Introduction
Hematopoiesis הוא תהליך התחדשות המבטיח את replenishing של תאי דם אבדו בגלל פציעה, קרינת מוות של תאים. תהליך זה מובטח על ידי תאי גזע hematopoietic (HSC) השוכנים בעיקר במח העצם הבוגר. בנוסף, תאי גזע hematopoietic יכול לשמש למטרות טיפוליות במחלות אוטואימוניות, מחלות ממאירות המטולוגית ו חסרים חיסוניים 1. יש אפוא צורך להבין טוב יותר את המנגנונים המווסתים פונקציה HSC, ובכלל זה, הרחבת שגשוג שלהם ואת יכולתם להגיע נקלטים במח העצם הנמען לאחר ההשתלה. למרות מחקרים שנעשו לאחרונה דיווחו מספר סמנים פני התא, כולל בני משפחה SLAM CD150 ו CD48, להעשיר HSCs מבוגר פרוספקטיבית HSCs העובר בכ -50% טוהר 2-4, המדד תקן הזהב עבור HSCs פונקציונלי נשאר in vivo repopulating assay כדי לקבוע את יכולתם להקים מחדש ג דםייצור ell ב מארח מוקרן 5.
את assay repopulating in vivo המשובטים בתחילה פותח על ידי טיל מקול'ץ 6 ומאז שוכלל והורחב. כהגדרתם במקור, HSCs להבטיח ייצור תאי דם חיים, דרך התחדשות עצמית והבחנה. העברת HSCs לתוך נמען מוקרן ובכך מאפשרת לנו להעריך: יכולתי להבחין באמצעות הניתוח של שושלות תאי דם השונות (לימפוציטים מסוג T, לימפוציטים מסוג B, גרנולוציטים, מונוציטים) ויכולים עבור התחדשות עצמית באמצעות השתלת סדרתי. את assay בדרך כלל יהיה כרוך ההשוואה של פונקציונליות ו / או כמות של שתי אוכלוסיות של HSCs, למשל, תאים המגיעים שני עכברים של גנוטיפים או תאים שונים אשר טופלו או מטופלים עם גורמים שונים שיכולים להשפיע על תחזוקה או הרחבה של HSCs בתרבות. chimerism התורם, או התרומה של התורם מועבר HSCs tייצור תאי דם o אז יכול להיקבע על ידי ניתוח תזרים cytometry בדם ההיקפי ומח עצם באמצעות סמנים פני תא או שיטות אחרות אשר להבחין בין תאי תורם מן הנמען, או מארח. הסמנים הנפוצים ביותר הם ללא ספק שני אללים של הגן Ptprc או לויקוציטים CD45 אנטיגן 7 שבחרנו עבור הדוגמות להלן.
את assay והאכלוס המשובט יכול להיות תחרותי או לא תחרותי. באווירה הלא תחרותית, HSCs מלא הבדיקה מועבר לעכברי נמען נפרדים ואת התוצאה עבור כל סוג תא תהיה עצמאית של אחרים. על רקע תחרותי, הפונקציה של שני HSCs הבדיקה והבקרה נמדדה כנגד אוכלוסייה של המתחרה HSCs. הפרוטוקול המתואר כאן משתמש בהגדרה התחרותית אבל יכול גם להיות מותאם למצבים שאינם תחרותיים. יש שני גישות היתרונות והמגבלות שלהם, ואנו להשוות אותם בפירוטדִיוּן. כמו כן, אנו מתארים גישות שונות על מנת להבטיח הון במספר HSCs המושתל, להסביר כיצד להתאים את assay עבור כימות של HSCs על ידי הגבלת assay דילול (LDA), ולספק דוגמאות הן של השתלות מוצלחות ולא מוצלחות על הפרשנות של תוצאות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הנהלים מתוארים בפרוטוקול זה אושרו על ידי ועדת אתיקת חיה המוסדית אחרי המועצה הקנדית על הנחיות טיפול בבעלי החיים.
הערה: כדי לשמור על תנאים סטריליים דיור / ספציפיים חינם לפתוגן, לנהל את כל הנהלים הקשורים טיפול ישיר של עכברים חיים בתוך ארון בטיחות ביולוגי או ברדס זרימה למינרית. נקו או לעקר כלובים, התקני ריסון, חומרים דיור, צ'או ומים הניתנים לבעלי החיים כראוי. השתמש רק מחטים סטריליות, חד פעמיות עבור הזריקות לדגימת דם. טכניקת אספטי היא קריטית במהלך תקופת ההכנה של השתל.
1. הכנת עכברים הנמען
- לזהות עכברי נמען עם חריצי אוזן (או שיטה אחרת שאושרה על ידי ועדת האתיקה של בעלי החיים המקומית 8) כדי לאפשר מעקב פרט של כינון מחדש מח העצם ודם היקפי לאורך זמן. לשקול העכברים עבור מעקב לאחר ההשתלה. לָנוּעכברי נמען דואר כי הם בין 7 ל 12 שבועות (פחות מ -25 גרם).
הערה: בדוגמא בתנאי, CD45.1 + CD45.2 + עכברי נמען גדלו בבית על ידי חציית עכברי C57Bl / 6 עם עכברי B6.SJL congenic. - מקרין עכברי נמען עם שתי מנות של 450 rad להרוס פעילות hematopoietic. נתן המנה הראשונה היום לפני השתלה ואת hr 1-2 השני לפני ההשתלה.
הערה: רנטגן או קרני גמא יכול גם לשמש תלוי בזמינות של הסביבה מתאימה.
