Introduction
تكون الدم هو عملية التجدد الذي يضمن يشير استكمال خلايا الدم التي فقدت بسبب الاصابة، والإشعاع وموت الخلايا. وتكفل هذه العملية عن طريق الخلايا الجذعية المكونة للدم (شهادة الثانوية العامة) الموجودة إلى حد كبير في نخاع العظام الكبار. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الخلايا الجذعية المكونة للدم يمكن أن تستخدم لأغراض علاجية في اضطرابات المناعة الذاتية، والأورام الخبيثة الدموية ونقص المناعة 1. وبالتالي فإن هناك حاجة إلى فهم أفضل للآليات التي تنظم وظيفة شهادة الثانوية العامة، بما في ذلك توسيع التكاثري، وقدرتها على الوصول إلى وتدبر نخاع العظام المتلقي بعد زرع. على الرغم من أن الدراسات التي أجريت مؤخرا وأفادت العديد من علامات سطح الخلية، بما في ذلك أفراد الأسرة SLAM CD150 وCD48، لإثراء مستقبلي HSCs الكبار وHSCs الجنين إلى ما يقرب من 50٪ نقاء 2-4، وقياس معيار الذهب للHSCs وظيفي لا يزال مقايسة في الجسم الحي إعادة إسكانها ل تحديد قدرتها على إعادة بناء الدم جإنتاج الذراع في مضيف المشع 5.
وقد وضعت في الجسم الحي نسيلي إعادة إسكانها فحص البداية حتى ومكولوتش 6 ومنذ ذلك الحين تم تنقيح وتوسيع نطاقها. كما هو محدد في الأصل، HSCs ضمان مدى الحياة إنتاج خلايا الدم من خلال تجديد الذات والتمايز. نقل HSCs إلى مستلم المشع مما يسمح لنا بتقييم: قدرتهم على التمييز من خلال تحليل مختلف الأنساب خلايا الدم (الخلايا اللمفية تي، الخلايا الليمفاوية B، المحببة، وحيدات) وقدرتها على التجديد الذاتي من خلال زرع التسلسلي. ان الفحص عادة ما تنطوي على المقارنة بين وظيفة و / أو كمية من اثنين من السكان من HSCs، على سبيل المثال، خلايا القادمة من اثنين من الفئران من المورثات أو الخلايا المختلفة التي تم التعامل أو غير المعالجة مع العوامل المختلفة التي يمكن أن تؤثر على صيانة أو توسعة HSCs في الثقافة. الخيمرية المانحة، أو مساهمة نقل المانحة HSCs رس إنتاج خلايا الدم ومن ثم يمكن تحديدها من قبل تحليل التدفق الخلوي في الدم المحيطي ونخاع العظام باستخدام علامات سطح الخلية أو وسائل أخرى من شأنها أن تميز الخلايا المانحة من المتلقي، أو المضيف. علامات الأكثر استخداما على نطاق واسع هي بالتأكيد الاليلين لجين Ptprc أو مستضد CD45 الكريات البيض 7 الذي اخترناه لالأمثلة الواردة أدناه.
وإعادة تعمير فحص نسيلي يمكن أن تكون تنافسية أو غير تنافسية. في وضع غير تنافسي، يتم نقل السيطرة واختبار HSCs في الفئران المتلقي منفصلة وستكون النتيجة لكل نوع من الخلايا أن يكون مستقلا عن الآخر. في وضع تنافسي، ويتم قياس وظيفة كل من اختبار ومراقبة HSCs ضد السكان من منافس HSCs. بروتوكول الموصوفة هنا يستخدم الإعداد تنافسية ولكن يمكن أيضا أن تتكيف لحالات غير تنافسية. كلا النهجين لها مزاياها وحدودها، ونحن سوف مقارنتها بالتفصيل فينقاش. نحن أيضا وصف أساليب مختلفة لضمان العدالة في عدد من HSCs المزروعة، وشرح كيفية التكيف مع الفحص لتقدير حجم HSCs من فحص تخفيف الحد (LDA)، وتقديم أمثلة على كل من زرع الناجحة وغير الناجحة لتفسير النتائج.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد تمت الموافقة على جميع الإجراءات الموضحة في هذا البروتوكول من قبل لجنة الأخلاق الحيوان المؤسسية ويتبع المجلس الكندي بشأن المبادئ التوجيهية رعاية الحيوان.
ملاحظة: للحفاظ على ظروف خالية من مسببات الأمراض معقمة / محددة الإسكان، وإجراء جميع الإجراءات التي تنطوي على التعامل المباشر من الفئران الحية داخل مجلس الوزراء السلامة البيولوجية أو غطاء تدفق الصفحي. نظيفة أو تعقيم أقفاص، وأجهزة الزجرية، المواد الإسكان، طعام والمياه المقدمة للحيوانات بشكل مناسب. استخدم فقط العقيمة، والإبر المتاح للحقن ولأخذ عينات الدم. العقيم تقنية حاسمة خلال إعداد والكسب غير المشروع.
1. إعداد الفئران مستلم
- تحديد الفئران المتلقي مع الشقوق الأذن (أو أي طريقة أخرى وافقت عليها لجنة أخلاقيات الحيوان المحلية 8) لتمكين الأفراد متابعة الطرفية الدم ونخاع العظام إعادة بمرور الوقت. وزن الفئران لمرحلة ما بعد الزرع المتابعة. لناالفئران مستلم البريد التي هي ما بين 7 و 12 أسابيع من العمر (أقل من 25 غراما).
ملاحظة: في المثال المقدمة، كانت ولدت CD45.1 + CD45.2 + الفئران المتلقي في المنزل عن طريق عبور C57BL / 6 الفئران مع الفئران B6.SJL مسانج. - أشرق الفئران المتلقي مع جرعتين من 450 راد لتدمير النشاط للدم. إعطاء الجرعة الأولى قبل يوم واحد زرع والثانية 1-2 ساعة قبل الزرع.
