This protocol provides step-by-step guidelines for setting up competitive mouse bone marrow transplant experiments to study hematopoietic stem/progenitor cell function without prior purification of stem cells by cell sorting.
The gold standard definition of a hematopoietic stem cell (HSC) is a cell that when transferred into an irradiated recipient will have the ability to reestablish blood cell production for the lifespan of the recipient. This protocol explains how to set up a functional assay to compare the HSC capacities of two different populations of cells, such as bone marrow from mice of two different genotypes, and how to analyze the recipient mice by flow cytometry. The protocol uses HSC equivalents rather than cell sorting for standardization and discusses the advantages and disadvantages of both approaches. We further discuss different variations to the basic protocol, including serial transplants, limiting dilution assays, homing assays and non-competitive transplants, including the advantages and preferred uses of these varied approaches. These assays are central for the study of HSC function and could be used not only for the investigation of fundamental HSC intrinsic aspects of biology but also for the development of preclinical assays for bone marrow transplant and HSC expansion in culture.
Hematopoiesis एक पुनर्योजी प्रक्रिया है कि रक्त कोशिकाओं है कि चोट, विकिरण और कोशिका मृत्यु के माध्यम से खो दिया है की भरपाई सुनिश्चित करता है। इस प्रक्रिया hematopoietic स्टेम कोशिकाओं (एचएससी) कि मोटे तौर पर वयस्क अस्थि मज्जा में रहते द्वारा सुनिश्चित किया जाता है। इसके अलावा, hematopoietic स्टेम कोशिकाओं autoimmune विकार, रक्त कैंसर और immunodeficiencies 1 में चिकित्सीय उद्देश्यों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। वहाँ इस तरह बेहतर तंत्र है कि एचएससी समारोह को विनियमित, उनके proliferative विस्तार और उनकी पहुंच और प्रत्यारोपण के बाद प्राप्तकर्ता अस्थि मज्जा टीका लगाना करने की क्षमता सहित समझने की जरूरत है। हालांकि हाल के अध्ययनों स्लैम परिवार के सदस्यों CD150 और CD48 सहित कई कोशिका की सतह मार्करों, भावी लगभग 50% शुद्धता 2-4 को वयस्क एचएससी और भ्रूण एचएससी संतुष्ट करने के लिए सूचित किया है, कार्यात्मक एचएससी के लिए स्वर्ण मानक मापने के लिए एक विवो repopulating परख बनी हुई है उनकी फिर से स्थापित करने के लिए रक्त ग क्षमता का निर्धारणएक विकिरणित मेजबान 5 में पक्ष उत्पादन।
इन विवो प्रतिरूप repopulating परख शुरू तक और McCulloch 6 से विकसित किया गया था और तब से परिष्कृत और विस्तारित किया गया है। मूल रूप में परिभाषित किया गया, एचएससी आत्म नवीकरण और भेदभाव के माध्यम से आजीवन रक्त कोशिका के उत्पादन किया जाता है। एक विकिरणित प्राप्तकर्ता में एचएससी के हस्तांतरण इस प्रकार हमें आकलन करने के लिए अनुमति देता है: उनके अलग अलग रक्त कोशिका प्रजातियों के विश्लेषण के माध्यम से अंतर करने के लिए (टी lymphocytes, बी लिम्फोसाइट, granulocytes, monocytes) और धारावाहिक प्रत्यारोपण के माध्यम से आत्म नवीकरण के लिए अपनी क्षमता की क्षमता। परख आमतौर पर कार्यक्षमता और / या एचएससी की दो आबादी की मात्रा की तुलना शामिल होगा, जैसे, अलग जीनोटाइप या कोशिकाओं के दो चूहों कि इलाज किया गया है या विभिन्न कारकों है कि रखरखाव या एचएससी के विस्तार को प्रभावित कर सकता है के साथ इलाज से आ रही कोशिकाओं संस्कृति में। डोनर काइमेरावाद, या स्थानांतरित कर दाता एचएससी टी का योगदानओ रक्त कोशिका के उत्पादन तो कोशिका की सतह मार्करों या अन्य तरीकों कि प्राप्तकर्ता, या मेजबान से दाता कोशिकाओं का उपयोग कर अलग होगा परिधीय रक्त में प्रवाह cytometry विश्लेषण और अस्थि मज्जा के द्वारा निर्धारित किया जा सकता है। सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया मार्करों निश्चित रूप से जीन Ptprc या CD45 ल्युकोसैट प्रतिजन 7 कि हम नीचे दिए गए उदाहरणों के लिए चुना है के लिए दो alleles हैं।
प्रतिरूप repopulation परख सकते हैं या तो प्रतियोगी या गैर-प्रतिस्पर्धी हो सकते हैं। एक गैर-प्रतिस्पर्धी माहौल में, नियंत्रण और परीक्षण एचएससी अलग प्राप्तकर्ता चूहों में स्थानांतरित कर रहे हैं और प्रत्येक कोशिका प्रकार के लिए परिणाम दूसरे से स्वतंत्र होगी। एक प्रतिस्पर्धी माहौल में, दोनों परीक्षण और नियंत्रण एचएससी के समारोह प्रतियोगी एचएससी की आबादी के खिलाफ मापा जाता है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल प्रतिस्पर्धी सेटिंग का उपयोग करता है, लेकिन यह भी गैर-प्रतिस्पर्धी स्थितियों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। दोनों दृष्टिकोण के अपने फायदे और सीमाएं हैं, और हम में विस्तार से उनकी तुलना होगाचर्चा। हम यह भी प्रत्यारोपित एचएससी की संख्या में इक्विटी सुनिश्चित करने के लिए अलग अलग दृष्टिकोण का वर्णन है, कैसे कमजोर पड़ने परख (झील प्राधिकरण) को सीमित करके एचएससी की मात्रा का ठहराव के लिए परख के लिए अनुकूल है, और परिणाम की व्याख्या के लिए दोनों सफल और असफल प्रत्यारोपण का उदाहरण देते समझाओ।
यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल जाना जाता प्रतियोगी एचएससी के खिलाफ दाता (परीक्षण) एचएससी के रिश्तेदार फिटनेस का मूल्यांकन करने के लिए बनाया गया है। प्रतियोगिता की स्थिति रिश्तेदार परख की संवेदनशीलता (अधिक स?…
The authors have nothing to disclose.