2. הכנת תאים במח העצם התורם ומתחרה
- להרדים תורם (מבחן ובקרה; CD45.2 +) ושל המתחרה (CD45.1 +; B6.SJL) עכברים בחנק CO 2 ואחריו נקע בצוואר רחם או בשיטות אושרו על ידי ועדת האתיקה של בעלי החיים המקומית.
- מניח עכברים על הגב, רגליים פתוחות לרווחה, צלחת פטרי ריקות או על גזת סטרילי (כדי לשמור על משטח העבודה נקי) inside ארון בטיחות ביולוגית. להרטיב את העור ופרווה עם 70% אתנול / 30% H 2 O (V / V).
- חותכים את הרגל עם להב כירורגי או במספריים חדים. לחתוך את העור לאורך הרגל ולמשוך את העור באמצעות מלקחיים משוננים. חותכים את השריר על עודף.
- לנקוע הירך על ידי משיכת עצם הרגל ושימוש להבי מספריים נגד עצמות האגן ככוח הדלפק. ניתוק השוקה ועצם ירך מן פיקת הברך ולהסיר חתיכות הנותרים של שרירים וגידים. מניחים את העצמות 2-3 מ"ל בופר פוספט סטרילית (PBS) בצלחת בתרבית רקמה 6 באר.
- איסוף תאים במח העצם על ידי שטיפה העצמות עם 5 מ"ל סטרילי PBS.
- החזק את העצם בעדינות עם מלקחיים להכניס מחט 25 G מצורף מזרק 1 מ"ל מלאים עד קצה אחד של העצם. לחץ על הבוכנה לאסוף את התאים צינור חרוטי 15 מ"ל. חזור לפי הצורך עד מרכז העצם הוא לבן.
- לנתק את התאים על ידי חוזרות עובר דרך המחטלקבל השעיה תא בודד. הימנע בועות כוח עודף. הערה: שימוש במחט מעט גדול (22 G) כדי לשפר את כדאיות התא בשלב זה.
- להעביר את התאים דרך מסננת ניילון 70 מיקרומטר כדי להבטיח השעית תא אחידה להסיר פסולת גושים.
- הסרת aliquot עבור ספירת תאים באמצעות hemocytometer. צנטריפוגה השעית התא הנותרת ב XG 200 במשך 5 דקות ב 4 °. כוונו צפיפות התאים כנדרש PBS סטרילי (10 8 תאים / מ"ל). שמור את התאים על קרח.
3. הקמת תורם תא ושווי HSC
- מעבירים את שווה ערך של 3 x 10 6 תאים (30 μl) לתוך 5 מ"ל עגול צינור קלקר בתחתית עבור cytometry זרימה מכתים. הוסף נפח שווה של נוגדנים ללא תווית נגד CD16 / CD32 לחסום מכתים הלא ספציפית (מדולל במאגר מכתים (PBS השלימו עם אלבומין 0.1% שור (BSA) ו 1 mM EDTA) ריכוז סופי של 2.5 מיקרוגרם / מ"ל). דגירה 5 דקות ב RT.
- להוסיף 90 μl תערובת אמן נוגדן fluorochrome- מצומדות ערוכים חיץ מכתים: קוקטייל Lineage biotinylated (B220, CD3e, CD11b, Gr1, Ter119), Sca1, CD117, CD135, CD150. דגירה על קרח למשך 30 דקות, מוגן מפני אור.
הערה: דילולים מתאימים צריכים להיקבע לכל מנה של נוגדנים. ראה טבלה של חומרים עבור דילולים השתמשו במחקר זה. - הוסף 2 מ"ל חיץ מכתים את התאים, מערבולת ו צנטריפוגות ב XG 200 במשך 5 דקות ב 4 ° C כדי להסיר נוגדן מאוגד. למזוג supernatant ו resuspend גלולה ידי מצליף.
- הוסף 10 μl streptavidin fluorochrome- מצומדות מדולל במאגר מכתים (ראה לוח חומרים). דגירה על קרח למשך 20 דקות, מוגן מפני אור. לשטוף כמו בשלב 3.3 להסיר streptavidin מאוגד.
- רוכש את דגימות תאים באמצעות cytometer זרימה עם 9 שישה גלאים לפחות. מהי תדירות של לין - Sca1 + CD117 + CD135 - CD150
הערה: תדירות HSCs פונקציונלי בתוך האוכלוסייה שניתן לאמוד אותה בין 1/3 ו 1/5 2,12. - להקים ושווי HSC מוערך עבור כל הדגימות 11, באמצעות דגימה אחת (בדרך כלל, המתחרה, B6.SJL CD45.1 + בדוגמה זו) כמו הבסיס כמפורט להלן ו באיור 2.
- לחשב את המספרים של תאים נדרש תוך שימוש בנוסחאות הבאות:
#transplanted HSCs / הנמען = 5 x 10 x 5 תאים תדירות HSC מוערך (כפי שנקבע עבור מדגם הבסיס, מספר זה הוא בדרך כלל בין 75 ל 125 עבור wildtype C57Bl / 6 עכברים) 10-12.
הערה: באיור 2, למדגם, התוצאה היא 139 HSCs.
תאים כוללים מושתלים # (עבור דוגמאות אחרות; למשל לדוגמא B באיור 2) = # טרנסתדירות HSCs / HSC נטוע.
הערה: באיור 2, עבור מדגם B, התוצאה היא 197,826 (או כ 2 x 10 5) תאי מח העצם הכולל.
