Summary

Konkurrencedygtige Transplantationer at vurdere hæmatopoietisk stamcelletransplantation Fitness

Published: August 31, 2016
doi:

Summary

This protocol provides step-by-step guidelines for setting up competitive mouse bone marrow transplant experiments to study hematopoietic stem/progenitor cell function without prior purification of stem cells by cell sorting.

Abstract

The gold standard definition of a hematopoietic stem cell (HSC) is a cell that when transferred into an irradiated recipient will have the ability to reestablish blood cell production for the lifespan of the recipient. This protocol explains how to set up a functional assay to compare the HSC capacities of two different populations of cells, such as bone marrow from mice of two different genotypes, and how to analyze the recipient mice by flow cytometry. The protocol uses HSC equivalents rather than cell sorting for standardization and discusses the advantages and disadvantages of both approaches. We further discuss different variations to the basic protocol, including serial transplants, limiting dilution assays, homing assays and non-competitive transplants, including the advantages and preferred uses of these varied approaches. These assays are central for the study of HSC function and could be used not only for the investigation of fundamental HSC intrinsic aspects of biology but also for the development of preclinical assays for bone marrow transplant and HSC expansion in culture.

Introduction

Hæmatopoiese er en regenerativ proces, der sikrer påfyldning af blodlegemer, der er gået tabt gennem skade, stråling og celledød. Denne proces sikres ved hæmatopoietiske stamceller (HSC), der stort set er bosiddende i den voksne knoglemarven. Desuden kan hæmatopoietiske stamceller anvendes til terapeutiske formål i autoimmune sygdomme, hæmatologiske maligniteter og immundefekter 1. Der er derfor behov for bedre at forstå de mekanismer, der regulerer HSC funktion, herunder deres proliferative ekspansion og deres evne til at nå og indpode modtageren knoglemarv efter transplantation. Selv om de seneste undersøgelser har rapporteret adskillige celleoverflademarkører, herunder SLAM familiemedlemmer CD150 og CD48, til fremadrettet berige voksne HSC'er og føtale HSC'er til ca. 50% renhed 2-4, guldstandarden foranstaltning til funktionel HSC'er forbliver et in vivo repopulating assay til bestemme deres evne til at genetablere blod cell produktion i en bestrålet vært fem.

In vivo klonal repopulation assay blev oprindeligt udviklet af Till og McCulloch 6 og er siden blevet forfinet og udvidet. Som oprindeligt defineret, HSC'er sikre produktionen livslang blodlegemer gennem selvstændig fornyelse og differentiering. Overførslen af ​​HSC'er i en bestrålet recipient tillader således os at vurdere: deres evne til at differentiere gennem en analyse af de forskellige blodcellelinjer (T-lymfocytter, B-lymfocytter, granulocytter, monocytter) og deres evne til selvfornyelse via seriel transplantation. Analysen vil normalt indebære en sammenligning af funktionalitet og / eller mængden af to populationer af HSC'er, fx celler, der kommer fra to mus af forskellige genotyper eller celler, der er blevet behandlet eller ubehandlet med forskellige faktorer, der kan påvirke vedligeholdelse eller udvidelse af HSC'er i kultur. Donorkimærisme, eller bidrag overført donor HSC'er to blodlegemer kan derefter bestemmes ved hjælp af flowcytometri analyse i det perifere blod og knoglemarv under anvendelse celleoverflademarkører eller andre metoder, der vil skelne donorceller fra modtageren, eller vært. De mest anvendte markører er helt klart de to alleler for det gen Ptprc eller CD45 leukocyt antigen 7, som vi har valgt til eksempler nedenfor.

Den klonale repopulation analysen kan enten være konkurrencedygtige eller ikke-konkurrencedygtige. I en ikke-kompetitiv indstilling, er kontrol- og test- HSC'er overført til separate recipientmus og resultaterne for hver celletype vil være uafhængigt af den anden. I en konkurrencepræget indstilling, er funktionen af ​​både test og kontrol HSC'er målt mod en befolkning på konkurrent HSC'er. Den her beskrevne protokollen bruger den konkurrencemæssige indstilling, men kan også tilpasses til ikke-konkurrencesituationer. Begge metoder har deres fordele og begrænsninger, og vi vil sammenligne dem i detaljer idiskussion. Vi beskriver også forskellige strategier for at sikre lighed i antallet af transplanterede HSC'er, forklare, hvordan at tilpasse analysen til kvantificering af HSC'er ved at begrænse fortynding assay (LDA), og give eksempler på både vellykkede og mislykkede transplantationer for fortolkning af resultaterne.