ملاحظة: يمكن للأشعة السينية أو أشعة غاما على حد سواء استخدامها تبعا لتوافر المرافق المناسبة.
2. إعداد المانحة والمنافس خلايا نخاع العظام
- الموت ببطء المانحة (الاختبار والمراقبة؛ CD45.2 +) ومنافس (CD45.1 +. B6.SJL) الفئران عن طريق CO 2 الخنق تليها خلع عنق الرحم أو باستخدام الطرق المعتمدة من قبل لجنة الأخلاق الحيوانية المحلية.
- وضع الفئران على عودتهم والساقين مفتوح على مصراعيه، في طبق بتري فارغة أو على شاش معقم (للحفاظ على سطح العمل النظيفة) طnside خزانة السلامة البيولوجية. الرطب الجلد والفراء مع الايثانول 70٪ / 30٪ H 2 O (ت / ت).
- قطع القدم مع شفرة جراحية أو مقص حاد. خفض فتح الجلد على طول الساق والانسحاب بعيدا الجلد باستخدام ملقط مسنن. قطع العضلات الزائدة.
- خلخل عظم الفخذ من خلال سحب على عظم الساق واستخدام شفرات مقص ضد عظام الحوض كقوة مضادة. فصل الساق والفخذ من الرضفة وإزالة البتات المتبقية من العضلات والأوتار. وضع العظام في 2-3 العقيمة مل الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) في 6 جيدا وحة زراعة الأنسجة.
- جمع خلايا نخاع العظام عن طريق تنظيف العظام مع 5 مل العقيمة برنامج تلفزيوني.
- عقد العظام بلطف مع ملقط وادخال ابرة 25 G تعلق على شغل حقنة 1 مل إلى واحدة من نهاية العظام. اضغط على المكبس وجمع الخلايا في 15 مل أنبوب مخروطي الشكل. كرر حسب الحاجة حتى وسط العظام هو الأبيض.
- فصل الخلايا عن طريق تكرار يمر من خلال إبرة لالحصول على تعليق خلية واحدة. تجنب فقاعات والقوة الزائدة. ملاحظة: استخدام إبرة أكبر قليلا (22 G) لتحسين بقاء الخلية على هذه الخطوة.
- تمر الخلايا من خلال مصفاة النايلون 70 ميكرون لضمان تعليق خلية موحد ولإزالة الأنقاض وكتل.
- إزالة قسامة لعد الخلايا باستخدام عدادة الكريات. الطرد المركزي تعليق خلية المتبقية في 200 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. إعادة ضبط كثافة الخلية كما هو مطلوب في برنامج تلفزيوني العقيمة (10 8 خلية / مل). تبقي الخلايا على الجليد.
3. إنشاء خلية المانحة حكمه شهادة الثانوية العامة
- نقل ما يعادل 3 × 10 6 خلايا (30 ميكرولتر) في 5 مل جولة أنبوب البوليسترين السفلي لالتدفق الخلوي تلطيخ. إضافة حجم مساو من الأجسام المضادة الخالي من الملصقات ضد CD16 / CD32 لمنع تلطيخ غير محددة (المخفف في عازلة تلطيخ (تستكمل برنامج تلفزيوني مع 0.1٪ زلال المصل البقري (BSA) و 1 ملي EDTA) لتركيز النهائي من 2.5 ميكروغرام / مل). احتضان 5 دقائق على RT.
- إضافة 90 ميكرولتر مزيج الرئيسي الأجسام المضادة تألقي مترافق أعد العازلة تلطيخ: كوكتيل النسب المعقدة البيروكسيديز (B220، CD3e، CD11b، GR1، Ter119)، Sca1، CD117، CD135، CD150. احتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة، ومحمية من الضوء.
ملاحظة: يجب تحديد التخفيفات المناسبة لكل الكثير من الأجسام المضادة. انظر جدول المواد للالتخفيفات المستخدمة في هذه الدراسة. - إضافة 2 مل العازلة تلطيخ للخلايا، ودوامة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية لإزالة الأجسام المضادة غير منضم. صب طاف بيليه resuspend بنقر.
- إضافة 10 ميكرولتر-تألقي مترافق streptavidin المخفف في عازلة تلطيخ (انظر المواد الجدول). احتضان على الجليد لمدة 20 دقيقة، ومحمية من الضوء. يغسل كما في الخطوة 3.3 لإزالة streptavidin غير منضم.
- الحصول على عينات من الخلايا باستخدام قياس التدفق الخلوي مع لا يقل عن ستة أجهزة الكشف عن 9. تحديد وتيرة لين - Sca1 + CD117 + CD135 - CD150
ملاحظة: تكرار HSCs وظيفية في غضون ذلك السكان يمكن أن تقدر ما بين 1/3 و 1/5 2،12. - إنشاء حكمه شهادة الثانوية العامة المقدرة لجميع العينات 11، وذلك باستخدام عينة واحدة (عادة المنافس، B6.SJL CD45.1 + في هذا المثال)، والأساس كما هو موضح أدناه وفي الشكل 2.
- حساب عدد الخلايا المطلوبة باستخدام الصيغ التالية:
#transplanted HSCs / المتلقي = 5 × 10 5 خلايا س يقدر شهادة الثانوية العامة تردد (كما هو محدد لعينة أساسية، وهذا الرقم هو عادة بين 75 و 125 لwildtype C57BL / 6 الفئران) 10-12.
ملاحظة: في الشكل 2، على عينة A، والنتيجة هي 139 HSCs.
إجمالي # زرع الخلايا (لعينات أخرى، على سبيل المثال نموذج B في الشكل 2) = # العابرةزرعت تردد HSCs / شهادة الثانوية العامة.
ملاحظة: في الشكل 2، العينة B، والنتيجة هي 197826 (أو ما يقرب من 2 × 10 5) مجموع خلايا نخاع العظام.
