Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

السلوكيات حاسة الشم يعاير التي تتبع الكمبيوتر Published: August 20, 2016 doi: 10.3791/54346
Automatic Translation
1, 2, 1
1The Solomon H. Snyder Department of Neuroscience, Center for Sensory Biology, Johns Hopkins University School of Medicine, 2MRC Clinical Sciences Center, Imperial College London

Abstract

ويكمن التحدي الرئيسي في بيولوجيا الأعصاب هو فهم كيف الدوائر العصبية تعمل لتوجيه سلوكيات الحيوان المناسبة. ذبابة الفاكهة هو نظام نموذجا ممتازا لمثل هذه التحقيقات بسبب سلوكياتها معقدة، تقنيات وراثية قوية، والجهاز العصبي المضغوط. وقد استخدمت مختبر فحوصات السلوكية طويلة مع ذبابة الفاكهة لمحاكاة خصائص البيئة الطبيعية ودراسة الآليات العصبية الكامنة وراء السلوكيات المقابلة (على سبيل المثال انجذاب ضوئي، الكيميائي، والتعلم الحسية والذاكرة) 1-3. مع توافر الأخيرة من مجموعات كبيرة من خطوط ذبابة الفاكهة المعدلة وراثيا أن تسمية مجموعات فرعية العصبية محددة، وقد اتخذت المقايسات السلوكية على الدور البارز لربط الخلايا العصبية مع السلوكيات 4-11. نماذج متعددة وقابلة للتكرار، جنبا إلى جنب مع إجراءات الحسابية الأساسية لتحليل البيانات، لا غنى عنها لاختبارات سريعة لخطوط الطيران مرشح مع مختلف genotypوفاق. ولا سيما مفيدة هي الاجهزة التي تتسم بالمرونة في عدد الحيوانات المختبرة، ومدة التجارب وطبيعة المحفزات المقدمة. يجب فحص الاختيار أيضا توليد البيانات استنساخه التي هي سهلة للحصول على وتحليلها. هنا، نقدم وصفا مفصلا للنظام وبروتوكول لمعايرة الاستجابات السلوكية ذبابة الفاكهة الذباب في الساحة أربعة ميدانية كبيرة. يستخدم الإعداد هنا لفحص ردود الذباب لحافز الشم واحد؛ ومع ذلك، قد يتم تعديل نفس الإعداد لاختبار حاسة الشم متعددة، والمحفزات البصرية أو علم البصريات الوراثي، أو مزيج من هذه. الإعداد olfactometer يسجل النشاط السكان ذبابة الرد على الروائح، وتطبق الأساليب التحليلية الحسابية لتحديد السلوكيات الطاير. ويتم تحليل البيانات التي تم جمعها للحصول على قراءة سريعة التدريجي من شوط التجريبية، وهو أمر ضروري لجمع البيانات بكفاءة والاستفادة المثلى من الظروف التجريبية.

Introduction

القدرة على التكيف والاستجابة للبيئة الخارجية هو أمر حاسم لبقاء جميع الحيوانات. يحتاج الحيوان إلى تجنب المخاطر، والسعي إلى الطعام وتجد زملائه، والتعلم من التجارب السابقة. تعمل أنظمة حسية لاستقبال مجموعة متنوعة من المحفزات، مثل البصرية والكيميائية وميكانيكية حسية، وترسل هذه الإشارات إلى الجهاز العصبي المركزي إلى أن تفسر وفك الشفرة. الدماغ ثم يوجه السلوكيات الحركية المناسبة تبعا لبيئة ينظر إليها، مثل بحثا عن الغذاء أو الهروب من الحيوانات المفترسة. فهم كيفية الكشف عن أنظمة حسية العالم الخارجي، وكيف يترجم المخ ويوجه القرارات، تحديا كبيرا في علم الأعصاب.

ذبابة الفاكهة هو نظام نموذج قوي للتحقيق في كيفية العصبية السلوكيات الدوائر دليل. وبالإضافة إلى كونها بسيطة وغير مكلفة للحفاظ على، ذبابة الفاكهة المعرض العديد من السلوكيات المتنوعة والمعقدة النمطية، ولكن القيام بذلك مع COMPACر الجهاز العصبي من حوالي 100،000 الخلايا العصبية. وتوجد تقنيات وراثية قوية لمعالجة جينوم ذبابة الفاكهة، والآلاف من خطوط المعدلة وراثيا قد تولدت أن تسمية انتقائي وبتكاثر نفس مجموعات فرعية من الخلايا العصبية 10-13. هذه خطوط المعدلة وراثيا يمكن أن تستخدم للتلاعب بشكل انتقائي على نشاط الخلايا العصبية المسماة (تنشيط أو تثبيط)، وهذه المعالجات يمكن استخدامها للتحقق من مدى العصبية السلوكيات وظائف دليل.

وقد وضعت المقايسات سلوكية متعددة لدراسة مختلف السلوكيات ذبابة الفاكهة. ذبابة الفاكهة، مثل العديد من الحيوانات، واستخدام حاسة الشم لتوجيه العديد من الخيارات السلوكية، مثل إيجاد الغذاء، وإيجاد الاصحاب، وتجنب المخاطر. لذا الشم هو نظام الحسي جيد للتحقيق في كيفية الكشف عن المؤثرات الخارجية وتفسيرها من قبل الجهاز العصبي للحيوان لتوجيه الخيارات المناسبة. على هذا النحو، وقد وضعت عددا من المقايسات لinvestigaتينغ اليرقات والسلوكيات حاسة الشم الكبار. تقليديا، كانت يعاير السلوكيات حاسة الشم في ذبابة الفاكهة عن طريق الاختيار اثنين النموذج T-متاهة، والتي يمكن أن تستخدم لمعايرة الفطرية وتعلم السلوكيات حاسة الشم 3. في هذا الاختبار، يتم منح حوالي 50 الذباب الاختيار بين اثنين من أنابيب: أنبوب واحد يحتوي على رائحة في مسألة والآخر يحتوي على الرائحة التحكم (عادة المذيب رائحة). وترد الذباب فترة معينة من الوقت لاتخاذ خيار، ثم عدد من الذباب التي هي في غرف مختلفة تحسب. على الرغم من أن T-متاهة هو فحص بسيط للعديد من التجارب، وهناك العديد من القيود. على سبيل المثال، يتم قياس السلوكيات حاسة الشم عند نقطة مرة واحدة فقط، ويتم التخلص منها خيارات مختلفة ألقاه أمام هذه نقطة زمنية. وبالمثل، فإن إهمال السلوكيات الفردية من الذباب في أوساط السكان. بالإضافة إلى ذلك، T-متاهة يتطلب العد والفرز اليدوي من الذباب، والتي قد إدخال أخطاء. وأخيرا، لأن هناك خيارين فقط مدروسة، وهذايقلل من القدرة الإحصائية في كثير من الأحيان المطلوبة للكشف عن التغيرات السلوكية خفية. بديل للاختيار من اثنين T-متاهة هو أربعة رباعي (أربعة الحقل) olfactometer 14-18. في هذا الاختبار، والحيوانات استكشاف الساحة التي شغل في كل من الزوايا الأربع من الساحة مع مصدرا محتملا للهواء odorized. الساحة ديها شكل نجمة مجعد لتحقيق أقصى قدر من تشكيل أربعة أجزاء رائحة محددة تجريبيا. إذا تم توفير رائحة في واحدة من زوايا ثم يرد عليه فقط في هذا الربع واحد. يمكن تتبع سلوكيات الحيوانات لأنها تدخل وترك الربع رائحة، وبسهولة مقارنة سلوكهم في الأرباع الثلاث لمراقبة. وبالتالي olfactometer فحص أربعة رباعي السجلات استجابة سلوكية المكانية والزمانية للمنبهات رائحة على الساحة التجريبية كبيرة.

