Introduction
Emopoiesi è un processo rigenerativo che assicura il rifornimento di cellule del sangue che sono state perse per infortunio, le radiazioni e la morte cellulare. Questo processo è garantita da cellule staminali ematopoietiche (HSC) che in gran parte si trovano nel midollo osseo. Inoltre, le cellule staminali ematopoietiche possono essere utilizzate a scopo terapeutico in malattie autoimmuni, neoplasie ematologiche e immunodeficienze 1. Vi è quindi la necessità di comprendere meglio i meccanismi che regolano la funzione HSC, tra cui la loro espansione proliferativa e la loro capacità di raggiungere e innestare il destinatario di midollo osseo dopo il trapianto. Anche se recenti studi hanno riportato diversi marcatori di superficie delle cellule, inclusi i membri della famiglia SLAM CD150 e CD48, per arricchire in modo prospettico CSE adulte e cellule staminali emopoietiche fetali di circa il 50% di purezza 2-4, la misura standard di riferimento per le CSE funzionale rimane un test in vivo ripopolamento a determinare la loro capacità di ristabilire sangue cproduzione ell in un host irradiato 5.
Il saggio ripopolamento clonale in vivo è stato inizialmente sviluppato da Till e McCulloch 6 e da allora è stata perfezionata e ampliata. Come originariamente definito, CSE garantire la produzione di globuli permanente attraverso l'auto-rinnovamento e la differenziazione. Il trasferimento di CSE in un destinatario irradiato permette quindi di valutare: la loro capacità di differenziare attraverso l'analisi delle diverse linee cellulari del sangue (linfociti T, linfociti B, granulociti, monociti) e la loro capacità di auto-rinnovamento attraverso il trapianto seriale. Il dosaggio di solito comporta il confronto della funzionalità e / o la quantità di due popolazioni di CSE, ad esempio, le cellule provenienti da due topi di differenti genotipi o cellule che sono state trattate o non trattate con differenti fattori che possono influenzare il mantenimento o l'espansione di CSE nella cultura. Donatore chimerismo, o il contributo di donatore di CSE trasferito to la produzione di globuli può quindi essere determinata mediante citometria di flusso analisi nel sangue periferico e nel midollo osseo utilizzando marcatori di superficie delle cellule o altri metodi che distinguerà cellule del donatore da parte del destinatario, o host. I marcatori più usati sono certamente i due alleli per il gene CD45 Ptprc o leucociti antigene 7 che abbiamo scelto per gli esempi forniti di seguito.
Il saggio ripopolamento clonale può essere competitivo o non competitiva. In un ambiente non competitivo, controllo e test CSE vengono trasferite in topi riceventi separati e il risultato per ogni tipo di cellula sarà indipendente dall'altro. In un ambiente competitivo, la funzione sia di prova e di controllo CSE è misurata contro una popolazione di concorrente CSE. Il protocollo qui descritto utilizza l'impostazione competitiva, ma può anche essere adattato per situazioni non competitivi. Entrambi gli approcci hanno i loro vantaggi e limitazioni, e li confronta in dettaglio neldiscussione. Abbiamo anche descrivere diversi approcci per garantire l'equità del numero di trapiantati CSE, è descritto come adattare il dosaggio per la quantificazione delle cellule staminali emopoietiche limitando test di diluizione (LDA), e fornire esempi di entrambi i trapianti di successo e insuccesso per l'interpretazione dei risultati.
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Protocol
Tutte le procedure descritte in questo protocollo sono stati approvati dal comitato etico degli animali istituzionale e seguire il Consiglio canadese sulle linee guida per la cura degli animali.
Nota: Per mantenere specifiche condizioni abitative sterili / esenti da organismi patogeni, di svolgere tutte le procedure che coinvolgono la gestione diretta di topi vivi all'interno di un armadio di sicurezza biologica o una cappa a flusso laminare. Pulire o sterilizzare gabbie, dispositivi di ritenuta, i materiali abitative, chow e acqua fornita agli animali in modo appropriato. Utilizzare aghi solo sterili, monouso per le iniezioni e per prelievi di sangue. tecnica asettica è di fondamentale importanza durante la preparazione del trapianto.
1. Preparazione di topi riceventi
- Identificare topi riceventi con tacche per le orecchie (o altro metodo approvato dal comitato etico locale animali 8) per consentire individuale follow-up di sangue e del midollo osseo periferico ricostituzione nel corso del tempo. Pesare i topi per la post-trapianto di follow-up. Noitopi riceventi e che sono tra i 7 e 12 settimane di età (meno di 25 g).
