प्रकार मैं कोलेजन और 300 माइक्रोग्राम / एमएल बाह्य मैट्रिक्स मिश्रण सीरम मुक्त Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) में पतला का एक मिश्रण समाधान-ईसीएम कोटिंग के 100 μl का परिचय बाँझ 1 मिलीलीटर सिरिंज।
    5. Incubaएक 37 डिग्री सेल्सियस में पूरे सेटअप ते 1 घंटे के लिए humidified 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर।
    6. देगास पूर्व गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) पूरी संस्कृति के माध्यम (DMEM, 20%, वी / वी, भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 100 इकाइयों / एमएल पेनिसिलिन, और 100 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन की 50 मिलीलीटर, एक 3 मिलीलीटर में aliquoted डिस्पोजेबल सिरिंज) 1 मिनट के लिए बीएससी में एक 50 मिलीलीटर छानने का काम प्रणाली (0.45 ताकना आकार में माइक्रोन) का उपयोग कर।
      1. छानने का काम प्रणाली के माध्यम से पूर्व गर्म मध्यम पास और 1 मिनट के माध्यम में किसी भी बुलबुले या भंग गैस को दूर करने के लिए मध्यम फ़िल्टर पर धीरे नल।
    7. Degassed पूरा माध्यम से विभाज्य एक 3 मिलीलीटर डिस्पोजेबल सिरिंज में रखें और एक 37 डिग्री सेल्सियस में सेते 1 घंटे के लिए humidified 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर।
    8. ऊपरी और निचले microchannels से कनेक्ट दो 3 मिलीलीटर डिस्पोजेबल सीरिंज degassed युक्त, पूर्व गर्म पूरी संस्कृति के माध्यम से।
    9. ऊपरी microchannel में degassed पूरा सेल संस्कृति के माध्यम से प्रवाह बड़ा पर एक सिरिंज पंप का उपयोग(0.02 डाएन / 2 सेमी पर कतरनी तनाव के बराबर) का प्रवाह 30 μl / घंटा की दर से एक 37 डिग्री सेल्सियस में 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर humidified हे / एन।
  2. आंत-ऑन-ए-चिप में Microengineered Caco -2 Villi का गठन।
    1. 50 और 65 के बीच पारित होने संख्या के साथ Caco-2BBE कोशिकाओं का प्रयोग करें।
    2. एक 37 डिग्री सेल्सियस में पूरी संस्कृति के माध्यम से युक्त एक T75 फ्लास्क में Caco -2 कोशिकाओं को विकसित पूरी तरह से मिला हुआ कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए 4-5 दिनों के लिए humidified 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर।
    3. पीबीएस मुक्त सीए 2 और मिलीग्राम के 2 + 10 मिलीलीटर जोड़ने के लिए पूरी तरह से मिला हुआ Caco-2 कोशिकाओं एक T75 फ्लास्क में वृद्धि हुई, कोशिकाओं को धोने तो पीबीएस बाहर निकालना। इस कदम दो बार दोहराएँ।
    4. एक 37 डिग्री सेल्सियस में 0.05% / trypsin EDTA समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ें और 5 मिनट के लिए सेते हैं humidified 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर।
    5. ऊपर pipetting द्वारा और तीन से पांच गुना नीचे 10 मिलीलीटर पूर्व गर्म पूरा सेल संस्कृति के माध्यम से (FBS के साथ) के साथ अलग कोशिकाओं Resuspend।
    6. ग द्वारा सेल निलंबन स्पिन5 मिनट के लिए 500 XG पर entrifugation, फिर सतह पर तैरनेवाला हटा दें।
    7. पूरा मध्यम के साथ फिर से 1 मिलीलीटर पूर्व गर्म ~ 1.5 x 10 5 कोशिकाओं / 2 सेमी डिवाइस में कम से सेल घनत्व को समायोजित करने के resuspend। hemocytometer का उपयोग सेल घनत्व का अनुमान है।
    8. 1 मिलीलीटर डिस्पोजेबल एक 25 g5 / 8 ऊपरी microchannel से जुड़े ट्यूबिंग के आउटलेट पर सुई से जुड़ी सिरिंज रखकर ऊपरी microchannel (लुमेन पक्ष) में resuspended Caco-2 कोशिकाओं के 100 μl दिखे।
    9. सभी inlets और ट्यूबिंग की दुकानों के ऊपरी और निचले microchannels बांधने की मशीन क्लिप का उपयोग करने के लिए लॉग इन दबाना।