تم تطوير olfactometer أربعة رباعي أول مرة من قبل بيترسون وآخرون. 15 والطبيب البيطري وآخرون. 17 للتحقيق في رأالاستجابات السلوكية مصنع من غشائيات الأجنحة الطفيلية الفردية. Faucher وآخرون. 18 وSemmelhack وانغ 16 تكييفها الإعداد لرصد ردود حاسة الشم الفردية ذبابة الفاكهة. وolfactometer أربعة رباعي حساسة بالتساوي على الردود جذابة ومثيرة للاشمئزاز، والسماح لمجموعة واسعة من عطر اختبار والشروط. تتبع البرامج الطيران العرف مكتوب، التي وضعتها أليكس Katsov 19 ويحتفظ بها حاليا من قبل جوليان براون (المفصل في المواد)، قدم مزايا إضافية لمزيد من تطبيقات الأخيرة من olfactometer أربعة رباعي 14،20-23. أصبح من الممكن الآن لفحص ما يصل الى 100 الذباب في وقت واحد في مكانية عالية (27.5 بكسل / سم) والزمنية (30 لقطة في الثانية) القرار الذي يسمح استخراج معايير مختلفة، مثل موقف والسرعة والتسارع من الذباب في أي نقطة زمنية. وهذا يتيح التحقيقات في ديناميات الاستجابات السلوكية الذباب "لالروائح 20 الجدول المواد)، وهو نفس التكوين يسمح فترات تتبع مرنة ويمكن استخدامها لتتبع الذباب لمدة تصل إلى 24 ساعة من التقاط الصور في انخفاض معدل الإطار. وقد استخدم هذا الخيار لدراسة السلوكيات وضع البيض من الذباب ومقارنة أوضاع الجسم مع تفضيلات ovipositional 14. ويمكن أيضا أن تستخدم olfactometer أربعة المجال لدراسة الردود على المتعدد الوسائط (مثل حاسة الشم والبصرية) المحفزات، أو الجمع بين علم البصريات الوراثي 9 أو توليد الحرارة 21 التحفيز مع العروض من المحفزات الحسية. وعلاوة على ذلك، يسمح القرار زمنية عالية استخراج مسارات FOص كل ذبابة الفردية في مجموعة البيانات الفرقة. وبالتالي، يسمح للطريقة التحقيق في سلوك السكان حاسة الشم الموجهة، وكذلك التفاعلات الاجتماعية الفردية. البيانات التي تم إنشاؤها بواسطة هذا الاختبار هي قوية وقابلة للتكرار للغاية، مما يسمح للاستخدام olfactometer أربعة الميداني للشاشات السلوكية.

نحن هنا وصف التجمع الإعداد لolfactometer أربعة رباعي. علينا مواصلة التظاهر استخدامها في معايرة جذب حاسة الشم ردا على خل التفاح والتنافر ردا على بروبيونات إيثيل عالية التركيز. وأخيرا، نحن تصف وتوفير رمز المثال لتحليل البيانات تتبع الطيران المسجلة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد الجمعية

  1. تصنيع الساحة على شكل نجمة (19.5 سم في 19.5 سم في 0.7 سم) من تترافلوروإيثيلين (PTFE) وفقا للالمقدمة رسم (المواد التكميلية، SupplementalSketch_StarShapedArena.pdf). يمكن تصنيعها الساحة التي كتبها تجاري أو مرفق مخصص.
  2. الحصول على لوحين من الزجاج (20.25 سم في 20.25 سم بسمك 2 ملم)، وحفر حفرة (~ 0.7 سم في القطر) على وجه التحديد في قلب واحدة من لوحات الزجاج باستخدام مثقاب المغلفة الماس.
  3. تصنيع مربع السلوك ضوء محكم للالساحة السلوكية. أيضا تصنيع كاميرا مربع ضوء محكم للكاميرا CCD فيديو الأشعة تحت الحمراء وفقا للرسومات المقدمة (المواد التكميلية، SupplementalSketch_LightTightBox.pdf). ويمكن تصنيع صناديق كتبها تجاري أو مرفق مخصص.
  4. تركيب وحدة تكييف الهواء على الجدار الخلفي والمصفوفات LED على الجدران الجانبية من مربع السلوك. وضع التحقيق في درجة الحرارةفي مربع السلوك من خلال ثقب الجانب في الوقت الحقيقي ردود الفعل درجة الحرارة والتعديل (انظر الشكلين 1 و 2 لمزيد من التفاصيل).
  5. إرفاق فلتر الأشعة تحت الحمراء والمستقطب الدائري للكاميرا، وجبل التجميع في مربع الكاميرا. يتم فصل مربع السلوك وصندوق الكاميرا من خلال نافذة زجاجية لتحسين التحكم في درجة الحرارة من مربع سلوك (أنظر الشكلين 1 و 2 لمزيد من التفاصيل).
  6. قم بتوصيل كاميرا CCD الأشعة تحت الحمراء لمحول الكاميرا. قم بتوصيل محول الكاميرا إلى محول USB. قم بتوصيل محول USB إلى منفذ USB على جهاز الكمبيوتر للحصول على البيانات.
  7. تثبيت برنامج التشغيل لتحويل الفيديو على الكمبيوتر وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. اختياريا، تثبيت برامج معالجة الصور المقدمة من قبل الشركة المصنعة للمحول USB فيديو للوصول إلى مجموعة واسعة من إعدادات الكاميرا والمعلمات الاستحواذ.
  8. قم بتوصيل وحدة تكييف الهواء (من خلال "الانتاج"على الجزء الخلفي من وحدة تحكم في درجة الحرارة) والتحقيق في درجة الحرارة (من خلال" الحرارية "على الجزء الخلفي من وحدة تحكم في درجة الحرارة) للتحكم في درجة الحرارة. ضع التحقيق في مربع السلوك.
    ملاحظة: نظام التحكم في درجة الحرارة في التخطيط لدينا هي قادرة على الحفاظ على درجة حرارة مربع ما بين 18 درجة مئوية و 30 درجة مئوية. يمكن أن يكون ارتفاع درجات الحرارة المحيطة أو أقل مفيدة لتوليد الحرارة (dTrpA1، TrpM8 أو shibire نهاية الخبر) تجارب على التعامل مع نشاط الخلايا العصبية أو منع انتقال متشابك. بالنسبة لمعظم التجارب، والحفاظ على درجة الحرارة عند 25 درجة مئوية.
  9. تجميع نظام تسليم رائحة في الخطوات التالية (يرجى الاطلاع على الشكل 1B لالخطط التفصيلية والتجهيزات اتصال):
    1. استخدام منظم ضغط الهواء للسيطرة على إدخال الهواء من نظام الهواء المركزية. توصيل فلتر الهواء الكربون (مليئة الفحم) إلى منظم الضغط لتنقية الهواء من والمركزينظام الأشعة تحت الحمراء.
    2. تجميع نظام التحكم في التدفق تتكون من قنوات متعددة تنظمها أنابيب الجريان عالية الدقة.
    3. وصل الناتج من فلتر الهواء الكربون في أنابيب الجريان عبر متعددة كما هو مبين في الشكل 1B و2F. توجيه الإخراج من أنابيب الجريان من خلال التحكم به إلكترونيا 3 في اتجاه الملف اللولبي الصمامات لتنظيم إذا تم طرد الهواء النظيف تاركا مقاييس التدفق إلى الغرفة أو دخل إلى غرف رائحة حسب الطلب (24).
    4. تثبيت وحدة تحكم صمام الملف اللولبي وفقا لدليل الشركة المصنعة.
  10. تثبيت متر تدفق الهواء الإلكتروني من خلال توصيله إلى جهاز الحصول على البيانات (دق)، وإمدادات الطاقة وفقا لدليل الشركة المصنعة. تثبيت البرنامج واجهة دق للتحقق من معدلات تدفق متساوية في كل رباعي من الساحة قبل كل تجربة.