Nota: Nell'esempio fornito, topi riceventi CD45.1 + CD45.2 + sono stati allevati in casa attraversando C57Bl / 6 topi con topi B6.SJL congenic. - Irradiare topi riceventi con due dosi di 450 rad per distruggere l'attività ematopoietiche. Dare la prima dose il giorno prima del trapianto e la seconda 1-2 ore prima del trapianto.
Nota: i raggi X o raggi gamma possono essere entrambi utilizzati a seconda della disponibilità di strutture adeguate.
2. Preparazione di donatori e concorrente cellule del midollo osseo
- Euthanize donatore (prova e di controllo; CD45.2 +) e concorrente (CD45.1 +; B6.SJL) topi da CO 2 asfissia seguita da dislocazione cervicale o utilizzando metodi approvati dal comitato etico degli animali locale.
- Mettere i topi sulla schiena, le gambe spalancate, in una capsula di Petri vuota o su una garza sterile (per mantenere la superficie di lavoro pulita) iabitacolo di una cappa di sicurezza biologica. Bagnare la pelle e pelliccia con il 70% di etanolo / 30% H 2 O (v / v).
- Tagliare il piede con una lama chirurgica o forbici affilate. Tagliare aprire la pelle lungo la gamba e tirare via la pelle con pinze dentellate. Tagliare il muscolo in eccesso.
- Dislocare femore tirando l'osso della gamba e l'utilizzo di lame delle forbici contro le ossa pelviche come una forza contatore. Staccare tibia e femore dalla rotula e rimuovere i rimanenti pezzi di muscoli e tendini. Mettere le ossa in 2-3 ml di sterile tampone fosfato salino (PBS) in una piastra di coltura tissutale 6-bene.
- Raccogliere le cellule del midollo osseo da vampate di calore le ossa con 5 ml di PBS sterile.
- Tenere l'osso delicatamente con una pinza e inserire un ago 25 G attaccato ad una siringa riempita 1 ml di una estremità dell'osso. Premere il pistone e raccogliere le cellule in un tubo da 15 ml. Ripetere se necessario fino al centro dell'osso è bianco.
- Dissociare le cellule ripetuti passando attraverso l'ago perottenere una sospensione di cellule singole. Evitare di bolle e la forza in eccesso. Nota: utilizzare un ago leggermente più grande (22 G) per migliorare la vitalità cellulare in questa fase.
- Passare le cellule attraverso un colino in nylon 70 micron per garantire sospensione cellulare uniforme e per rimuovere i detriti e grumi.
- Rimuovere una aliquota per il conteggio delle cellule utilizzando un emocitometro. Centrifugare la sospensione cellulare restante a 200 xg per 5 minuti a 4 ° C. Regolare densità cellulare come richiesto in PBS sterile (10 8 cellule / ml). Mantenere le cellule in ghiaccio.
3. Stabilire donatore di cellule HSC equivalenti
- Trasferire l'equivalente di 3 x 10 6 celle (30 ml) in un 5 ml rotonde provetta di polistirene di fondo per citometria a flusso colorazione. Aggiungere un volume uguale di anticorpo marcato contro CD16 / CD32 per bloccare colorazione non specifica (diluito in tampone colorazione (PBS integrato con 0,1% di albumina sierica bovina (BSA) e 1 mM EDTA) per una concentrazione finale di 2,5 mg / ml). Incubare 5 minuti a temperatura ambiente.
- Aggiungere 90 ml master mix anticorpi coniugati a fluorocromi preparato in tampone colorazione: cocktail di Lineage biotinilato (B220, CD3e, CD11b, GR1, Ter119), Sca1, CD117, CD135, CD150. Incubare in ghiaccio per 30 minuti, al riparo dalla luce.
Nota: diluizioni adeguate dovrebbero essere determinati per ciascun lotto di anticorpi. Vedere la Tabella dei Materiali per diluizioni utilizzati in questo studio. - Aggiungere 2 ml di tampone colorazione alle cellule, vortex e centrifugare a 200 xg per 5 minuti a 4 ° C per rimuovere l'anticorpo non legato. Decantare il surnatante e risospendere pellet muovendo.
- Aggiungere 10 ml streptavidina coniugato a un fluorocromo diluito in buffer di colorazione (vedi Materiali Tavolo). Incubare in ghiaccio per 20 minuti, al riparo dalla luce. Lavare come al punto 3.3 per rimuovere streptavidina non legato.