- לחשב את המספרים של תאים נדרש תוך שימוש בנוסחאות הבאות:
- לחשב את המספרים הכוללים של תאים נדרשו למקבל שתל עבור כל דגימה באמצעות התוצאות שהתקבלו לעיל.
הערה: מספר זה אמור להיות 5 x 10 5 למדגם המחקר (המתחרה).- הכפל את מספר המתקבלים צעד 3.7 במספר עכברים הנמען ולהוסיף מספיק תאים עבור לפחות שני עכברים נוספים כדי לפצות על נפח מת בתוך המזרק.
- מערבבים מתחרה (למשל, CD45.1 +) ותאי הבדיקה (CD45.2 +) ב 1: 1 יחס שווה HSC כפי שחושב בשלב 3.6 ולהתאים את עוצמת הקול הסופי עבור 200 μl לכל זריקה באמצעות PBS סטרילית.
הערה: קבוצה של חמישה עכברים הנמען נפח הציע ובכך יהיה לפחות 1.4 מ"ל, המכיל תאים במח העצם 3.5 x 10 6 מתחרה (אוHSCs 973 מוערך למדגם באיור 2), ומספר שווה של תאים הבדיקה (באיור 2, המקבילה עבור B לדוגמא יהיה 197,826 x 7 = 1,384,782 תאים במח העצם).
4. השתלת מח עצם
- לחמם את עכברי הנמען המוקרנים בשלב 1.2 עם מנורת חום אדומה על מנת להבטיח התרחבות של כלי דם ועל מנת להפוך את הזנב לרוחב ורידים יותר לעין.
- הכן מזרק טוברקולין 1 מ"ל מצויד במחט 27 G (או קטן יותר). לשאוב כ 750 μl של השעית התא המוכנה (עבור 3 עכברי נמען). ודא שאין בועות אוויר בתוך המזרק.
- הכנס את העכבר לתוך מכשיר הרחקה. בדוק את הזנב ולחפש ורידי הזנב לרוחב כי צריך להיות בבירור משני צידי הזנב. נגב את הזריקה עם אתנול. הכנס את המחט שפוע מעלה, במקביל העור ולחץ בעדינות את הבוכנה. הזרקה צריכה להיות קלה. אם כוח הוא מחדשquired, המחט לא בתוך הווריד.
הערה: יש עכברים מבוגרים עור עבה יותר, מה שעשוי להפוך את מציאת הווריד קשה יותר. אם המחט אינה בווריד, הכנס שוב את הפרוקסימלי מחט על הזריקה הראשונית. - הסר את המחט ולחץ על הזריקה עם גזה סטרילי במשך כמה שניות כדי לעצור את הדימום. מעבירים את העכבר לכלוב נקי.
הערה: השתמש באותו מזרק ומחט במשך שלוש זריקות, שלאחריו המחט עשויה להיות משעממת מדי. - עבור המעקב לאחר ההשתלה, להזריק 1 מ"ל סטרילי מתחת לעור PBS רעננותם העכברים בחמשת הימים הראשונים. להוסיף אנטיביוטיקה במי שתייה למניעת זיהומים (אם נדרש; אופציונאלי). לשקול עכברים כל יומיים שלושה במשך שלושת השבועות הראשונים להרדים עכברים שאיבדו יותר מ 15-20% ממשקל הגוף מראש השתלת שלהם (או כפי שנקבע על ידי ועדת האתיקה של בעלי חיים מקומיים).
5. ניתוח של דם היקפי
- אסוף טיפת הדם (אpprox. 50-100 μl) לתוך צינורות EDTA.
- כדי לאסוף דם מהעורק mandibular, השתמש ניתוח או מחט 22 G כדי לחדור את עור הפנים בסמוך למקום ללא שיער הממוקם מתחת לעצם הלסת במקום צינור איסוף לקבל את טיפת הדם 13. איסוף דם ב 4, 8, 12 ו -16 שבועות לאחר ההשתלה לעקוב כינון מחדש רבת שושלת.
- הוסף 1 מ"ל מוכן טרי RT חיץ אדום דם תא תמוגה (9 חלקים 0.16 M NH 4 Cl + 1 חלק 0.17 M Tris-HCl pH 7.65) עד טיפת הדם שנאסף בשלב 5.1.1. מערבבים והעברת מדגם ל -5 מ"ל צינור קלקר מסביב לתחתית מתאים cytometry הזרימה. תנו להחזיק מעמד 4 דקות ב RT.
- הוסף 4 כרכים של PBS קר כקרח. מערבבים על ידי סיבוב מקצה לקצה ולהעביר מיד על הקרח. צנטריפוגה 10 דקות ב 200 XG ב 4 מעלות צלזיוס.
- למזוג supernatant ו resuspend גלולה ידי מצליף. Supernatant צריך להיות ברור ואדום. הוסף 2 מ"ל מכתים חיץ בקצרה מערבולת. צנטריפוגה 5 דקות ב 200 XGAt 4 מעלות צלזיוס.
- למזוג supernatant ו resuspend גלולה ידי מצליף.
- המשך עם זרימת cytometry מכתים באמצעות פרוטוקול הכלליים המפורטים צעדים 3.1 עד 3.3 ואת הנוגדנים הבאים מיקס מאסטר: CD45.1, CD45.2, CD3e, CD19, Gr1.
- רוכש את דגימות תאים באמצעות cytometer זרימה עם 9 שישה גלאים לפחות. מהי התדירות של תאים תורמים נגזר לכל שושלת (לימפוציטים CD19 + B, לימפוציטים CD3e + T, גרנולוציטים בהיר Gr1) בכל מדגם באמצעות תבנית הניתוח מסופקת באיור 3 ו כפי שפורסם 10,11.