2. إعداد المحفزات الشم

  1. إعداد 5 رائحةغرف النمل 24 التي تتكون من وعاء الخارجي من البلاستيك والزجاج الحاوية الداخلية، وحسب الطلب السليكوون غطاء إدراج، غطاء حاوية الأصلي مع الجزء المركزي إزالتها، واثنين من صمامات ذات اتجاه واحد.
    ملاحظة: حي يا خاتم حول الغطاء PTFE يمكن أن تستخدم لمنع تسرب الهواء من الغرفة رائحة خلال نضح رائحة. انظر الشكل رقم 1 لالتخطيطي والشكل 2 للحصول على صور للغرف.
  2. استخدام أربع غرف الرائحة لعناصر المذيبات، وغرفة واحدة لالرائحة الاختبار. ملء العبوات الزجاجية مع 1000 ميكرولتر من تمييع المذيبات أو الرائحة (عطر اختبار + المذيبات المناسبة، تخلط جيدا قبل التجارب)، ضع إناء زجاجي داخل غرفة البلاستيك المقابلة (لا تمتد إلى السائل إلى غرفة البلاستيك) وإحكام الغطاء . تأكد دائما استخدام غرفة نظيفة للالرائحة اختبار والضوابط المذيبات.
    ملاحظة: قد تكون ناجمة جذب الشمي من 1/16 التخفيف من خل التفاح (5٪ الحموضة) في ثالعاطر. في المقابل، قد تدرس سلوك التنافر حاسة الشم باستخدام تخفيف 10٪ من بروبيونات الإيثيل في الزيوت المعدنية. المحفزات تحكم في هذه الحالات هي غرف رائحة مع الزيوت المعدنية النقية.

3. إعداد يطير

  1. الذباب الخلفي على وسط الذرة القياسية. وضع 30 من الذكور و 30 من الإناث الذباب الوالدين في زجاجة القياسية، والسماح لهم وضع البيض لمدة 5 أيام في درجة حرارة 25 مئوية أو درجة حرارة الغرفة.
  2. لكل تجربة، وجمع eclosed حديثا (<1 يوم من العمر) 25 من الذكور و 25 من الإناث الذباب تحت وجيزة CO 2 التخدير.
  3. إبعاد الذباب في قارورة مع المتوسط ​​ذبابة القياسية لمدة 2-4 أيام.
  4. 40-42 ساعة قبل التجربة، ونقل الذباب دون CO 2 التخدير   إلى قارورة مع ~ agarose هلام 10 مل 1٪. هذا وسوف تبقي الذباب مرطب بدون الطعام، مما يساعد على زيادة النشاط الحركي لها.
    ملاحظة: أكثر من 90٪ من الذباب يجب أن تنجو من الموت جوعا. بعض التراكيب الوراثية هي أقل شفاءخاصتك وقد لا تجعل من خلال التجويع 40 ساعة. في هذه الحالات، وفترات أقصر مثل 24-28 ساعة مقبولة ولكن يجب أن تبقى هي نفسها لجميع الظروف التجريبية ويكرر.

4. الاستجابات السلوكية للعطور جذابة وطارد

  1. التبديل على وحدة تحكم في درجة الحرارة وتعيينه إلى 25 درجة مئوية.
  2. ربط غرف الرائحة (مراقبة واختبار عطر) عن طريق إدخال أنبوب إلى مخرج الغرفة الرائحة ودفع إلى ربط المناسب في مربع السلوك.
  3. تحقق معدل التدفق في كل رباعي باستخدام متر تدفق الهواء للتأكد من أن السيطرة وairstreams الرائحة تساوي 100 مل / دقيقة.
  4. تنظيف الساحة PTFE الطاير ولوحات الزجاج مع 70٪ من الإيثانول 2-3 مرات والسماح لهم تماما الهواء الجاف (~ 3-4 دقيقة).
  5. يضعوا لوحات الزجاج إلى الساحة مع المشابك.
  6. نقل الذباب دون CO 2 التخدير في الساحة من خلال ثقب في واحدة من لوحات الزجاج. الخلفإيه نقل، ووضع شبكة دائرية على الفتحة لمنع الذباب من الهرب.
    ملاحظة: وقد تبين CO 2 التخدير للتأثير على السلوك ذبابة الفاكهة 25 و لا ينبغي أن تستخدم خلال 24 ساعة من تجربة سلوكية.
  7. وضع الساحة مع الذباب في غرفة ضوء ضيق، وربط مجاري الهواء أربعة السيطرة من خلال ربط الأنابيب التي تعلق على الضغط وربط المناسب في مربع السلوك إلى زوايا الساحة، أغلق باب الغرفة وانتظر 10- 15 دقيقة للسماح للالذباب التأقلم مع البيئة الجديدة. إذا كان ذلك ممكنا، تبديل الأنوار في الغرفة حيث يتم تنفيذ التجارب، لتفادي وقوع تسرب ضوء الحد الأدنى الذي قد يؤثر على نتائج تجريبية.
  8. تشغيل التجربة السيطرة 5-10 دقيقة، والذي يتعرض الذباب لتيارات الهواء 4 السيطرة.
  9. تحليل البيانات مباشرة (انظر القسم تحليل البيانات أدناه) للتأكد من أن الذباب تتوزع بشكل موحد في الساحة، والجذب مؤشر قريبإلى 0. هذه الخطوة ضرورية، كما أنه يتحقق من عدم وجود مصادر غير المنضبط الأفضلية أو تجنب داخل الساحة (على سبيل المثال على ضوء ما تسرب من الخارج، وتوزيع درجات الحرارة متفاوتة، الساحة متفاوتة، التلوث رائحة، وما إلى ذلك). إذا وزعت الذباب بشكل غير متساو أو النشاط الحركي لهم منخفض، تجاهل الذباب، وتنظيف الساحة من جديد (الخطوة 4.4) واستخدام دفعة جديدة من الذباب لتكرار التجربة.
  10. ربط غرفة الاختبار الرائحة إلى الإعداد عن طريق التحول على 3 في اتجاه والصمامات أو إعادة توصيل-الأنابيب الموصل.
  11. تشغيل التجربة اختبار لمدة 5-10 دقيقة وتحليل البيانات كما هو مبين في المادة 5 أدناه (انظر أيضا المرجع 14) والشكل (3). تسجيلات أطول من 20 دقيقة يمكن أن يؤدي إلى ملفات البيانات التي قد يكون من الصعب عملية حسابيا. وإذا رغبت التسجيلات يعد التجريبية، ووقف بسرعة وإعادة بدء برنامج التتبع. وهذا يؤدي إلى وجود فجوة ثانية ~ 10 بين التسجيلات التجريبية.
  12. Discarالذباب د.
  13. نظيفة الساحة والزجاج لوحات مع 70٪ من الإيثانول (الخطوة 4.4)، واستبدال أنابيب موصل داخل العلبة الخفيفة محكم. لتسريع التجارب، ساحة نظيفة جديدة يمكن استخدامها، والساحة القذرة تنظيفها أثناء أداء التشغيل التجريبي.
  14. تشغيل تجربة أخرى مع دفعة جديدة من الذباب، وإذا لزم الأمر. إذا تم تشغيل العديد من التجارب في نفس اليوم، واتخاذ الحذر الشديد لضمان عدم ترك أي الرائحة في النظام من تشغيل الاختبار السابق. هذا هو عادة لا مشكلة مع تركيزات منخفضة من عطر أو مع CO 2، ولكن قد تكون هناك حاجة إلى محفزات لمركزة للغاية تصل إلى فجوة 24 ساعة بين التشغيل التجريبي. وبالإضافة إلى ذلك، فإن جميع الأنابيب بعد تدفق أنابيب يمكن استبدال إذا اشتبه التلوث الرائحة خلال التجارب السيطرة. تترك دائما الهواء الجاف على بين التجارب لطرد المستمر للنظام

تحليل 5. البيانات

ملاحظة: ذبابة اقترح اكتساب تتبع سوفتواريه (المفصل في المواد)، ويتتبع الذباب في الوقت الحقيقي خلال الاستحواذ، ويحفظ الطابع الزمني وإحداثيات كل الذباب الكشف في شكل دات *. لقد قمنا بتطوير حسب الطلب مطلب روتين لتحويل البيانات إلى تنسيق ماتلاب، وتحليل البيانات. وقدمت أمثلة التعليمات البرمجية في المواد التكميلية، ولكن تفاصيل التنفيذ تعتمد على البرمجيات المستخدمة للحصول على البيانات.