    10. 1 घंटे के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस, humidified 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में पूरे सेटअप को सेते झरझरा झिल्ली की सतह का पालन करने के लिए अलग Caco-2 कोशिकाओं की अनुमति है।
    11. अकड़न निकालें और एक सिरिंज पंप का उपयोग कर जब तक कोशिकाओं 24-36 घंटे के लिए एक अक्षुण्ण monolayer फार्म केवल 30 μl / घंटा पर ऊपरी microchannel के लिए संस्कृति के माध्यम के प्रवाह को फिर से शुरू। चरण Contras का प्रयोग करेंटी या अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) माइक्रोस्कोपी एक सेल monolayer में सेल सेल जंक्शनों पुष्टि करने के लिए।
    12. कोशिकाओं एक monolayer फार्म जब, संस्कृति 30 μl / घंटा की एक ही प्रवाह दर पर दोनों ऊपरी (लुमेन) में मध्यम और निचले (केशिका) microchannels छिड़कना।
    13. क्रमाकुंचन-तरह गति 5.9 नकल उतार यांत्रिक विकृतियों के अनुप्रयोग।
      1. वैक्यूम तनाव उपकरणों से लैस पंप चालू करें।
      2. एक स्टेनलेस स्टील कनेक्टर के साथ ट्यूबिंग के माध्यम से वैक्यूम नियंत्रक करने के लिए वैक्यूम कक्षों से कनेक्ट।
      3. निर्वात को नियंत्रित करने सॉफ्टवेयर पर चक्रीय साइन समारोह मोड के साथ 0.15 हर्ट्ज की एक आवृत्ति पर 10% मतलब सेल तनाव की खींच गति सेट करें, तो क्लिक करें "आरंभ"।
    14. निरंतर संस्कृति के माध्यम से दोनों ऊपरी और निचले microchannel में मिला हुआ Caco -2 monolayer के लिए यांत्रिक विकृतियों के तहत ~ 100 घंटे के लिए प्रवाह (30 μl / घंटा) (10%, 0.15 हर्ट्ज) बनाए रखें।
      नोट: Caco-2 कोशिकाओं प्रायोजितtaneously उपकला microchannel 5,8-10 के लुमेन की ओर बढ़ाया लहरदार 3 डी अनुमानों के साथ अंकुर morphogenesis गुज़रना पड़ता है।
  3. पेट-ऑन-ए-चिप 10 में लुमेन केशिका ऊतक इंटरफ़ेस के साथ रहने वाले मानव आंत के अंग स्तर के कार्यों का अनुकरण करने के लिए, के रूप में वर्णित चरणों का पालन करें।
    1. 2.1 से 2.2 के लिए कदम दोहरा द्वारा बढ़ो microengineered Caco -2 विल्ली।
    2. पूर्व गर्म सह-संस्कृति के माध्यम से प्रवाह (पूरा Caco -2 सेल संस्कृति के माध्यम से और पूर्ण HMVECs संस्कृति के माध्यम से एक मिश्रण है, 1: 1 वी / वी) 30 μl / घंटा पर ऊपरी और निचले microchannels करने के लिए।
    3. अलग सामान्य मानव केशिका microvascular endothelial कोशिकाओं के 100 μl का परिचय (HMVECs; अंतिम सेल घनत्व, ~ 5.0 x 10 5 कोशिकाओं / 2 सेमी) समान विधि 2.2.3 से 2.2.9 के लिए चरणों में वर्णित से कम microchannel में।
    4. (0.5 सेमी एक्स 1 सेमी एक्स 1 सेमी एक ठीक आयताकार PDMS टुकड़ा प्लेस, चौड़ाई x लंबाई x ऊँचाई; 15: 1, w/ डब्ल्यू इलास्टोमेर: इलाज एजेंट) पेट पर एक चिप डिवाइस के शीर्ष पर है, तो फ्लिप पूरे डिवाइस सेटअप उल्टा (यानी, ऊपरी microchannel नकारात्मक पक्ष को सामना करना पड़ता है, और कम microchannel उल्टा करने के लिए चेहरे)।
    5. 1 घंटे के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस, humidified 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में सेटअप सेते अलग HMVECs कम microchannel में झरझरा झिल्ली की सतह का पालन करने के लिए अनुमति देने के लिए।
    6. सीओ 2 इनक्यूबेटर से एक पूरे सेटअप बाहर ले लो, और फिर से सेटअप फ्लिप।
    7. प्रवाह पूर्व गर्म सह-संस्कृति के माध्यम से (पूरा Caco -2 सेल संस्कृति के माध्यम से और पूर्ण HMVECs संस्कृति के माध्यम से एक मिश्रण है, 1: 1 वी / वी) 30 μl / मैकेनिकल खींच गतियों के साथ मानव संसाधन में दोनों ऊपरी और निचले microchannels में ( 10%, 0.15 हर्ट्ज) में कम से कम तीन दिनों के लिए एक endothelial monolayer के सेल सेल जंक्शनों के रूप में।

