Summary
우리는 인간의 장 - 온 - 어 - 칩 microphysiological 시스템을 사용하여 확장 된 기간 동안 체외 프로토콜 공동 문화 장내 마이크로 바이 옴과 장 융모에 대해 설명합니다.
Abstract
여기서는 인간 소화관 온 칩 microphysiological 장치 microengineered 장내 융모와 멀티 종 장기적 공 배양 인간 소화관 마이크로 바이을 수행하는 프로토콜을 기술한다. 우리는 생리 기계적 변형 및 유체 전단 흐름이 지속적으로 연동 운동을 모방 적용되는 미세 유체 장치에서 장 루멘 - 모세관 조직 인터페이스를 요점을 되풀이. 루멘 마이크로 채널에서, 인간의 장내 상피 카코이 세포는 '무균'융모 상피 세포를 형성하고 소장 융모를 재생하는 배양. 전 배양 된 미생물 세포 호스트 미생물 생태계를 확립 내강 측에 접종한다. 미생물 세포가 융모의 선 단면에 부착 한 후, 유체 유동 및 기계적 변형은 정상 상태의 신선한 배지 끊임없이 공급되는 미세 언 바운드 박테리아 (뿐만 아니라 박테리아 폐기물) 연속 제거를 생성 재개된다. 확장 공 배양 후 F주에 ROM 일 여러 microcolonies 임의로 융모 사이에 위치한 것으로 밝혀졌다, 미생물 및 상피 세포 모두 배양 최소 1 주일 동안 생존과 기능을 유지. 더불어 배양 프로토콜은 건강과 질환 조율 인간 마이크로 바이 역할의 시험 관내 연구를 용이하게 할 수있다 각종 인간 장기에서 발견 될 수있는 다른 호스트 마이크로 바이 생태계에 대한 다목적 플랫폼을 제공하도록 구성 될 수있다.
Introduction
인간의 장내 미생물 종의 놀랄만큼 다양한 배열 (<1,000 종)과 엄청난 미생물 세포의 수 (인간 숙주 세포보다 10 배 이상) 유전자 (인간 게놈보다 100 배 이상) 1 항구. 이러한 인간 microbiomes은 영양소 및 대사 생체 이물질 면역 반응을 조절하고, 2 장 항상성 유지에 중요한 역할을한다. 당연히 이러한 다양한 기능 제공, 공생 장내 마이크로 바이 옴은 광범위하게 건강과 질병 (3)을 변조한다. 따라서, 장내 마이크로 바이 옴 및 호스트 - 미생물 상호 작용의 역할을 이해하는 위장관 (GI) 건강 증진 및 장 질환 4에 대한 새로운 치료제를 탐험하기 위해 매우 중요하다. 그러나, 시험 관내 장 모델 (예, 정적 인 배양)에 존재하는 시간의 짧은 기간 (<1 일) 균체 자라다 장내 장벽을 손상하기 때문에 호스트 마이크로 바이에 공 배양을 제한기능 5. 대리 동물 모델 (예를 들어, 무균 6 유전자 조작 생쥐 7)도 일반적으로 식민지와 인간의 장내 마이크로 바이 옴의 안정 유지가 어렵 기 때문에 호스트 장내 마이크로 바이 옴 크로스 토크를 연구하는 데 사용되지 않습니다.
이러한 문제를 극복하기 위해, 최근 살아있는 인간 대장 5,8- 발생 호스트 장내 마이크로 바이 상호 작용을 에뮬레이트하기 위해 "거트 온 칩"microphysiological 시스템 (좌도 1a) 생체 모방 인간을 개발 하였다. 창자 - 온 - 어 - 칩 마이크로 디바이스는 유연성, 다공성, 세포 외 기질 (ECM) 인간의 장내 상피 카코이 세포에 의해 줄 지어 코팅 된 막, 장 루멘 - 모세관 조직 인터페이스 (그림 1A을 흉내 낸에 의해 분리 된 두 개의 평행 한 미세 유체 채널을 포함 , 오른쪽) 9. 진공 중심의 순환 리듬 변형은 일반적으로 induc 변경을 모방 생리 기계적 변형을 유도(오른쪽 그림 1A) 연동 운동에 의해 에드. 흥미롭게도, 카코 -2 세포는 100 개 이상의 시간 동안 소화관 온 칩에서 성장 될 때, 자발적 단단히 접합, 정점 브러시 테두리 기저 지하실에 한정되는 증식 성 세포를 3 차원 (3D) 장내 융모를 형성 점액 생산 증가 약물 대사 활동 (예를 들어, 시토크롬 P450 3A4, CYP3A4), 향상된 글루코스 재 흡수 8. 이 '무균'미세 환경에서, 프로 바이오 틱 유산균 rhamnosus의 GG 또는 최대 2 주 5,10에 대한 호스트 상피 세포와 바이오 틱 박테리아 혼합물의 치료 형성하는 공동 문화 수 있었다.