  1. تحميل البيانات الخام. إنشاء قناع المكاني الذي يلي معالم الساحة وتطبيق قناع للبيانات الأولية لإزالة كافة نقاط البيانات التي تقع خارج الساحة لأنها تمثل الضوضاء (الشكل 4A، التكميلية كود MaskSpatialFiltering.m، Score.m، DrawCircularMask. م).
  2. إزالة كافة نقاط البيانات التي تتحرك بسرعة أقل من 0.163 سم / ثانية لمدة أطول من 3S، حيث من المحتمل أن يكون الضجيج أو المتولدة عن طريق الذباب غير متحركة (الشكل 4B، التكميلية كود TemporalFiltering.m) هذه البيانات.
  3. تصور البيانات المتبقيةنقاط من خلال التآمر بها في كل مرة أو مسارات واحدة (الشكل 3، وقانون التكميلية SingleTrajectoryViewer.m).
    ملاحظة: موقع الحدود رائحة في مجال أربع سنوات على الأرجح يعتمد على عدد من العوامل، مثل خصائص كل الرائحة ومعدلات تدفق الهواء المستخدمة. على سبيل المثال، سوف عطر شديدة التقلب المحتمل ملء الربع رائحة بشكل كامل من عطر أقل تقلبا. وبالتالي فمن المحتمل أن كل الرائحة قد تظهر حدود رائحة مختلفة قليلا. استخدام جهاز الكشف عن التأيين الضوى لقياس حدود رائحة يمكن أن يكون مشكلة لأنه يستخدم فراغ لأخذ عينات الهواء من نقطة محددة، وذلك يعطل تركيز الرائحة في تلك البقعة. ومع ذلك، حدود رائحة يمكن تقدير بسرعة على أساس البيانات السلوكية ذبابة. على سبيل المثال، حدود رائحة بناء على مسارات الطيران المتراكمة ردا على الروائح المختلفة يمكن ملاحظتها بوضوح في أرقام 3C و 3D.
  4. كالculate مؤشر جذب لتحديد ما إذا كانت تجارب السيطرة تولد أي رد تفضيل، وأيضا للوصول إلى استجابة إلى الرائحة (أو علم البصريات الوراثي 9) التحفيز. لحساب الجذب مؤشر (منظمة العفو الدولية)، استخدم 5 دقائق الأخير من عنصر تحكم أو تسجيل الاختبار. للحصول على قياس الجاذبية التي تقع بين +1 (جذب المطلق) و-1 (التنافر المطلق)، يتم استخدام المعادلة التالية لحساب منظمة العفو الدولية:
    المعادلة 1
    حيث N الاختبار هو عدد نقاط البيانات في الربع اختبار ومراقبة N هو متوسط ​​عدد نقاط البيانات في الأرباع الثلاث لمراقبة. هذا الإجراء هو بديهية كما هو مبين أي تفضيل من القيم تقترب من الصفر. ومع ذلك، فإنه لا يشير بشكل صحيح نسبة من إجمالي عدد الذباب التي تقع في الربع الرائحة. للحصول على هذا الإجراء، وهو مؤشر النسبة المئوية (PI) يمكن استخدامها:
    المعادلة 2 حيث N الاختبار هو عدد نقاط البيانات في الربع اختبار، وN المجموع هو عدد نقاط البيانات في جميع الأرباع الأربعة. وتنص هذه الصيغة وهو الإجراء الذي يقع بين 0 و 1، مع 0.25 الموافق أي تفضيل السلوكي (الشكل 3E و4C، التكميلية كود AttractionIndex.m).
  5. تشغيل 5-10 يكرر كل حالة تجريبية، وذلك باستخدام مجموعة جديدة من الذباب عن كل تكرار. مقارنة مؤشرات جذب بين الظروف أو ضد الرقابة باستخدام كولموجوروف-سميرنوف غير حدودي الاختبار (الشكل 3F، وظيفة kstest2 في Matlab).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

أربعة رباعي olfactometer سجلات فحص وتحليل أنشطة قريبة من العديد من الذباب على مساحة السلوكي كبير. ويمكن إدخال عطور في تيارات الهواء التي تدخل واحد، اثنان، ثلاثة، أو كل أربعة أجزاء. في حالة عدم وجود الروائح الكريهة، والذباب التحرك بحرية بين جميع الأرباع الأربعة. هذا السلوك هو أمر حاسم لمراقبة كما يشير التي لم يتم إدخال التحيز غير العمدية إلى الفحص. ويمكن لهذه التحيزات تشمل ضوء، التقلبات في درجات الحرارة، والاختلافات في تدفق الهواء، أو الملوثات رائحة. ويبين الشكل 3B والاستجابات السلوكية في olfactometer أربعة رباعي من 25 ذكرا و 25 أنثى الذباب إلى الهواء الجاف. ومن أبرز يطير مسار واحد من البيانات التي تم جمعها أيضا في الشكل 3B، ويوضح أن هذا الطيران واستكشاف الساحة السلوكية بأكملها. النتيجة مؤشر جاذبية (منظمة العفو الدولية) لجميع المسارات في تحليلها خلال فترة الاختبار 5-مين هي قريبة من 0، indicatiنانوغرام عدم وجود جاذبية لرباعي رائحة. وبالمثل، فإن مؤشر نسبة (PI) من التجربة هو 0.24، مشيرا إلى أن الذباب وزعت حتى إلى حد ما في كل الأرباع الأربعة خلال فترة الاختبار 5 دقيقة.

يظهر استجابة أربعة الميداني السلوكية إلى الرائحة جذابة في الشكل 3C. يتم تقديم خل التفاح في مجرى الهواء   أعلى اليسار رائحة رباعي الهواء تيار عن طريق وضع تخفيف 6.25٪ من خل التفاح إلى غرفة الاختبار رائحة. مسارات الطيران التي تم جمعها هو مبين في الرمادي وتبين أن معظم الذباب جمع في هذا الربع رائحة، وأنه لم يعد استكشاف جميع الأرباع الأربعة. يظهر مسار الطيران بلون واحد مرة واحدة ذبابة يدخل خل التفاح رائحة رباعي، فإنه يميل إلى البقاء في المربع رائحة جذابة. منظمة العفو الدولية من 0.94 للتجربة بالقرب 1 يشير إلى جذب قوي لهذه الرائحة. المعهد البترولي من 0.92 إلى أن 92٪ من الذباب ص emained في الربع رائحة خلال فترة التحليل.

يظهر استجابة أربعة الميداني السلوكية إلى الرائحة والمواد الطاردة للفي الشكل 3D. تم استخدام تخفيف 10٪ من بروبيونات إيثيل الرائحة وضعوا في غرفة رائحة كمصدر للرائحة لتيار الهواء أعلى يسار. مسارات الطيران حشدت للتجربة تحليلها تبين تجنب الربع رائحة، موحية من التنافر موجهة رائحة. يظهر مسار الطيران بلون واحد أن يطير، عندما دخلت الربع رائحة، سرعان ما تحولت بعيدا لتجنب الربع رائحة. منظمة العفو الدولية من -0.68 أقل من 0، مما يدل على التنافر، وبالقرب -1، مما يدل على استجابة الرائحة المنفرة قوية. المعهد البترولي من 0.06 في التجربة تشير إلى أن 6٪ فقط (مقارنة ب ~ 25٪ في التجارب رائحة محايدة) من نقاط البيانات ذبابة تعقب عثر في الربع الرائحة فوق مسار التجربة.