एक आंत-ऑन-ए-चिप microdevice में 3. मेजबान आंत Microbiome सह संस्कृति

  1. पूर्व संस्कृति ओ प्रदर्शन करनाएफ बैक्टीरियल कोशिकाओं के रूप में microengineered आंतों विल्ली पर सह-संस्कृति खानेवाला पेट Microbiome इस प्रकार है।
    1. autoclaved Lactobacilli मिसेज शोरबा और प्रबलित Clostridial माध्यम से: (1, वी / वी 1) मिश्रण के 10 मिलीलीटर में फ्रीज सूखे प्रोबायोटिक जीवाणु ख़स्ता मिश्रण Resuspend।
    2. , विभाज्य माइक्रोबियल सेल निलंबन के 3 मिलीलीटर एक 10 मिलीलीटर डिस्पोजेबल बाँझ ट्यूब में मध्यम की उचित मात्रा में जोड़ने तब तक (600 एनएम) लगभग 0.2 ऑप्टिकल घनत्व इकाइयों को अंतिम सेल घनत्व को समायोजित करें।
    3. प्लेस नलियों अवायवीय कंटेनर में माइक्रोबियल कोशिकाओं resuspended हैं। अवायवीय गैस पैदा पाउच के दो पैक कंटेनर में जोड़ें। एक 37 डिग्री सेल्सियस में मिलाते हुए बिना कसकर कंटेनर ढक्कन बंद और कंटेनर सेटअप सेते humidified 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर हे / एन।
  2. Microbiome और आंतों उपकला कोशिकाओं 5,10 के साथ सह-संस्कृति का टीका।
    1. 3 मिलीलीटर डिस्पोजेबल degassed antibioti युक्त सीरिंज तैयारसी-फ्री सेल संस्कृति के माध्यम से (यानी, 20% FBS के साथ DMEM)। संस्कृति के माध्यम से degassing प्रक्रिया के लिए 2.1.6 देखें।
    2. सीओ 2 इनक्यूबेटर से microengineered विल्ली युक्त पेट-ऑन-ए-चिप डिवाइस के एक पूरे सेटअप बाहर ले लो, तो जैव सुरक्षा कैबिनेट के लिए कदम।
    3. ऊपरी और निचले microchannels से जुड़े टयूबिंग के लिए लॉग इन सीरिंज निकालें। इस उपकरण के लिए 3.2.1 में तैयार सीरिंज कनेक्ट, वापस सीओ 2 इनक्यूबेटर करने के लिए लाने के लिए, तो 12 घंटे के लिए इस एंटीबायोटिक मुक्त संस्कृति के माध्यम से प्रवाह Microbiome के बोने से पहले।
    4. 5 मिनट के लिए 10,000 XG पर पूर्व सुसंस्कृत प्रोबायोटिक जीवाणु मिश्रण कोशिकाओं (3.1 चरण देखें) स्पिन। सतह पर तैरनेवाला निर्वात का उपयोग कर बाहर महाप्राण, तो एंटीबायोटिक मुक्त DMEM मध्यम में resuspend (अंतिम सेल घनत्व, ~ 1.0 10 x 7 CFU / एमएल)।
    5. 1 मिलीलीटर डिस्पोजेबल एक 25 से जुड़ी सिरिंज का उपयोग "रोगाणु मुक्त" आंतों विल्ली युक्त microchannel के लुमेन पक्ष में सेल निलंबन दिखेG5 / 8 सुई। के लिए आंतों विल्ली के शिखर सतह के लिए माइक्रोबियल कोशिकाओं का पालन करने की अनुमति दें ~ सभी ट्यूबिंग अंत करने के लिए clamping द्वारा प्रवाह के बिना 1.5 घंटे।
    6. 40 μl / चक्रीय तालबद्ध विकृतियों के साथ मानव संसाधन (10%, 0.15 हर्ट्ज) पर दोनों ऊपरी और निचले microchannels में पूर्व गर्म एंटीबायोटिक मुक्त संस्कृति के माध्यम छिड़कना।
    7. हरी प्रतिदीप्ति प्रोटीन के सह संस्कृति (GFP) -labeled के लिए ई कोली (GFP ई कोलाई, गैर रोगजनक DH5-अल्फा ई कोलाई मेजबान) microengineered विल्ली के साथ 10,11 कोशिकाओं, पूर्व खेती GFP ई 12 घंटे के लिए शर्त (200 आरपीएम) झटकों के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर autoclaved लेग माध्यम में कोलाई कोशिकाओं। 3.2.5 से 3.2.6 के लिए प्रक्रिया दोहराएँ GFP ई के सह-संस्कृति से बाहर ले जाने के लिए microengineered विल्ली साथ कोलाई कोशिकाओं।
  3. छवि कोशिकाओं 5,8-10
    1. माइक्रोबियल और उपकला आकृति विज्ञान 5,8,10 की रिकॉर्डिंग के लिए जिला उद्योग केंद्र, epifluorescence, या लेजर स्कैनिंग confocal माइक्रोस्कोपी प्रदर्शन।
      1. डीआईसी इमेजिंग के लिए, सीओ 2 इनक्यूबेटर से पेट-ऑन-ए-चिप माइक्रोसिस्टम के एक सेटअप बाहर लेने के लिए एक खुर्दबीन के मंच पर डिवाइस सेटअप जगह है, तो सेल आकृति विज्ञान रिकॉर्ड है।