Protocol

Alle procedurer, der er beskrevet i denne protokol er blevet godkendt af den institutionelle dyreetik udvalg og følger den canadiske Rådet om Animal Care retningslinjer. Bemærk: For at opretholde sterile / specifikke patogenfrie boligforhold, udføre alle procedurer, der involverer direkte håndtering af levende mus inde i et biologisk sikkerhedsskab eller en laminar flow hætte. Rens eller sterilisere bure, fastholdelsesanordninger, boliger materialer, chow og vand leveres til dyrene kor…

Representative Results

En generel beskrivelse af den konkurrencemæssige transplantation indstilling, herunder sekundære transplantationer (diskuteret yderligere nedenfor) kan findes i figur 1. Kan findes en repræsentativ analyse for pre-transplantation knoglemarv HSC'er i figur 2. Mere detaljerede oplysninger om udelukkelse af dubletter og døde celler kan findes andre steder 9. Figur 3</st…

Discussion

Den her beskrevne protokollen er designet til at evaluere den relative egnethed af donor (test) HSC'er mod kendt konkurrent HSC'er. Situationen for konkurrence øger den relative sensitivitet (mere tilbøjelige til at opdage moderate fald i stamceller fitness) og giver en intern teknisk kontrol for effekten af ​​bestråling og injektion. Det bør dog ikke anvendes som et absolut mål for HSC fitness; et fald i konkurrencemæssig rekonstituering betyder ikke automatisk, at HSC'er ikke ville klare sig godt…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi er taknemmelige for Roxann Hetu-Arbour for hjælp med figuren design og demonstration af procedurerne. Forskning i laboratoriet blev understøttet af en Transition pris fra Cole Foundation, Discovery give no. 419226-2012 fra naturvidenskab og teknik Forskningsråd of Canada (NSERC) og Canada Foundation for Innovation (CFI Leaders Fund give nr. 31377). KMH er en chercheur-Boursier Junior til Fonds de recherche du Québec – Santé (FRQS).

Materials

Microtainer tubes with K2EDTA BD Biosciences 365974
20G needle BD Syringe For blood sampling from the mandibular vein
LabQuake Shaker rotisserie Thermo  Scientific C415110 Any other rotating mixer will work as well to prevent coagulation of blood samples
Purified anti-mouse CD16/CD32 (clone 2.4G2, Fc Block) BD Biosciences 2.50 553142 Alternatively use clone 93 from eBioscience (cat # 14-0161) or Biolegend (cat# 101310) 
Pe-Cy7-conjugated anti-mouse CD3e (clone 145-2C11) eBioscience 0.25 25-0031 For most flow cytometry antibodies, the clone is important but the colours and companies can vary depending on the available equipment
PE-conjugated anti-mouse CD19 (clone 1D3) eBioscience 0.25 12-0193
APC-eFluor780 (APC-Cy7 equivalent)-conjugated anti-mouse GR1 (clone RB6-8C5) eBioscience 0.25 47-5931
FITC-conjugate anti-mouse CD45.1 (clone A20) eBioscience 2.50 11-0453
eFluor450-conjugated anti-mouse CD45.2 (clone 104) eBioscience 1.00 48-0454
Biotinylated anti-human/mouse CD45R (B220) (clone RA3-6B2) eBioscience 1.25 13-0452
Biotinylated anti-mouse CD3e (clone 145-2C11) eBioscience 1.25 13-0031
Biotinylated anti-mouse CD11b (clone M1/70) eBioscience 1.25 13-0112
Biotinylated anti-mouse GR1 (clone RB6-8C5) eBioscience 1.25 13-5931
Biotinylated anti-mouse TER119 (clone TER119) eBioscience 0.63 13-5921
V500 streptavidin BD Biosciences 0.50 561419
PE-conjugated anti-mouse CD117 (clone 2B8) BD Biosciences 0.25 553355
PE-Cy7-conjugated anti-mouse Ly6A/E (Sca1) (clone D7) BD Biosciences 0.25 558162
PerCP-eFluor710-conjugated anti-mouse CD135 (clone A2F10) eBioscience 0.50 46-1351
Alexa fluor 647-conjugated anti-mouse CD150 (clone TC15-12F12.2) Biolegend 0.63 115918 BD Biosciences and eBioscience do not carry the same clone
1ml tuberculin syringe with 27G needle BD Syringe 309623
1ml tuberculin syringe with 25G needle BD Syringe 309626
70 um cell strainer BD Falcon 352350

References

  1. Li, H. W., Sykes, M. Emerging concepts in haematopoietic cell transplantation. Nat Rev Immunol. 12 (6), 403-416 (2012).
  2. Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Terhorst, C., Morrison, S. J. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).
  3. Kim, I., He, S., Yilmaz, O. H., Kiel, M. J., Morrison, S. J. Enhanced purification of fetal liver hematopoietic stem cells using SLAM family receptors. Blood. 108 (2), 737-744 (2006).
  4. Mayle, A., Luo, M., Jeong, M., Goodell, M. A. Flow cytometry analysis of murine hematopoietic stem cells. Cytometry A. 83 (1), 27-37 (2013).
  5. Rossi, L., et al. Less Is More: Unveiling the Functional Core of Hematopoietic Stem Cells through Knockout Mice. Cell Stem Cell. 11 (3), 302-317 (2012).
  6. Till, J. E., McCulloch, E. A direct measurement of the radiation sensitivity of normal mouse bone marrow cells. Radiat Res. 14, 213-222 (1961).
  7. Shen, F. W., et al. Cloning of Ly-5 cDNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (21), 7360-7363 (1985).
  8. . Identification of GM mice. Laboratory Animals. 37 (suppl 1), 33-35 (2003).
  9. Rundberg Nilsson, A., Bryder, D., Pronk, C. J. H. Frequency determination of rare populations by flow cytometry: A hematopoietic stem cell perspective. Cytometry Part A. 83A (8), 721-727 (2013).
  10. Abidin, B. M., Owusu Kwarteng, E., Heinonen, K. M. Frizzled-6 Regulates Hematopoietic Stem/Progenitor Cell Survival and Self-Renewal. J Immunol. 195 (5), 2168-2176 (2015).
  11. Heinonen, K. M., Vanegas, J. R., Lew, D., Krosl, J., Perreault, C. Wnt4 enhances murine hematopoietic progenitor cell expansion through a planar cell polarity-like pathway. PLoS One. 6 (4), e19279 (2011).
  12. Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. J. SLAM family markers resolve functionally distinct subpopulations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors. Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).
  13. Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Anim (NY). 34 (9), 39-43 (2005).
  14. Santaguida, M., et al. JunB protects against myeloid malignancies by limiting hematopoietic stem cell proliferation and differentiation without affecting self-renewal. Cancer Cell. 15 (4), 341-352 (2009).
  15. Czechowicz, A., Kraft, D., Weissman, I. L., Bhattacharya, D. Efficient transplantation via antibody-based clearance of hematopoietic stem cell niches. Science. 318 (5854), 1296-1299 (2007).
  16. Zhang, C. C., Lodish, H. F. Murine hematopoietic stem cells change their surface phenotype during ex vivo expansion. Blood. 105 (11), 4314-4320 (2005).
  17. Benveniste, P., et al. Intermediate-Term Hematopoietic Stem Cells with Extended but Time-Limited Reconstitution Potential. Cell Stem Cell. 6 (1), 48-58 (2010).
  18. Fazekasde St Groth, B. The evaluation of limiting dilution assays. J Immunol Methods. 49 (2), R11-R23 (1982).
  19. Louis, I., Heinonen, K. M., Chagraoui, J., Vainio, S., Sauvageau, G., Perreault, C. The signaling protein Wnt4 enhances thymopoiesis and expands multipotent hematopoietic progenitors through beta-catenin-independent signaling. Immunity. 29 (1), 57-67 (2008).
  20. Cui, Y. Z., et al. Optimal protocol for total body irradiation for allogeneic bone marrow transplantation in mice. Bone Marrow Transplant. 30 (12), 843-849 (2002).
  21. Benz, C., et al. Hematopoietic Stem Cell Subtypes Expand Differentially during Development and Display Distinct Lymphopoietic Programs. Cell Stem Cell. 10 (3), 273-283 (2012).
  22. Eppert, K., et al. Stem cell gene expression programs influence clinical outcome in human leukemia. Nat Med. 17 (9), 1086-1093 (2011).
  23. McIntosh, B. E., et al. Nonirradiated NOD,B6.SCID Il2rgamma-/- Kit(W41/W41) (NBSGW) mice support multilineage engraftment of human hematopoietic cells. Stem Cell Reports. 4 (2), 171-180 (2015).

Play Video

Cite This Article
Kwarteng, E. O., Heinonen, K. M. Competitive Transplants to Evaluate Hematopoietic Stem Cell Fitness. J. Vis. Exp. (114), e54345, doi:10.3791/54345 (2016).

View Video