Introduction
Hematopoiezis yaralanma, radyasyon ve hücre ölümü ile kaybolmuş kan hücrelerinin doldurulmasını sağlayan bir rejeneratif bir süreçtir. Bu işlem, büyük ölçüde Yetişkin kemik iliğinde bulunan hematopoietik kök hücreler (HSC) ile sağlanmaktadır. Buna ek olarak, hematopoietik kök hücreler, otoimmün bozukluklar, hematolojik malignanlıklar ve immün yetmezliği 1 terapötik amaçlar için kullanılabilir. daha iyi çoğalma genişlemesi ve ulaşmak ve nakli sonrasında alıcı kemik iliğini aşılamak için kendi yeteneği dahil olmak üzere, HSC işlevini düzenleyen mekanizmaları anlamak için bir ihtiyaç vardır. Son çalışmalar, ileriye yönelik olarak, yaklaşık% 50 saflıkta 2-4 yetişkin HSClerin ve fetal HSClerin ettirecek SLAM aile üyeleri CD150 ve CD48 dahil olmak üzere birçok hücre yüzey belirteçleri, rapor olmakla birlikte, işlevsel HSCler altın standart ölçmek için bir in vivo deney, repopulating kalır kan c yeniden kurmak için yeteneklerini belirlemekIşınlanan ev 5 ell üretimi.
In vivo klonal repopulating tahlil başlangıçta kadar ve McCulloch 6 tarafından geliştirilen ve o zamandan beri rafine ve genişletilmiştir. Başlangıçta tanımlandığı gibi, HKH'lerin kendini yenileme ve farklılaşma yoluyla yaşam boyu kan hücresi üretimini sağlamak. Işınlanan alıcıya HKH'lerin transferi Böylece ABD değerlendirmek sağlar: farklı kan hücre soylarının analizi ile (T lenfositler, B lenfositler, granülositler, monositler) ve seri transplantasyonu ile kendini yenileme kapasitelerini ayırt etme yeteneği. Tahlil genellikle HKH'lerin iki nüfusun işlevselliği ve / veya miktar karşılaştırılması yer alacağı, örneğin, tedavi veya HKH'lerin bakım veya genişleme etkileyebilecek değişik faktörlerin ile işlenmemiş olan farklı genotipleri veya hücre iki farelerin gelen hücreler kültür. Donör kimerizm, veya transfer donör HKH'lerin t katkısıO kan hücresi üretimi daha sonra hücre yüzeyi markerleri veya alıcı ya da ev sahibi donör hücreleri ayırt edecek başka yöntemler kullanılarak periferik kan akış sitometri analizi ve kemik iliği ile tespit edilebilir. En yaygın olarak kullanılan belirteçler kesinlikle aşağıda verilen örnekler için seçtiğiniz gen Ptprc veya CD45 lökosit antijen 7 için iki alleldir.
klonal repopulation tahlil rekabetçi ya da rekabetçi olmayan olabilir. bir rekabetçi olmayan bir ortamda, kontrol ve test HSC hücreleri ayrı bir alıcı farelere aktarıldı ve her hücre tipi için sonuç birbirinden bağımsız olacaktır. Rekabetçi bir ortamda, test ve kontrol hem HKH'lerin işlevi rakip HKH'lerin bir nüfusa karşı ölçülür. Burada açıklanan protokol rekabetçi bir ortam kullanır, ancak, aynı zamanda, rekabetçi olmayan durumlar için uyarlanabilir. Her iki yaklaşımın da avantajları ve sınırlamaları var ve biz detaylı olarak bunları karşılaştırmak olacaktırtartışma. Biz de nakledilen HKH'lerin sayısında hakkaniyeti sağlamak için farklı yaklaşımlar tarif seyreltme deneyi (LDA) sınırlayarak HKH'lerin ölçülmesi için tahlil adapte ve sonuçların yorumlanması için başarılı ve başarısız nakli hem de örnekler sunmak nasıl açıklar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokol açıklanan tüm prosedürler kurumsal hayvan etik komitesi tarafından onaylanmış ve Hayvan Bakımı yönergelere Kanada Konseyi izleyin edilmiştir.
Not: Steril / spesifik patojen free konut koşulları sağlamak için, biyolojik güvenlik kabini veya laminer akış kaputu içinde canlı farelerin doğrudan kullanım ile ilgili tüm işlemleri yürütmek. Temizleyin veya sterilize kafesleri, kısıtlayıcı cihazlar, konut malzemeleri, uygun hayvanlara verilen yemi ve su. enjeksiyonlar için ve kan alma için, sadece steril, tek kullanımlık iğneler kullanın. Aseptik teknik greft hazırlanması sırasında çok önemlidir.
Alıcı 1. Farelerin hazırlanması
- Zamanla periferik kan ve kemik iliği sulandırma bireysel takiplerinde etkinleştirmek için kulak çentikler (ya da yerel hayvan etik kurulu 8 tarafından onaylanmış başka bir yöntemle) ile alıcı fareler tanımlayın. Nakil sonrası izlem için fareler tartılır. Bize(Az 25 g), 7 ila 12 hafta eski e alıcı fareler.
Not: Verilen örnekte, CD45.1 + CD45.2 + alıcı fareler congenic B6.SJL fareler ile C57BL / 6 fareler geçerek evinde yetiştirildi. - hematopoetik aktivite yok etmek için 450 rad iki doz ile alıcı fareler ışın tedavisi. İlk doz transplantasyondan önceki gün ve transplantasyon öncesi ikinci 1-2 saat verin.