- حساب عدد الخلايا المطلوبة باستخدام الصيغ التالية:
- حساب مجموع أعداد الخلايا المطلوبة لكل متلق الكسب غير المشروع لكل عينة باستخدام نتائج التي تم الحصول عليها أعلاه.
ملاحظة: يجب أن يكون هذا الرقم 5 × 10 5 لعينة خط الأساس (منافس).- مضاعفة عدد تم الحصول عليها من الخطوة 3.7 على عدد من الفئران المتلقي وإضافة ما يكفي من الخلايا لمدة سنتين على الأقل الفئران إضافية للتعويض عن حجم القتلى في المحقنة.
- مزيج منافس (على سبيل المثال، CD45.1 +) والخلايا اختبار (CD45.2 +) في 1: 1 شهادة الثانوية العامة النسبة المكافئة المحسوبة في الخطوة 3.6 وضبط الحجم النهائي ل 200 ميكرولتر في الحقن باستخدام برنامج تلفزيوني العقيمة.
ملاحظة: للحصول على مجموعة من خمسة الفئران المتلقي أن حجم اقترح بالتالي يكون 1.4 مل على الأقل، تحتوي على 3.5 × 10 6 منافس خلايا نخاع العظم (أو973 HSCs المقدرة للعينة (أ) في الشكل 2)، وعدد مماثل من الخلايا اختبار (في الشكل 2، أي ما يعادل العينة B سيكون 197826 × 7 = 1384782 خلايا نخاع العظام).
4. زرع نخاع العظم
- الاحماء الفئران المتلقي المشع في الخطوة 1.2 مع مصباح الحرارة الأحمر لضمان تمدد في الأوعية الدموية، وجعل الذيل الأفقي الأوردة أكثر وضوحا.
- إعداد 1 مل السلين حقنة مزودة إبرة G 27 (أو أصغر). نضح ما يقرب من 750 ميكرولتر من تعليق خلية استعداد (للفئران 3 المتلقي). تأكد من عدم وجود فقاعات الهواء في حقنة.
- إدراج الماوس في جهاز زجرية. دراسة الذيل والبحث في الأوردة ذيل الجانبية التي يجب أن تكون واضحة للعيان على جانبي الذيل. مسح موقع الحقن مع الايثانول. ادخال الإبرة شطبة تصل، بالتوازي مع الجلد واضغط بلطف على المكبس. وينبغي أن يكون حقن سهلا. إذا القوة هي إعادةفلكل وإبرة ليس في الوريد.
ملاحظة: الفئران أقدم لها سمكا الجلد، والتي قد تجعل العثور على الوريد أكثر صعوبة. إذا كانت الإبرة ليست في هذا السياق، أعد القريبة الإبرة إلى موقع الحقن الأولي. - إزالة الإبرة والضغط على موقع الحقن مع شاش معقم لبضع ثوان لوقف النزيف. نقل الماوس في قفص نظيفة.
ملاحظة: استخدم نفس المحاقن والإبر لمدة ثلاث حقن، وبعد ذلك إبرة قد تصبح مملة جدا. - لمرحلة ما بعد الزرع المتابعة، حقن 1 مل العقيمة برنامج تلفزيوني تحت الجلد لترطيب الفئران على مدى الأيام الخمسة الأولى. إضافة المضادات الحيوية في المياه الصالحة للشرب لمنع العدوى (إذا لزم الأمر، اختياري). وزن الفئران كل 2-3 أيام خلال الأسابيع الثلاثة الأولى والموت ببطء الفئران التي فقدت أكثر من 15-20٪ من قبل زرع وزن الجسم (أو كما هو محدد من قبل لجنة الأخلاق الحيوانية المحلية).
5. تحليل الدم المحيطي
- جمع قطرة من الدم (أpprox. 50-100 ميكرولتر) في أنابيب EDTA.
- لجمع الدم من الوريد الفك السفلي، واستخدام مشرط أو إبرة 22 G على اختراق جلد الوجه بالقرب من بقعة أصلع تقع تحت عظام الفك ووضع أنبوب جمع لاستقبال قطرة دم 13. جمع الدم في 4 و 8 و 12 و 16 أسبوعا بعد زرع لمتابعة متعددة النسب إعادة.
- إضافة 1 مل الطازجة RT خلايا الدم الحمراء تحلل العازلة (9 أجزاء 0.16 M NH 4 الكلور + 1 جزء 0.17 M تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 7.65) إلى قطرة من الدم التي تم جمعها في الخطوة 5.1.1. مزيج عينة نقل إلى 5 مل أنبوب البوليسترين جولة القاع مناسبة لالتدفق الخلوي. اسمحوا الوقوف لمدة 4 دقائق على RT.
- إضافة 4 مجلدات من الجليد الباردة برنامج تلفزيوني. مزيج من قبل تحول نهاية إلى نهاية، ونقل على الفور على الجليد. الطرد المركزي 10 دقيقة في 200 x ج في 4 درجات مئوية.
- صب طاف بيليه resuspend بنقر. وينبغي أن يكون طاف واضح والأحمر. إضافة 2 مل تلطيخ العازلة ودوامة لفترة وجيزة. الطرد المركزي 5 دقائق في 200 XGAر 4 درجة مئوية.
- صب طاف بيليه resuspend بنقر.
- المضي قدما مع التدفق الخلوي تلطيخ باستخدام بروتوكول عام مفصل في الخطوات 3،1-3،3 والأجسام المضادة التالية للحصول على مزيج الرئيسي: CD45.1، CD45.2، CD3e، CD19، GR1.
- الحصول على عينات من الخلايا باستخدام قياس التدفق الخلوي مع لا يقل عن ستة أجهزة الكشف عن 9. تحديد وتيرة الخلايا المشتقة من الجهات المانحة لكل النسب (الخلايا الليمفاوية CD19 + B، الخلايا الليمفاوية CD3e + T، GR1 المحببة مشرق) في كل عينة باستخدام قالب التحليل الوارد في الشكل (3) وكما نشرت 10،11.