6. ניתוח של כינון מח עצם
- איסוף תאים במח העצם כמפורט בסעיף 2. הכתם התאים לניתוח cytometry זרימה באמצעות פרוטוקול הכלליים המפורטים צעדים 3.1 עד 3.3 ואת הנוגדנים הבאים מיקס מאסטר: קוקטייל Lineage, Sca1, CD117, CD135, CD150, CD45.1 , CD45.2. זיהוי ליןeage נוגדנים קוקטייל באמצעות streptavidin fluorochrome- מצומדות כמתואר בשלב 3.4.
- רוכש דגימות תאים באמצעות cytometer זרימה עם 9 שמונה גלאים לפחות. אם רק שש זמינים, להוסיף CD135 לאותו ערוץ כמו לוח שושלת כפי CD135 + תאים ייכללו. מהי התדירות של לין תורם נגזר - Sca1 + CD117 + CD135 - CD150 + HSCs בכל מדגם באמצעות תבנית הניתוח מסופקת באיור 4 וכפי שפורסם 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תיאור כללי של הגדרת ההשתלה התחרותית, לרבות השתלות משניות (דנו בהמשך) ניתן למצוא באיור 1. ניתוח נציג HSCs במח עצם מראש השתלה ניתן למצוא באיור 2. מידע מפורט יותר על הדרת כפילויות ו ניתן למצוא תאים מתים במקום אחר 9.
איורים 3 ו -4 לספק דוגמאות של זרימת cytometry תבניות ניתוח דם היקפיים ומח העצם, בהתאמה. זה נורמלי לזהות כמה לימפוציטים T הפונדקאי (עד 20% מכלל תאי T; איור 3), כמו תאי T הם יותר עמיד רדיו. נגזרות תאי מתחרה צריכים להיות נוכחים בכל שלוש השושלות. את גבול הגילוי תלוי הרבה על מספר התאים הכוללים שנרכשו לניתוח, אבל מניסיוננו סך של 20 אלף תאים בתוךשער לויקוציטים יחיד הוא בדרך כלל מספיק. שימוש סף שרירותי של 1% או 0.5%, אם תאי תורם מייצגים יחס נמוך יותר מאשר ההפסקה בכל שושלת נתונה (הלימפה B, הלימפה T, או מיאלואידית כפי שמוצג באיור 3), העכבר אינו נחשב חיובי עבור כינון מחדש multilineage . מושג זה הופך להיות חשוב כאשר ההשתלות התחרותיות משולבות עם assay דילול מגביל לכמת HSCs תורם כפי שהוסברו בדיון. אפשר בהחלט להיות, למשל, תורם נגזרות לימפוציטים מסוג T ו- B אבל אובדן הדרגתי של תאים מיאלואידית, אשר בדרך כלל הייתי מציעים כינון מחדש חולף בלבד. יש לימפוציטים זמן מחצית חיים יותר מאשר תאי מיאלואידית (במיוחד גרנולוציטים Gr1hi SSChi / נויטרופילים) ויכולים להימשך גם בהיעדר של מח עצם 10 HSCs.
איור 5 מתאר תוצאות נציג chimerism דם היקפי תחת באתרו השונהations. כאשר HSCs התורם הם מקבילים לתאים מתחרים, את הפרופורציות של תורם (CD45.2 +) ושל מתחרה (CD45.1 +) תאי -derived שקולים (איור 5 א). תאי המארח שיורית (CD45.1 + CD45.2 +) באיור 5A ו 5B הם כמעט אך ורק לימפוציטים מסוג T כפי שהם יותר רדיו עמיד. כאשר תאי תורם מציגים שיעור נמוך בהרבה של לויקוציטים מדם היקפיים (איור 5), כמה היבטים של תפקוד HSC צפויים ומחקרים נוספים פגומים נדרשים כמתואר בדיון. הנוכחות של תאי מתחרה מאשרת כי assay עבד טוב אבל מח עצם מתורם היה פשוט פחות יעיל. זאת בניגוד לתוצאות שהוצגו איור 5 ג, שבו שני תאי התורם מתחרים נוכחים במספרים נמוכים ותאי מארח מייצגים את רוב תאי דם היקפיים. במקרה זה ההשתלה לא צלח ואניt לא ניתן להסיק מסקנות באשר הפונקציונלי היחסית של תורם לעומת תאים מתחרים. פתרונות שונים נדונים בהמשך.