- Acquisire i campioni di cellule utilizzando un citofluorimetro con almeno sei rilevatori 9. Determinare la frequenza di Lin - Sca1 + CD117 + CD135 - CD150
Nota: La frequenza delle cellule staminali emopoietiche funzionali all'interno di quella popolazione può essere stimato tra 1/3 e 1/5 2,12. - Stabilire equivalenti HSC stimati per tutti i campioni 11, utilizzando un campione (tipicamente, il concorrente, B6.SJL CD45.1 + in questo esempio) come linea di base come descritto di seguito e nella figura 2.
- Calcolare il numero di cellule necessarie utilizzando le seguenti formule:
#transplanted CSE / destinatario = 5 x 10 5 cellule x frequenza HSC stimato (come determinato per il campione di riferimento, questo numero è di solito tra il 75 e il 125 per tipo selvatico C57Bl 6 topi /) 10-12.
Nota: In figura 2, per il campione A, il risultato è 139 CSE.
# trapiantato cellule totali (per altri campioni; es campione B in figura 2) = # transFrequenza di CSE / HSC piantato.
Nota: In figura 2, per il campione B, il risultato è 197.826 (o circa 2 x 10 5) cellule totali del midollo osseo.
- Calcolare il numero di cellule necessarie utilizzando le seguenti formule:
- Calcolare il numero totale di cellule necessarie per destinatario trapianto per ogni campione utilizzando i risultati ottenuti in precedenza.
Nota: Questo numero dovrebbe essere di 5 x 10 5 per il campione di riferimento (concorrente).- Moltiplicare il numero ottenuto dalla fase 3.7 per il numero di topi riceventi e aggiungere abbastanza cellule per almeno due topi supplementari per compensare il volume morto nella siringa.
- Mescolare concorrente (ad esempio, CD45.1 +) e celle di prova (CD45.2 +) in rapporto 1: 1 equivalente HSC come calcolato al punto 3.6 e regolare il volume finale di 200 ml per iniezione utilizzando PBS sterile.
Nota: Per un gruppo di cinque topi riceventi il volume suggerito sarebbe quindi almeno 1.4 ml, contenente 3,5 x 10 cellule midollari 6 concorrenti (o973 CSE stimati per il campione A in figura 2), e il numero equivalente di celle di prova (in figura 2, l'equivalente per il campione B sarebbero 197.826 x 7 = 1,384,782 cellule del midollo osseo).
4. trapianti di midollo osseo
- Riscaldare i topi riceventi irradiati in fase di 1.2 con una lampada di calore rosso per garantire la dilatazione dei vasi sanguigni e di fare la coda laterale vene più visibile.
- Preparare una tubercolina siringa da 1 ml dotata di un ago G 27 (o inferiore). Aspirare circa 750 ml di sospensione cellulare preparato (per topi riceventi 3). Assicurarsi che non vi siano bolle d'aria nella siringa.
- Inserire il mouse in un dispositivo di ritenuta. Esaminate la coda e cercare le vene coda laterali che dovrebbero essere chiaramente visibili da entrambi i lati della coda. Pulire il sito di iniezione con etanolo. Inserire l'ago smussare up, parallelamente alla pelle e premere delicatamente lo stantuffo. L'iniezione deve essere facile. Se la forza è reRICHIESTO, l'ago non è in vena.
Nota: i topi anziani hanno la pelle più spessa, che può rendere trovare la vena più difficile. Se l'ago non è in vena, reinserire prossimale dell'ago al sito di iniezione iniziale. - Rimuovere l'ago e premere il sito di iniezione con una garza sterile per alcuni secondi per fermare l'emorragia. Trasferire il mouse in una gabbia pulita.
Nota: utilizzare la stessa siringa e l'ago per tre iniezioni, dopo di che l'ago potrebbe diventare troppo noioso. - Per post-trapianto di follow-up, iniettare 1 ml di PBS sterile per via sottocutanea per reidratare i topi per i primi cinque giorni. Aggiungere antibiotici nell'acqua potabile per prevenire le infezioni (se richiesto; opzionale). Pesare topi ogni due o tre giorni per le prime tre settimane e euthanize topi che hanno perso più del 15-20% del loro peso corporeo pre-trapianto (o come determinato dal comitato etico degli animali locale).
5. Analisi del sangue periferico
- Raccogliere una goccia di sangue (unpprox. 50-100 ml) in provette EDTA.
- Per raccogliere il sangue dalla vena mandibolare, usare una lancetta o un ago 22 G per forare la pelle del viso vicino al punto senza pelo si trova sotto la mandibola e posizionare il tubo di raccolta per ricevere la goccia di sangue 13. Prelevare il sangue a 4, 8, 12 e 16 settimane dopo il trapianto di seguire multi-lignaggio ricostituzione.