6. تحليل نخاع العظم إعادة إعماره
- جمع خلايا نخاع العظام على النحو المفصل في القسم 2. وصمة عار الخلايا لتحليل التدفق الخلوي باستخدام بروتوكول عام مفصل في الخطوات 3،1-3،3 والأجسام المضادة التالية للحصول على مزيج الرئيسي: النسب الكوكتيل، Sca1، CD117، CD135، CD150، CD45.1 ، CD45.2. كشف لينEAGE كوكتيل الأجسام المضادة باستخدام streptavidin ملون تألقي مترافق كما هو موضح في الخطوة 3.4.
- الحصول على عينات من الخلايا باستخدام قياس التدفق الخلوي مع ثمانية على الأقل للكشف عن 9. إذا تتوفر ستة فقط، إضافة CD135 على نفس القناة كلوحة النسب كما سيتم استبعاد CD135 خلايا +. تحديد وتيرة لين المستمدة من المانحين - Sca1 + CD117 + CD135 - CD150 + HSCs في كل عينة باستخدام قالب التحليل الوارد في الشكل (4) وكما نشرت 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وصف عام للإعداد زرع تنافسية، بما في ذلك زرع الثانوية (التي تناقش أدناه) يمكن العثور عليها في الشكل 1. ويمكن الاطلاع على تحليل تمثيلي للنخاع قبل زرع العظام HSCs في الشكل 2. معلومات أكثر تفصيلا عن استبعاد الحلل و الخلايا الميتة يمكن العثور عليها في أي مكان آخر 9.
أرقام 3 و 4 أمثلة من التدفق الخلوي القوالب تحليل للدم المحيطي ونخاع العظام، على التوالي. فمن الطبيعي أن كشف بعض الخلايا اللمفية المضيفة T (ما يصل إلى 20٪ من جميع الخلايا T، والشكل 3B)، وخلايا تي هي أكثر مقاومة للراديو. يجب أن تكون الخلايا المشتقة منافس موجود في كل الأنساب الثلاثة. حد الكشف يعتمد كثيرا على عدد من مجموع الخلايا المكتسبة للتحليل، ولكن في تجربتنا ما مجموعه 20 ألف خلية داخلبوابة الكريات البيض واحدة وعادة ما يكفي. باستخدام عتبة التعسفية من 1٪ أو 0.5٪، إذا تمثل الخلايا المانحة نسبة أقل من قطع في أي نسب معينة (B اللمفاوية، T اللمفاوية، أو النخاعي كما هو مبين في الشكل 3)، لا يعتبر الماوس إيجابية لإعادة multilineage . يصبح هذا المفهوم المهم عندما يتم الجمع بين زرع تنافسية مع فحص تخفيف الحد لتحديد HSCs المانحة كما هو موضح في المناقشة. ومن الممكن بالتأكيد أن يكون، على سبيل المثال، T و B الخلايا الليمفاوية المستمدة المانحة لكن الفقدان التدريجي للخلايا الدم النخاعي، وهو ما يشير عادة إعادة فقط عابرة. الخلايا الليمفاوية لديها أطول نصف العمر من خلايا الدم النخاعي (خاصة Gr1hi SSChi المحببة / العدلات) ويمكن أن تستمر حتى في غياب نخاع العظام HSCs 10.
يصور الشكل 5 نتائج ممثل عن الطرفية الخيمرية الدم تحت الموقع مختلفةبالجمع. عندما تكون HSCs المانحة أي ما يعادل وظيفيا إلى الخلايا منافس، نسب المانحة (CD45.2 +) ومنافس (CD45.1 +) خلايا -derived هي ما يعادل (الشكل 5A). الخلايا المضيفة المتبقية (CD45.1 + CD45.2 +) في الشكل 5A و5B على وجه الحصر تقريبا اللمفاويات التائية لأنها أكثر مقاومة للراديو. عندما تظهر الخلايا المانحة نسبة أقل بكثير من الكريات البيض في الدم الطرفية (الشكل 5B)، هي بعض الجوانب من وظيفة شهادة الثانوية العامة من المرجح معيبة، وهناك حاجة إلى مزيد من الدراسات كما هو موضح في المناقشة. وجود خلايا منافس يؤكد أن الفحص يعمل بشكل جيد ولكن كان نخاع العظم المانحة ببساطة أقل فعالية. هذا هو على النقيض من النتيجة المعروضة في الشكل 5C، حيث كل من الخلايا المانحة ومنافس الحالية في الأرقام والخلايا المضيفة أدنى تمثل الغالبية العظمى من الخلايا الدموية المحيطية. في هذه الحالة كان زرع ناجحة وأنار من غير الممكن استخلاص أي استنتاجات بخصوص وظيفة النسبية المانحة مقابل خلايا منافس. وتناقش حلولا مختلفة مما يلي.