"1"> فهرس الجذب هو المقياس الأكثر استخداما على نطاق واسع لتحليل البيانات حاسة الشم لأنه يسمح عشرات أكبر من 0 للإشارة إلى جاذبية (إيجابي) وعشرات أقل من 0 للإشارة إلى التنافر (سلبي). كلما اقتربت من الرقم +1 أو -1، وأقوى من جاذبية أو التنافر إلى أن رائحة، على التوالي. كما هو موضح أعلاه، هذا المقياس قد لا تشير بوضوح إلى النسبة المئوية أو نسبة من الذباب تتبع لرباعي الرائحة فوق مسار التجربة. في هذه الحالة، قد يكون مؤشر نسبة أكثر إفادة. الشكل 3E المخططات العلاقة بين منظمة العفو الدولية وعشرات PI، وكيف تتصل هذه الأرقام إلى السلوكيات جذابة أو مثيرة للاشمئزاز.

نتائج فحص أربعة الميداني في السلوكيات حاسة الشم قوية وقابلة للتكرار. وهذا يسمح للمقارنات كمية بين السيطرة والظروف التجريبية كما هو مبين في الشكل 3F، وأيضا تمكن من تحديد olfactor خفيةردود ذ أن تحيد عن الحياد.

وعلاوة على ذلك، كما يتم الحصول على البيانات في القرار المكانية والزمانية عالية، فمن الممكن لدراسة عوامل عديدة من الاستجابات السلوكية، مثل مسارات الذباب واحدة (كما هو موضح في الشكل 3)، وكذلك تميز ديناميكية النشاط مختلفة من الذباب في حقل رائحة (على سبيل المثال، والتغيرات في الاتجاه وسرعة 19،20).

ويمكن أن يكون في كثير من الأحيان من الصعب وضع الساحة أربعة الحقل في نفس المكان المحدد لكل تجربة، وخاصة منذ مطلوب التنظيف المتكرر من الساحة. وقدمت يحلل النصوص تعويض عن هذه الاختلافات الطفيفة التي لأول مرة تركيب البيانات كما هو موضح في الشكل رقم 4A. في هذه الحالة، يتم احتساب شكل الساحة أربعة الحقل، وتتم إزالة نقاط البيانات التي تقع خارج هذا الفضاء. غالبا ما تمثل هذه الكائنات المتعقبة ديبالريس أو الأفكار التي يتم تعقب خطأ. لأنها لا تقع ضمن الساحة، وبالتالي تمثل الضوضاء، فمن المهم أن تتم إزالة هذه البيانات تشير إلى منع خاطئة تحليل البيانات. وبالمثل، فمن المهم أيضا أن إزالة نقاط البيانات المتعقبة التي قد تمثل الضوضاء أو غير متحركة الذباب داخل الساحة. لتحقيق هذا الهدف، ويستخدم برنامج نصي التحليل (وارد هنا) التي تزيل نقاط البيانات التي أساسا لا تتحرك (كما هو موضح في الشكل رقم 4B). هذه النقاط البيانات وعادة ما تكون في الأقلية، بعد أن الاحتفاظ بها يؤدي إلى أخطاء في التحاليل.

ويمكن حساب مؤشر الجذب وعشرات مؤشر تفضيل بعد فترة الزمنية المحددة (على سبيل المثال في نهاية التجربة 5 دقائق كما هو مبين في الشكل 3). وتجدر الإشارة إلى أنه، مع ذلك، أنه منذ يتم تعقب الذباب مع القرار المكانية والزمانية عالية، يمكن أن يؤديها تحليلات مماثلة في كافة مراحل التجربة. هذا هوهو مبين في الشكل 4C التي تحسب عشرات مؤشر الجذب ومؤشر النسبة المئوية في استمرار صناديق 10 ثانية على مدى فترة زمنية. هذا التحليل يسمح تقدير أفضل للتغيرات حاسة الشم التي قد تحدث في كافة مراحل التجربة، مثل التعود إلى الرائحة.

شكل 1
الشكل 1:. تخطيطي للOlfactometer أربعة رباعي يتكون (أ) إعداد سلوك نظام تسليم رائحة، ونظام التحكم في درجة الحرارة (لا تخطيطي)، ونظام الحصول على الصور (أضواء الأشعة تحت الحمراء وكاميرا CCD IR وصله بجهاز الكمبيوتر LED)، الساحة أربعة رباعي والسلوك والساحة صناديق ضوء محكم. الدوائر الحمراء تعين مكونات المقابلة هو مبين في الشكل 2. (ب) تصميم مفصل للنظام التسليم رائحة. تمثل الأحرف الخضراء أحجام اتصال / تحويل وittings. وصفت أنابيب من 1/16 معرف و08/01 OD باللون الأصفر في حين أن من 1/8 معرف و04/01 OD وصفت باللون الوردي. الاختصارات: الأشعة تحت الحمراء والأشعة تحت الحمراء. CF، ضغط تركيب؛ BF، شائك المناسب، MNPT، ذكر الأنابيب الوطنية الموضوع. الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: صور من إعداد الشم الفحص (A) رؤية واسعة المجال كاميرا مربع ومربع سلوك. (ب) عرض داخل منطقة الجزاء السلوك. وصفت لجنة التحقيق في درجة الحرارة، وأنابيب الموصل، والأشعة تحت الحمراء المصفوفات LED. (ج) أربعة رباعي الساحة. (D) عرض-حقل واسع للنظام التسليم رائحة متصلة إلى مربع السلوك. تمت إزالة مربع كاميرا للكشف عن كاميرا CCD. (E (F) مثال على أنابيب رائحة متصلة متعددة. (G) عالية الدقة أنابيب تدفق تنظيم تدفق الهواء. (H) ورائحة أنابيب التوصيل والموصلات المصب من المنظمين flowtube. (I) والملف اللولبي الصمامات تنظم إذا يتم تمرير الهواء النقي من خلال غرفة رائحة أو طردوا إلى الغرفة. ترتبط غرف (J) ورائحة لصمامات ذات اتجاه واحد، وتحتوي على إناء زجاجي الداخلية للالرائحة. (K) مربع السلوك يحتوي خارج التجهيزات الضغط والاتصال التي تتصل أنابيب تسليم رائحة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
مثال البيانات التي تم إنشاؤها باستخدام الفحص الشم أربعة الميدان (A) رسم تخطيطي للالساحة أربعة الميدان. ويلاحظ (ب) الاستجابات المحايدة عندما تحتوي على جميع الأرباع الأربعة فقط نضح الهواء الجاف. الردود (C) الجذب لتخفيف 6.25٪ من خل التفاح perfused من الربع العلوي الأيسر. السلوكيات (D) تنافر أثارت بنسبة 10٪ إيثيل بروبيونات. في الشكل 2B-2D، يتم رسم مسار واحد من البيانات التي يحصل عليها. يتم استخدام التدرج اللون للدلالة على مدار الساعة من التسجيل، مع الألوان الزرقاء والحمراء كونها بداية ونهاية التسجيلات، على التوالي. (E) مقارنة مؤشر الجذب (منظمة العفو الدولية) والنسبة المئوية مؤشر (PI). (F) متوسط ​​لمنظمة العفو الدولية من 3- 6 تجارب مع عدم وجود رائحة (التحكم)، خل التفاح (أكف) و 10٪ الأثيل بروبيونات (EP). أشرطة الخطأ تشير SEM. تم تقييم الفرق الإحصائية التي كولموجوروف-سميرنوف الشركة المصرية للاتصالاتالحادي والعشرين. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل 4: مثال البيانات التي تصدرها تحليل البيانات خطوات (A) تصفية المكانية للبيانات، التي يؤديها MaskSpatialFiltering.m لإزالة نقاط البيانات التي تقع خارج الساحة. وتشير الدوائر الحمراء المواقف الأولية من الدوائر التي تستخدم لتحديد حدود الساحة. الدوائر السوداء هي المواقف النهائية، التي حصل عليها تركيب دائرة الخطوط العريضة للبيانات (رمادي المنطقة المظللة داخل الحقل أربع سنوات). النقاط الحمراء والسهام السوداء تشير إلى نقاط البيانات التي سيتم إزالتها من مجموعة البيانات بعد هذه الخطوة التصفية. (ب) تصفية الزمانية للبيانات، التي يؤديها TemporalFiltering.m. هذه الخطوة تصفية يزيل نقاط البيانات التي تتحرك سلوفاكيا جداwly أو لا على الإطلاق، والتي من المحتمل أن تتولد عن طريق الذباب غير متحركة أو التراب / تأملات من الساحة. النقطة الحمراء محاطا مربع أحمر متقطع تشير مواقف ~ 6000 نقاط البيانات مع إحداثيات متطابقة التي سيتم إزالتها من قبل هذه الخطوة التصفية. مؤشر (C) معلم الجذب (منظمة العفو الدولية) ومؤشر النسبة المئوية (PI)، وتحسب في صناديق 10 ثانية خلال 5 دقائق الأخير من التجربة التي كتبها AttractionIndex.m. تحتوي ملامح الزمنية لهذه المؤشرات المعلومات حول ديناميات الاستجابات السلوكية، ويمكن استخدامه لتحليل مفصل من السلوكيات. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وolfactometer أربعة الميدانية الموصوفة هنا هو نظام السلوكي تنوعا لدراسة ردود حاسة الشم لوجود أعداد كبيرة من النوع البري ومتحولة ذبابة الفاكهة الذباب. يأخذ كل تجربة ~ 1 ساعة (بما في ذلك الإعداد، التشغيل التجريبي، والتنظيف)، و4-6 التجارب لا يمكن أن يؤديها بشكل روتيني كل يوم. وفحص نموذجي باستخدام 40-50 الذباب لمدة 5 دقائق يولد ما يقرب من 450،000 تتبع نقاط البيانات لتحليلها. التكوين وصفها ويمكن أيضا أن تستخدم، مع تعديلات طفيفة، لرصد تحركات الحشرات الأخرى أو يرقات الحشرات ردا على حاسة الشم أو غيرها من المحفزات الحسية على مدى فترة زمنية، تتراوح من دقيقة لأيام. فحص أربعة رباعي حساس لآثار كل من المحفزات جذابة ومثيرة للاشمئزاز. معظم عطر توليد مؤشرات جذب (منظمة العفو الدولية) بين -0.9 و +0.9 (المعادلة 1). ومنظمة العفو الدولية في مجموعة من 0،5-1 يدل سلوك جاذبية قوية من الذباب للمنبهات، في حين أن منظمة العفو الدولية في نطاق من -0.5 إلى -1 هوالناجمة عن المواد الطاردة قوية. وبصفة عامة، استجابة محايدة من الروائح التحكم (الهواء الجاف والهواء مرطب، الزيوت المعدنية) ينبغي أن تقع بين +0.1 و-0.1. منظمة العفو الدولية في كثير من الأحيان يتغير طوال فترة التجربة اختبار، والتي تعكس في الوقت تتطلب الذباب على السير في أعمدة الرائحة، الأولي جذب وزيادة النشاط الحركي نحو حافزا الرواية، والحساسية في نهاية المطاف في استجابة لحافز. تشغيل عنصر التحكم قبل الاختبار ضرورية، ويجب إجراء بعناية للتأكد من أن الذباب وزعت بشكل موحد في الساحة في ظل غياب الحافز المطلوب.