हम यह आंकड़ा डिजाइन और प्रक्रियाओं के प्रदर्शन के साथ सहायता के लिए Roxann Hétu-कुंज के आभारी हैं। प्रयोगशाला में अनुसंधान कोल फाउंडेशन से एक संक्रमण पुरस्कार द्वारा समर्थित किया गया था, डिस्कवरी कोई अनुदान। प्राकृतिक विज्ञान और कनाडा () NSERC के इंजीनियरिंग रिसर्च काउंसिल और अभिनव के लिए कनाडा फाउंडेशन (CFI लीडर्स फंड अनुदान नहीं। 31377) से 419226-2012। Santé (FRQS) – KMH के लिए Fonds डे Recherche डु क्यूबेक एक Chercheur-BOURSIER जूनियर है।
Microtainer tubes with K2EDTA | BD Biosciences | 365974 | ||
20G needle | BD Syringe | For blood sampling from the mandibular vein | ||
LabQuake Shaker rotisserie | Thermo Scientific | C415110 | Any other rotating mixer will work as well to prevent coagulation of blood samples | |
Purified anti-mouse CD16/CD32 (clone 2.4G2, Fc Block) | BD Biosciences | 2.50 | 553142 | Alternatively use clone 93 from eBioscience (cat # 14-0161) or Biolegend (cat# 101310) |
Pe-Cy7-conjugated anti-mouse CD3e (clone 145-2C11) | eBioscience | 0.25 | 25-0031 | For most flow cytometry antibodies, the clone is important but the colours and companies can vary depending on the available equipment |
PE-conjugated anti-mouse CD19 (clone 1D3) | eBioscience | 0.25 | 12-0193 | |
APC-eFluor780 (APC-Cy7 equivalent)-conjugated anti-mouse GR1 (clone RB6-8C5) | eBioscience | 0.25 | 47-5931 | |
FITC-conjugate anti-mouse CD45.1 (clone A20) | eBioscience | 2.50 | 11-0453 | |
eFluor450-conjugated anti-mouse CD45.2 (clone 104) | eBioscience | 1.00 | 48-0454 | |
Biotinylated anti-human/mouse CD45R (B220) (clone RA3-6B2) | eBioscience | 1.25 | 13-0452 | |
Biotinylated anti-mouse CD3e (clone 145-2C11) | eBioscience | 1.25 | 13-0031 | |
Biotinylated anti-mouse CD11b (clone M1/70) | eBioscience | 1.25 | 13-0112 | |
Biotinylated anti-mouse GR1 (clone RB6-8C5) | eBioscience | 1.25 | 13-5931 | |
Biotinylated anti-mouse TER119 (clone TER119) | eBioscience | 0.63 | 13-5921 | |
V500 streptavidin | BD Biosciences | 0.50 | 561419 | |
PE-conjugated anti-mouse CD117 (clone 2B8) | BD Biosciences | 0.25 | 553355 | |
PE-Cy7-conjugated anti-mouse Ly6A/E (Sca1) (clone D7) | BD Biosciences | 0.25 | 558162 | |
PerCP-eFluor710-conjugated anti-mouse CD135 (clone A2F10) | eBioscience | 0.50 | 46-1351 | |
Alexa fluor 647-conjugated anti-mouse CD150 (clone TC15-12F12.2) | Biolegend | 0.63 | 115918 | BD Biosciences and eBioscience do not carry the same clone |
1ml tuberculin syringe with 27G needle | BD Syringe | 309623 | ||
1ml tuberculin syringe with 25G needle | BD Syringe | 309626 | ||
70 um cell strainer | BD Falcon | 352350 |