يتم خلط؛ (B6.SJL CD45.1 +) في الشكل رقم 1. التصميم التجريبي (A) لعملية زرع تنافسية، وخلايا نخاع العظم من فئران المانحة (CD45.2 + ؛؛ C57Bl6 خلفية الرقابة والاختبار) ومنافس مسانج الفئران نسبة 1: 1 وحقنها في الوريد ذيل الفئران المتلقي المشع (CD45.1 + CD45.2 +، F1 ذرية C57Bl6 أزواج العاشر تربية B6.SJL). يتم تحديد فعالية إعادة نخاع العظام في الدم المحيطي (PB) في 4 و 8 و 12 و 16 أسبوعا بعد زرع وفي نخاع العظام في 16 أسبوعا بعد زرع أو في وقت لاحق. (ب) مواصلة تقييم الذاتي تجديد الخلايا المزروعة، بونخلايا نخاع البريد تعافى من متلقى بعد 16 أسبوعا يمكن نقلها إلى الفئران المتلقي الثانوية المشع. شهادة الثانوية العامة، الخلايا الجذعية المكونة للدم. MPP، خلية سلفية متعددة القدرات. LMPP، معبي اللمفاوية MPP. الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. قبل زراعة نخاع العظم شهادة الثانوية العامة قالب تحليل وضمن الخلايا واحدة، حدد HSPCs وفقا لcKit (CD117) والتعبير سلالته. ضمن قاتمة / لين - السكان الخلية، حدد cKit Sca1 مشرق + السكان (LSK). ضمن LSKs، حدد CD150 + CD135 - HSCs. يحتوي هذا الشعب على حد سواء طويلة الأجل وقصيرة الأجل إعادة إسكانها HSCs (وتيرة خلية إعادة إسكانها داخل هذه الفئة من السكان هو أن يكونتوين 1/3 و 1/5). يتم حساب التردد المقدر من نخاع العظام HSCs بقسمة عدد من الأحداث في باب شهادة الثانوية العامة من قبل عدد من الأحداث في بوابة وحيدة الخلية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. بعد زرع قالب تحليل الدم المحيطي. (A) داخل الخلايا واحدة، حدد أول المحببة مرحبا التعاون بين بلدان الجنوب GR1 مشرق. (ب) ثم حدد CD19 + CD3e - الخلايا الليمفاوية B وCD3e + CD19 - الخلايا اللمفية تي. يحتوي الماوس الدم المحيطي نسبة كبيرة من الخلايا الليمفاوية، والخلايا الليمفاوية B يجري نوع من الخلايا الرئيسية (ما يقرب من 50٪ جميع الخلايا الدموية المحيطية). م) رسم تدفق 2D الخلوي المؤامرات لكل مجموعة فرعية مع CD45.2 على محور واحد وCD45.1 من جهة أخرى. تحديد الجهات المانحة (CD45.2 +)، المضيف (CD45.1 + CD45.2 +) والخلايا منافس (CD45.1 +) لكل النسب كما هو موضح. ومن الطبيعي أن يكون هناك بعض الخلايا المضيفة المتبقية، ولا سيما في السكان الخلايا اللمفاوية T كما رأينا في لوحة E. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4. بعد زرع قالب تحليل نخاع العظم شهادة الثانوية العامة، وضمن الخلايا واحدة، حدد HSPCs وLSKs كما هو مبين في الشكل 2. في غضون LSKs رتخا، CD150 + CD135- HSCs، CD150- CD135- الأسلاف متعددة القدرات (أو ميجابايت في الثانية) وCD150- CD135 + اللمفاوية ميجابايت في الثانية -primed (أو LMPPs). نسبة LMPPs أقل بعد زرع من الفئران غير المعرضة للإشعاع. رسم 2D تدفق جytometry المؤامرات لكل مجموعة فرعية مع CD45.2 على محور واحد وCD45.1 من جهة أخرى. تحديد الجهات المانحة، المضيف والخلايا منافس لمجموعة حيوانية كما هو مبين. إذا كان التشعيع وزرع ناجحة، يجب أن يكون هناك عدد قليل جدا من HSPCs المضيف المتبقية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5. ممثل النتائج لالطرفية الخيمرية الدم. (A) زرع ناجحة حيث المانحة HSCs هي يعادل الخلايا منافس وظيفيا. الغالبية العظمى من الخلايا المضيفة المتبقية (CD45.1 + CD45.2 +) هي عادة اللمفاويات التائية. (ب) عملية زرع ناجحة حيث انخفض المانحة HSCs عرض وظيفة بالمقارنة مع خلايا منافس. هذه المساهمة انخفض يمكن أن يكون راجعا إلىوستكون هناك حاجة العديد من العوامل المختلفة، ومزيد من التحليل (انظر المناقشة). (C) زرع غير ناجحة مع الترددات المنخفضة من كلا منافس والخلايا المانحة، ونسبة كبيرة من الخلايا المضيفة المتبقية. هذا النوع من نتيجة يشير إلى وجود أقل من الجرعة المتوقعة للإشعاع، حقن ناجحة (انخفاض بقاء الخلية، وانخفاض حجم الحقن، حقن خارج الوريد الذيل)، أو مزيج من هذه. الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تم تصميم البروتوكول الموصوفة هنا لتقييم اللياقة البدنية النسبية للمانحين (اختبار) HSCs ضد منافس يعرف HSCs. وضع المنافسة يزيد من حساسية النسبية للفحص (أكثر عرضة للكشف عن انخفاض معتدل في اللياقة البدنية الخلايا الجذعية) ويوفر الرقابة الفنية الداخلية لفعالية التشعيع والحقن. ومع ذلك، فإنه لا ينبغي أن تستخدم كتدبير المطلق للشهادة الثانوية العامة اللياقة البدنية. لا يعني انخفاضا في إعادة تنافسية تلقائيا أن أن HSCs لا أداء جيدا في ظل غياب المنافسة. على الرغم من أنه يمكن القول بأن وضع تنافسي هو نقطة انطلاق أفضل، حيث أن خلايا منافس سوف انقاذ وظيفة شهادة الثانوية العامة المعيبة وجميع الفئران المتلقي سوف البقاء على قيد الحياة، يجب على المرء أن يكون حذرا مع تفسير النتائج. وتؤكد النتائج في وضع غير تنافسي ترسيخ الاستنتاجات.