معظم أسباب متكررة من التحيز المكاني من الذباب في الساحة هي: تيارات متفاوتة الهواء، وربما يعود ذلك إلى أنابيب قطع أو ألواح الزجاج فرضت كاف من الساحة على شكل نجمة (في تجربتنا، والذباب قادرة على الكشف عن الاختلافات في تدفق الهواء من أقل قدر 15 مل / دقيقة). توزيع درجات الحرارة متفاوتة عبر الساحة، التي يمكن أن تحسن من وضعمكيف الهواء وحدة لتوليد أضعف وأكثر انتشارا تدفق الهواء و / أو أطول فترة ما قبل الاستحواذ (~ 20 دقيقة) لضمان حتى درجة حرارة الساحة، الحد الأدنى من تسرب الضوء من خلال فتح التحقيق في درجة الحرارة، قد خفضت بنسبة ختم الافتتاح مع شريط أسود. رائحة المتبقية في الساحة أو في نظام توصيل الهواء، في هذه الحالة الإعداد (الساحة، flowtubes، والتجهيزات من العلبة الخفيفة محكم، وما إلى ذلك) لا بد من تنظيفها ويترك ليجف لعدة أيام أو استبدالها كلما أمكن ذلك.

صيانة المعدات حاسة الشم أمر مهم للحصول على نتائج موثوقة ومتسقة. ، دفع إلى ربط حديد التسليح في مربع السلوك ومداخل الهواء والجدران الداخلية للالساحة ينبغي تنظيفها مع الايثانول بعد كل تجربة إذا تم استخدام الروائح القوية، ويترك ليجف تماما. يجب غسلها لوحات الزجاج ثلاث مرات مع الإيثانول 70٪، التي عادة ما تكون كافية لإزالة رائحة المتبقية والأوساخ من لوحات، ولكن الهكسان مفيدفي إزالة المركبات العضوية التي أودعتها الذباب (على سبيل المثال، الفيرومونات تتكون من سلاسل طويلة الهيدروكربونية). عموما لا ينصح صابون لأنه عادة ما يحتوي على مكونات عطرية، التي من شأنها أن تؤثر على سلوك الشم. يجب أن تظل خانة السلوك متصلا مداخل الهواء الجاف بين التجارب (على سبيل المثال بين عشية وضحاها) لتسهيل إزالة الروائح المتبقية من النظام.

إذا كان النشاط الحركي من الذباب منخفضة، فإنها قد تولد نقاط البيانات قليلة جدا، والتي غالبا ما ينتج عن ذلك مؤشر الجذب صاخبة ومتغير. قد تساعد أطول الجوع وتسجيل الأوقات لحل هذه المشكلة. في المقابل، إذا كان الذباب هي مريضة، 24-28 ساعة من الجوع سيكون عموما كاف لتعزيز النشاط الحركة طالما أنها تتفق في جميع أنحاء التجارب. هناك توازن دقيق بين المحافظة على حالة صحية من الذباب وزيادة الحركة. ويمكن استخدام 40 ساعة المجاعة كنقطة انطلاق، وتعديلها فيما بعدالحاجة بناء على النتائج التجريبية. سيتم مؤشرات جذب تتأثر إلى حد ما قبل مدة من الموت جوعا، وبالتالي فإنه من الضروري أن يموت جوعا كل حيوانات التجارب لنفس الفترة من الوقت من أجل تجنب آثار الخلط من وقت المجاعة. مرات المجاعة أطول عادة ما جعل ردود طاردة أضعف (أقرب إلى 0)، واستجابات جذابة أقوى. تيارات الهواء المراقبة الجوية الجافة تميل إلى يجفف الذباب، ويجب أن لا تستخدم لفترة أطول من 40 دقيقة.

ويمكن استخدام olfactometer أربعة رباعي لدراسة ردود الذباب واحدة 16،18 أو متعددة لحافز واحد أو لدراسة تفضيل خيار بين المحفزات. على سبيل المثال، الروائح المختلفة يمكن أن تستخدم في كل من الأرباع الأربعة. ويمكن أيضا أن تستخدم لتحديد استجابات لرائحة خليط من خلال دراسة حدود رائحة الأرباع. وتجدر الإشارة إلى أنه على الرغم من نظام التتبع يسمح المسارات الفردية أن تكون معزولة من البيانات التي تم جمعها، فمنممكن أن الذباب الفردية قد تتصرف بشكل مختلف عندما يعاير كجزء من مجموعة من عندما يتم اختبارها وحدها. على سبيل المثال، مجموعة من الذباب تظهر تزايد النفور موجهة رائحة بسبب التفاعلات الفيزيائية بين الذباب (26). ويمكن أيضا أن تتكيف نظام التتبع والتخطيط لاستخدامها في المقايسات غير حاسة الشم. قد إطار فحص تستوعب بسهولة مجموعة LED 9 لتحفيز علم البصريات الوراثي، أو لوحة الحرارية 27 للthermogenetics. ويمكن أيضا أن تتكيف النظام لدراسة الخيارات السلوكية لفترة زمنية العديد من ساعة، على سبيل المثال لدراسة سلوك وضع البيض 14. في هذه الحالة، معدل الإطار اكتساب يحتاج إلى تعديل لتجنب توليد ملفات البيانات الكبيرة، ومصدرا للرطوبة والركيزة (1٪ agarose هلام) بحاجة إلى أن تقدم كما الركيزة وضع البيض.