. באיור 1. עיצוב ניסיוני (א) להשתלה תחרותית, תאי מח עצם מעכברים תורמים (CD45.2 +; C57BL6 רקע; מלאי בדיקה) ו congenic המתחרה עכברים (CD45.1 +; B6.SJL) מעורבבים יחס של 1: 1 ו מוזרק לוריד הזנב של עכברי נמען מוקרנים (CD45.1 + CD45.2 +; צאצאי F1 של C57BL6 x זוגות רביית B6.SJL). יעילותה של כינון מחדש של מח העצם נקבעה בדם היקפי (PB) בשעה 4, 8, 12 ו -16 שבועות לאחר השתלה ו במח העצם בגיל 16 שבועות לאחר השתלה או במאוחר. (ב) כדי להעריך עוד יותר את ההתחדשות העצמית של תאים מושתלים, bonתאי דואר מח התאוששו מושתלים לאחר 16 שבועות ניתן להעביר לעכברי נמען משניים מוקרן. HSC, תאי גזע hematopoietic; MPP, תא אב מולטיפוטנטיים; LMPP, MPP דרוך-הלימפה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
תבנית ניתוח איור 2. HSC מח עצם טרום ההשתלה. בתוך תאים בודדים, בחר HSPCs פי cKit (CD117) וביטוי Lineage. בתוך לין עמום / - אוכלוסיית תאים, בחר את cKit בהיר Sca1 + האוכלוסייה (LSK). בתוך LSKs, בחר CD150 + CD135 - HSCs. אוכלוסייה זו כוללת הן לטווח ארוך לטווח קצר repopulating HSCs (תדירות תא repopulating בתוך אוכלוסייה זו להיותtween 1/3 ו 1/5). את התדירות המשוערת של מח עצם HSCs מחושבת על ידי חלוקת מספר אירועי שער HSC במספר אירועי שער התא הבודד. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
תבנית איור 3. בדיקות דם היקפיים לאחר ההשתלה. (א) תוך תאים בודדים, בחר Gr1 הראשון גרנולוציטים היי SSC בהיר. (ב) לאחר מכן בחר CD19 + CD3e - לימפוציטים מסוג B ו CD3e + CD19 - לימפוציטים מסוג T. העכבר היקפי דם מכיל חלק גדול של לימפוציטים, עם לימפוציטים מסוג B להיות סוג התאים העיקרי (כ 50% מכלל תאי הפריפריה). CE) צייר זרימת 2D cytometry מגרשים עבור כל תת קבוצה עם CD45.2 על ציר CD45.1 אחד על השני. לזהות התורם (CD45.2 +), המארח (CD45.1 + CD45.2 +) ותאי מתחרה (CD45.1 +) עבור כל השושלת כפי שמוצג. זה נורמלי יש כמה תאים לארח נותרים, בעיקר בקרב האוכלוסייה לימפוציטים T כפי שניתן לראות בלוח א אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. מח עצם לאחר ההשתלה HSC תבנית ניתוח. בתוך תאים בודדים, HSPCs בחר LSKs כמוצג עבור איור 2. בתוך LSKs, בחר CD150 + CD135- HSCs, CD150- CD135- אבות multipotent (או mpps) ו CD150- CD135 + הלימפה mpps -primed (או LMPPs). חלקם של LMPPs נמוך לאחר ההשתלה מאשר עכברים שאינם מוקרנים. צייר ג זרימת 2Dytometry מגרשים עבור כל תת קבוצה עם CD45.2 על ציר אחד CD45.1 מאידך גיסא. לזהות תאים תורמים, מארח מתחרה עבור כל תת-אוכלוסייה כמוצגת. אם קרינת ההשתלה מצליחות, לא אמור להיות HSPCs המארח שנותר מעט מאוד. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5. נציגי תוצאות עבור chimerism דם היקפי. (א) השתלה מוצלחת שבו תורם HSCs הם מקבילים לתאי המתחרה. הרוב המכריע של תאי מארחים נותרים (CD45.1 + CD45.2 +) הוא בדרך כלל לימפוציטים מסוג T. (ב) השתלה מוצלחת היכן להציג את תורם HSCs ירידה בתפקוד לעומת תאים מתחרים. תרומת ירד זה יכול להיות בגללמספר גורמים וניתוח שונים עוד יהיו צורך (ראה דיון). (C) השתלה מוצלחת עם תדרים נמוכים של שתי מתחרה ותאי תורם חלק גדול של תאים לארח נותרים. סוג זה של תוצאה מציע נמוך יותר מאשר מינון צפוי של הקרנה, הזרקה מוצלחת (ירידת כדאי תא, ירד היקף ההזרקה, הזרקה מחוץ וריד הזנב), או שילוב של אלה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול המתואר כאן נועד להעריך את הכושר היחסי של HSCs התורם (מבחן) נגד ידוע המתחרה HSCs. המצב של תחרות מגביר את הרגישות היחסית של assay (סיכוי גבוהה יותר לזהות ירידות מתונות כושר תאי גזע) ומספק שליטה טכנית פנימית ליעילות של הקרנה והזרקה. עם זאת, זה לא אמור לשמש מדד מוחלט של כושר HSC; ירידת כינון מחדש תחרותי לא אומרת אוטומטית כי HSCs לא מתפקד היטב בהעדר התחרות. למרות זאת ניתן לטעון כי על רקע תחרותי היא נקודת הזינוק הטובה יותר, כמו התאים המתחרים יצילו פונקצית HSC פגומה וכל עכברי הנמען ישרדו, אחד צריך להיות זהיר עם הפרשנות של התוצאות. המאשר את התוצאות בסביבה לא תחרותית יהיה לגבש מסקנות.
העיצוב הניסיוני שהוצג כאן משתמש qu המקבילה HSCantities של תאי מח עצם הכולל במקום אוכלוסיות טהורות של זרימת cytometry HSCs -sorted. חשוב להשוות את המספרים של HSCs בכל האוכלוסיות הנחקרות (תורמים שונים, המתחרה) לחסל השתנות בין תורמים שונים ולהבטיח כי שינויים בתדירות פנוטיפי HSC לא להתפרש שינויים HSC פונקציה 14. היתרונות של הגישה המתוארת כאן על HSCs מטוהרים הם: כדאיות התא משופרת בשל משך הזמן הדרוש להשלמת מקוצר וחוסר לחץ חיצוני במהלך המיון; ביות ומשופרת עד לשד עצם נמען (הנוכחות של נוגדנים על תאים ממוינים עלולה להפריע engraftment שלהם במח העצם 15). לעומת זאת, החסרון העיקרי היא התרומה של הלא-HSC אוכלוסיות לתוצאת ההשתלה, במיוחד את התפקיד של תא קצר מועד ובתאים בנקודות זמן מוקדם לאחר השתלה. יתר על כן, אם הטיפול או הנדסה גנטית משנה את ביטוי surfacסמני דואר המשמשים לבחירת 16 HSCs, ייתכנו מספר משמעותי של HSCs "בתחפושת" במדגם אחד אך לא באחר, אשר יהיה להטות את התוצאות. עם זאת, אותה הבעיה עלולה להתרחש גם בעת שימוש HSCs המטוהר הנו חלק אינהרנטי assay ההשתלה.
התוצאות שהושגו באמצעות הפרוטוקול הנוכחי הן איכותיות רק ברמת האוכלוסייה. במילים אחרות, תרומה ירד תאי התורם לאחר ההשתלה יכול לנבוע; מספר נמוך של HSCs הפונקציונלי באוכלוסיית ההתחלה; יכולת פחתה של HSCs הפרט להתיישב לתוך מח העצם ולהרחיב בימים ובשבועות הראשונים לאחר השתלה; או בעיות עם בידול וצמיחה לתאים בוגרים המשמשים לגילוי בפריפריה. מכיוון שכך, חשוב לא להשתמש בתוצאות מהשתלה תחרותית בבידוד, אלא להשלים אותם עם מבחנים כי תהיה למדוד תא התפשטות, הישרדות, והבחנה מ HSC כדי במחזור תאי דם. כמו כן, חשוב להשוות תרומת תא תורם בין דם ההיקפי (איור 3) ומח עצם (איור 4) הנוכחות של HSCs התורם הנגזרות במח העצם בשילוב עם העדר תאי תורם בדם היקפי תהיה מעידה על בלוק בידול . אמנם לא שמוצג בדוגמא, אפשר גם להעריך כינון מחדש erythroid מבוסס על isoforms השונה של Gpi1 17. בהתחשב במספרים הגדולים של אריתרוציטים נוכח דם, הם מייצגים שיטה רגישה ביותר של זיהוי תאי תורם נגזר, אשר יכולה להיות שימושית במיוחד כאשר משתילי מספרים נמוכים של HSCs או באי התפוקה שלהם על פני תקופות זמן ארוכות. בקצה השני של הספקטרום, תאים מיאלואידית הם לרוב הראשונים להיכשל שיראו, בין השאר בשל התדירות הנמוכה שלהם בדם ההיקפי ובחלקה בגלל זמן מחצית החיים הקצר שלהם.
אפשר להסתגל הassay ואכלוס דואר תחרותי לאפשר כימות של HSCs באמצעות assay דילול מגביל (או LDA). זה ידרוש מספר גדול בהרבה של עכברי נמען מחולקים לכמה קבוצות שונות כאשר כל קבוצה מקבלת יחס שונה של מתחרה: תאי תורם, או מיון או לא ממוינים כמתואר לעיל. ככל שמספר תאי תורם יורד, יהיה יותר עכברים שבו חלקם של תאים תורמים נגזר לא מגיעים לסף שנקבע מראש באחד או בכמה שושלות. זהו אז אפשר לתכנן את תדירות עכברים "שליליים" לכל קבוצה נגד מספר תאי תורם המושתל ולקבוע את תדירות HSCs מהגרף שהתפתח 18,19.
המשך הציע מעקב לאחר השתלה משתנה בספרות. בעבר היה קונסנסוס מסוים כאשר תקופת 16 שבועות לאחר ההשתלה נחשבת מספיק כדי לשקף את הפלט של לטווח ארוך HSCs. עם זאת, הדיווחים האחרונים של "intermediate "HSCs שהפקיד מסרב זמן קצר לאחר 16 שבועות יש הדגישו את הצורך קיימים אפילו עבור הערכה קפדנית יותר של HSC פונקציה 17. אפשר בהחלט להאריך את המעקב של המושתלים מעבר לנקודת 16 שבוע הזמן כדי לספק את החששות האלה. אפשרות חלופית, פעם נוספת עם רגישות לטעון גבוהה, היא ההשתלה משני (איור 1 ב), שבו תאים במח העצם התאוששו מושתלים ראשונים מוזרקים לתוך מקבלים משני מוקרן. השתלת השני מפעילה לחץ שגשוג נוסף על HSCs, מכריח היציאה שלהם מן התרדמת ומאפשרים תאים רק עם התחדשות עצמית חזקה כדי לשמור על התפוקה שלהם. זה לפעמים עדיף להשתמש בתאי תורם מיון להתאים מספרי HSC טובים יותר בין מדגמים שונים עבור ההשתלות המשניות. לחלופין, אפשר להקים יחס מוערך של תורם : HSCs המתחרה ממח העצם העיקרי (למשל,
כאמור, ישנם מספר סיבות מדוע באוכלוסיית נתונה של התורם HSCs עשויה להראות ירידת קיבולת עבור כינון מחדש לטווח ארוך. סיבה אחת כזו היא היכולת של HSCs להגר במח העצם לאחר ההשתלה (גם ביות שנקרא) ולהתיישב עצמם בגומחה מח עצם. אפשר להתאים את הפרוטוקול המובא כאן לחקור ביות מח עצם והרחבת לטווח קצר. יש צורך להגדיל את מספר התאים המושתלים (המקבילה של 5,000-10,000 HSCs עבורמבחני 1,000-2,000 HSCs ביות לניתוח בתוך השבוע הראשון לאחר ההשתלה). ב assay ביות, עכברים הנמען מומתים בתוך השתלת 16-24 שעות לאחר הראשונה ומספר HSCs התורם שהגיעו במח העצם נקבע כמוסבר בפרוטוקול הנוכחי. כדי להוסיף ולבחון את תפקידם, תאי מח העצם התאוששו מן הנמענים לטווח קצר ניתן יושתלו משני כמוסבר באיור 1B. חלקם של תאים תורמים הנגזרת של מקבלים המשניים לאחר מכן ניתן להשתמש כדי להעריך את היכולת של התורם HSCs להגר ולהתיישב לתוך מח עצם נמען.