Not: X-ışını veya gama ışınları hem uygun tesislerin doluluk durumuna bağlı olarak kullanılabilir.
Verici ve Rakip kemik iliği hücrelerinin 2. Hazırlık
- Donör (testi ve kontrolü; CD45.2 +) Euthanize ve rakip (CD45.1 +; B6.SJL), boyunları kırılarak ya da yerel hayvan etik komitesi tarafından onaylanmış yöntemler kullanılarak takip CO 2 boğulma tarafından fareler.
- Boş bir petri veya steril gazlı bez üzerine, açık geniş sırtlarında, bacaklar fareler yerleştirin i (temiz iş yüzeyi tutmak için)Bir biyolojik güvenlik kabini nside. % 70 etanol /% 30 H deri ve kürk Islak 2 O (hac / hac).
- Bir cerrahi bıçak veya keskin bir makas ile ayak kesti. bacak boyunca cildi açın ve tırtıklı forseps kullanarak cilt çekmeye kesin. aşırı kas kesip.
- Bacak kemiği çekerek ve bir karşı güç olarak pelvis kemikleri karşı makas bıçakları kullanarak femur yerinden. tibia ayırın ve dizkapağı gelen femur ve kas ve tendonların artıklarını temizleyin. 6-yuvalı doku kültürü plakasında 2-3 ml steril fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde kemik yerleştirin.
- Steril PBS 5 ml kemikleri temizlenerek kemik iliği hücreleri toplamak.
- forseps ile yavaşça kemik tutun ve kemik bir ucuna bir dolu 1 ml şırınga bağlanmış bir 25 G iğne yerleştirin. pistonu ve 15 ml konik bir tüp içinde hücreleri toplamak. Kemik merkezi beyaz kadar gerektiği gibi tekrarlayın.
- iğne geçen tekrarlı hücreleri ayırmaktek bir hücre süspansiyonu elde etmek. kabarcıklar ve aşırı kuvvet kaçının. Not: Bu adımda, hücre canlılığını geliştirmek için biraz daha büyük bir iğne (22 g) kullanın.
- homojen bir hücre süspansiyonu sağlamak ve enkaz ve kümeleri kaldırmak için 70 mikron naylon süzgeç vasıtasıyla hücrelere geçerler.
- Bir hemasitometre kullanarak hücre sayımı için bir numuneyi çıkarın. 4 ° C'de 5 dakika 200 x g'de kalan hücre süspansiyonu santrifüj. Steril PBS (10 8 hücre / ml) içinde gerekli olan hücre yoğunluğu yeniden ayarlayın. hücreleri buz üzerinde tutun.
3. Donör Hücre HSC Benzerleri oluşturulması
- Flow sitometri boyama için alt polistiren tüp yuvarlak bir 5 ml'lik 3 x 10 6 hücre (30 ul) eşdeğer aktarın. (2.5 ug / ml'lik bir nihai konsantrasyonda (PBS,% 0.1 büyükbaş hayvan serum albümini (BSA) ve 1 mM EDTA ile takviye edilmiş) boyama bileşiği içinde sulandırılmış) özel olmayan renklenme engelleme CD16 / CD32 karşı işaretlenmemiş antikora eşit hacim. Oda sıcaklığında 5 dakika inkübe.
- boyama tamponu içinde hazırlanmış 90 ul florokrom-konjuge antikor ana karışımı ekleyin: biyotinlenmiş Lineage kokteyl (B220, CD3e, CD11b, GR1, Ter119), Sca1, CD117, CD135, CD150. ışıktan koruyarak 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.
Not: Uygun seyreltmeler antikorun her lot için belirlenmelidir. Bu çalışmada kullanılan dilüsyonları için Malzemelerin tabloya bakınız. - bağlanmamış antikorların çıkarılması için 4 ° C'de 5 dakika 200 x g'de hücreleri, girdap ve santrifüj 2 mi lekeleme tampon maddesi ekleyin. hafifçe vurarak süpernatant ve tekrar süspansiyon pelet süzün.
- Lekeleme tampon maddesi içinde seyreltilmiş 10 ul florokrom-eşlenik streptavidin ekleyin (Malzeme Tablo). ışıktan koruyarak 20 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. bağlanmamış streptavidin kaldırmak için adım 3.3 olarak yıkayın.
- En az altı dedektör 9 ile debi sitometresinde hücre örnekleri edinin. Lin sıklığını belirlemek - Sca1 + CD117 + CD135 - CD150
Şekil 2'de gösterildiği gibi, daha önce 10,11 rapor etmiştir.
Not: Bu nüfus içinde fonksiyonel HKH'lerin sıklığı 1/3 ve 1/5 2,12 arasında olduğu tahmin edilebilir. - (Tipik olarak, bu örnekte, rakip B6.SJL CD45.1 +) temel olarak altında ve Şekil 2'de ayrıntılı olarak, bir örnek kullanarak, tüm örnekler 11 tahmini HSC eşdeğerleri oluşturulması.
- aşağıdaki formüller kullanılarak gerekli hücrelerin sayısını hesaplayın:
#transplanted HSC / alıcının = 5 x 10 5 hücre X tahmin HSC frekansı (başlangıç numune için belirlenen bu sayı vahşi tipli C57BL / 6 fareleri için, genellikle 75 ila 125) 10-12.
Not: Şekil 2'de, Örnek A için, sonuç 139 HKH'lerin olduğunu.
(Diğer örnekler için Şekil 2'de örneğin Örnek B) toplam sayısı nakledilen hücrelerin = # transekili HKH'lerin / HSC frekansı.