التصميم التجريبي المقدمة هنا يستخدم شهادة الثانوية العامة ما يعادل تشوantities من مجموع خلايا نخاع العظام بدلا من السكان نقية من التدفق الخلوي HSCs -sorted. ومن المهم لتحقيق المساواة في أعداد HSCs في جميع السكان تحت الدراسة (مختلف الجهات المانحة، منافس) للقضاء على التباين بين مختلف الجهات المانحة والتأكد من أن الاختلافات في وتيرة شهادة الثانوية العامة المظهري لن تفسر على أنها تغيرات في وظيفة شهادة الثانوية العامة (14). مزايا النهج وصفها هنا على HSCs النقاء هي: تحسين بقاء الخلية نظرا لأوقات المعالجة تقصير وعدم وجود ضغط خارجي أثناء الفرز. وتحسين صاروخ موجه إلى نخاع العظام المتلقي (وجود الأجسام المضادة على الخلايا مرتبة قد تتداخل مع engraftment في نخاع العظم 15). على العكس من ذلك، والعيب الرئيسي هو مساهمة من السكان غير شهادة الثانوية العامة نتائج الزرع، ولا سيما دور الخلايا الاولية لم تدم طويلا في نقطة زمنية مبكرة بعد زرع. وعلاوة على ذلك، إذا كان العلاج أو التعديل الوراثي يغير التعبير عن surfacعلامات الإلكترونية المستخدمة في اختيار من HSCs 16، قد يكون هناك عدد كبير من HSCs "مقنعة" في عينة واحدة ولكن ليس في بلد آخر، والتي سوف التحيز في النتائج. ومع ذلك، قد تحدث نفس المشكلة أيضا عند استخدام HSCs النقاء ومتأصل في فحص زرع.
النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام هذا البروتوكول هي النوعية فقط على مستوى السكان. وبعبارة أخرى، يمكن أن مساهمة انخفضت من الخلايا المانحة بعد زرع يكون راجعا إلى؛ عدد أقل من HSCs وظيفية في عدد السكان انطلاق؛ ضعف قدرة من HSCs الفردية لتسوية في نخاع العظام والتوسع في الأيام والأسابيع الأولى بعد الزرع. أو مشاكل مع التمايز والنمو في الخلايا الناضجة التي تستخدم للكشف في الهامش. بالتالي فمن المهم أن لا تستخدم نتائج عملية زرع تنافسية في العزلة، ولكن لتكمل لهم فحوصات من شأنها قياس تكاثر الخلايا، البقاء على قيد الحياة، والتمايز من HSC لتعميم خلايا الدم. من المهم للمقارنة بين مساهمة الخلية المانحة بين الدم المحيطي (الشكل 3)، ونخاع العظام (الشكل 4) كما أن وجود HSCs المشتقة من المانحين في نخاع العظم جنبا إلى جنب مع عدم وجود الخلايا المانحة في الدم المحيطي يكون مؤشرا لكتلة التمايز . وإن لم يكن هو موضح في المثال، فمن الممكن أيضا لتقييم محمر إعادة بناء على الإسوية مختلفة من Gpi1 17. ونظرا لأعداد كبيرة من كريات الدم الحمراء الموجودة في الدم، فهي تمثل طريقة حساسة للغاية للكشف عن الخلايا المشتقة من الجهات المانحة، والتي يمكن أن تكون مفيدة بشكل خاص عند زرع انخفاض أعداد HSCs أو بعد إنتاجها على مدى فترات طويلة من الزمن. في الطرف الآخر من الطيف، وخلايا الدم النخاعي غالبا ما تكون أول من الفشل يتم الكشف عنها، وذلك جزئيا بسبب التردد المنخفض في الدم المحيطي وجزئيا بسبب وضعهم قصيرة نصف الحياة.
فمن الممكن أن تكيف عشره إعادة تعمير تنافسية فحص للسماح الكمي من HSCs باستخدام فحص تخفيف الحد (أو LDA). وهذا يتطلب وجود عدد أكبر من الفئران المتلقي تنقسم الى عدة مجموعات مختلفة حيث تحصل كل مجموعة على نسبة مختلفة من منافس: الخلايا المانحة، إما فرزها أو لم يتم فرزها كما هو موضح أعلاه. ولما كان عدد من الخلايا المانحة النقصان، سيكون هناك المزيد من الفئران التي نسبة الخلايا المشتقة من الجهات المانحة لا تصل إلى عتبة محددة سلفا في واحد أو عدة الأنساب. ومن ثم يمكن لمؤامرة تردد من الفئران "سلبي" في كل مجموعة ضد عدد من الخلايا المانحة المزروعة وتحديد وتيرة HSCs من الرسم البياني التي تلت 18،19.
مدة المقترح لمرحلة ما بعد الزرع المتابعة تختلف في الأدب. هناك تستخدم ليكون توافق معين حيث اعتبر الفترة من 16 أسبوعا بعد زرع أن تكون كافية لتعكس مخرجات طويلة الأجل HSCs. ومع ذلك، التقارير الأخيرة من "طntermediate "HSCs الذي تراجع بعد فترة وجيزة وقد أكد 16 أسبوعا على ضرورة وظيفة لتقييم أكثر صرامة من شهادة الثانوية العامة وظيفة (17). ومن المؤكد أنه يمكن تمديد المتابعة للمتلقى الماضي نقطة زمنية 16 أسبوعا لتلبية هذه المخاوف. ومن الخيار البديل، مرة أخرى مع حساسية أعلى يمكن القول، هو زرع الثانوي (الشكل 1B)، حيث استعادت خلايا نخاع العظام من متلقى الأول تحقن المتلقين الثانوي المشع. يضع زرع الثاني ضغط التكاثري إضافية على HSCs، مما اضطر خروجهم من السكون والسماح الخلايا الوحيدة مع القوي التجديد الذاتي للحفاظ على إنتاجهم. ومن الأفضل في بعض الأحيان لاستخدام الخلايا المانحة المفروزة إلى ضبط أفضل أرقام شهادة الثانوية العامة بين عينات مختلفة لزرع الثانوية. بدلا من ذلك، فمن الممكن لإنشاء النسبة المقدرة المانحة : HSCs منافس من نخاع العظم الأساسي (على سبيل المثال،
وكما ذكر أعلاه، هناك عدد من الأسباب لماذا عدد معين من السكان من الجهات المانحة HSCs قد تظهر انخفاض القدرة على إعادة المدى الطويل. واحد من هذه الأسباب هو قدرة HSCs إلى الهجرة إلى نخاع العظم بعد زرع (وتسمى أيضا صاروخ موجه) وتسوية أنفسهم في مكانة نخاع العظام. فمن الممكن أن تكيف بروتوكول المعروضة هنا للتحقيق في نخاع العظام صاروخ موجه والتوسع على المدى القصير. من الضروري زيادة عدد الخلايا المزروعة (ما يعادل 5،000-10،000 HSCs لصاروخ موجه المقايسات و1،000-2،000 HSCs لتحليلها خلال الأسبوع الأول بعد زرع). في مقايسة صاروخ موجه، يصرح باستخدامها الفئران المتلقي داخل ساعة الأولى 16-24 بعد زرع وعدد من الجهات المانحة HSCs التي وصلت إلى نخاع العظم يتم تحديد كما هو موضح في هذا البروتوكول. لمزيد من تقييم وظيفتها، وخلايا نخاع العظم تعافى من المتلقين على المدى القصير يمكن زرعها في المتلقين الثانوي كما هو موضح في الشكل 1B. ويمكن بعد ذلك نسبة الخلايا المشتقة من المانحين في المتلقين الثانوي استخدامها لتقييم قدرة الجهات المانحة HSCs إلى الهجرة والاستقرار في نخاع العظام المتلقي.