- Aggiungere 1 ml appena preparato RT buffer di lisi dei globuli rossi (9 parti 0,16 M NH 4 Cl + 1 parte di 0,17 M Tris-HCl pH 7,65) alla goccia di sangue raccolto nella fase 5.1.1. Mescolare e campione di trasferirli in una provetta di polistirene da 5 ml a fondo rotondo adatto per citometria a flusso. Lasciate riposare per 4 minuti a temperatura ambiente.
- Aggiungere 4 volumi di PBS ghiacciato. Mescolare ruotando end-to-end e trasferire immediatamente in ghiaccio. Centrifugare 10 min a 200 xg a 4 ° C.
- Decantare il surnatante e risospendere pellet muovendo. Surnatante deve essere chiaro e rosso. Aggiungere 2 ml di colorazione tampone e vortex brevemente. Centrifugare 5 min a 200 XGAt 4 ° C.
- Decantare il surnatante e risospendere pellet muovendo.
- Procedere con citometria a flusso colorazione utilizzando il protocollo generale descritto nei passaggi da 3.1 a 3.3 e seguenti anticorpi per il master mix: CD45.1, CD45.2, CD3e, CD19, GR1.
- Acquisire i campioni di cellule utilizzando un citofluorimetro con almeno sei rilevatori 9. Determinare la frequenza di cellule del donatore-derivato per ogni lignaggio (linfociti CD19 + B, linfociti T CD3e, GR1 granulociti luminosi) in ogni campione utilizzando il modello di analisi fornito in figura 3 e come pubblicato 10,11.
6. Analisi del midollo osseo Ricostituzione
- Raccogliere cellule del midollo osseo come descritto nella sezione 2. Stain le cellule per l'analisi di citometria a flusso utilizzando il protocollo generale descritto nei passaggi da 3.1 a 3.3 e seguenti anticorpi per il master mix: Lineage cocktail, Sca1, CD117, CD135, CD150, CD45.1 , CD45.2. Rileva linanticorpi cocktail EAGE utilizzando streptavidina coniugato a un fluorocromo come descritto al punto 3.4.
- Acquisire campioni di cellule utilizzando un citofluorimetro con almeno otto rilevatori 9. Se solo sei sono disponibili, aggiungere CD135 sullo stesso canale come pannello lignaggio come verranno esclusi cellule CD135 +. Determinare la frequenza di Lin donatore-derivati - Sca1 + CD117 + CD135 - CD150 + cellule staminali emopoietiche in ogni campione utilizzando il modello di analisi fornito nella figura 4 e come pubblicato 10.
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Representative Results
Una descrizione generale della trapiantati competitivo, compresi i trapianti secondari (discussi più avanti) può essere trovato in Figura 1. Un'analisi rappresentativo per pre-trapianto di midollo osseo CSE può essere trovato in figura 2. Informazioni più dettagliate sulla esclusione di doppietti e le cellule morte possono essere trovati altrove 9.
Figure 3 e 4 forniscono esempi di citometria a flusso modelli di analisi per il sangue periferico e nel midollo osseo, rispettivamente. È normale per rilevare alcuni linfociti T ospitante (fino al 20% di tutte le cellule T; la figura 3B), come le cellule T sono più radio-resistenti. cellule concorrente-derivati dovrebbero essere presenti in tutte e tre le linee. Il limite di rivelazione dipende molto dal numero di cellule totali acquisite per l'analisi, ma nella nostra esperienza un totale di 20 mila cellule all'interno dellasingola porta leucocitaria è in genere sufficiente. Utilizzando una soglia arbitraria di 1% o 0,5%, se le cellule donatrici rappresentano una percentuale inferiore al cutoff in un dato lineage (B linfoide, T linfoide o mieloide come mostrato in figura 3), il mouse non è considerato positivo per la ricostituzione multilineage . Questo concetto diventa importante quando i trapianti competitivi sono combinati con un saggio di diluizione limitante per quantificare CSE donatori come spiegato nella discussione. E 'certamente possibile avere, per esempio, T e B linfociti del donatore-derivato, ma graduale perdita di cellule mieloidi, che di solito suggerire la ricostituzione solo transitoria. I linfociti hanno emivita più lunga rispetto alle cellule mieloidi (in particolare Gr1hi SSChi granulociti neutrofili /) e può persistere anche in assenza di midollo osseo cellule staminali emopoietiche 10.