Not: Şekil 2, örnek B, sonuç 197.826 (ya da yaklaşık olarak 2 x 10 5) toplam kemik iliği hücreleri.
- aşağıdaki formüller kullanılarak gerekli hücrelerin sayısını hesaplayın:
- Yukarıda elde edilen sonuçları kullanarak, her numune için, nakil alıcısına başına gereken hücrelerin toplam sayıları hesaplayın.
Not: Bu sayı temel örneği (rakip) için 5 x 10 5 olmalıdır.- alıcı farelerin sayısı adım 3.7 elde çarpın ve şırınga ölü hacim telafi etmek için en azından iki ilave fareler için yeterli hücre ekleyin.
- Adım 3.6 hesaplanan ve steril PBS kullanarak enjeksiyon başına 200 ul nihai ses seviyesini ayarlamak olarak 1 HSC eşdeğer oranda (örneğin, CD45.1 +) rakip ve 1 test hücreleri (CD45.2 +) karıştırın.
Not: Beş alıcı farelerin bir grup önerilen hacminin büyümesine, dolayısıyla 3.5 x 10 6 rakip kemik iliği hücreleri ihtiva eden, en az 1.4 mi, olduğu (ya da olur için973, Şekil 2'de Örnek A) için tahmin edilen HSC hücreleri, test hücre eşdeğer sayısı (Şekil 2'de, Örnek B eşdeğeri) 197.826 x 7 = 1.384.782 kemik iliği hücreleri olabilir.
4. Kemik İliği Nakilleri
- Kan damarlarının genişlemesine sağlamak ve lateral kuyruk daha görünür damarları yapmak için kırmızı ısı lambası ile adım 1.2 ışınlanmış alıcı fareler ısıtın.
- 27 G iğne (veya daha küçük) ile donatılmış bir 1 ml tüberkülin şırıngası hazırlayın. Aspire (3 alıcı fareler için) hazırlanan hücre süspansiyonu, yaklaşık 750 ul. şırınga içinde hiçbir hava kabarcığı olmadığından emin olun.
- frenleyici bir cihaz içine fare yerleştirin. kuyruk inceleyin ve kuyruk her iki tarafında açıkça görülebilir olmalıdır yanal kuyruk venleri arayın. etanol ile enjeksiyon bölgesini silin. Yukarı konik iğneyi deriye paralel ve pistonu hafifçe bastırın. Enjeksiyon kolay olmalıdır. kuvvet yeniden isequired iğne ven değil.
Not: Eski fareler damar daha zor bulma yapabilir kalın bir deri var. İğne ven değilse, ilk enjeksiyon yerinde iğne proksimal takın. - İğneyi çıkarın ve kanamayı durdurmak için birkaç saniye için steril gazlı bez ile enjeksiyon bölgesini basın. Temiz bir kafesin içine fare aktarın.
Not: İğne çok sıkıcı hale gelebilir, bundan sonra üç enjeksiyon, aynı şırınga ve iğne kullanın. - Nakil sonrası takipte, ilk beş gün boyunca fareler rehydrate steril PBS subkutan 1 ml enjekte edilir. (; Opsiyonel gerekirse) enfeksiyonları önlemek için içme suyu antibiyotik ekleyin. İlk üç hafta boyunca her iki ya da üç gün fareler tartılır ve fazla% 15-20 oranında kendi nakil öncesi vücut kilo kaybı (ya da yerel hayvan etik komitesi tarafından belirlenir) olan fareler euthanize.
Periferik Kan 5. Analizi
- bir damla kan toplayın (approx. EDTA tüpleri içine 50-100 ul).
- Mandibular ven kan toplamak için, çene kemiği altında bulunan tüysüz noktaya yakın yüz cilt delmek ve kan 13 damla almak için toplama tüp yerleştirmek için bir neşter veya 22 G iğne kullanın. çok soyundan sulandırma takip etmek nakilden sonra 4, 8, 12 ve 16 haftalarda kan toplayın.
- Aşama 5.1.1 toplanan kan damla 1 ml taze hazırlanmış RT alyuvar lisiz tamponu (9 kısım 0.16 M NH4CI + 1 kısım 0.17 M Tris-HCI, pH 7.65) ilave. 5 ml flow sitometri için uygun yuvarlak dipli polistiren tüp karıştırın ve transfer örnek. Oda sıcaklığında 4 dakika bekletin.
- buz soğukluğunda PBS 4 hacim ekleyin. uçtan uca çevirerek karıştırın ve buz üzerinde hemen aktarın. 4 ° C'de 200 x g'de santrifüjleyin 10 dakika.
- hafifçe vurarak süpernatant ve tekrar süspansiyon pelet süzün. Süpernatant berrak ve kırmızı olmalıdır. kısaca tampon ve vorteks boyama 2 ml ekleyin. 200 XGA santrifüjleyin 5 dakikaT, 4 ° C.
- hafifçe vurarak süpernatant ve tekrar süspansiyon pelet süzün.
- CD45.1, CD45.2, CD3e, CD19, GR1: adımlara 3.3 3.1 ayrıntılı genel protokolünü kullanarak flow sitometri boyama ve aşağıdaki ana karışımı için antikorlar ile devam edin.
- En az altı dedektör 9 ile debi sitometresinde hücre örnekleri edinin. Şekil 3'te verilen analiz şablon kullanılarak her numune her bir soy (CD19 + B lenfositleri, CD3e + T lenfositleri, GR1 parlak granülositler) ve 10,11 geçme donor kaynaklı hücrelerin sıklığını belirler.