وجود قيود على هذا الإعداد هو أن يتم تعقب الذباب كما IR-يعكس الكائنات في وتحت arena- إذا أي عنصر من عناصر علم البصريات الوراثي أووتعكس تجربة توليد الحرارة الأشعة تحت الحمراء، وسوف تحتاج إلى إزالتها خلال مرحلة ما بعد المعالجة نقاط البيانات غير ذات صلة. حاليا كما أنه ليس من الممكن تصوير الذباب في القرار المكانية التي تسمح الذباب مختلفة ليكون تمييزها بشكل مستمر، ولكن هذا يمكن أن يتحسن في المستقبل باستخدام كاميرات الفيديو أكثر تقدما. الحد آخر للنظام الحالي هو أن حركة الذباب مقيدة إلى بعدين لتعزيز السلوكيات المشي، وسوف تمنع الردود رحلة حاسة الشم التي يسببها.

وتجدر الإشارة إلى أن فحوصات الآلي إضافية كما تم تطويرها لتحقيق السلوكيات حاسة الشم من واحد أو مجموعة من الذباب. التصميم الأكثر مماثلة لفحص الموصوفة هنا هو الطريقة التي وضعتها Beshel وتشونغ 28. في هذا الاختبار، ويتم رصد ردود ~ 30 الذباب في ساحة دائرية صغيرة (تقريبا ربع مساحة الساحة أربعة ميدانية) التي تنفذ بها الروائح من 1 من 4 منافذ رائحة طول وا الساحةليرة لبنانية، وإزالة من خلال ثقب في وسط الساحة الدائرية. وبالاضافة الى الساحة الصغيرة، وتشمل الاختلافات في التصميم غيرها من التصرفات التي يتم تنفيذها تحت ظروف الإضاءة، وعطر مع التركيز بشكل رئيسي على مقربة من موانئ رائحة (بدلا من جميع أنحاء الربع الرائحة حسب توجيهات الجدران مجعد من الساحة أربعة الحقل). ومع ذلك، فإن الساحة الدائرية هي طريقة مناسبة لفحص ردود حاسة الشم من الذباب، ويمكن أن تتكيف مع تصميم تتبع الطيران موضح هنا.

نهج بديل هو مراقبة في وقت واحد نشاط العديد من الذباب واحدة ردا على الروائح. في مقايسة Flywalk، وتوضع الذباب الفردية في أنابيب صغيرة، وردودهم تتبع عندما و perfused عطر من خلال أنبوب 29،30. تغييرات في الاتجاه إلى الأمام أو عكسي، أو التغيرات في سرعات، يمكن استخدامها لقياس ما إذا كان الرائحة عموما جذابة أو مثيرة للاشمئزاز. هذا الاختبار، مثل فحص أربعة الحقل، المسارات تلقائيا ذبابة مovements، وهكذا يمكن أن تستخدم لقياس سرعة ردود حاسة الشم لمجموعة واسعة من الروائح. ولكن، خلافا مجال أربع سنوات، وديناميات الحركية المعقدة، مثل زوايا مسار تحول والتفاعلات الاجتماعية المحتملة، وربما غاب في تسجيل فحص Flywalk.