Figura 5 illustra i risultati rappresentativi per periferiche chimerismo nel sangue sotto diversi situzioni. Quando CSE donatori sono funzionalmente equivalenti alle cellule concorrenti, le proporzioni del donatore (CD45.2 +) e concorrente (CD45.1 +), le cellule -derived sono equivalenti (Figura 5A). Le cellule ospiti residue (CD45.1 + CD45.2 +) nella Figura 5A e 5B sono quasi esclusivamente i linfociti T in quanto sono più radio-resistenti. Quando le cellule donatrici presentano una percentuale molto bassa di leucociti del sangue periferico (Figura 5B), alcuni aspetti della funzione HSC probabilmente difettoso e sono necessari ulteriori studi come descritto nella discussione. La presenza di cellule concorrenti conferma che il saggio funzionava bene ma midollo osseo del donatore era semplicemente meno efficace. Questo è in contrasto con il risultato illustrato nella figura 5C, dove entrambe le cellule del donatore e concorrente sono presenti in numero e cellule ospiti partire rappresentano la maggior parte delle cellule del sangue periferico. In questo caso il trapianto ha avuto successo ed it non è possibile trarre conclusioni in merito alla relativa funzionalità del donatore contro cellule concorrenti. Diverse soluzioni sono discusse più avanti.
. Figura 1. Disegno sperimentale (A) per un trapianto competitivo, cellule del midollo osseo di topi donatori (+ CD45.2; C57BL6 sfondo, controllo e test) topi e concorrente congenic (CD45.1 +; B6.SJL) vengono miscelati in un rapporto 1: 1 e iniettato nella vena della coda di topi riceventi irradiati (CD45.1 + CD45.2 +; F1 progenie di C57Bl6 x coppie nidificanti B6.SJL). L'efficacia di ricostituzione del midollo osseo è determinato nel sangue periferico (PB) a 4, 8, 12 e 16 settimane dopo il trapianto e nel midollo osseo a 16 settimane dopo il trapianto o successiva. (B) Per valutare ulteriormente l'auto-rinnovamento delle cellule trapiantate, boncellule del midollo e recuperati dai pazienti sottoposti a trapianto dopo 16 settimane possono essere trasferite in topi riceventi secondarie irradiati. HSC, cellule staminali ematopoietiche; MPP, cellule progenitrici multipotenti; LMPP, MPP linfoide-innescato. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Pre-trapianto di midollo osseo HSC modello di analisi. All'interno di singole cellule, selezionare HSPCs secondo il CKIT (CD117) e l'espressione Lineage. All'interno del dim / Lin - popolazione cellulare, selezionare il CKIT luminoso Sca1 + popolazione (TSS). All'interno LSKs, selezionare CD150 + CD135 - CSE. Questa popolazione contiene sia a lungo termine ea breve termine ripopolamento HSC (la frequenza di una cellula ripopolamento all'interno di questa popolazione è esseretween 1/3 e 1/5). La frequenza stimata di midollo osseo cellule staminali emopoietiche è calcolato dividendo il numero di eventi nella porta HSC per il numero di eventi nella porta singola cella. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. post-trapianto modello di analisi del sangue periferico. (A) all'interno delle singole celle, selezionare primi GR1 luminose granulociti hi SSC. (B) Selezionare quindi CD19 + CD3e - linfociti B e CD3e + CD19 - linfociti T. sangue periferico mouse contiene una grande percentuale di linfociti, con i linfociti B sono i principali tipi di cellule (circa 50% tutte le cellule del sangue periferico). CE) Disegnare flusso 2D citometria trame per ogni sottogruppo con CD45.2 a un asse e CD45.1 dall'altro. Identificare donatore (CD45.2 +), host (CD45.1 + CD45.2 +) e cellule concorrente (CD45.1 +) per ogni lignaggio, come mostrato. E 'normale avere qualche cellule ospiti restanti, in particolare nella popolazione di linfociti T come si vede nella pannello E. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. post-trapianto modello di analisi del midollo osseo HSC. All'interno di singole cellule, selezionare HSPCs e LSKs come mostrato in Figura 2. Entro LSKs, selezionare CD150 + CD135- HSC, CD150- CD135- progenitori multipotenti (o MPP) e CD150- CD135 + linfoide MPPs -primed (o LMPPs). La proporzione di LMPPs è inferiore dopo trapianto rispetto ai topi non irradiate. Disegna 2D flusso cytometry trame per ogni sottoinsieme con CD45.2 su un asse e CD45.1 dall'altro. Identificare donatore, host e celle concorrente per ciascuna sottopopolazione come illustrato. Se l'irraggiamento e trapianto sono di successo, ci dovrebbe essere molto pochi HSPCs ospitanti rimasti. Fai clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5. Risultati rappresentativi per periferiche chimerismo nel sangue. (A) trapianto di successo in cui donatore cellule staminali emopoietiche sono funzionalmente equivalenti alle cellule concorrenti. La stragrande maggioranza delle cellule ospiti rimanenti (+ CD45.1 CD45.2 +) è di solito linfociti T. (B) trapianto di successo in cui la funzione dei donatori CSE spettacolo è diminuito rispetto alle cellule concorrenti. Questa diminuzione contributo può essere a causa disaranno necessari diversi fattori e ulteriori analisi (vedi la discussione). (C) trapianto riuscito a basse frequenze di entrambi concorrente e cellule del donatore e una grande proporzione di cellule ospiti rimanenti. Questo tipo di risultato suggerisce valori inferiori alle dosi previsto di irradiazione, iniezione senza successo (diminuita vitalità cellulare, è diminuito il volume di iniezione, iniezione di fuori della vena della coda), o una combinazione di questi. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura .
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Discussion
Il protocollo qui descritto è stato progettato per valutare l'idoneità relativa del donatore (test) HSC contro concorrente noto CSE. La situazione di concorrenza aumenta la sensibilità relativa del test (più probabile per rilevare diminuzioni modeste palestra cellule staminali) e fornisce un controllo tecnico interno per l'efficacia di irradiazione e iniezione. Tuttavia, non dovrebbe essere usato come una misura assoluta di HTS fitness; una diminuzione della ricostituzione competitivo non significa automaticamente che il CSE non si comporta bene in assenza di concorrenza. Anche se si può sostenere che un ambiente competitivo è il punto di partenza migliore, come le cellule concorrenti potranno salvare difettoso funzione HSC e tutti i topi riceventi sopravviverà, si dovrebbe fare attenzione con l'interpretazione dei risultati. Confermando i risultati in un ambiente non competitivo rafforzerà le conclusioni.
Il disegno sperimentale qui presentata utilizza HSC equivalente quantities di cellule totali del midollo osseo, invece di popolazioni pure di citometria a flusso CSE -sorted. E 'importante per equalizzare il numero di HSC in tutte le popolazioni in studio (diversi donatori, concorrente) eliminare variabilità tra i diversi donatori e garantire che variazioni di frequenza HSC fenotipica non saranno interpretati come alterazioni nella funzione HSC 14. I vantaggi del metodo descritto qui sopra CSE purificati sono: migliore vitalità cellulare a causa di tempi di lavorazione più brevi e mancanza di pressione esterna di cernita; perfezionata homing al destinatario midollo osseo (la presenza di anticorpi sulle cellule filtrate può interferire con il loro attecchimento nel midollo osseo 15). Viceversa, lo svantaggio principale è il contributo di popolazioni non HSC all'esito trapianto, in particolare il ruolo delle cellule progenitrici di breve durata in punti temporali iniziali dopo il trapianto. Inoltre, se il trattamento o la modificazione genetica altera l'espressione di surface marcatori utilizzati per la selezione di CSE 16, ci può essere un numero significativo di CSE "mascherato" in un campione, ma non in un altro, che influenzeranno i risultati. Tuttavia, lo stesso problema può verificarsi anche quando si utilizzano CSE purificati ed è inerente al dosaggio trapianto.
I risultati ottenuti con il presente protocollo sono solo qualitativi a livello di popolazione. In altre parole, un minor apporto di cellule del donatore dopo il trapianto potrebbe essere dovuto; un minor numero di CSE funzionali nella popolazione iniziale; una ridotta capacità dei singoli HSC a stabilirsi nel midollo osseo ed espandere nei primi giorni e settimane dopo il trapianto; o problemi di differenziazione e la crescita in cellule mature che vengono utilizzati per il rilevamento in periferia. E 'quindi importante non utilizzare i risultati da un trapianto competitiva in isolamento, ma di integrarle con test che misura la proliferazione cellulare, la sopravvivenza e la differenziazione da HSC di circolazione delle cellule del sangue. E 'anche importante confrontare contributo cellula donatrice tra sangue periferico (figura 3) e del midollo osseo (Figura 4) Presenza di CSE derivati dal donatore nel midollo osseo combinata con l'assenza di cellule donatrici nel sangue periferico sarebbe indicativa di un blocco di differenziazione . Sebbene non mostrato nell'esempio, è anche possibile valutare eritroide ricostituzione basato su diverse isoforme di GPI1 17. Dato l'elevato numero di eritrociti presenti nel sangue, rappresentano un metodo altamente sensibile di rilevazione per cellule derivate dal donatore, che possono essere particolarmente utili quando il trapianto basso numero di CSE o dopo la loro uscita per lunghi periodi di tempo. All'altra estremità dello spettro, cellule mieloidi sono spesso i primi a fallire essere scoperti, in parte a causa della loro bassa frequenza nel sangue periferico e in parte a causa della loro breve emivita.