Kemik İliği Sulandırma 6. Analizi
- bölüm 2. Leke master karışımı için adımlar 3.3 3.1 ayrıntılı genel protokolünü kullanarak flow sitometri analizi için hücreleri ve aşağıdaki antikorlar ayrıntılı olarak kemik iliği hücreleri toplamak: Lineage kokteyl, Sca1, CD117, CD135, CD150, CD45.1 , CD45.2. lin AlgılamaAşama 3.4 de tarif edildiği gibi florokrom-eşlenik streptavidin kullanılarak EAGE kokteyl antikorlar.
- En az sekiz dedektör 9 ile debi sitometresinde hücre örnekleri edinin. Sadece altı varsa CD135 + hücreleri dahil edileceği gibi, kalıtsal aynı kanala CD135 ekleyin. Donör kaynaklı Lin sıklığını belirlemek - Sca1 + CD117 + CD135 - Şekil 4 ve 10 geçme olarak sağlanan analiz şablon kullanılarak her numunede CD150 + HSC hücreleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
(Ayrıca aşağıda açıklanmıştır) ikincil nakli dahil rekabetçi nakli ayarı, genel bir açıklama Şekil 1'de bulunabilir. Transplantasyon öncesi kemik iliği HKH'lerin için temsili bir analiz Şekil 2'de bulunabilir. Daha detaylı bilgi çiftler dışlanması ve ölü hücreler başka yerde 9 bulunabilir.
3 ve 4, sırasıyla periferal kan, kemik iliği için analiz şablonları akış sitometrisi örneklerini verir. Bazı konakçı T lemfositlerini tespit etmek için normal (bütün T hücreleri% 20; Şekil 3B), T-hücreleri daha fazla telsiz dayanıklı gibidir. Rakip türetilmiş hücreler üç soy mevcut olmalıdır. tespit sınırı analizi için elde edilen toplam hücre sayısına çok bağlıdır, ancak içinde 20 bin hücre deneyimlerimiz toplamTek lökosit kapısı genellikle yeterlidir. (Şekil 3'te gösterildiği gibi B lenfoid T lenfoid, veya miyeloid) verici hücreler, herhangi bir soy kesim daha düşük bir oranını temsil, fare multilinaj sulandırma için pozitif olarak kabul edilmez,% 1 ya da% 0.5 rasgele bir eşik kullanılarak . rekabet nakli tartışma açıklandığı gibi donor HSClerin ölçmek için sınırlayıcı seyreltme deneyi ile birleştirilir, bu kavram önemli hale gelir. Örneğin, donör alınan T ve B lenfositlerinin, ancak genellikle sadece geçici sulandırma öneriyoruz miyeloid hücreleri, kademeli kaybı kesinlikle mümkündür. Lenfositler miyeloid hücreler daha uzun bir yarı-ömür (özellikle Gr1hi SSChi granülositler / nötrofiller) ve hatta kemik iliği yokluğunda HSCler 10 devam edebilir.
Şekil 5 farklı yerinde altında periferik kan kimerizmin için temsili sonuçlar göstermektedirations. Donör HSC rakip hücre fonksiyonel olarak eşdeğer olduğunda, verici (CD45.2 +) ve rakip (CD45.1 +) oranlan türevi hücrelerin eşdeğeri (Şekil 5A) vardır. Daha radyo dayanıklıdır ve Şekil 5A ve 5B 'de tortusal konakçı hücreler (CD45.1 + CD45.2 +) hemen hemen tamamen T lenfositleri bulunmaktadır. Verici hücreler arasında periferal kan lökositleri (Şekil 5B) çok daha düşük bir oranda mevcut olduğunda, HSC fonksiyonu bazı yönleri hatalı olasıdır ve tartışmada tarif edildiği gibi daha ileri çalışmalara ihtiyaç vardır. rakip hücrelerinin varlığı tahlil iyi çalıştı ama donör kemik iliği sadece daha az etkili olduğunu doğrulamaktadır. Bu, hem donör ve rakip hücre sayıları ve konak hücreler düşük mevcut periferal kan hücrelerinin çoğunluğu temsil Şekil 5C'de, sunulan sonuca zıttır. Bu durumda nakli başarısız ve ben oldut rakip hücrelerinin karşı donörün göreli işlevselliğine herhangi bir sonuç çıkarmak mümkün değildir. Farklı çözümler daha aşağıda ele alınmaktadır.