المشاكل الرئيسية مع عمليات زرع نخاع العظام التنافسية تنشأ من أشعة والحقن وتقدم نفسها على أنها إما زيادة معدل الوفيات بعد زرع أو انخفضت كفاءة إعادة. تشعيع جرعة الانقسام، كما وردت هنا، يترافق عادة مع myeloablation أكثر كفاءة وسمية أقل بالمقارنة مع جرعة واحدة (20). مع الجرعة الموصى بها هنا (مرتين 450 راد)، يتم حذف النخاعي وباء السكان اللمفاوية بكفاءة ولكن الخلايا اللمفية تي المتبقية لا تزال هناك (الشكل 3). إذا كان هناك أي سبب للشك في رفض الكسب غير المشروع (المانحة والمتلقية الفئران من خلفيات وراثية مختلفة)، وجرعة عالية من الإشعاع (جرعتين من 550-600 راد) وتأخير أقصر بين الجرعات اثنين (4 ساعات بدلا من اليوم التالي ) يجب أن تساعد في القضاء على الخلايا اللمفية تي المتبقية وتقليل احتمال فشل الكسب غير المشروع يرجع إلى الرفض. حقن غير صحيحة، أو الحقن في الفضاء المحيط بالأوعية بدلا من الوريد الذيل، ومشاكل مع بقاء الخلية المانحة، أو تلوث الخلية المانحة بسبب نقص الرعاية أثناء إعداد العينة تزيد أيضا فشل الكسب غير المشروع وفيات ما بعد الزرع. والتشعيع غير فعال (بسبب مشاكل فنية، على سبيل المثال) يؤدي إلى كفاءة إعادة انخفضت ولكن يجب أن لا تزيد موrtality. في كل هذه الحالات، وجود خلايا منافس في الفحص يساعد على فصل المشاكل التقنية (كما هو موضح هنا) من انخفاض الحقيقيين في المانحة وظيفة شهادة الثانوية العامة كما الخلايا منافس ينبغي أن يكون دائما قادرا على إعادة المتلقي المشع. ويمكن أيضا أن تستضيف العوز المناعي أن تستخدم، على سبيل المثال، لتقليل الحاجة للإشعاع و / أو خطر الرفض الكسب غير المشروع، وتقييم وظيفة HSCs البشري 21-23.
وفي الختام، فإننا نقدم هنا بروتوكول زرع تنافسية التي يمكن تكييفها لعدة استخدامات مختلفة كما هو مبين في المناقشة. يستخدم نهجنا في حكمه على شهادة الثانوية العامة، مما يقلل الوقت اللازم وفي وقت واحد يحسن بقاء الخلية في الكسب غير المشروع بالمقارنة مع فرز الخلايا. بل هو أيضا حلا عمليا عندما الوصول إلى فارز خلية محدودة، ويتطلب أقل الفئران بالمقارنة مع فحص LDA الكمي، مما يجعلها نقطة انطلاق جذابة لتحليل وظيفة شهادة الثانوية العامة. </ P>
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
ونحن ممتنون لروكسان هيتو-أربور للمساعدة في تصميم الشكل ومظاهرة من الإجراءات. وأيد البحوث في المختبر من قبل جائزة الانتقال من مؤسسة كول، ديسكفري منح لا. 419226-2012 من العلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث كندا (NSERC) والمؤسسة الكندية للابتكار (صندوق قادة CFI منح رقم 31377). KMH هو جديد Chercheur-Boursier لفون للبحوث كيبيك - سانتيه (FRQS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microtainer tubes with K2EDTA | BD Biosciences | 365974 | |
| 20 G needle | BD Syringe | For blood sampling from the mandibular vein | |
| LabQuake Shaker rotisserie | Thermo Scientific | C415110 | |
| Purified anti-mouse CD16/CD32 (clone 2.4G2, Fc Block) | BD Biosciences | 553142 | 2.50 μg/ml |
| Pe-Cy7-conjugated anti-mouse CD3e (clone 145-2C11) | eBioscience | 25-0031 | 0.25 μg/ml |
| PE-conjugated anti-mouse CD19 (clone 1D3) | eBioscience | 12-0193 | 0.25 μg/ml |
| APC-eFluor780 (APC-Cy7 equivalent)-conjugated anti-mouse GR1 (clone RB6-8C5) | eBioscience | 47-5931 | 0.25 μg/ml |
| FITC-conjugate anti-mouse CD45.1 (clone A20) | eBioscience | 11-0453 | 2.50 μg/ml |
| eFluor450-conjugated anti-mouse CD45.2 (clone 104) | eBioscience | 48-0454 | 1.00 μg/ml |
| Biotinylated anti-human/mouse CD45R (B220) (clone RA3-6B2) | eBioscience | 13-0452 | 1.25 μg/ml |
| Biotinylated anti-mouse CD3e (clone 145-2C11) | eBioscience | 13-0031 | 1.25 μg/ml |
| Biotinylated anti-mouse CD11b (clone M1/70) | eBioscience | 13-0112 | 1.25 μg/ml |
| Biotinylated anti-mouse GR1 (clone RB6-8C5) | eBioscience | 13-5931 | 1.25 μg/ml |
| Biotinylated anti-mouse TER119 (clone TER119) | eBioscience | 13-5921 | 0.625 μg/ml |
| V500 streptavidin | BD Biosciences | 56149 | 0.5 μg/ml |
| PE-conjugated anti-mouse CD117 (clone 2B8) | BD Biosciences | 553355 | 0.25 μg/ml |
| PE-Cy7-conjugated anti-mouse Ly6A/E (Sca1) (clone D7) | BD Biosciences | 558162 | 0.25 μg/ml |
| PerCP-eFluor710-conjugated anti-mouse CD135 (clone A2F10) | eBioscience | 46-1351 | 0.5 μg/ml |
| Alexa fluor 647-conjugated anti-mouse CD150 (clone TC15-12F12.2) | Biolegend | 115918 | 0.625 μg/ml BD Biosciences and eBioscience do not carry the same clone |