È possibile adattare thtest e ripopolamento competitivo per consentire la quantificazione delle cellule staminali emopoietiche usando il saggio di diluizione limitante (o LDA). Ciò richiederà un numero molto maggiore di topi riceventi divisi in diversi gruppi in cui ogni gruppo riceve un diverso rapporto di concorrente: cellule del donatore, sia ordinati o non ordinati come descritto sopra. Poiché il numero di cellule del donatore diminuisce, ci saranno più topi in cui la proporzione di cellule derivate dal donatore non raggiunge la soglia prefissata in una o più linee. È allora possibile tracciare la frequenza di topi "negativo" per gruppo rispetto al numero di cellule donatrici trapiantate e determinare la frequenza del CSE dal grafico che segue 18,19.
La durata suggerito di post-trapianto follow-up varia in letteratura. C'era certo consenso in cui il periodo di 16 settimane dopo il trapianto è stato ritenuto sufficiente per riflettere l'uscita di lungo termine CSE. Tuttavia, recenti segnalazioni di "intermediate "HSC cui funzione declina poco dopo 16 settimane hanno sottolineato la necessità di una valutazione ancora più rigorosa della funzione HSC 17. E 'certamente possibile estendere il follow-up dei pazienti trapiantati oltre il punto in tempo 16 settimane per soddisfare queste preoccupazioni. Un un'opzione alternativa, ancora una volta con una sensibilità senza dubbio più alto, è il trapianto secondario (Figura 1B), in cui le cellule del midollo osseo recuperati dai destinatari primo trapianto vengono iniettati nel destinatari secondari irradiati. il secondo trapianto mette ulteriore pressione proliferativa sul CSE, costringendo la loro uscita da dormienza e consentendo solo cellule con robusta automantenimento per mantenere la loro produzione. a volte è preferibile utilizzare cellule del donatore ordinati per regolare meglio numeri HSC tra diversi campioni per i trapianti secondarie. in alternativa, è possibile stabilire un rapporto approssimativo di donatore : CSE concorrente dal midollo osseo primario (ad esempio,
Come accennato in precedenza, ci sono una serie di motivi per cui una data popolazione di donatori CSE può mostrare diminuita capacità di ricostituzione a lungo termine. Uno di questi motivi è la capacità delle cellule staminali emopoietiche di migrare verso il midollo osseo dopo il trapianto (chiamato anche homing) e si stabilirsi nella nicchia midollo osseo. È possibile adattare il protocollo qui presentato per indagare midollo osseo homing ed espansione a breve termine. È necessario aumentare il numero delle cellule trapiantate (l'equivalente di 5.000-10.000 CSE perhoming saggi e 1000-2000 CSE per l'analisi entro la prima settimana dopo il trapianto). Nel saggio di homing, topi riceventi sono eutanasia entro il primo 16-24 ore dopo il trapianto e il numero di donatori CSE che hanno raggiunto il midollo osseo viene determinato come spiegato nel presente protocollo. Per valutare ulteriormente la loro funzione, le cellule del midollo osseo recuperati dai beneficiari a breve termine possono essere trapiantate in destinatari secondari come spiegato nella Figura 1B. La percentuale di cellule del donatore-derivato direttamente al destinatario secondario può quindi essere utilizzato per valutare la capacità dei donatori CSE di migrare e stabilirsi nel ricevente del midollo osseo.
I principali problemi con i trapianti di midollo osseo competitivi derivano da irradiazione e di iniezione e si presentano come sia un aumento della mortalità post-trapianto o diminuita efficienza ricostituzione. irradiazione Split-dosi, come qui presentata, è di solito associata con mieloablazione più efficienti emeno tossicità se confrontato con dose singola 20. Con la dose raccomandata qui (due volte 450 RADS), le popolazioni linfoidi mieloidi e B sono efficacemente eliminati, ma i linfociti T residui fanno rimanere (Figura 3). Se non vi è alcun motivo di sospettare rigetto (topi donatori e beneficiari provenienti da diversi background genetico), una dose maggiore di irradiazione (due dosi di 550-600 rad) e un ritardo più breve tra le due dosi (4 ore anziché il giorno successivo ) dovrebbe contribuire ad eliminare i linfociti T residue e diminuire la possibilità di fallimento del trapianto a causa di rifiuto. iniezione non corretto, o l'iniezione nello spazio perivascolare invece della vena della coda, i problemi con la vitalità delle cellule del donatore, o la contaminazione delle cellule del donatore a causa della mancanza di attenzione durante la preparazione del campione aumenterà anche il fallimento del trapianto e la mortalità post-trapianto. irradiazione inefficiente (per problemi tecnici, per esempio) provocherà efficienza ricostituzione diminuito ma non dovrebbe aumentare mortality. In tutte queste situazioni, la presenza di cellule concorrenti nel test aiuta a dissociare i problemi tecnici (come dettagliato qui) da una diminuzione buona fede del donatore funzione HSC come le cellule concorrente dovrebbero sempre essere in grado di ricostituire il destinatario irradiato. Host immunodeficienti possono anche essere usati, per esempio, per ridurre la necessità di irraggiamento e / o rischio di rigetto, e per valutare la funzione di CSE umana 21-23.