. Donör farelerden Şekil 1. Deneysel tasarım, rekabetçi bir nakli için (A), kemik iliği hücreleri (CD45.2 +; C57BL6 plan, kontrol ve test) ile konjenik rakip fareler (CD45.1 +; B6.SJL) karıştırılır 1: 1 oranında ve ışınlanmış alıcı farelerin kuyruk damarına enjekte (CD45.1 + CD45.2 +; C57Bl6 F1 soyu B6.SJL üreyen x). Kemik iliği sulandırma etkinliği 4, 8, 12 ve 16 hafta sonra nakil ve 16. haftada, kemik iliği transplantasyonundan sonra ya da daha sonra, kanda (PB) 'de tespit edilir. (B) ayrıca nakledilen hücrelerin kendini yenileme değerlendirmek, bon16 hafta sonra transplant alıcılarında elde e iliği hücreleri ışımaya tutulmuş, ikincil alıcı farelere aktarılabilir. HSC, hematopoetik kök hücre; MPP, multipotent progenitör hücre; LMPP, lenfoid hazırlanmış MPP. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2. Ön nakli, kemik iliği HSC analiz şablonu. Tek hücreler içinde, cKit (CD117) ve Lineage ifadeye göre HSPCs seçin. Lin dim / içinde - hücre popülasyonu, cKit parlak Sca1 + nüfus (LSK) seçin. HKH'lerin - LSKs içinde, CD150 + CD135 seçin. Bu nüfusun bu nüfus olabilirsiniz içinde HKH'lerin (bir repopulating hücrenin sıklığını repopulating uzun vadeli ve kısa vadeli hem de içerirTween 1/3 ve 1/5). Kemik iliği HKH'lerin tahmin edilen frekans tek bir hücre kapısı olayların sayısına göre HSC kapısı olayların sayısına bölünmesiyle hesaplanır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3. Post-transplant periferik kan analizleri şablonu. (A) tek hücrelerin içinde, ilk GR1 parlak DGM merhaba granülositler seçin. B lenfositleri ve CD3e + CD19 - - T lenfositleri (B) Sonra CD19 + CD3e seçin. Fare çevresel kan B lenfositleri başlıca bir hücre türüdürler (yaklaşık% 50 tüm çevresel kan hücreleri) olmak üzere, lenfosit büyük bir kısmını içerir. CE) CD4 her alt kümesi için araziler sitometri 2B akışını Beraberlikdiğer tarafta bir eksen ve CD45.1 5.2. Gösterildiği gibi donör (CD45.2 +), ana bilgisayar (CD45.1 + CD45.2 +) ve her soy için rakip hücreleri (CD45.1 +) belirleyin. Panelde görüldüğü gibi özellikle T lenfosit popülasyonunda, bazı kalan konak hücreleri olması normaldir E. bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4. Post-transplant kemik iliği HSC analiz şablonu. LSKs içinde Şekil 2'de gösterildiği gibi tek hücreler seçin HSPCs ve LSKs içinde seçin CD150 + CD135- HSC, CD150- CD135- multipotent atalarıdır (veya MPPs) ve CD150- CD135 + lenfoid -astarlı MPPs (veya LMPPs). LMPPs oranı ışınlanmamış farelerde daha sonra nakli düşüktür. 2B akış c çizmekdiğer tarafta bir eksen ve CD45.1 üzerinde CD45.2 her alt kümesi için araziler ytometry. gösterildiği gibi, her ICSI'nin için donör, ev sahibi ve rakip hücreleri tanımlamak. Işınlama ve nakli başarılı olursa, çok az sayıda kalan konak HSPCs olmalıdır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Periferik kan kimerizmin için Şekil 5. Temsilcisi sonuçları. (A) Başarılı nakli donör HKH'lerin işlevsel rakip hücrelerine eşdeğerdir. Kalan konakçı hücrelerin büyük çoğunluğunun (CD45.1 + CD45.2 +), genellikle T lenfositleri olup. (B) rakip hücrelere kıyasla verici HKH'lerin gösterisi fonksiyonunda azalma Başarılı nakli. Bu azalma katkı nedeniyle olabilirbirkaç farklı faktörler ve daha fazla analiz (tartışma) ihtiyaç duyulacaktır. (C) rakip ve donör hücreleri ve kalan konak hücrelerin büyük bir kısmı hem düşük frekansları ile başarısız nakli. Sonuç Bu tür başarısız enjeksiyon (kuyruk damarından dışında, enjeksiyon, hücre canlılığını azalma enjeksiyon hacminde azalma) ışınlama beklenen dozundan daha düşük anlaşılacağı veya bunların bir kombinasyonu olabilir. Bu rakamın büyük halini görmek için tıklayınız .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada açıklanan protokol bilinen rakip HKH'lerin karşı donör (test) HKH'lerin göreceli uygunluğunu değerlendirmek için tasarlanmıştır. Yarışmanın durum (kök hücre fitness ılımlı düşüşler tespit etmek için daha büyük olasılıkla) tahlil göreceli hassasiyetini arttırır ve ışınlama ve enjeksiyonu etkinliğinin için bir iç teknik kontrol sağlar. Bununla birlikte, HSC spor mutlak ölçü olarak kullanılmamalıdır; Rekabetçi sulandırma bir azalma otomatik HKH'lerin rekabet yokluğunda iyi bir performans olmaz anlamına gelmez. rekabetçi bir ayar daha iyi bir başlangıç noktası rakip hücreleri hayatta kusurlu HSC fonksiyonu ve tüm alıcı fareler kurtarmak gibi, olduğu iddia edilebilir olsa da, bir sonuçların yorumlanması konusunda dikkatli olmalıdır. bir rekabetçi olmayan bir ortamda sonuçlarını onaylayan sonuçlar pekiştireceğiz.
Burada sunulan deneysel tasarım HSC eşdeğer qu kullanırToplam kemik iliği hücrelerinin durumlarla yerine -sorted HKH'lerin akış sitometrisi saf popülasyonu. Farklı bağışçılar arasında değişkenlik ortadan kaldırmak ve fenotipik HSC sıklığı varyasyonlar HSC fonksiyonu 14 değişiklikler olarak yorumlanır olmayacak emin olmak için çalışmanın (farklı donörler, rakip) altındaki tüm nüfus içinde HKH'lerin sayıları eşitlemek için önemlidir. Arıtılmış HKH'lerin burada açıklanan yaklaşımın avantajları şunlardır: geliştirilmiş hücre canlılığı nedeniyle kısaltılmış işlem süreleri ve sıralama esnasında dış basınç eksikliği; ve alıcı kemik iliğine geliştirilmiş homing (sıralı hücreleri üzerinde antikorların varlığı, kemik iliğinde 15 kendi engraftment engel olabilir). Bunun aksine, ana dezavantajı nakli sonucu olmayan HSC populasyonu katkısı, nakilden sonra erken zaman noktalarında kısa ömürlü progenitör hücrelerin, özellikle bir rolü vardır. Bundan başka, muamele ya da genetik modifikasyon Surfac ekspresyonunu değiştirip değiştirmediğiniHSC 16 seçiminde kullanılan e belirteçleri, hangi edecek önyargı sonuçları, tek numunede değil başka "kılık değiştirmiş" HKH'lerin önemli sayıda olabilir. saflaştırılmış HKH'lerin kullanarak ve nakli tahlil doğasında vardır Ancak, aynı sorunu da ortaya çıkabilir.