| 1 ml tuberculin syringe with 27 G needle | BD Syringe | 309623 | |
| 1 ml tuberculin syringe with 25 G needle | BD Syringe | 309626 | |
| 70 μm cell strainer | BD Falcon | 352350 |
References
- Li, H. W., Sykes, M. Emerging concepts in haematopoietic cell transplantation. Nat Rev Immunol. 12 (6), 403-416 (2012).
- Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Terhorst, C., Morrison, S. J. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).
- Kim, I., He, S., Yilmaz, O. H., Kiel, M. J., Morrison, S. J. Enhanced purification of fetal liver hematopoietic stem cells using SLAM family receptors. Blood. 108 (2), 737-744 (2006).
- Mayle, A., Luo, M., Jeong, M., Goodell, M. A. Flow cytometry analysis of murine hematopoietic stem cells. Cytometry A. 83 (1), 27-37 (2013).
- Rossi, L., et al. Less Is More: Unveiling the Functional Core of Hematopoietic Stem Cells through Knockout Mice. Cell Stem Cell. 11 (3), 302-317 (2012).
- Till, J. E., McCulloch, E. A direct measurement of the radiation sensitivity of normal mouse bone marrow cells. Radiat Res. 14, 213-222 (1961).
- Shen, F. W., et al. Cloning of Ly-5 cDNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (21), 7360-7363 (1985).
- Identification of GM mice. Laboratory Animals. 37 (suppl 1), 33-35 (2003).
- Rundberg Nilsson, A., Bryder, D., Pronk, C. J. H. Frequency determination of rare populations by flow cytometry: A hematopoietic stem cell perspective. Cytometry Part A. 83A (8), 721-727 (2013).
- Abidin, B. M., Owusu Kwarteng, E., Heinonen, K. M. Frizzled-6 Regulates Hematopoietic Stem/Progenitor Cell Survival and Self-Renewal. J Immunol. 195 (5), 2168-2176 (2015).
- Heinonen, K. M., Vanegas, J. R., Lew, D., Krosl, J., Perreault, C. Wnt4 enhances murine hematopoietic progenitor cell expansion through a planar cell polarity-like pathway. PLoS One. 6 (4), e19279 (2011).
- Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. J. SLAM family markers resolve functionally distinct subpopulations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors. Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).
- Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Anim (NY). 34 (9), 39-43 (2005).
- Santaguida, M., et al. JunB protects against myeloid malignancies by limiting hematopoietic stem cell proliferation and differentiation without affecting self-renewal. Cancer Cell. 15 (4), 341-352 (2009).
- Czechowicz, A., Kraft, D., Weissman, I. L., Bhattacharya, D. Efficient transplantation via antibody-based clearance of hematopoietic stem cell niches. Science. 318 (5854), 1296-1299 (2007).
- Zhang, C. C., Lodish, H. F. Murine hematopoietic stem cells change their surface phenotype during ex vivo expansion. Blood. 105 (11), 4314-4320 (2005).
- Benveniste, P., et al. Intermediate-Term Hematopoietic Stem Cells with Extended but Time-Limited Reconstitution Potential. Cell Stem Cell. 6 (1), 48-58 (2010).
- Fazekasde St Groth, B. The evaluation of limiting dilution assays. J Immunol Methods. 49 (2), R11-R23 (1982).
- Louis, I., Heinonen, K. M., Chagraoui, J., Vainio, S., Sauvageau, G., Perreault, C. The signaling protein Wnt4 enhances thymopoiesis and expands multipotent hematopoietic progenitors through beta-catenin-independent signaling. Immunity. 29 (1), 57-67 (2008).
- Cui, Y. Z., et al. Optimal protocol for total body irradiation for allogeneic bone marrow transplantation in mice. Bone Marrow Transplant. 30 (12), 843-849 (2002).
- Benz, C., et al. Hematopoietic Stem Cell Subtypes Expand Differentially during Development and Display Distinct Lymphopoietic Programs. Cell Stem Cell. 10 (3), 273-283 (2012).
- Eppert, K., et al. Stem cell gene expression programs influence clinical outcome in human leukemia. Nat Med. 17 (9), 1086-1093 (2011).
- McIntosh, B. E., et al. Nonirradiated NOD,B6.SCID Il2rgamma-/- Kit(W41/W41) (NBSGW) mice support multilineage engraftment of human hematopoietic cells. Stem Cell Reports. 4 (2), 171-180 (2015).