      2. अंकुर उपकला के प्रतिदीप्ति इमेजिंग के लिए, 10 मिनट के लिए 100 μl / घंटा पर कोशिकाओं को धोने के लिए पीबीएस प्रवाह।
        1. 4% (w / v) 15 मिनट के लिए paraformaldehyde के साथ विल्ली को ठीक करें। फिर 10 मिनट के लिए 100 μl / घंटा पर कोशिकाओं को धोने के लिए पीबीएस प्रवाह।
        2. 0.3% के साथ विल्ली permeabilize (वी / वी) ट्राइटन X-100 पीबीएस 2% से युक्त (डब्ल्यू / वी) 10 मिनट के लिए गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) में पतला। फिर 10 मिनट के लिए 100 μl / घंटा पर कोशिकाओं को धोने के लिए पीबीएस प्रवाह।
        3. 2% के साथ ब्लॉक कोशिकाओं (w / v) 1 घंटे के लिए पीबीएस में बीएसए समाधान। फिर 10 मिनट के लिए 100 μl / घंटा पर कोशिकाओं को धोने के लिए पीबीएस प्रवाह।
        4. 4 में से 300 एनएम ', 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) समाधान प्रकाश संरक्षण के तहत परमाणु धुंधला के लिए पीबीएस में पतला जोड़ें।
        5. फ्लोरोसेंट phalloidin की 25 इकाइयों / मिलीलीटर जोड़ें(Phalloidin-CF647 साधना) प्रकाश संरक्षण के तहत एफ actin धुंधला के लिए पीबीएस में भंग कर दिया।
        6. एक लेजर स्कैनिंग confocal खुर्दबीन का उपयोग fluorescently दाग कोशिकाओं के रिकार्ड छवियों।
          नोट: एक 25x उद्देश्य confocal माइक्रोस्कोपी के दौरान उचित ऑप्टिकल ज़ूम के साथ लागू किया गया था। चित्रा 3 बी में, लगभग 525X बढ़ाई इस्तेमाल किया गया था।

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Representative Results

इन विट्रो में मानव आंतों मेजबान Microbiome पारिस्थितिकी तंत्र का अनुकरण करने के लिए, यह है आवश्यक ऐसे क्रमाकुंचन की तरह यांत्रिकी और द्रव का प्रवाह के रूप में शारीरिक शर्तों के तहत पेट के बैक्टीरिया और मानव आंतों उपकला कोशिकाओं के स्थिर लंबी अवधि के सह संस्कृति पुनर्गठित करने के लिए एक प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल विकसित करने के लिए। यहाँ, हम एक biomimetic पेट पर एक चिप का उपयोग microdevice (चित्रा 1 ए) के सह-संस्कृति के लिए इन विट्रो में एक सप्ताह की अवधि या उससे अधिक के लिए मानव विल्ली रहने के साथ सीधे संपर्क में माइक्रोबियल कोशिकाओं रह रहे हैं। आंतों उपकला कोशिकाओं अनायास अच्छी तरह से विभेदित विल्ली फार्म जब physiologically प्रासंगिक द्रव का प्रवाह और चक्रीय यांत्रिक विकृतियों 5 की उपस्थिति में एक 2-चैनल microfluidic युक्ति के एक चैनल में एक झरझरा ईसीएम लेपित झिल्ली के एक तरफ सुसंस्कृत। microengineered विल्ली ढांचे और मानव छोटी आंतों विल्ली, formati सहित के कार्यों को दोहरानेस्तंभ उपकला एक शिखर ब्रश सीमा से लाइन में खड़ा कोशिकाओं, प्रवास और अंकुर टिप, बलगम उत्पादन, बढ़ाया दवा metabolizing गतिविधि और बढ़ ग्लूकोज अवरोध 8 के उच्च स्तर पर तहखाना से प्रगति बेटी कोशिकाओं के भेदभाव के साथ बेसल proliferative तहखाने के पर। रहने endothelial कोशिकाओं आंतों की दीवारों के ऊतक ऊतक इंटरफ़ेस विश्राम करने के लिए एक ही झिल्ली के विपरीत दिशा में संवर्धित किया जा सकता है, और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के रूप में अच्छी तरह से 10 प्रणाली में संवर्धित किया जा सकता है। आंतों उपकला कोशिकाओं, एक पेट पर एक चिप में गठित आंतों विल्ली की तंग जंक्शन बाधा के सुरक्षात्मक कार्य को मान्य करने के लिए रहकर transepithelial विद्युत प्रतिरोध (तीर) 5,10,12 को मापने के द्वारा quantitated है। Teer मूल्य की नियमित निगरानी के हर मोड़ पर एक सेल monolayer या आंतों विल्ली की अखंडता अनुमान लगाने के लिए आवश्यक है (जैसे, लुमेन में बैक्टीरिया जोड़ने से पहले)।