Mevcut protokolü kullanılarak elde edilen sonuçlar nüfus düzeyinde sadece nitel vardır. Diğer bir deyişle, nakilden sonra donör hücrelerin azalan katılım nedeniyle olabilir; Başlangıç popülasyonunda fonksiyonel HKH'lerin bir alt numarası; Kemik iliği içine yerleşmek ve nakilden sonra ilk günlerde ve haftalarda genişletmek için bireysel HKH'lerin azalmış becerisi; veya çevre tespiti için kullanılan olgun hücrelerine farklılaşmasının ve gelişiminin sorunları. Izolasyon rekabetçi bir transplant ile ilgili sonuçları kullanma, ancak H, hücre proliferasyonunu, hayatta kalmasını ve farklılaşmasını ölçecek deneyler ile güzelleştirmek için o böylece önemlidirkan hücresi dolaşan SC. Periferik kan verici hücrelerin yokluğunda birlikte kemik iliği donör kaynaklı HKH'lerin varlığı farklılaşma bloğunun gösterge olabilir, aynı zamanda periferik kan (Şekil 3) ve kemik iliği (Şekil 4) arasında verici hücre katkı karşılaştırmak için önemlidir . Örnekte gösterilmemiş olmasına rağmen, Gpi1 17 farklı izoform göre eritroid sulandırma değerlendirmek de mümkündür. kanda mevcut eritrosit çok sayıda göz önüne alındığında, HKH'lerin düşük sayıda nakli veya uzun süreler boyunca kendi çıkışı takip eden özellikle yararlı olabilir donör kaynaklı hücreler için algılama son derece hassas bir yöntem gösterir. Spektrumun diğer ucunda, miyeloid hücreler sık sık nedeniyle kısa yarılanma ömrü, periferik kanda ve kısmen düşük frekansta bir parçası olarak, algılanan başarısız ilk kişilerdir.
Inci uyarlamak mümkündürE rekabetçi repopulation deneyi sınırlayıcı seyreltme analizi (veya LDA) ile HKH'lerin miktarını belirlemek için. sıralı ya da yukarıda tarif edildiği gibi ayrıştırılmamış ya donör hücreleri: Bu, birkaç farklı olup her biri bir grup yarışmacının farklı oranı alır gruba alıcı farelerin çok daha büyük bir gerektirecektir. donör hücrelerin sayısı azaldıkça, donör kaynaklı hücrelerin oranı, bir veya birden fazla soy önceden belirlenmiş eşik ulaşmaz içinde daha fazla farenin olacaktır. Nakledilen donör hücreleri sayısında karşı grup başına "negatif" farelerin sıklığını arsa ve ardından gelen grafikte 18,19 den HKH'lerin sıklığını belirlemek mümkündür.
Nakil sonrası izlem önerilen süre literatürde değişir. nakilden sonra 16 haftalık periyodu uzun vadeli HKH'lerin çıkışını yansıtmak için yeterli olduğu kabul edildi uzlaflmalar olması için kullanılır. i "Bununla birlikte, son raporlarİşlevi 16 hafta gerektiğinin altını çizdi var kısa bir süre sonra azalır ntermediate "HKH'lerin HSC işlevinin 17 daha titiz değerlendirme için. endişeleri tatmin etmek için 16 haftalık bir zaman noktasında geçmiş transplant alıcılarında takibini uzatmak elbette mümkündür. Bir bir kez daha bir tartışmasız yüksek hassasiyet ile alternatif bir seçenek, kemik iliği hücreleri ışınlanmış ikincil alıcıların içine enjekte edilir, ilk transplant alıcılarında kurtarıldı ikincil nakli (Şekil 1B) 'dir. ikinci nakli onların çıkış zorlayarak, HKH'lerin ek proliferatif baskı koyar daha iyi ikincil nakli için farklı örnekler arasında HSC numaraları ayarlamak için sıralı donör hücreleri kullanmak bazen tercih edilir dormansi gelen ve çıkışını sürdürmek için sağlam kendini yenileme ile sadece hücreleri tanır.. Alternatif olarak, vericinin tahmini oranını kurmak mümkündür : birincil kemik iliğinden rakip HKH'lerin (örneğin,
Yukarıda belirtildiği gibi, verici HSCler belirli bir göstermeyi nedenleri olabilir bir takım uzun vadeli yeniden oluşturma kapasitesine azalma vardır. Böyle bir nedeni nakli (diğer adıyla hominginde) sonra kemik iliğine göç ve kemik iliği niş içinde kendilerini yerleşmek HKH'lerin yeteneğidir. Kemik iliği homing ve kısa süreli genişleme araştırmak için burada sunulan protokol adapte etmek mümkündür. Nakledilen hücrelerin sayısı (5,000-10,000 HKH'lerin eşdeğer geliştirmek için gerekli olangüdümlü tahlilleri ve nakilden sonra ilk hafta içinde analiz için 1.000-2.000 HKH'lerin). güdümlü deneyde, alıcı fareler nakilden sonra ilk 16-24 saat ve mevcut protokolde belirtildiği şekilde saptanan kemik iliği ulaşmış donör HKH'lerin sayısı içinde ötenazi. Şekil 1B açıklandığı gibi daha da işlevini değerlendirmek için, kısa vadeli alıcılar kurtarıldı kemik iliği hücrelerinin ikincil alıcıya naklediliyor edilebilir. İkinci alıcı verici türevli hücrelerin oranı daha sonra göç ve alıcı kemik iliği içine yerleşmek için donör HKH'lerin yeteneğini değerlendirmek için de kullanılabilir.