הבעיות העיקריות עם השתלת מח העצם התחרותית לנבוע הקרנת הזרקה ולהציג עצמם או תמותה לאחר ההשתלה להגדיל או להקטין יעילות כינון מחדש. הקרנה פיצול במינון, כפי שהוצגו כאן, מזוהה בדרך כלל עם myeloablation יעיל יותרפחות רעילות כשמשווים יחיד במינון 20. עם המינון המומלץ כאן (פעמיים 450 rads), האוכלוסיות הלימפה מיאלואידית ו- B נמחקות ביעילות אבל לימפוציטים מסוג T שיורית לעשות להישאר (איור 3). אם קיימת סיבה כלשהי לחשוד דחיית שתל (עכברים תורמים ומקבל מרקע גנטי שונה), מינון גבוה יותר של קרינה (שתי מנות של 550-600 rads) וכן עיכוב קצר בין שתי המנות (4 שעות במקום למחרת ) אמור לעזור לחסל לימפוציטים מסוג T שיורית להקטין את האפשרות של כישלון השתל בשל דחייה. הזרקה שגויה, או זריקה לחלל perivascular במקום וריד הזנב, בעיות עם כדאיויות תא תורם, או זיהום תא תורם עקב חוסר טיפול במהלך הכנת מדגם גם תגדלנה לכישלון שתל ותמותה לאחר השתלה. הקרנה יעילה (בשל בעיות טכניות, למשל) תגרום יעילויות כינון מחדש ירד אבל לא צריך להגדיל מוrtality. בכל המצבים האלה, הנוכחות של תאי מתחרה ב assay עוזרת לניתק בעיות טכניות (כמפורט כאן) מירידה בתום לב בתפקוד תורם HSC כמו התאים המתחרים תמיד צריכים להיות מסוגלים להקים מחדש את הנמען המוקרן. המארחים immunodeficient יכול לשמש גם, למשל, כדי להקטין את הצורך קרינה ו / או סיכון של דחיית שתל, וכדי להעריך את הפונקציה של האדם HSCs 21-23.
לסיכום, אנו מציגים כאן פרוטוקול השתלה תחרותי שיכול להיות מותאם עבור מספר שימושים שונים כמפורטת בדיון. הגישה שלנו משתמשת ושווי HSC, אשר מקטין משך הזמן הדרוש להשלמת ומשפר כדאיות התא בו זמנית השתל בהשוואה מיון התא. זה גם פתרון מעשי כאשר גישת סדרן תא מוגבלת, ודורשת עכברים פחות בהשוואת assay LDA כמותית, מה שהופכת אותו לנקודת התחלה אטרקטיבית לניתוח פונקצית HSC. </ P>
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
אנו מודים RoxAnn Hétu-ארבור לסיוע עם עיצוב דמות והדגמה של הליכים. מחקר במעבדה נתמך על ידי פרסים מעבר מקרן קול, דיסקברי להעניק אין. 419226-2012 מן למדעי הטבע וההנדסה מועצת המחקר של קנדה (NSERC) וקרן קנדה עבור חדשנות (קרן מנהיגים CFI להעניק אין. 31,377). KMH הוא ג'וניור Chercheur-Boursier עבור Fonds דה משוכלל ונדיר קוויבק - Santé (FRQS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microtainer tubes with K2EDTA | BD Biosciences | 365974 | |
| 20 G needle | BD Syringe | For blood sampling from the mandibular vein | |
| LabQuake Shaker rotisserie | Thermo Scientific | C415110 | |
| Purified anti-mouse CD16/CD32 (clone 2.4G2, Fc Block) | BD Biosciences | 553142 | 2.50 μg/ml |
| Pe-Cy7-conjugated anti-mouse CD3e (clone 145-2C11) | eBioscience | 25-0031 | 0.25 μg/ml |
| PE-conjugated anti-mouse CD19 (clone 1D3) | eBioscience | 12-0193 | 0.25 μg/ml |
| APC-eFluor780 (APC-Cy7 equivalent)-conjugated anti-mouse GR1 (clone RB6-8C5) | eBioscience | 47-5931 | 0.25 μg/ml |
| FITC-conjugate anti-mouse CD45.1 (clone A20) | eBioscience | 11-0453 | 2.50 μg/ml |
| eFluor450-conjugated anti-mouse CD45.2 (clone 104) | eBioscience | 48-0454 | 1.00 μg/ml |
| Biotinylated anti-human/mouse CD45R (B220) (clone RA3-6B2) | eBioscience | 13-0452 | 1.25 μg/ml |
| Biotinylated anti-mouse CD3e (clone 145-2C11) | eBioscience | 13-0031 | 1.25 μg/ml |
| Biotinylated anti-mouse CD11b (clone M1/70) | eBioscience | 13-0112 | 1.25 μg/ml |
| Biotinylated anti-mouse GR1 (clone RB6-8C5) | eBioscience | 13-5931 | 1.25 μg/ml |
| Biotinylated anti-mouse TER119 (clone TER119) | eBioscience | 13-5921 | 0.625 μg/ml |
| V500 streptavidin | BD Biosciences | 56149 | 0.5 μg/ml |
| PE-conjugated anti-mouse CD117 (clone 2B8) | BD Biosciences | 553355 | 0.25 μg/ml |
| PE-Cy7-conjugated anti-mouse Ly6A/E (Sca1) (clone D7) | BD Biosciences | 558162 | 0.25 μg/ml |
| PerCP-eFluor710-conjugated anti-mouse CD135 (clone A2F10) | eBioscience | 46-1351 | 0.5 μg/ml |
| Alexa fluor 647-conjugated anti-mouse CD150 (clone TC15-12F12.2) | Biolegend | 115918 | 0.625 μg/ml BD Biosciences and eBioscience do not carry the same clone |
| 1 ml tuberculin syringe with 27 G needle | BD Syringe | 309623 | |
| 1 ml tuberculin syringe with 25 G needle | BD Syringe | 309626 | |
| 70 μm cell strainer | BD Falcon | 352350 |
References
- Li, H. W., Sykes, M. Emerging concepts in haematopoietic cell transplantation. Nat Rev Immunol. 12 (6), 403-416 (2012).
- Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Terhorst, C., Morrison, S. J. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).
- Kim, I., He, S., Yilmaz, O. H., Kiel, M. J., Morrison, S. J. Enhanced purification of fetal liver hematopoietic stem cells using SLAM family receptors. Blood. 108 (2), 737-744 (2006).
- Mayle, A., Luo, M., Jeong, M., Goodell, M. A. Flow cytometry analysis of murine hematopoietic stem cells. Cytometry A. 83 (1), 27-37 (2013).
- Rossi, L., et al. Less Is More: Unveiling the Functional Core of Hematopoietic Stem Cells through Knockout Mice. Cell Stem Cell. 11 (3), 302-317 (2012).
- Till, J. E., McCulloch, E. A direct measurement of the radiation sensitivity of normal mouse bone marrow cells. Radiat Res. 14, 213-222 (1961).
- Shen, F. W., et al. Cloning of Ly-5 cDNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (21), 7360-7363 (1985).
- Identification of GM mice. Laboratory Animals. 37 (suppl 1), 33-35 (2003).
- Rundberg Nilsson, A., Bryder, D., Pronk, C. J. H. Frequency determination of rare populations by flow cytometry: A hematopoietic stem cell perspective. Cytometry Part A. 83A (8), 721-727 (2013).
- Abidin, B. M., Owusu Kwarteng, E., Heinonen, K. M. Frizzled-6 Regulates Hematopoietic Stem/Progenitor Cell Survival and Self-Renewal. J Immunol. 195 (5), 2168-2176 (2015).
- Heinonen, K. M., Vanegas, J. R., Lew, D., Krosl, J., Perreault, C. Wnt4 enhances murine hematopoietic progenitor cell expansion through a planar cell polarity-like pathway. PLoS One. 6 (4), e19279 (2011).
- Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. J. SLAM family markers resolve functionally distinct subpopulations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors. Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).
- Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Anim (NY). 34 (9), 39-43 (2005).
- Santaguida, M., et al. JunB protects against myeloid malignancies by limiting hematopoietic stem cell proliferation and differentiation without affecting self-renewal. Cancer Cell. 15 (4), 341-352 (2009).
- Czechowicz, A., Kraft, D., Weissman, I. L., Bhattacharya, D. Efficient transplantation via antibody-based clearance of hematopoietic stem cell niches. Science. 318 (5854), 1296-1299 (2007).
- Zhang, C. C., Lodish, H. F. Murine hematopoietic stem cells change their surface phenotype during ex vivo expansion. Blood. 105 (11), 4314-4320 (2005).
- Benveniste, P., et al. Intermediate-Term Hematopoietic Stem Cells with Extended but Time-Limited Reconstitution Potential. Cell Stem Cell. 6 (1), 48-58 (2010).
- Fazekasde St Groth, B. The evaluation of limiting dilution assays. J Immunol Methods. 49 (2), R11-R23 (1982).
- Louis, I., Heinonen, K. M., Chagraoui, J., Vainio, S., Sauvageau, G., Perreault, C. The signaling protein Wnt4 enhances thymopoiesis and expands multipotent hematopoietic progenitors through beta-catenin-independent signaling. Immunity. 29 (1), 57-67 (2008).
- Cui, Y. Z., et al. Optimal protocol for total body irradiation for allogeneic bone marrow transplantation in mice. Bone Marrow Transplant. 30 (12), 843-849 (2002).
- Benz, C., et al. Hematopoietic Stem Cell Subtypes Expand Differentially during Development and Display Distinct Lymphopoietic Programs. Cell Stem Cell. 10 (3), 273-283 (2012).
- Eppert, K., et al. Stem cell gene expression programs influence clinical outcome in human leukemia. Nat Med. 17 (9), 1086-1093 (2011).
- McIntosh, B. E., et al. Nonirradiated NOD,B6.SCID Il2rgamma-/- Kit(W41/W41) (NBSGW) mice support multilineage engraftment of human hematopoietic cells. Stem Cell Reports. 4 (2), 171-180 (2015).