كما تم تكييفها التتبع التلقائي من الذباب المشي واحدة إلى T-متاهة نوع الفحص 31،32. في هذا الاختبار، يتم وضع الذباب في غرف صغيرة فيها و perfused الروائح من طرفي الغرفة، والخروج عبر منفذ في وسط الغرفة. أيضا يتم تعقب مواقف الذباب تلقائيا. هذا يقلد، وعلى نطاق ذبابة واحدة، إطارا T-المتاهة. جنبا إلى جنب مع علم البصريات الوراثي، هذا الاختبار تم مناسبة بشكل خاص لمعايرة الدوائر العصبية التوسط التعلم حاسة الشم والذاكرة، ويمكن أيضا أن تستخدم لقياس تفضيلات حاسة الشم من الذباب واحدة. على غرار Flywalk، فإنه لا يمكن رصد ديناميات النشاط المعقدة التي قد تحدث في مناطق المكانية أكبر، مثل تلك التي تحدث خلال 14 عاما بحثا عن الغذاء، أو السلوكيات التي لا تحدث إلا في السكان الطاير.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Air delivery system  (Quantity needed)
Tubing and connectors
Thermoplastic NPT(F) Manifolds Cole-Parmer, IL, USA R-31522-31 1
Hex reducing  nipple (1/4MNPT->1/8MNPT) McMaster-Carr, IL, USA 5232T314 1
Tubing (ID:1/8) McMaster-Carr, IL, USA 5108K43 50 Ft
Tubing (ID:1/16) McMaster-Carr, IL, USA 52355K41 100 Ft
Barbed tube fittings McMaster-Carr, IL, USA 5117K71 1 pack
Push-to-connect tube fittings McMaster-Carr, IL, USA 5779K102 4
Barbed Tube Fittings (1/4MNPT->1/8BF) McMaster-Carr, IL, USA 5463K439 1 pack (10)
Barbed Tube Fittings (1/8MNPT->1/8BF) McMaster-Carr, IL, USA 5463K438 2 pack (10) 
Barbed Tube Fittings (1/8MNPT->1/16BF) McMaster-Carr, IL, USA 5463K4 2 pack (10) 
Barbed Tube Fittings (1/4MNPT->1/4BF) McMaster-Carr, IL, USA   5670K84 1
Hex head plug McMaster-Carr, IL, USA 48335K152 1
Air pressure regulator, air filter and flowmeters (Quantity needed)
Labatory gas drying unit W A HAMMOND DRIERITE CO LTD, OH, USA Model: L68-NP-303; stock #26840 1
Multitube frames for 150 mm flowtubes Cole-Parmer, IL, USA R03215-30 1
Multitube frames for 150 mm flowtubes Cole-Parmer, IL, USA R03215-76 1
150 mm flowtubes Cole-Parmer, IL, USA R-03217-15 9
Valve Cartridge Cole-Parmer, IL, USA R-03218-72 9
Precision Air regulator McMaster-Carr, IL, USA 6162K13 1
Soleniod valves Automate Scientific, Berkeley, CA 02-10i 4
Solenoid valve controller ValveLink 8.2, Automate Scientific, Berkeley, CA 01-18 1
Electronic flow meter Honeywell AWM3100V 1
DAQ (NI USB-6009, National Instruments) and a  National Instruments NI USB-6009 1
Power supply Extech Instruments 382200 1
Odor chambers
Polypropylene Wide Mouth jar 2 oz; 60 ml Nalgene 562118-0002 At least 5 are required per experiment, but a separate chamber is required for each dillution of each odorant. Available at Container Store, part #635114)
Glass odor chamber, 0.25 oz Sunburst Bottle LB4B At least 5 are required per experiment 
"In" valve for odor chamber Smart Products, Inc., CA, USA 214224PB-0011S000-4074 1 of these parts is used per odor chamber but they need to be replaced frequently
"Out" valve for odor chamber Smart Products, Inc., CA, USA 224214PB-0011S000-4074 1 of these parts is used per odor chamber but they need to be replaced frequently
O ring RT Dygert International, MN, USA AS568-029 Buna-N O-R 1 pack (100)
Fly arena, camera and behavior boxes (Quantity needed)
Behavior and camera box material Interstate plastics, CA, USA ABS black extruded (https://www.interstateplastics.com/Abs-Black-Extruded-Sheet-ABSBE~~ST.php) 1803 sq inch
Teflon for fly arena and odor chamber inserts, 3/8" thick, 12" x 12" McMaster-Carr, IL, USA 8545K27  1
Glass plates, 1/8" Thick, 9" x 9" McMaster-Carr, IL, USA 8476K191  2
Dual action thermoelectric controller WAtronix Inc, CA, USA DA12V-K-0 1
IR LED array Advanced Illumination, Rochester, VT, USA AL4554-88024, PS24-TL 2 LED arrays and one power supply
Air conditioner Unit Melcor Store  MAA280T-12 1
Imaging system (Quantity needed)
Cosmicar/Pentax C21211TH (12.5 mm F/1.4) C-mount Lens B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA PEC21211 KP 1
CCXC-12P05N Interconnect Cable B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA SOCCXC12P05N 1
DC-700 Camera Adapter B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA SODC700 1
B+W 40,5 093 IR filter B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA 65-072442 1
TiFFEN 40.5 mm Circular polarizer Amazon 1
IR Videocamera Industrial Vision Source, FL, USA Sony XC-EI50 (SY-XC-E150) 1
USB video converter The Imagingsource, NC, USA DFG/USB2-It 1
iFlySpy2 (fly tracking software) Julian Brown, Stanford, Calfornia: julianrbrown@gmail.com iFlySpy2 1
IC Capture 2.2 software The Imagingsource, NC, USA (http://www.theimagingsource.com/en_US/products/software/iccapture/)
Miscellaneous (Quantity needed)
Dremel rotary tool Dremel, Racine, WI, USA Dremel 8000-03  1
Diamond-coated drill bits for glass cutting Available from various suppliers; MSC industrial Supply Co, Melville, NY 90606328 1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Benzer, S. Behavioral mutants of Drosophila isolated by countercurrent distribution. Proc Natl Acad Sci U S A. 58 (3), 1112-1119 (1967).
  2. Thorpe, W. H. Further studies on pre-imaginal olfactory conditioning in insects. Proc R Soc B. 127 (848), 424-433 (1939).
  3. Tully, T., Quinn, W. G. Classical conditioning and retention in normal and mutant Drosophila melanogaster. J Comp Physiol A. 157 (2), 263-277 (1985).
  4. Anholt, R. R., Mackay, T. F. Quantitative genetic analyses of complex behaviours in Drosophila. Nat Rev Genet. 5 (11), 838-849 (2004).
  5. Vosshall, L. B. Into the mind of a fly. Nature. 450 (7167), 193-197 (2007).
  6. Wu, M. N., Koh, K., Yue, Z., Joiner, W. J., Sehgal, A. A genetic screen for sleep and circadian mutants reveals mechanisms underlying regulation of sleep in Drosophila. Sleep. 31 (4), 465-472 (2008).
  7. Dankert, H., Wang, L., Hoopfer, E. D., Anderson, D. J., Perona, P. Automated monitoring and analysis of social behavior in Drosophila. Nat Methods. 6 (4), 297-303 (2009).
  8. Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nat Methods. 6 (6), 451-457 (2009).
  9. Aso, Y., et al. Mushroom body output neurons encode valence and guide memory-based action selection in Drosophila. Elife. 3, e04580 (2014).
  10. Pfeiffer, B. D., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (28), 9715-9720 (2008).
  11. Pfeiffer, B. D., et al. Refinement of tools for targeted gene expression in Drosophila. Genetics. 186 (2), 735-755 (2010).
  12. Venken, K. J., et al. Genome engineering: Drosophila melanogaster and beyond. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. , (2015).
  13. Diao, F., et al. Plug-and-play genetic access to drosophila cell types using exchangeable exon cassettes. Cell Rep. 10 (8), 1410-1421 (2015).
  14. Lin, C. C., Prokop-Prigge, K. A., Preti, G., Potter, C. J. Food odors trigger Drosophila males to deposit a pheromone that guides aggregation and female oviposition decisions. Elife. 4, (2015).
  15. Pettersson, J. An aphid sex attractant. Insect Systematics & Evolution. 1 (1), 63-73 (1970).
  16. Semmelhack, J. L., Wang, J. W. Select Drosophila glomeruli mediate innate olfactory attraction and aversion. Nature. 459 (7244), 218-223 (2009).
  17. Vet, L. E. M., Lenteren, J. C. V., Heymans, M., Meelis, E. An airflow olfactometer for measuring olfactory responses of hymenopterous parasitoids and other small insects. Physiological Entomology. 8 (1), 97-106 (1983).
  18. Faucher, C., Forstreuter, M., Hilker, M., de Bruyne, M. Behavioral responses of Drosophila to biogenic levels of carbon dioxide depend on life-stage, sex and olfactory context. J Exp Biol. 209 (Pt 14), 2739-2748 (2006).
  19. Katsov, A. Y., Clandinin, T. R. Motion processing streams in Drosophila are behaviorally specialized. Neuron. 59 (2), 322-335 (2008).
  20. Gao, X. J., et al. Specific kinematics and motor-related neurons for aversive chemotaxis in Drosophila. Curr Biol. 23 (13), 1163-1172 (2013).
  21. Gao, X. J., Clandinin, T. R., Luo, L. Extremely sparse olfactory inputs are sufficient to mediate innate aversion in Drosophila. PLoS One. 10 (4), e0125986 (2015).
  22. Ronderos, D. S., Lin, C. C., Potter, C. J., Smith, D. P. Farnesol-detecting olfactory neurons in Drosophila. J Neurosci. 34 (11), 3959-3968 (2014).
  23. Riabinina, O., et al. Improved and expanded Q-system reagents for genetic manipulations. Nat Methods. 12 (3), 219-222 (2015).
  24. Lundstrom, J. N., Gordon, A. R., Alden, E. C., Boesveldt, S., Albrecht, J. Methods for building an inexpensive computer-controlled olfactometer for temporally-precise experiments. Int J Psychophysiol. 78 (2), 179-189 (2010).
  25. Colinet, H., Renault, D. Metabolic effects of CO2 anaesthesia in Drosophila melanogaster. Biology Letters. 8 (6), 1050-1054 (2012).
  26. Ramdya, P., et al. Mechanosensory interactions drive collective behaviour in Drosophila. Nature. 519 (7542), 233-236 (2015).
  27. Ofstad, T. A., Zuker, C. S., Reiser, M. B. Visual place learning in Drosophila melanogaster. Nature. 474 (7350), 204-207 (2011).
  28. Beshel, J., Zhong, Y. Graded encoding of food odor value in the Drosophila brain. J Neurosci. 33 (40), 15693-15704 (2013).
  29. Steck, K., et al. A high-throughput behavioral paradigm for Drosophila olfaction - The Flywalk. Sci Rep. 2, 361 (2012).
  30. Thoma, M., Hansson, B. S., Knaden, M. High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm. J. Vis. Exp. (106), (2015).
  31. Claridge-Chang, A., et al. Writing memories with light-addressable reinforcement circuitry. Cell. 139 (2), 405-415 (2009).
  32. Parnas, M., Lin, A. C., Huetteroth, W., Miesenbock, G. Odor discrimination in Drosophila: from neural population codes to behavior. Neuron. 79 (5), 932-944 (2013).

Tags

علم الأعصاب، العدد 114، بيولوجيا الأعصاب وعلم الأحياء الحسي، عطر، الفيرومونات، حاسة الشم السلوك الفحص، ماتلاب، تحليل البيانات، وذبابة الخل، وتتبع الحركة، olfactometer أربعة الميداني
السلوكيات حاسة الشم يعاير التي تتبع الكمبيوتر<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; في Olfactometer أربعة رباعي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lin, C. C., Riabinina, O., Potter,… More

Lin, C. C., Riabinina, O., Potter, C. J. Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer. J. Vis. Exp. (114), e54346, doi:10.3791/54346 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter