Abstract
אתגר מרכזי בנוירוביולוגיה הוא להבין כיצד מעגלים עצביים לתפקד להנחות התנהגויות בעלי חיים מתאימות. תסיסנית היא מערכת מודל מצוינת עבור חקירות כאלה בשל ההתנהגויות המורכבות שלה, טכניקות גנטיות חזקות, ומערכת עצבים קומפקטית. מבחני התנהגות מעבדה כבר זמן רב בשימוש עם תסיסנית לדמות תכונות של הסביבה הטבעית לחקור את המנגנונים העצביים שבבסיס את ההתנהלויות (למשל phototaxis, chemotaxis, למידה חושית וזיכרון) 1-3. עם הזמינות האחרונות של אוספים גדולים של קווי תסיסנית מהונדס כי תווית תת עצביים ספציפיים, מבחני התנהגות לקחו על תפקיד בולט לקשר נוירונים עם התנהגויות 4-11. פרדיגמות צדדית לשחזור, יחד עם השגרה חישובית הבסיסית לניתוח נתונים, הן הכרחיות עבור בדיקות מהירות של קווים לטוס מועמד עם genotyp השונהes. שימושי במיוחד הם setups גמישים במספר לחיות ניסוי, משך הניסויים והטבע בגירויים מוצגים. את assay של בחירה צריך גם להפיק נתונים לשחזור כי הוא קל לרכוש ולנתח. כאן, אנו מציגים תיאור מפורט של מערכת ופרוטוקול עבור assaying תגובות התנהגותיות של תסיסנית זבובים בתוך זירת ארבעה שדה גדולה. ההתקנה משמשת כאן assay תגובות של זבובים לגירוי חוש ריח יחיד; עם זאת, אותה התכנית ההתקנה עשויה להיות שונה כדי לבדוק הרחה מרובה, גירויים חזותיים או optogenetic, או שילוב של אלה. התקנת אולפקטומטר מתעדת את הפעילות של אוכלוסיות זבוב להגיב לריחות, ושיטות אנליטיות חישובית מוחלות לכמת התנהגויות זבוב. הנתונים הנאספים מנותחים לקבל לקריאה מתוך מהירה של ריצת ניסיוני, אשר הינה הכרחית עבור איסוף נתונים יעיל אופטימיזציה של תנאי הניסוי.
Introduction
היכולת להסתגל ולהגיב הסביבה החיצונית היא קריטית להישרדות של כל בעלי החיים. בעל חיים צריכים למנוע סכנות, לחפש מזון למצוא בנות זוג, וללמוד מניסיונם הקודם. מערכות חושיות לתפקד לקבל מגוון של גירויים, כגון חזותי, כימי mechanosensory, ולשלוח אותות אלה למערכת העצבים המרכזית צורך לפרש מפוענח. המוח ואז מפנה התנהגויות מוטוריות המתאים בהתבסס על הסביבה הנתפסת, כגון תר אחר מזון או לברוח טורף. הבנה כיצד מערכות חושיות לזהות את העולם החיצוני, וכיצד המוח מפענח ומפנה החלטות, הוא אתגר גדול בנוירוביולוגיה.
תסיסנית היא מערכת מודל עוצמה על חקירת התנהגויות מדריך מעגלים עצביים איך. מלבד היותו פשוט וזול יותר לתחזק, תסיסנית תערוכה רבות התנהגויות מגוונות ומורכבות סטריאוטיפיות, עדיין עושה זאת עם compact מערכת העצבים של כ 100,000 נוירונים. טכניקות גנטיות עצמה קיימות מניפולציה של הגנום תסיסנית, ואלף קווים מהונדסים נוצרו כי סלקטיבי reproducibly לתייג אותה תת הקבוצות של נוירונים 10-13. קווים מהונדסים אלה יכולים לשמש כדי לתפעל את הפעילות באופן סלקטיבי של נוירונים שכותרתו (להפעיל או לעכב), ואת המניפולציות האלה יכולים לשמש כדי לחקור התנהגויות מדריך פונקציות איך עצבי.
מבחני התנהגות נפוצים פותחו ללימוד התנהגויות תסיסנית שונות. תסיסנית, כמו בעלי חיים רבים, להשתמש בחוש הריח שלהם להדרכת בחירות התנהגותיים רבות, כגון מציאת מזון, מציאת בני זוג, לבין הימנעות סכנות. Olfaction לכן מערכת חושית טובה חוקר כיצד לגירויים חיצוניים מזוהים ופורשו על ידי מערכת העצבים של בעלי חי להנחות בחירות מתאימות. ככזה, מספר מבחני פותחו עבור investigaזחל טינג והתנהגויות הרחה מבוגרת. באופן מסורתי, התנהגויות ההרחה תסיסנית היו assayed ידי פרדיגמת שתי הבחירה T-מבוך, אשר ניתן להשתמש בהם עבור assaying מולד למדו התנהגויות ההרחה 3. ב assay זה, כ -50 זבובים מקבלים בחירה בין שני צינורות: צינור אחד מכיל את הריח מדובר והשני מכיל odorant מלא (בדרך כלל ממס הריח). הזבובים ניתנים לתקופה קצובה של זמן לעשות בחירה, ולאחר מכן את מספר הזבובים הנמצאים בתאים השונים נספר. למרות T-המבוך הוא assay פשוט עבור ניסויים רבים, ישנם מספר מגבלות. לדוגמא, התנהגויות הרחה נמדדות רק בנקודת זמן אחת, ואת האפשרויות שונות שנעשו לפני נקודת זמן זו מבוטלות. בדומה לכך, התנהגויות הפרט של הזבובים בתוך האוכלוסייה מוזנחות. בנוסף, T-המבוך דורש ספירה ידנית של זבובים, אשר עשוי להציג שגיאות. לבסוף, שכן יש רק שתי אפשרויות מדודות, זהמקטין את הכח הסטטיסטי נדרש לעתים קרובות כדי לזהות שינויי התנהגותיים עדינים. חלופת מבוך T ושתיים בחירה היא של ארבעה רביעים (ארבעה-שדה) אולפקטומטר 14-18. ב assay זה, חיות לחקור זירה שבה כל אחת מארבע הפינות של הזירה מתמלאת מקור פוטנציאלי של אוויר odorized. הזירה יש צורת כוכב המכווץ על מנת למקסם את ההיווצרות של ארבעה רביעי ריח מוגדרים באופן ניסיוני. אם ריח מסופק באחת הפינות ואז הוא מוכל רק באותה ברבע אחד. ההתנהגויות של בעלי החיים ניתן לעקוב כפי שהוא להיכנס ולצאת ברבעים הריח, ובקלות לעומת התנהגותם הרביעים המלאים השלושה. את assay אולפקטומטר הארבעה ברבע ובכך רשום בתגובה במרחב ובזמן התנהגותיות לגירויי הריח פני זירה ניסיונית גדולה.
אולפקטומטר ארבע ברבע פותחה לראשונה על ידי Pettersson et al. 15 Vet et al. 17 לחקור את olתגובות מפעל התנהגותיים של דבוראים טפילים פרט. Faucher et al. 18 Semmelhack וואנג 16 התאימו את ההגדרה כדי לפקח על התגובות חוש הריח של תסיסנית הפרט. אולפקטומטר הארבעה ברבע רגיש לא פחות לתגובות אטרקטיביות ודוחות, המאפשר מגוון רחב של בדיקה ניחוחי ותנאים. תוכנת מעקב-אישית בכתב זבוב, שפותחה על ידי אלכס Katsov 19 ומתוחזק כיום על ידי ג'וליאן בראון (המפורטים חומרים), הציג יתרונות נוספים למימושים עדכנית יותר של אולפקטומטר ארבע ברבע 14,20-23. עכשיו זה אפשרי כדי assay עד 100 זבובים בו זמנית מרחבית גבוהה (27.5 פיקסלים / ס"מ) ובזמן (30 פריימים לשנייה) רזולוציה, המאפשר חילוץ פרמטרים שונים, כגון מיקום, מהירות ותאוצה של זבובים בכל נקודת זמן. זה מאפשר חקירות הדינמיקה של תגובות התנהגותיות "הזבובים לריחות 20 חומרי טבלה), אותה התצורה מאפשרת תקופות מעקב גמישות ויכולה לשמש למעקב אחר זבובים עד 24 שעות על ידי לקיחת תמונות בקצב מסגרת נמוכה. אפשרות זו שמשה ללמוד התנהגויות הטלה של זבובים ולהשוות תנוחות הגוף שלהם עם העדפות ovipositional 14. אולפקטומטר ארבעה השדה עשוי לשמש גם כדי ללמוד תגובות מולטימודליות (למשל חוש ריח וחזותי) גירויים, או לשלב optogenetic 9 או thermogenetic 21 גירוי עם מצגות של גירויים חושיים. יתר על כן, הרזולוציה הגבוהה הזמנית מאפשרת המיצוי של מסלולי FOr כל זבובי פירות בערכת הנתונים האנסמבל. לכן, השיטה מאפשרת חקירת התנהגויות אוכלוסיית הרחה מודרכת גם אינטראקציות חברתיות פרט. הנתונים שנוצרו על ידי assay זה הם חזקים מאוד לשחזור, המאפשרים את השימוש אולפקטומטר ארבעת שדה למסכים התנהגותי.