In conclusione, vi presentiamo qui un protocollo di trapianto competitivo che può essere adattato per diversi usi diversi come descritto nella discussione. Il nostro approccio utilizza equivalenti HSC, che diminuisce i tempi di lavorazione e migliora simultaneamente vitalità cellulare nell'innesto rispetto a separazione delle cellule. E 'anche una soluzione pratica quando l'accesso a un cell sorter è limitato, e richiede meno topi rispetto al dosaggio quantitativo LDA, rendendolo un interessante punto di partenza per l'analisi della funzione HSC. </ P>
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Acknowledgments
Siamo grati a Roxann Hétu-Arbour per l'assistenza con il disegno figura e dimostrazione delle procedure. La ricerca in laboratorio è stato sostenuto da un premio di transizione dalla Fondazione Cole, Discovery concedere alcuna. 419226-2012 dalle scienze naturali e ingegneria Research Council del Canada (NSERC) e il Canada Foundation for Innovation (leader CFI Fondo concedere n. 31377). KMH è una Junior Chercheur-Boursier per il Fonds de recherche du Québec - Santé (FRQS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microtainer tubes with K2EDTA | BD Biosciences | 365974 | |
| 20 G needle | BD Syringe | For blood sampling from the mandibular vein | |
| LabQuake Shaker rotisserie | Thermo Scientific | C415110 | |
| Purified anti-mouse CD16/CD32 (clone 2.4G2, Fc Block) | BD Biosciences | 553142 | 2.50 μg/ml |
| Pe-Cy7-conjugated anti-mouse CD3e (clone 145-2C11) | eBioscience | 25-0031 | 0.25 μg/ml |
| PE-conjugated anti-mouse CD19 (clone 1D3) | eBioscience | 12-0193 | 0.25 μg/ml |
| APC-eFluor780 (APC-Cy7 equivalent)-conjugated anti-mouse GR1 (clone RB6-8C5) | eBioscience | 47-5931 | 0.25 μg/ml |
| FITC-conjugate anti-mouse CD45.1 (clone A20) | eBioscience | 11-0453 | 2.50 μg/ml |
| eFluor450-conjugated anti-mouse CD45.2 (clone 104) | eBioscience | 48-0454 | 1.00 μg/ml |
| Biotinylated anti-human/mouse CD45R (B220) (clone RA3-6B2) | eBioscience | 13-0452 | 1.25 μg/ml |
| Biotinylated anti-mouse CD3e (clone 145-2C11) | eBioscience | 13-0031 | 1.25 μg/ml |
| Biotinylated anti-mouse CD11b (clone M1/70) | eBioscience | 13-0112 | 1.25 μg/ml |
| Biotinylated anti-mouse GR1 (clone RB6-8C5) | eBioscience | 13-5931 | 1.25 μg/ml |
| Biotinylated anti-mouse TER119 (clone TER119) | eBioscience | 13-5921 | 0.625 μg/ml |
| V500 streptavidin | BD Biosciences | 56149 | 0.5 μg/ml |
| PE-conjugated anti-mouse CD117 (clone 2B8) | BD Biosciences | 553355 | 0.25 μg/ml |
| PE-Cy7-conjugated anti-mouse Ly6A/E (Sca1) (clone D7) | BD Biosciences | 558162 | 0.25 μg/ml |
| PerCP-eFluor710-conjugated anti-mouse CD135 (clone A2F10) | eBioscience | 46-1351 | 0.5 μg/ml |
| Alexa fluor 647-conjugated anti-mouse CD150 (clone TC15-12F12.2) | Biolegend | 115918 | 0.625 μg/ml BD Biosciences and eBioscience do not carry the same clone |
| 1 ml tuberculin syringe with 27 G needle | BD Syringe | 309623 | |
| 1 ml tuberculin syringe with 25 G needle | BD Syringe | 309626 | |
| 70 μm cell strainer | BD Falcon | 352350 |
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