7 CFU / एमएल) उपकला microchannel के लुमेन में inoculated हैं (चित्रा 1 बी, "टीका")। बाद माइक्रोबियल कोशिकाओं ~ 1.5 घंटे के लिए प्रवाह के अभाव (चित्रा 1 बी, "अनुलग्नक"), शारीरिक प्रवाह (40 μl / घंटा) में विल्ली के शिखर सतह पर पालन चक्रीय यांत्रिक विकृतियों के साथ दोनों चैनलों के माध्यम से फिर से शुरू है (10% तनाव में 0.15 हर्ट्ज) दोनों बैक्टीरियल और अंकुर उपकला कोशिकाओं (चित्रा 1 बी, "सह-संस्कृति") को अपार पेट के बैक्टीरिया और आपूर्ति के पोषक तत्वों को दूर करने के लिए। साथ व्यवहार्य बैक्टीरियल microcolonies सह संस्कृति में अप करने के लिए दो सप्ताह (आंकड़े 2A, 2 बी) के लिए बनाए रखा जा रहा है इस सह संस्कृति प्रोटोकॉल, intervillus अंतरिक्ष में प्रोबायोटिक बैक्टीरिया की कई प्रजातियों के स्थिर उपनिवेशवाद की अनुमति देता है। इस अध्ययन में, एक सहmmercial प्रोबायोटिक सूत्रीकरण कि 8 अलग ऐच्छिक या लाचार अवायवीय के एक मिश्रित आबादी शामिल है, Bifidobacterium ब्रीव, बी के प्रोबायोटिक उपभेदों longum, बी infantis, लैक्टोबैसिलस acidophilus, एल plantarum, एल paracasei, एल bulgaricus, और स्ट्रेप्टोकोकस thermophiles प्रयोग किया जाता है।

यह सह-संस्कृति विधि मोटे तौर पर मानव आंतों मेजबान सूक्ष्म जीव पारिस्थितिकी तंत्र का अनुकरण करने के लिए लागू किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, गैर रोगजनक GFP ई कोली सह सुसंस्कृत जा सकती है एक आंत-ऑन-ए-चिप डिवाइस में उगाई आंतों विल्ली की सतह पर। एक ही प्रोटोकॉल के आधार पर ऊपर वर्णित है, का पालन GFP ई कोलाई विल्ली पर कोशिकाओं 3 दिन के साथ कई microcolonies (चित्रा 3 ए, 1 घंटा बनाम 72 घंटा) है कि intervillus रिक्त स्थान का पता लगाने में (चित्रा 3 बी, 1 घंटा बनाम 72 घंटा) जब मिलने वाले तहत सुसंस्कृत करने के लिए 1 घंटा पर एकल कक्षों से बढ़ने फ्लो (40 μl /मानव संसाधन) क्रमाकुंचन की तरह विकृतियों की उपस्थिति में (10%, 0.15 हर्ट्ज)।

आकृति 1
चित्रा 1. मानव आंत-ऑन-ए-चिप मेजबान पेट Microbiome सह संस्कृति के लिए microphysiological प्रणाली। (ए) एक तस्वीर (बाएं) और एक 2 चैनल के एक योजनाबद्ध (दाएं), पेट-ऑन-ए-चिप microfluidic युक्ति। तीर संस्कृति के माध्यम से प्रवाह की दिशा का संकेत (नीले, शीर्ष microchannel, लाल, नीचे microchannel)। (बी) के पेट पर एक चिप में मेजबान पेट Microbiome सह संस्कृति की प्रक्रिया के योजनाबद्ध चित्र। बाद आंतों उपकला कोशिकाओं विल्ली (~ 100 एचआर) के रूप में, सेल संस्कृति माध्यम में resuspended माइक्रोबियल कोशिकाओं लुमेन microchannel (टीका) के लिए पेश कर रहे हैं, तो मध्यम संस्कृति के प्रवाह ~ 1.5 घंटे (लगाव) के लिए निलंबित कर दिया है। माइक्रोबियल कोशिकाओं आंतों विल्ली के शिखर सतह का पालन करने के बाद, प्रवाह फिर से शुरू है (सह -culture)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. पेट पर एक चिप में आंतों विल्ली के साथ कई प्रोबायोटिक बैक्टीरिया के सह संस्कृति। (ए) एक अंतर हस्तक्षेप विपरीत माइक्रोग्राफ प्रोबायोटिक जीवाणु पेट चिप में विल्ली के बीच बढ़ते कोशिकाओं का एक microcolony पता चलता है। (बी) ए के एक उच्च शक्ति बढ़ाई दृश्य (एक काला बिंदीदार वर्ग) प्रोबायोटिक बैक्टीरियल कोशिकाओं की microcolony (एक लाल तीर) दिखा। वी, विल्ली; स्केल बार = 20 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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चित्रा 3. गैर रोगजनक, GFP लेबल ई के सह-संस्कृति पेट-ऑन-ए-चिप में आंतों विल्ली साथ कोलाई। (ए) मढ़ा प्रतिदीप्ति और डीआईसी सूक्ष्म छवियों, 1 और 72 घंटा में लिया GFP ई के औपनिवेशीकरण प्रदर्शित कोलाई पेट पर एक चिप में उगाया आंतों विल्ली पर। (बी) मढ़ा प्रतिदीप्ति confocal 1 और 72 घंटा में लिया micrographs के उच्च शक्ति बढ़ाई विचारों GFP लेबल ई की वृद्धि दर्ज की गई एक एकल कोशिका (एक लाल तीर) एक microcolony करने से कोली (एक सफेद तीर)। ब्लू, नाभिक; मैजेंटा, एफ actin; स्केल बार = 30 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

समझना मेजबान Microbiome बातचीत दवा को आगे बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण है; हालांकि, एक प्लास्टिक पकवान या एक स्थिर अच्छी तरह से थाली में प्रदर्शन पारंपरिक सेल संस्कृति मॉडल अधिक से अधिक 1-2 दिनों के लिए आंत रोगाणुओं रहने के साथ मानव आंतों की कोशिकाओं के स्थिर सह संस्कृति का समर्थन नहीं करते क्योंकि माइक्रोबियल कोशिकाओं ज्यादातर इन विट्रो में स्तनधारी कोशिकाओं ऊंचा हो जाना। Overgrowing माइक्रोबियल आबादी तेजी से ऑक्सीजन और पोषक तत्वों की खपत है, बाद में चयापचय अपशिष्ट (जैसे, कार्बनिक अम्ल), जो गंभीरता से आंत्र बाधा कार्यों समझौता और आंतों उपकला कोशिका मृत्यु का कारण की अत्यधिक मात्रा में उत्पादन होता है। इसलिए, माइक्रोबियल अतिवृद्धि कि पोषक तत्वों की कमी का कारण बनता है और माइक्रोबियल कचरे के संचय को रोकने व्यवहार्य मेजबान Microbiome सह-अस्तित्व के सह संस्कृति microenvironment में (सप्ताह के दिनों से) एक विस्तारित अवधि के लिए बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है।

इन चुनौतियों का एक microphysiological पर काबू पाने के लिए,आंत-ऑन-ए-चिप डिवाइस 5.8 पूरी तरह से विभेदित मानव आंतों विल्ली के लिए फार्म और इन विट्रो में आंतों लुमेन के स्थिर राज्य microenvironment बनाए रखने के लिए विकसित किया गया है। के डिजाइन और कार्यात्मक इकाइयों (जैसे, microfluidic प्रवाह सेल कक्षों, वैक्यूम संचालित चक्रीय विकृतियों) एक आंत-ऑन-ए-चिप microfluidic युक्ति ठीक माइक्रोबियल सह संस्कृति 5 के लिए शारीरिक, भौतिक और रासायनिक microenvironment का अनुकरण करने के लिए संशोधित कर रहे हैं, 10। पेट-ऑन-ए-चिप microfluidic संस्कृति में लागू कतरनी तनाव मानव आंत में 5,13 ल्यूमिनल प्रवाह की शारीरिक सीमा के द्वारा निर्धारित किया गया था। मेजबान सूक्ष्म जीव सह संस्कृति के लिए, पेट-ऑन-ए-चिप के ल्यूमिनल microchannel में माइक्रोबियल आबादी के "स्थिर राज्य" को बनाए रखने के लिए रासायनिक और पोषण संभव शर्तों के समर्थन में महत्वपूर्ण है। पेट-ऑन-ए-चिप माइक्रोसिस्टम में, उस में इंट्रा-ल्यूमिनल स्थिर राज्य अनुमान लगाने के लिए संभव है पेट-ऑन-ए-चिप measuri द्वारासंस्कृति के माध्यम से और माइक्रोबियल सेल घनत्व का पीएच एनजी। क्योंकि ताजा संस्कृति के माध्यम से लगातार microchannels के माध्यम से बहती है, दोनों माइक्रोबियल और उपकला कोशिकाओं जब माइक्रोबियल कोशिकाओं की प्रारंभिक बोने घनत्व और संस्कृति के माध्यम से बड़ा प्रवाह दर अनुकूलित कर रहे हैं पोषक तत्व की कमी से गुजरना नहीं है। वातानुकूलित माध्यम microchannel से गुजर रहा एक परिभाषित बड़ा प्रवाह दर (यहाँ, 40 μl / घंटा) है, तो चयापचय अपशिष्ट (जैसे, कार्बनिक अम्ल) के रूप में अच्छी तरह के रूप में सेलुलर secretomes (जैसे, साइटोकिन्स) लगातार सह से हटा रहे हैं पर बाहर बहती संस्कृति microenvironment। इस प्रकार, पेट-ऑन-ए-चिप डिवाइस आवश्यक और प्रभावी ढंग से आंतों microchannel के लुमेन से अपार या ऊंचा हो गया माइक्रोबियल कोशिकाओं बाहर धोने के लिए पर्याप्त एक स्थिर राज्य microenvironment, जो की पीढ़ी की सुविधा के साथ एक "निरंतर बायोरिएक्टर" के रूप में माना जा सकता है 2-3 दिनों के भीतर एक स्थिर माइक्रोबियल आला।

महत्वपूर्ण एफए रहे हैंctors कि सफल आंतों विल्ली पर माइक्रोबियल कोशिकाओं के सह संस्कृति के लिए समस्या के रूप में माना जाना चाहिए। सबसे पहले, यह अनुकूलित ऊष्मायन समय विल्ली की सतह को देते हैं क्योंकि माइक्रोबियल आसंजन माइक्रोबियल प्रजातियों के बीच भिन्न हो सकते हैं माइक्रोबियल कोशिकाओं के लिए आवश्यक निर्धारित करने के लिए आवश्यक है। उदाहरण के लिए, इस तरह के लैक्टोबैसिलस rhamnosus जी जी के रूप में 5 प्रोबायोटिक बैक्टीरिया, आम तौर पर की आवश्यकता होती है ~ 1.0-1.5 मानव संसाधन देते हैं, लेकिन कुछ अन्य माइक्रोबियल प्रजातियों कम (जैसे, रोगजनक रोगाणुओं) बार उनके आसंजन कैनेटीक्स 14 के आधार पर आवश्यकता हो सकती है या अब। दूसरा, माइक्रोबियल कोशिकाओं की प्रारंभिक बोने घनत्व पहचान की जानी चाहिए क्योंकि अत्यधिक माइक्रोबियल सेल नंबर सह संस्कृति के प्रारंभिक चरण में बैक्टीरिया का परिणाम है, जो एक स्थिर स्थिर राज्य की उपलब्धि के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं हो सकता है। इस बोने घनत्व का अनुकूलन करने के लिए, यह antibi में लक्ष्य माइक्रोबियल तनाव के विकास प्रोफ़ाइल को चिह्नित करने की सिफारिश की हैविभिन्न बोने घनत्व में कान से मुक्त सेल संस्कृति के माध्यम से। अंत में, बड़ा प्रवाह की दर का समायोजन माइक्रोबियल प्रजातियों के आधार पर आवश्यक हो सकता है। उदाहरण के लिए, बढ़ प्रवाह दरों यदि माइक्रोबियल कोशिकाओं को बहुत तेजी से पैदा की आवश्यकता होगी। यह प्रयोगात्मक पुष्टि की गई 300 μl / घंटा (0.2 डाएन / 2 सेमी) बाधा समारोह और microengineered विल्ली की सेल आकृति विज्ञान समझौता नहीं करने के लिए है कि प्रवाह की दर (डेटा) नहीं दिखाया। हालांकि लैक्टोबैसिलस rhamnosus जी जी 5, ओवर-द-काउंटर प्रोबायोटिक मिश्रण, VSL # 3, गैर रोगजनक प्रयोगशाला तनाव ई कोलाई के रूप में अच्छी तरह से रोगजनक enteroinvasive ई के रूप में कोलाई तनाव 10 सफलतापूर्वक पेट पर एक चिप में लंबी अवधि के सह संस्कृति के लिए लागू किया गया, यह अभी भी रोगजनक सूक्ष्मजीवों के लिए संक्रामक खानेवाला पेट microbiota से माइक्रोबियल प्रजातियों में से एक किस्म का परीक्षण करने के लिए आवश्यक है। इन विट्रो में माइक्रोबियल कोशिकाओं के cultivability उपस्थिति या अनुपस्थिति में विचार किया जाना चाहिएसहजीवन और विकास के संदर्भ में, जहां unculturable पेट Microbiome खेती की कसौटी पर एक साज़िश चुनौती है में मेजबान कोशिकाओं की। अंत में, पेट-ऑन-ए-चिप में दोनों एरोबिक और anaerobic रोगाणुओं के सह-संस्कृति के लिए एक मजबूत प्रोटोकॉल भविष्य में खोज की जा करने के लिए एक महत्वपूर्ण unmet की आवश्यकता है।

वहाँ कदम, इस तरह के प्राथमिक आंतों उपकला या व्यक्तिगत मानव विषयों जो इस तरह के Crohn रोग या कोलोरेक्टल कैंसर के रूप में विशिष्ट है जठरांत्र रोगों से undifferentiated स्टेम कोशिकाओं के उपयोग के रूप में है कि आगे मॉडल में सुधार करने के लिए लिया जा सकता है; या प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (IPSCs)। अन्य मेजबान Microbiome मानव शरीर में पाए पारिस्थितिक तंत्र की नकल करने के लिए लागू किया जा बहरहाल, मानव स्वास्थ्य और रोग orchestrating में मानव Microbiome की भूमिका में बढ़ती दिलचस्पी के साथ, हमारे मेजबान Microbiome सह संस्कृति विधि एक विशाल महत्व और क्षमता है (जैसे , मौखिक गुहा 15, त्वचा 16, या मूत्रजननांगी टीract 17)। अंत में, इस सह-संस्कृति विधि bioavailability, प्रभावकारिता, और नई दवा यौगिकों की विषाक्तता पर कैसे पेट Microbiome प्रभावों के संदर्भ में predictability में सुधार के द्वारा पारंपरिक दवा के विकास की प्रक्रिया को नया सकता है। साथ में ले ली, पेट-ऑन-ए-चिप microphysiological प्रणाली एक स्थिर स्थिर राज्य आंतों microenvironment कि मेजबान Microbiome पारिस्थितिकी तंत्र को पुनर्गठित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है स्थापित करने के लिए एक मजबूत मंच प्रदान कर सकते हैं।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) containing 25 mM glucose and 25 mM HEPES Gibco 10564-011 Warm it up at 37 °C in a water bath.
Difco Lactobacilli MRS broth BD 288120 Run autoclave at 121 °C for 15 min.
Poly(dimethylsiloxane) Dow Corning 3097358-1004 15:1 (w/w), PDMS : cureing agent
Caco-2BBE human colorectal carcinoma line Harvard Digestive Disease Center Human colorectal adenocarcinoma 
Heat-inactivated FBS Gibco 10082-147 20% (v/v) in DMEM
Penicillin-streptomycin-glutamine Gibco 10378-016 1/100 dilution in DMEM
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride Molecular Probes D1306 Nuclei staining
Phalloidin-CF647 conjugate (25 units/ml) Biotium 00041 F-actin staining
Flexcell FX-5000 tension system Flexcell International Corporation FX5K Peristalsis-like stretcing motion (10% cell strain, 0.15 Hz frequency)
Inverted epifluorescence microscope Zeiss Axio Observer Z1 Imaging, DIC
Scanning confocal microscope Leica DMI6000 Imaging, Fluorescence
UVO Cleaner Jelight Company Inc 342 Surface activation of the gut-chip
Type I collagen  Gibco A10483-01 Extracellular matrix component for cell culture into the chip
Matrigel BD 354234 Extracellular matrix component for cell culture into the chip
1 ml disposable syringe BD 309628 Cell and media injection stuff
25 G 5/8 needle BD 329651 Cell and media injection stuff
Syringe pump Braintree Scientific Inc. BS-8000 Injection equipment into the chip
VSL#3 Sigma-Tau Pharmaceuticals 7-45749-01782-6 A formulation of 8 different commensal gut microbes
Reinforced Clostridial Medium BD 218081 Anaerobic bacteria culture medium
GasPak EZ Anaerobe Container System with Indicator BD 260001 Anaerobic gas generating sachet 
4% paraformaldehyde Electron Microscopy Science 157-4-100 Fixing the cells for staining
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787 Permeabilizing the cells
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A7030 Blocking agent for staining of the cells
Corona treater Electro-Technic Products BD-20AC Plasma generator for fabrication of the chip
Steriflip  Millipore SE1M003M00 Degasing the complete culture medium
Disposable hemocytometer iNCYTO DHC-N01 For manual cell counting

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References

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जैव अभियांत्रिकी अंक 114 सह-संस्कृति पेट-ऑन-ए-चिप आंत Microbiome विल्ली microphysiological प्रणाली मेजबान सूक्ष्म जीव बातचीत
में Microengineered मानव आंत्र Villi साथ रहने का Microbiome के सह-संस्कृति एक आंत-ऑन-ए-चिप Microfluidic डिवाइस
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Kim, H. J., Lee, J., Choi, J. H., Bahinski, A., Ingber, D. E. Co-culture of Living Microbiome with Microengineered Human Intestinal Villi in a Gut-on-a-Chip Microfluidic Device. J. Vis. Exp. (114), e54344, doi:10.3791/54344 (2016).

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