אנו מתארים כאן את הרכבת ההתקנה עבור אולפקטומטר של ארבעה רביעים. בנוסף, אנו מראים את השימוש בו מנסה לאמוד משיכה ההרחה בתגובה חומץ תפוחים ודחייה בתגובה propionate אתיל מרוכז מאוד. לבסוף, אנו מתארים ולספק קוד לדוגמא עבור הניתוח של נתוני מעקב זבוב המוקלטים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הגדרת עצרת
- ייצור בזירה בצורת כוכב (19.5 ס"מ על 19.5 ס"מ על 0.7 ס"מ) מתוך polytetrafluoroethylene (PTFE) פי (חומרים משלים, SupplementalSketch_StarShapedArena.pdf) ציור מסופק. הזירה עשויה להיות מיוצרת על ידי בפרסומת או מתקן מותאם אישית.
- רוכשת שתי צלחות זכוכית (20.25 ס"מ על 20.25 ס"מ עם עובי של 2 מ"מ), לקדוח חור (~ 0.7 ס"מ קוטר) בדיוק במרכז אחד מלוחות הזכוכית באמצעות המקדח מצופה יהלומים.
- ייצור תיבת התנהגות אור חזק עבור התנהגותית. גם לייצר קופסות מצלמת אור חזקה עבור מצלמת וידאו CCD-אדום אינפרא לי תרשים סיפק (חומרים משלימים, SupplementalSketch_LightTightBox.pdf). התיבות עשויות להיות מיוצרות על ידי מסחרי או מתקן מותאם אישית.
- להתקין את יחידת המזגן על הקיר האחורי ואת מערכי LED על הקירות הצדדיים של תיבת ההתנהגות. מניח את חללית הטמפרטורהבתיבת התנהגות דרך חור בצד משוב וכוונון טמפרטורה בזמן אמת (ראה איורים 1 ו -2 לפרטים נוספים).
- חבר את מסנן IR ו מקטב מעגלי למצלמה, ולעגן את המכלול לתוך תיבת המצלמה. תיבת התנהגות תיבת מצלמה מופרדת חלון זכוכית עבור בקרת טמפרטורה טובה יותר של תיבת ההתנהגות (ראה איורים 1 ו -2 לפרטים נוספים).
- חבר את מצלמת CCD אינפרא האדומה למתאם מצלמה. חבר את מתאם מצלמת ממיר USB. חבר את ממיר ה- USB ליציאת USB במחשב לרכישת נתונים.
- התקן את מנהל ההתקן עבור ממיר וידאו במחשב על פי הוראות היצרן. לחלופין, להתקין תוכנות עיבוד תמונה שסיפק היצרן של ממיר וידאו USB לגשת למגוון רחב יותר של הגדרות המצלמה ופרמטרים הרכישה.
- חבר את יחידת המזגן (באמצעות "פלט"על גביו של בקר טמפרטורה) ואת בדיקת הטמפרטורה (באמצעות" תרמי "בגב בקר טמפרטורה) אל בקר הטמפרטורה. מניח את החללית לתוך תיבת ההתנהגות.
הערה: מערכת בקרת הטמפרטורה בפריסה שלנו היא מסוגלת לשמור על טמפרטורת התיבה בין 18 ° C ו- 30 ° C. כאשר טמפרטורה סביבתית גבוהה או נמוכה יותר יכולה להיות שימושית עבור thermogenetic (dTrpA1, TS TrpM8 או shibire) ניסויים לתמרן פעילות עצבית או לעכב בשידור סינפטי. עבור רוב הניסויים, הטמפרטורה נשמרת על 25 מעלות צלזיוס. - הרכיבו את מערכת המסירה ריח בשלבים הבאים (ראה איור 1B עבור שרטוטים מפורטים ואביזרים חיבור):
- השתמש ווסת לחץ האוויר לשלוט קלט האוויר ממערכת האוויר המרכזית. חבר מסנן אוויר פחמן (מלא פחם) אל ווסת הלחץ כדי לטהר את האוויר מן המרכזימערכת ir.
- הרכב את מערכת בקרת זרימה המורכבת של ערוצים מרובים מוסדרים על ידי צינורות flowmeter ברזולוציה גבוהה.
- חברו את יציאת ממסנן האוויר פחמן אל צינורות flowmeter דרך סעפת כפי שמוצג באיור 1B ו 2F. כוון את הפלט של צינורות flowmeter דרך שסתומי סולנואיד 3 כיוונים נשלטו אלקטרוני להסדיר אם אוויר נקי לעזוב את למדידת התצרוכת מסולק לחדר או התקשר תאי ריח מחוייט 24.
- התקן את בקר שסתום סולנואיד פי הוראות היצרן.
- תקן מד זרימת האוויר האלקטרוני על ידי חיבורו להתקן רכישת נתונים (DAQ) וכן אספקת חשמל בהתאם למדריך של היצרן. התקן את תוכנת ממשק DAQ לאמת ספיקות שווות בכל רבע של הזירה לפני כל ניסוי.
2. הכנת גירויי חוש ריח
- הכן ריח 5תאי נמלה 24 מורכבות של מכל חיצוני פלסטיק, זכוכית מיכל פנימי, להכניס מכסת מחוייט PTFE, מכסה מיכל מקורי עם חלק מרכזי הוסרו, ושני שסתומים חד כיווניים.
הערה: O-Ring מסביב למכסת PTFE יכול לשמש כדי למנוע דליפת אוויר מאולם הריח במהלך זלוף ריח. ראה איור 1 עבור סכמטי באיור 2 לתמונות של תאי. - השתמש ארבעה תאי odorant עבור פקדי ממס, קאמרית אחת עבור odorant הבדיקה. מלאו את מיכלי זכוכית עם 1,000 μl של דילול ממס או odorant (ניחוחי מבחן + ממיסים המתאים, ומערבבים היטב לפני ניסויים), מניחים את מיכל זכוכית בפנים הקאמרית פלסטיק המקביל (לא לשפוך את הנוזל לתוך תא פלסטיק) והדק את המכסה . הקפד תמיד להשתמש בתא נקי עבור odorant מבחן ובקרות ממס.
הערה: משיכת חוש ריח יכולה להיות מופעלת על ידי 1/16 דילול של חומץ תפוחים (5% חומציות) ב wאטר. לעומת זאת, התנהגות דחייה חוש הריח עלול להיחקר באמצעות דילול 10% של propionate אתיל בשמן מינרלי. גירויי בקרה במקרים אלה הם תאי ריח עם שמן מינרלים טהור.
3. הכנה טס
- אחורי זבובים על מדיום קמח תירס רגיל. מניח 30 זכר 30 זבובים הוריים נשיים בקבוק סטנדרטי, ולתת להם להטיל ביצים במשך 5 ימים של 25 מעלות צלזיוס או בטמפרטורת חדר.
- עבור כל ניסוי, לאסוף eclosed החדש (<1 יממה) 25 גברים ו 25 נשים זבובים בהרדמה CO 2 קצר.
- שמור זבובי בקבוקון עם מדיום לטוס תקן 2-4 ימים.
- 40-42 שעות לפני הניסוי, להעביר את הזבובים בלי CO 2 הרדמה בקבוקון עם ג'ל agarose ~ 10 מ"ל 1%. זה ישמור על הזבובים humidified ללא מזון, אשר מסייע להגביר את הפעילות של התנועה שלהם.