Rekabetçi kemik iliği nakli ile büyük sorunlar ışınlama ve enjeksiyon kaynaklanan ve ya artmış transplant sonrası mortalite olarak kendilerini veya sulandırma verimliliği azalmıştır. Burada sunulan tanımlanan split-doz ışınlama, genellikle daha verimli miyeloablasyon ile bağlantılıdır vetek doz 20 oranla daha az toksisite. Doz (iki kez 450 rad) burada tavsiye ile, miyeloid ve B lenfoid popülasyonları verimli silinmiş ama artık T lenfositleri (Şekil 3) olmaya devam ediyor edilmiştir. greft reddi (farklı genetik kökenden gelen donör ve alıcı fareler), ışınlama daha yüksek bir doz (550-600 rad iki doz) ile iki doz arasında kısa bir gecikme (4 saat yerine ertesi gün kuşkulanmak için herhangi bir neden varsa ) rezidüel T lenfositleri ortadan kaldırmaya yardımcı ve ret nedeniyle greft yetmezliği olasılığı azaltmak gerekir. perivasküler alan yerine kuyruk damar içine yanlış enjeksiyon veya enjeksiyon, numune hazırlama esnasında gerekli özeni eksikliği donör hücre canlılığı, ya da donör hücre kontaminasyonu ile ilgili sorunlar da greft yetmezliği ve nakil sonrası mortaliteyi arttıracaktır. (Örneğin, teknik sorunlar nedeniyle) etkin olmayan ışıma azalma sulandırma verimi ile sonuçlanır, ancak mo artmamalıdırrtality. rakip hücreleri daima ışınlanmış alıcıyı sulandırmak mümkün olması gerektiği gibi donör HSC işlevinde iyi niyetli bir azalma (burada ayrıntılı olarak), bu durumların hepsinde, deneyde rakip hücrelerinin varlığı teknik sorunlar ayırmak için yardımcı olur. Bağışıklık yetersizliği olan ana da ışınlama ve / veya gref reddi açısından risk ihtiyacını azaltmak için ve insan HSC 21-23 fonksiyonunu değerlendirmek için, örneğin, de kullanılabilir.
Sonuç olarak, burada bir tartışma ayrıntılı olarak farklı kullanımlar için uyarlanabilen bir rekabetçi nakil protokolü sunulmaktadır. Bizim yaklaşımımız işlem sürelerini azaltır ve hücre sıralama karşılaştırıldığında aynı anda greft hücre canlılığı artırır, HSC eşdeğerleri kullanır. Bir hücre sıralayıcı erişim sınırlıdır ve HSC fonksiyonunun analizi için cazip bir başlangıç noktası yapmak, nicel LDA tahlile göre daha az fareler gerektiğinde ayrıca pratik bir çözümdür. </ P>
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Biz prosedürlerin rakam tasarımı ve gösteri yardım için Roxann Hetu-Arbour müteşekkiriz. Laboratuvarda Araştırma Cole Vakfı Geçiş ödülü tarafından desteklenen, Discovery hayır verin. Doğa Bilimleri ve Kanada'nın (NSERC) Mühendislik Araştırma Konseyi ve Kanada Yenilik Vakfı (CFI Liderler Fonu hayır. 31377 hibe) 419226-2012. Santé (FRQS) - KMH Fonds de recherche du Québec için chercheur-BOURSIER konumundadır olduğunu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microtainer tubes with K2EDTA | BD Biosciences | 365974 | |
| 20 G needle | BD Syringe | For blood sampling from the mandibular vein | |
| LabQuake Shaker rotisserie | Thermo Scientific | C415110 | |
| Purified anti-mouse CD16/CD32 (clone 2.4G2, Fc Block) | BD Biosciences | 553142 | 2.50 μg/ml |
| Pe-Cy7-conjugated anti-mouse CD3e (clone 145-2C11) | eBioscience | 25-0031 | 0.25 μg/ml |
| PE-conjugated anti-mouse CD19 (clone 1D3) | eBioscience | 12-0193 | 0.25 μg/ml |
| APC-eFluor780 (APC-Cy7 equivalent)-conjugated anti-mouse GR1 (clone RB6-8C5) | eBioscience | 47-5931 | 0.25 μg/ml |
| FITC-conjugate anti-mouse CD45.1 (clone A20) | eBioscience | 11-0453 | 2.50 μg/ml |
| eFluor450-conjugated anti-mouse CD45.2 (clone 104) | eBioscience | 48-0454 | 1.00 μg/ml |
| Biotinylated anti-human/mouse CD45R (B220) (clone RA3-6B2) | eBioscience | 13-0452 | 1.25 μg/ml |
| Biotinylated anti-mouse CD3e (clone 145-2C11) | eBioscience | 13-0031 | 1.25 μg/ml |
| Biotinylated anti-mouse CD11b (clone M1/70) | eBioscience | 13-0112 | 1.25 μg/ml |
| Biotinylated anti-mouse GR1 (clone RB6-8C5) | eBioscience | 13-5931 | 1.25 μg/ml |
| Biotinylated anti-mouse TER119 (clone TER119) | eBioscience | 13-5921 | 0.625 μg/ml |
| V500 streptavidin | BD Biosciences | 56149 | 0.5 μg/ml |
| PE-conjugated anti-mouse CD117 (clone 2B8) | BD Biosciences | 553355 | 0.25 μg/ml |
| PE-Cy7-conjugated anti-mouse Ly6A/E (Sca1) (clone D7) | BD Biosciences | 558162 | 0.25 μg/ml |
| PerCP-eFluor710-conjugated anti-mouse CD135 (clone A2F10) | eBioscience | 46-1351 | 0.5 μg/ml |
| Alexa fluor 647-conjugated anti-mouse CD150 (clone TC15-12F12.2) | Biolegend | 115918 | 0.625 μg/ml BD Biosciences and eBioscience do not carry the same clone |
| 1 ml tuberculin syringe with 27 G needle | BD Syringe | 309623 | |
| 1 ml tuberculin syringe with 25 G needle | BD Syringe | 309626 | |
| 70 μm cell strainer | BD Falcon | 352350 |
References
- Li, H. W., Sykes, M. Emerging concepts in haematopoietic cell transplantation. Nat Rev Immunol. 12 (6), 403-416 (2012).
- Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Terhorst, C., Morrison, S. J. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).
- Kim, I., He, S., Yilmaz, O. H., Kiel, M. J., Morrison, S. J. Enhanced purification of fetal liver hematopoietic stem cells using SLAM family receptors. Blood. 108 (2), 737-744 (2006).
- Mayle, A., Luo, M., Jeong, M., Goodell, M. A. Flow cytometry analysis of murine hematopoietic stem cells. Cytometry A. 83 (1), 27-37 (2013).
- Rossi, L., et al. Less Is More: Unveiling the Functional Core of Hematopoietic Stem Cells through Knockout Mice. Cell Stem Cell. 11 (3), 302-317 (2012).
- Till, J. E., McCulloch, E. A direct measurement of the radiation sensitivity of normal mouse bone marrow cells. Radiat Res. 14, 213-222 (1961).
- Shen, F. W., et al. Cloning of Ly-5 cDNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (21), 7360-7363 (1985).
- Identification of GM mice. Laboratory Animals. 37 (suppl 1), 33-35 (2003).
- Rundberg Nilsson, A., Bryder, D., Pronk, C. J. H. Frequency determination of rare populations by flow cytometry: A hematopoietic stem cell perspective. Cytometry Part A. 83A (8), 721-727 (2013).
- Abidin, B. M., Owusu Kwarteng, E., Heinonen, K. M. Frizzled-6 Regulates Hematopoietic Stem/Progenitor Cell Survival and Self-Renewal. J Immunol. 195 (5), 2168-2176 (2015).
- Heinonen, K. M., Vanegas, J. R., Lew, D., Krosl, J., Perreault, C. Wnt4 enhances murine hematopoietic progenitor cell expansion through a planar cell polarity-like pathway. PLoS One. 6 (4), e19279 (2011).
- Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. J. SLAM family markers resolve functionally distinct subpopulations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors. Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).
- Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Anim (NY). 34 (9), 39-43 (2005).
- Santaguida, M., et al. JunB protects against myeloid malignancies by limiting hematopoietic stem cell proliferation and differentiation without affecting self-renewal. Cancer Cell. 15 (4), 341-352 (2009).
- Czechowicz, A., Kraft, D., Weissman, I. L., Bhattacharya, D. Efficient transplantation via antibody-based clearance of hematopoietic stem cell niches. Science. 318 (5854), 1296-1299 (2007).
- Zhang, C. C., Lodish, H. F. Murine hematopoietic stem cells change their surface phenotype during ex vivo expansion. Blood. 105 (11), 4314-4320 (2005).
- Benveniste, P., et al. Intermediate-Term Hematopoietic Stem Cells with Extended but Time-Limited Reconstitution Potential. Cell Stem Cell. 6 (1), 48-58 (2010).
- Fazekasde St Groth, B. The evaluation of limiting dilution assays. J Immunol Methods. 49 (2), R11-R23 (1982).
- Louis, I., Heinonen, K. M., Chagraoui, J., Vainio, S., Sauvageau, G., Perreault, C. The signaling protein Wnt4 enhances thymopoiesis and expands multipotent hematopoietic progenitors through beta-catenin-independent signaling. Immunity. 29 (1), 57-67 (2008).
- Cui, Y. Z., et al. Optimal protocol for total body irradiation for allogeneic bone marrow transplantation in mice. Bone Marrow Transplant. 30 (12), 843-849 (2002).
- Benz, C., et al. Hematopoietic Stem Cell Subtypes Expand Differentially during Development and Display Distinct Lymphopoietic Programs. Cell Stem Cell. 10 (3), 273-283 (2012).
- Eppert, K., et al. Stem cell gene expression programs influence clinical outcome in human leukemia. Nat Med. 17 (9), 1086-1093 (2011).
- McIntosh, B. E., et al. Nonirradiated NOD,B6.SCID Il2rgamma-/- Kit(W41/W41) (NBSGW) mice support multilineage engraftment of human hematopoietic cells. Stem Cell Reports. 4 (2), 171-180 (2015).