본 연구에서는 장기간 장내 온칩 장치 호스트 장내 마이크로 바이 공동 배양을 수행하는 상세한 프로토콜을 설명한다. 또한, 우리는 중요한 문제와 잠재적 인 문제를 논의하는 것은이 호스트 마이크로 바이 옴 공동 문화 (p)의 폭 넓은 응용 프로그램에 대해 고려해야 할rotocol.
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Protocol
창자 - 온 - 어 - 칩 장치 1. 마이크로
주 : 창자 - 온 - 칩은 플렉시블 의해 분리 된 두 개의 평행 한 미소 유로 (1mm 폭 × 150 μm의 높이 X 1cm 길이)를 포함하는 투명 가스 투과성 실리콘 중합체 (폴리 디메틸 실록산, PDMS)로 이루어지는 미세 유체 소자이며 기공 (세공 직경 10 ㎛의 간격, 공극 25 μm의 세공을 위해) 막을 PDMS 5,9. 제공되는 단계에 따라 창자 - 온 - 어 - 칩 (왼쪽 그림 1A)를 제작.
- 창자 - 온 - 어 - 칩 5,9의 미세 절차.
- PDMS의 예비 중합체와 경화제를 혼합하여 경화되지 탈기 PDMS 준비 (15 w / w 1), 30 분 동안 진공 건조기에 배치.
- 30g 각각 SU-8 위의 기반 미세 패턴과 장 - 온 - 어 - 칩의 낮은 마이크로있는 각 실리콘 몰드 상에 미 경화, 탈기 PDMS의 3g을 따르십시오. 이어서 L에 대한 건조 오븐에서 60 ℃에서 경화동쪽 4 시간.
- 수술 용 메스를 이용하여 주변 에지 절단에 의해 각 실리콘 주형으로부터 상하부 PDMS 층 탈형. 조직 검사 구멍을 뚫는 (구멍 직경 2.0 mm)를 사용하여 6 홀 (두 개의 입구, 두 개의 출구, 2 개의 진공 챔버)를 펀치.
- w 1 : 평면과 중첩 원형 기둥 (직경 10 μm의 높이가 25 μm의) 포스트 어레이를 포함하는 실란 화 된 실리콘 웨이퍼 상에 경화되지 않은 탈기 PDMS의 10g을 주입하여 다공성 막을 제조, PDMS 지지층 (15 실란 화 / w; 1cm 두께). 설정에 3kg 중량 누름을 넣고 12 시간 이상 60 ℃에서 폴리머를 경화.
- 신중 웨이퍼로부터 슬래브의 모서리를 들어 올려, 다공질 PDMS 막을 완전히 웨이퍼로부터 분리 될 때까지 박리하여 실리콘 웨이퍼의 PDMS지지 슬래브에 부착 다공성 PDMS 막의 설정 탈형.
- 는 PL 및 공막 측 : 상위 계층의 채널 사이드 (1, w / w PDMS 15) 폭로ASMA은 각각 1 분, 3 초를위한 휴대용 코로나 treater에 의해 생성.
- 기포없이 병렬로 각 조각을 배치하여 등각 접촉 다공질 PDMS 막의 상부 미세 층의 플라즈마 처리 한 표면에 놓는다.
- 두 PDMS 층의 비가 역적 결합 80 ° CO / N에서 전체 설치를 품어.
- 주의 지지층의 모서리를 들어 올려, 상기 지지층을 완전히 막과 상층으로부터 분리 될 때까지 박리하여 다공성 막과 상층의 어셈블리에서 PDMS 지지층 벗겨.
- 중공 진공 챔버를 만들기 위해 미세한 팁 핀셋을 이용하여 진공 챔버 (메인 채널의 양쪽에 위치하는 두 챔버) 위에 위치하고이 멤브레인의 일부를 절취.
- 내가 설명 된대로 상단 부분과 같은 방법으로 플라즈마에 낮은 조각에 새겨진 채널 측면에 부착 된 막으로면을 노출n은 1 분간 1.1.6 단계.
- 입체경 하에서 기포없이 병렬로 각 조각을 배치함으로써 균일 한 접촉 다공성 멤브레인 미세 상부 층과 하부 층을 맞추고.
- 미세 유체 채널 셀에 다음의 두 중공 진공 챔버를 포함하는 완전한 규모 창자 - 온 - 칩 마이크로 유체 소자를 제작하기 위해 80 ° CO / N에서 건조 오븐에서 온 설정을 치료.
- 90 ° 굴곡 스테인레스 스틸 무딘 엔드 바늘을 통해 장 - 온 - 어 - 칩의 상부 또는 하부 마이크로 채널에 연결된 각 포트의 입구와 출구에 튜브를 연결합니다.
- 90 ° 절곡 스테인리스 평활 말단 바늘을 이용하여 상기 진공 챔버에 연결되는 구멍에 튜브를 연결한다.
- 일회용 주사기를 소독 1 ml에 사용 70 % (v / v)의 에탄올을 흐르는하여 마이크로 및 튜브를 소독.
- 60 ° C 건조 오븐 O / N에서 마이크로 및 튜브를 건조.
마이크로 엔진 2. 성장창자 - 온 - 어 - 칩 장치에 겹 장내 융모
- 창자 - 온 - 어 - 칩 마이크로 디바이스의 5,9에 씨앗 장내 상피 세포 (예 : 카코 2BBE).
- 70 %와 60 ℃ 건조 오븐 O에서 건조시켜 1 ㎖의 멸균 일회용 주사기를 사용하는 (V / V) 에탄올 (단계 1.4 참조) 장치를 소독 / N은 표면 활성화하기 전에 (단계 150 참조).
- 창자 - 온 - 어 - 칩 마이크로 시스템의 전체 설정을 노출 (즉,의 몸 장 - 온 - 어 - 칩 튜브에 연결) 동시에 40 분 동안 자외선 (253.7 ㎚) 및 오존.
- 바이오 안전성 캐비닛 (BSC)에 UV 빛 아래 15 분 동안 실온에서 장치를 냉각.
- 일회용을 사용하여 두 상하 미세로 - I 콜라겐를 50㎍ / ㎖의 유형 및 혈청이없는 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM)로 희석하고 300 μg의 / ml의 세포 외 기질 혼합물의 혼합 용액 - 전자 재료 피막의 100 μl를 소개 멸균 1 ML의 주사기.
- Incuba37 ° C에서 전체 셋업 테 1 시간 동안 5 % CO 2 인큐베이터 가습.
- 드가 예열 된 (37 ℃)에서 완전 배양 배지 (DMEM, 20 % V / V, 소 태아 혈청 (FBS), 100 유닛 / ㎖ 페니실린, 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신 50 ㎖, 3 ㎖의 분취 1 분 동안 BSC 50 ㎖의 여과 시스템 (기공 크기 0.45 μm의)을 이용하여 일회용 주사기).
- 여과 시스템을 통해 사전 예열 매체에 합격 한 분은 중간에있는 거품 또는 용해 가스를 제거하기위한 여과 매체에 부드럽게 누릅니다.
- 37 ° C에서 3 ㎖ 일회용 주사기에 탈기 완전한 매체의 나누어지는을 놓고 품어 1 시간 동안 5 % CO 2 배양기를 가습.
- 상부 및 하부 마이크로에,이 3 ㎖ 일회용 주사기가 탈기 함유 미리 예열 전체 문화 매체를 연결합니다.
- 체적에서 주사기 펌프를 사용하여 상부에 마이크로 탈기 전체 세포 배양 배지 흐름37 ° C에서 (0.02 다인 / ㎠의 전단 응력에 상당) 30 μL / hr의 유량은 O / N, 5 % CO 2 인큐베이터 가습.
- 창자 - 온 - 어 - 칩 Microengineered 카코 2 융모의 형성.
- 50과 65 사이의 통로 번호 카코 2BBE 세포를 사용합니다.
- 37 ° C에서 완전 배양 배지를 함유하는 T75 플라스크에 카코 -2 세포 성장이 완전히 융합 세포를 수득 4-5 일 동안 5 % CO 2 인큐베이터 가습.
- 완전히 T75 플라스크에 성장 합류 카코 2 셀, 다음, 세포를 씻어 PBS를 대기음하는 PBS - 무료 2 + 칼슘과 마그네슘의 10 ML을 추가합니다. 두 번이 단계를 반복합니다.
- 37 ° C에서 0.05 % 트립신 / EDTA 용액 1 ㎖를 추가하고 품어 5 분 동안 5 % CO 2 배양기를 가습.
- 로 pipetting 의해 3~5 배 하 (FBS)와 예열 된 전체 세포 배양 배지 10 mL로 해리 된 세포를 재현 탁.
- C로 세포 현탁액을 스핀5 분 500 XG에 entrifugation 후 상등액을 제거합니다.
- 다시 1 ml의 장치에서 ~ 1.5 × 10 5 세포 / cm 2의 세포 밀도를 조정하는 완전 배지를 미리 예열을 Resuspend. 세포 밀도를 추정 혈구를 사용한다.
- 상부에 연결된 마이크로 튜브의 출구에 25 G5 / 8 바늘에 부착 된 1 ㎖의 일회용 주사기를 위치시킴으로써 상부 마이크로 (내강 측)에 재현 탁하고, 카코 -2 세포 100 μl를 주입.
- 바인더 클립을 사용하여 상부 및 하부 마이크로 채널에 연결된 모든 입구와 튜브의 출구를 조인다.
- 1 시간 동안 37 ° C, 가습 5 % CO 2 배양기에서 전체 설치를 품어 다공성 막 표면에 부착 카코 2 세포를 해리 허용합니다.
- 클램프를 제거하고 세포를 24-36 시간 동안 온전한 단일 층을 형성 할 때까지 주사기 펌프를 사용하여 30 μL / 시간 상부 마이크로에 배양액의 흐름을 재개. 위상 콘트라을 사용하여t 또는 미분 간섭 대비 (DIC) 현미경은 세포 단층의 세포 - 세포 접합을 확인합니다.
- 세포 단일 층을 형성 할 때, 30 μL / hr의 동일한 유량의 두 상부 (루멘)로 배지 낮은 모세관을 미세 관류.
- 연동 운동과 같은 운동 5,9을 흉내 낸 기계적인 변형의 응용 프로그램입니다.
- 인장 장비를 갖춘 진공 펌프를 켭니다.
- 스테인레스 스틸 튜브 커넥터를 통해 진공 컨트롤러에 진공 챔버를 연결한다.
- 진공 제어 소프트웨어에 대한주기적인 사인 함수 모드 0.15 Hz의 주파수에서 10 %의 평균 세포주의 스트레칭 운동을 설정 한 다음 "시작"을 클릭합니다.
- ~ 100 시간 동안 기계적 변형 하에서 합류 카코 -2 단층을 모두 상단 및 하단의 마이크로 배양액의 일정한 흐름 (30 μL / 시간) (10 %, 0.15 Hz로)를 유지한다.
참고 : 카코 2 세포가 spontaneously 상피 마이크로 5,8-10의 루멘으로 확장 파상 3D 돌기 융모 형태 형성을 겪는다.
- , 창자 - 온 - 어 - 칩 (10)의 루멘 - 모세관 조직 인터페이스 살아있는 인간의 소장의 기관 수준의 기능을 모방 한 바와 같이 단계를 수행하십시오.
- 2.1에서 2.2 단계를 반복하여 microengineered 카코 2 융모 성장.
- 미리 예열 공동 배양액의 흐름 (완전한 카코 -2 세포 배양 배지 전체 HMVECs 배지의 혼합물을 1 : 1 v / v)의 30 μL / 시간 상하 마이크로한다.
- 해리 정상적인 인간의 모세 혈관의 미세 혈관 내피 세포 100 ㎕ 소개 (HMVECs, 최종 셀 밀도를 ~ 5.0 × 10 5 세포 / cm 2) 2.2.3에서 2.2.9로 단계에 설명 된 동일한 방법으로 낮은 마이크로에.
- 경화 직사각형 PDMS 조각을 배치 (0.5 cm × 1 cm × 1 cm, 폭 X 길이 x 높이; 15 : 1, w/ 엘라스토머 W : 경화제) 창자 온 칩 디바이스 위에 후 거꾸로 전체 장치 설치 플립 () 즉, 상부 마이크로이 아래쪽에 대향하고, 상기 하부 마이크로은 위쪽에 직면한다.
- 해리 HMVECs 하부 미세 다공질 막의 표면에 부착 할 수 있도록, 1 시간 동안 37 ° C, 가습 된 5 % CO 2 인큐베이터에서 인큐베이션 설정.
- 이산화탄소 배양기에서 전체 설치를 꺼내, 다시 통해 설정을 뒤집습니다.
- 기계적 스트레칭 운동에 30 μL / 시간 모두 상하 미세으로 ((1 V / V 한 완전한 카코 -2 세포 배양 배지 전체 HMVECs 배지의 혼합물) 예열 된 공동 배양 배지 흐름 적어도 3 일 동안 10 %, 0.15 Hz로)는 내피 세포의 단층 세포 연접을 형성한다.
3. 굿 - 온 - 어 - 칩 마이크로 디바이스의 마이크로 바이 옴 공동 문화를 호스트 굿
- O를 사전 문화를 수행F 박테리아 세포를 microengineered 장 융모에하는 공동 문화 공생 장내 마이크로 바이 옴을 다음과 같이.
- 멸균 유산균 MRS 국물 강화 중간의 클로스 트리 디움 (1, V / V 1)의 혼합물 10ml에 동결 건조 생균제 세균 분말 혼합물을 재현 탁.
- 10 ㎖의 일회용 멸균 튜브에 분취 한 후, 균체 현탁액의 3 ㎖를 매체의 적당량을 첨가하여 (600 nm에서) 약 0.2 광학 밀도 단위로 최종 세포 밀도를 조정한다.
- 장소 관은 혐기성 용기에 미생물 세포를 재현 탁 함유. 컨테이너에서 혐기성 가스 발생 향 주머니의 두 팩을 추가합니다. 37 ° C에서 흔들림없이 컨테이너 설치를 단단히 용기 뚜껑을 닫고 품어 5 % CO 2 인큐베이터 O / N를 가습.
- 장내 상피 세포 5, 10과 마이크로 바이 옴과 공동 문화의 접종.
- 탈기 antibioti를 포함하는 3 ㎖ 일회용 주사기를 준비합니다C 무 세포 배양 배지 (예, 20 % FBS를 가진 DMEM). 문화 매체의 탈 절차 2.1.6를 참조하십시오.
- 이산화탄소 배양기에서 microengineered 융모를 포함하는 장 - 온 - 어 - 칩 디바이스의 전체 설정을 가지고, 다음 바이오 안전성 캐비닛로 이동합니다.
- 상부 및 하부 마이크로 채널에 연결 튜빙에 연결된 주사기를 제거합니다. 다음 이전 마이크로 바이 옴의 파종에 12 시간 동안이 항생제없는 배지 흐름, 다시 CO 2 배양기에 가져, 장치에 3.2.1에서 제조 된 주사기를 연결합니다.
- 5 분 동안 10,000 XG에서 미리 배양 바이오 틱 박테리아 혼합물 세포 (3.1 단계 참조) 스핀 다운. 진공을 이용하여 상등액 대기음 후 (~ 최종 세포 밀도가 1.0 × 107 CFU / ㎖) 항생제가없는 DMEM 배지에 재현 탁.
- 25에 부착 된 1 ㎖의 일회용 주사기를 사용하여 "무균"장내 융모를 함유하는 마이크로 채널의 내강 측에 세포 현탁액을 주입G5 / 8 바늘. 의 장 융모의 혀끝의 표면에 미생물 세포의 부착을 허용 ~ 모든 튜브 끝으로 클램핑하여 흐름없이 1.5 시간.
- 40 μL / 환상 리듬 변형과 시간 (10 %, 0.15 Hz로) 모두에서 상하로 미세 예열 항생제가없는 배지를 관류.
- 녹색 형광 단백질의 공 배양 (GFP)을 표지 된 E.를 들어 콜라이 (E. coli에 GFP 비 - 병원성 DH5 알파 E. 콜라이 숙주) microengineered 융모와 10,11 세포 사전 배양 GFP E. 12 시간 동안 상태 (200 RPM)를 진탕하에 37 ℃에서 멸균 LB 배지에서 대장균 세포. E. GFP의 공존 배양을 수행 3.2.5에서 3.2.6에 절차를 반복 microengineered 융모와 대장균 세포.
- 이미지 셀 5,8-10
- 미생물 및 상피 형태 5,8,10를 기록 DIC, 표면 형광 또는 레이저 스캐닝 공 초점 현미경을 수행합니다.
- DIC 이미징 들어, CO 2 배양기에서 장 - 온 - 어 - 칩 마이크로 시스템의 설정을 가지고 현미경의 무대 장치 설치를 배치 한 다음 세포 형태를 기록합니다.
- 융모 상피 형광 이미징의 경우, 10 분 동안 100 μL / 시간 세포를 PBS 세척을 흐른다.
- 4 % 15 분 (w / v)의 파라 포름 알데히드와 융모를 수정합니다. 그런 다음 10 분 동안 100 μL / 시간 세포를 PBS 세척을 흐른다.
- 0.3 %과 융모를 Permeabilize 하시려면 (v / v) 트리톤 X-100의 PBS 10 분간 소 혈청 알부민 (BSA) (/ V W) 2 %를 함유하는 희석. 그런 다음 10 분 동안 100 μL / 시간 세포를 PBS 세척을 흐른다.
- 2 %와 블록 세포를 1 시간 동안 PBS에서 BSA 용액 (/ V w). 그런 다음 10 분 동안 100 μL / 시간 세포를 PBS 세척을 흐른다.
- 4 300 nM의 '빛의 보호 아래 핵 염색을 위해 PBS에 희석, 6-diamidino-2-페닐 인돌 디 하이드로 클로라이드 (DAPI) 솔루션을 추가합니다.
- 형광 팔로이 딘의 25 단위 / ㎖ 추가빛 보호 아래 F - 굴지 염색을 위해 PBS에 용해 (Phalloidin의-CF647 접합체).
- 레이저 스캐닝 공 초점 레이저 주사 현미경을 사용하여 형광 염색 된 세포의 이미지를 기록.
참고 : 25X 목적은 공 초점 현미경 동안 적절한 광학 줌으로 적용되었다. 도 3b에서, 약 525X의 배율을 사용 하였다.
- 미생물 및 상피 형태 5,8,10를 기록 DIC, 표면 형광 또는 레이저 스캐닝 공 초점 현미경을 수행합니다.
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Representative Results
시험 관내에서 인간의 장내 호스트 마이크로 바이 생태계를 에뮬레이트하기 위해, 인 필요는 연동 운동과 같은 역학과 유체 흐름과 같은 생리 학적 조건에서 장내 세균과 인간의 장내 상피 세포의 안정적인 장기 협력 문화를 재구성하는 실험 프로토콜을 개발. 여기서, 우리는 생체 모방 창자 - 온 - 칩 마이크로 디바이스를 이용 (그림 1A)를 체외에서 일주일의 기간 이상 인간 융모 생활과 직접 접촉하는 미생물 세포 생활 문화 공동합니다. 장 상피 세포는 자연적으로도 분화 융모를 형성 할 때 중요한 생리 유체 유동 및 고리 기계적 변형 (5)의 존재하에 2 채널 미세 유동 장치의 한 채널에서 다공성 ECM 피복 막의 한쪽에 배양 하였다. microengineered 융모는 인간의 소장 융모 포함 formati의 구조와 기능을 복제혀끝의 브러시 테두리로 줄 지어 원주 상피 세포, 마이그레이션 및 융모 팁, 점액 생산, 향상된 약물 대사 활동을 증가 포도당 재 흡수 8의 높은 수준에 지하실에서 진행 딸 세포의 분화와 기초 증식 지하실의에. 생활 내피 세포 장벽의 조직 조직 인터페이스를 다시 동일한 막의 반대측에 배양 할 수있어, 면역 세포도 10 시스템에서 배양 될 수있다. 장 상피 세포, 창자 - 온 - 어 - 칩에 형성 장 융모의 꽉 접합 장벽의 보호 기능을 확인하기 위해 간헐적으로 transepithelial 전기 저항 (봉사자) 5,10,12를 측정하여 정량한다. 티이 값 감시 루틴은 매 시점에서 세포 단층 또는 장내 융모의 무결성을 추정하도록 요구된다 (예를 들어, 루멘 박테리아를 첨가하기 전).
107 CFU / ㎖의 X) 상피 마이크로 채널의 루멘에 접종 (도 1b "예방 접종"). 균체 ~ 1.5 시간 동안 유동이없는 (도 1b, "첨부 파일") 생리 흐름 (40 μL / 시간)에서 융모의 선 단면에 부착 한 후 (환상 기계적 변형과 두 채널을 통해 10 %의 변형률을 재개 0.15 Hz에서)은 모두 박테리아와 융모 상피 세포 (그림 1B, "공동 문화")에 언 바운드 장내 세균과 공급 영양분을 제거합니다. 가능한 세균 microcolonies 공동 문화까지 2 주 (도 2A, 2B) 유지되면서이 공동 문화 프로토콜은 intervillus 공간에서 바이오 틱 박테리아의 여러 종의 안정적인 정착을 할 수 있습니다. 본 연구에서는 공동8 다른 통성 또는 의무 혐기성의 혼합 인구를 포함 mmercial 프로 바이오 틱 제형, 비피 도박 테 리움 브레 베, B의 프로 바이오 틱 균주 longum의, B. 인판, 락토 바실러스 유산균, L. 란타, L. paracasei, L. bulgaricus를하고, 연쇄상 구균의 열성이 사용됩니다.
이 공 배양 방법은 크게 인체 장내 미생물 호스트 환경을 에뮬레이트에 적용될 수있다. 예를 들어, 비 - 병원성 E. GFP 콜라이 공동 배양 할 수있는 장내 온 칩 디바이스 성장 장내 융모의 표면. 동일한 프로토콜을 기반으로는 GFP E. 부착 상술 대장균 융모에 세포가 intervillus 공간에 살수 아래의 경우 배양 (그림 3B, 1 시간 대 72 시간)을 찾습니다 삼일 여러 microcolonies (그림 3A, 1 시간 대 72 시간)에 1 시간에 하나의 세포에서 성장 흐름 (40 μL /연동 형 변형의 존재 HR) (10 %, 0.15 Hz로).
도 1. 인간 굿 온칩 호스트 장내 마이크로 바이 공동 배양 microphysiological 시스템. (A)는 사진 (좌측) 및 2 채널의 개략도 (오른쪽), 창자 온칩 미세 유체 장치. 화살표는 배양액의 흐름의 방향 표시 (청색, 상부 마이크로을 적색, 하부 마이크로 채널). (B)의 용기 - 온 - 어 - 칩 호스트 장내 마이크로 바이 옴 공동 문화의 절차의 도식 다이어그램. 장 상피 세포가 융모 (~ 100 시간)을 형성 한 후, 세포 배양 배지에 재현 탁 균체 루멘 마이크로 (접종)에 도입 된 후, 배양액의 흐름 ~ 1.5 시간 (부착)이 정지된다. 균체 장내 융모의 선 단면에 부착 한 후, 흐름은 (주 재개 - 문화). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
창자 - 온 - 어 - 칩 장 융모 여러 프로 바이오 틱 박테리아의 그림 2. 공동 문화. (A)는 차등 간섭 대비 현미경은 장내 칩의 융모 사이에 성장하는 바이오 틱 박테리아 세포의 microcolony을 보여줍니다. 프로 바이오 틱 박테리아 세포의 microcolony (빨간색 화살표)를 보여주는 (B) (A)의 높은 전력 확대보기 (검은 점선 사각형). V, 융모; 스케일 바 = 20 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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비 병원성, GFP 표지 E. 그림 3. 공동 문화 창자 - 온 - 어 - 칩 장 융모와 대장균. (A) 오버레이 형광 및 DIC 현미경 이미지는 GFP E.의 식민지를 표시 한 72 시간에서 찍은 창자 - 온 - 어 - 칩에서 재배 장 융모에 대장균. (B) GFP 표지 E.의 성장을 도시 한도 1 및 72 시간에서 찍은 포개어 형광 공 초점 현미경의 고출력 확대보기 microcolony에 단일 셀 (빨간색 화살표)에서 대장균 (흰색 화살표). 블루, 핵; 마젠타, F 액틴; 스케일 바 = 30 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
호스트 마이크로 바이 옴의 상호 작용을 이해하는 것은 의학의 발전을 위해 중요하다; 균체 주로 시험 관내에서 포유 동물 세포를 자라다 때문에 플라스틱 접시 또는 정적 웰 플레이트에서 수행 기존의 세포 배양 모델 이상 1-2일 위해 장내 미생물 살아있는 인간의 장 세포의 안정적 공 배양을 지원하지 않는다. overgrowing 미생물 개체군 빠르게 연속적 심각 장 장벽 기능을 손상시키고 장내 상피 세포 사멸을 야기 대사성 폐기물 (예를 들면, 유기산)의 과잉 생산, 산소 및 영양분을 소비한다. 따라서, 영양소의 고갈을 일으키는 세균 과증식 미생물 노폐물의 축적을 방지하는 공동 배양에 미세 (주 일간) 장기간 가능한 호스트 마이크로 바이 공존 유지에 매우 중요하다.
하는 microphysiological을 이러한 문제를 극복하기 위해창자 온 - 칩 디바이스 5,8- 완전히 분화 된 인간의 장내 융모를 형성하고 시험 관내 장 루멘의 정상 상태 미세 환경을 유지하기 위해 개발되었다. 디자인과 기능 유닛 (예를 들면, 미세 유동 셀 챔버, 진공 구동 환상 변형) 미세 유체 소자 정확하게 미생물 공 배양 5 물리적 생리 화학적 미세 에뮬레이션 수정 거트 온 칩, 10. 장내 온칩 미세 배양에서 적용된 전단 응력은 인간 대장 5,13 내강의 흐름의 생리적 범위에 의해 결정 하였다. 호스트 미생물 공동 배양, 소화관 - 온 - 칩의 내강에 마이크로 미생물 집단의 "정상 상태"를 유지하는 것이 가능한 화학적 영양 조건을 지원하는데 중요하다. 장내 온칩 마이크로 시스템에서, 상기 인트라 내강 안정 상태를 추정 할 수있다 창자 온칩 measuri하여배지 및 미생물 세포 밀도의 pH 겨. 신선한 배지 연속 마이크로 흐른다 때문에 균체의 초기 접종 농도와 배지의 부피 유량을 최적화하는 경우, 미생물 모두 상피 세포 영양분 고갈을받지 않는다. 마이크로 채널을 통과 한 조정 배지 때문에 대사성 폐기물 (예를 들면, 유기산)뿐만 아니라 셀룰러 secretomes는 (예를 들어, 사이토 카인)가 연속적으로 공동으로부터 제거되는 한정된 체적 유량 (여기서는, 40 μL / 시간)에 유출 문화 미세. 따라서, 장 - 온 - 어 - 칩 장치의 생성을 용이하게 필요한 효과적으로 장 마이크로 채널의 루멘에서 바인드하거나 자란 균체를 세척하기에 충분한 정상 미세 가진 "연속 생물 반응기"로 간주 될 수있다 2~3일 내에서 안정적인 미생물 틈새.
중요한 FA가 있습니다장 융모의 미생물 세포의 성공적인 공동 문화에 대한 문제 해결로 간주합니다 ctors. 먼저, 미생물 부착 미생물 종에 따라 다를 수 있기 때문에 융모의 표면에 부착 균체에 필요한 최적의 배양 시간을 결정하는 것이 필요하다. 예를 들면, 락토 rhamnosus의 GG 5와 같은 바이오 틱 균은 일반적으로 부착 ~ 1.0-1.5 시간을 필요로하지만, 다른 미생물 종은 부착 동역학 (14)에 따라 시간이 짧은 (예를 들면 병원성 미생물)이 필요 이상있다. 과도한 균체 수가 안정된 안정 상태의 달성을 방해 할 수있는 공 배양의 초기 단계에서의 세균의 생장을 초래할 수 있기 때문에 둘째, 균체의 초기 접종 농도가 식별되어야한다. 이 시드 농도를 최적화하기 위해, antibi 타겟 미생물 균주의 성장 프로파일을 특성화하기 위해 권장다양한 파종 밀도에서 자유 - 귀 세포 배양 배지. 마지막으로, 체적 유량의 조정은 미생물의 종류에 따라 요구 될 수있다. 균체 매우 빠르게 증식하는 경우 예를 들어, 증가 된 유속이 필요하다. 이는 실험적으로 300 μL / 시간 (0.2 다인 / cm 2) 장벽 기능과 microengineered 융모 세포 형태를 손상하지 않는까지 그 유량을 확인 하였다 (데이터는 보이지 않음). 비록 유산균 rhamnosus의 GG 5, 장외 바이오 틱 혼합, VSL # 3, 비 병원성 실험실 균주 E. 대장균뿐만 아니라 병원성 E. 등 enteroinvasive 콜라이 균주 10 성공적 장내 온 칩의 장기 공동 배양에 적용하고, 여전히 병원성 감염성 미생물을 공생 장내 미생물에서 미생물 등의 다양한 테스트를 할 필요가있다. 체외 균체의 cultivability은 존재 또는 부재 하에서 고려되어야unculturable 장내 마이크로 바이 옴 양성의 테스트가 흥미로운 도전이다 공생과 진화의 맥락에서 숙주 세포. 마지막으로, 장 - 온 - 칩의 호기성 및 혐기성 세균의 공동 배양 강력한 프로토콜 앞으로 발견 될 위험 충족 할 필요가있다.
이러한 기본 장 상피 또는 크론 병 또는 대장 암과 같은 특정 위장관 질환을 개별 피험자에서 미분화 줄기 세포의 사용과 같은 추가 모델을 향상시키기 위해 수행 될 수있는 단계가있다; 또는 유도 만능 줄기 세포 (iPSCs). 인체에서 발견되는 다른 호스트 마이크로 바이 옴 생태계를 모방에 적용 할 수 있지만, 인간의 건강과 질병을 조율 인간 마이크로 바이 옴의 역할 급성장 관심을 가지고, 우리의 호스트 마이크로 바이 옴 공동 문화 방법은 엄청난 중요성과 잠재력을 가지고있다 (예를 들어, 구강 (15), 피부 (16), 또는 비뇨 생식기 tRACT (17)). 마지막으로, 공동 배양법은 신약 화합물의 생물학적 효능 및 독성 방법 장내 마이크로 바이 영향의 관점에서 예측 성을 개선함으로써 종래의 약물 개발 프로세스 혁신있다. 종합적으로, 창자 온칩 microphysiological 시스템은 호스트 마이크로 바이 생태계를 재구성하는데 사용될 수있는 안정된 정상 장내 미세 환경을 확립하기위한 강력한 플랫폼을 제공 할 수있다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) containing 25 mM glucose and 25 mM HEPES | Gibco | 10564-011 | Warm it up at 37 °C in a water bath. |
| Difco Lactobacilli MRS broth | BD | 288120 | Run autoclave at 121 °C for 15 min. |
| Poly(dimethylsiloxane) | Dow Corning | 3097358-1004 | 15:1 (w/w), PDMS : cureing agent |
| Caco-2BBE human colorectal carcinoma line | Harvard Digestive Disease Center | Human colorectal adenocarcinoma | |
| Heat-inactivated FBS | Gibco | 10082-147 | 20% (v/v) in DMEM |
| Penicillin-streptomycin-glutamine | Gibco | 10378-016 | 1/100 dilution in DMEM |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Molecular Probes | D1306 | Nuclei staining |
| Phalloidin-CF647 conjugate (25 units/ml) | Biotium | 00041 | F-actin staining |
| Flexcell FX-5000 tension system | Flexcell International Corporation | FX5K | Peristalsis-like stretcing motion (10% cell strain, 0.15 Hz frequency) |
| Inverted epifluorescence microscope | Zeiss | Axio Observer Z1 | Imaging, DIC |
| Scanning confocal microscope | Leica | DMI6000 | Imaging, Fluorescence |
| UVO Cleaner | Jelight Company Inc | 342 | Surface activation of the gut-chip |
| Type I collagen | Gibco | A10483-01 | Extracellular matrix component for cell culture into the chip |
| Matrigel | BD | 354234 | Extracellular matrix component for cell culture into the chip |
| 1 ml disposable syringe | BD | 309628 | Cell and media injection stuff |
| 25 G 5/8 needle | BD | 329651 | Cell and media injection stuff |
| Syringe pump | Braintree Scientific Inc. | BS-8000 | Injection equipment into the chip |
| VSL#3 | Sigma-Tau Pharmaceuticals | 7-45749-01782-6 | A formulation of 8 different commensal gut microbes |
| Reinforced Clostridial Medium | BD | 218081 | Anaerobic bacteria culture medium |
| GasPak EZ Anaerobe Container System with Indicator | BD | 260001 | Anaerobic gas generating sachet |
| 4% paraformaldehyde | Electron Microscopy Science | 157-4-100 | Fixing the cells for staining |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Permeabilizing the cells |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | Blocking agent for staining of the cells |
| Corona treater | Electro-Technic Products | BD-20AC | Plasma generator for fabrication of the chip |
| Steriflip | Millipore | SE1M003M00 | Degasing the complete culture medium |
| Disposable hemocytometer | iNCYTO | DHC-N01 | For manual cell counting |
References
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