הערה: יותר מ -90% של הזבובים צריכים לשרוד את הרעב. גנוטיפים חלקם פחות לרפאעמך וייתכן שלא לעשות את זה דרך רעב 40 שעות. במקרים אלה, לתקופות קצרות כגון 24-28 שעות תתקבלנה, אבל צריך להישמר זהה עבור כל התנאים והחוזרים ניסיוני.
4. תגובות התנהגותיות ניחוחות אטרקטיביים ודוחים
- הפעל את בקר הטמפרטורה ולהגדיר אותו ל -25 מעלות צלזיוס.
- חבר את תאי odorant (ניחוחי מלא בדיקה) על ידי החדרת צינורות לשקע של תא odorant ואל שכיבות כדי להתחבר הולם על קופסא ההתנהגות.
- בדוק את קצב הזרימה בכל רבע באמצעות מד זרימת אוויר לוודא כי מלאה איירסטרים odorant שווים ל -100 מ"ל / דקה.
- נקו את הזירה PTFE זבוב ואת לוחות זכוכית עם 70% 2-3 פעמים אתנול ולאפשר להם אוויר יבש לגמרי (~ 3-4 דקות).
- הצמד את לוחות הזכוכית לזירה עם מהדק.
- העברת זבובים בלי CO 2 הרדמה לזירה דרך החור אחד מלוחות הזכוכית. אָחוֹראה ההעברה, להציב רשת מעגלית על החור כדי למנוע זבובים לברוח.
הערה: הרדמת CO 2 הוכחה כדי להשפיע על התנהגות תסיסנית 25 ולא אמור לשמש תוך 24 שעות של ניסוי התנהגותי. - מניח את הזירה עם זבובים לתוך תא האור חזק, לחבר את זרמי אוויר ארבע שליטה על ידי חיבור הצינור המחובר אל שכיבות כדי להתחבר הולם על קופסא ההתנהגות לפינות הזירה, לסגור את הדלת של החדר ולחכות 10- 15 דקות כדי לתת את הזבובים להתאקלם בסביבה החדשה. במידת האפשר, כיבתה את האורות בחדר שבו הניסויים מבוצעים, כדי למנוע דליפת אור מינימלית האפשריים שעשויים להטות את התוצאה הניסיונית.
- הפעל ניסוי בניהול 5-10 דקות, שבו זבובים נחשפים פרצי אוויר 4 שליטה.
- לנתח את הנתונים באופן מיידי (ראה סעיף ניתוח נתונים להלן) כדי לוודא כי הזבובים מופצים באופן אחיד בזירה, ואת משיכת האינדקס קרובהצעד ל -0 זה חיוני, כפי שהוא מוודא כי אין מקורות בלתי מבוקרים של העדפה או הימנעות בתוך הזירה (למשל חדר אור דולף מבחוץ, התפלגות טמפרטורה אחידה, בזירה אחידה, זיהום ריח, וכו '). אם הזבובים מופצים שוויוניים או הפעילות של התנועה שלהם היא נמוכה, לבטל את הזבובים, לנקות את הזירה שוב (שלב 4.4) ולהשתמש קבוצה חדשה של זבובים לחזור על הניסוי.
- חבר את תא odorant המבחן כדי ההתקנה כשיפעיל שסתומי 3 הכיוונים או מחדש חיבור הצינורות המחברים.
- הפעל ניסוי מבחן למשך 5-10 דקות ולנתח את הנתונים כפי שפורט בסעיף 5 להלן (ראה גם הפניה 14 ו איור 3). הקלטות ארוכות מ -20 דקות יכולות לגרום קבצי נתונים שעשויות להיות קשה תהליך מחשוב. אם הקלטות ניסיוניות יותר הם רצויות, במהירות לעצור מחדש להפעיל את תכנית המעקב. התוצאה היא פער ~ 10 שניות בין הקלטות ניסיוניות.
- Discarזבובים ד.
- בזירה וזכוכית נקיות צלחות עם אתנול 70% (שלב 4.4), ולהחליף צינורות מחבר בתוך מתחם האור חזק. כדי לזרז את ניסויים, זירה נקיה חדשה יכולה לשמש, ובזירה המלוכלכת לנקות בעת ביצוע ריצות ניסיון.
- הפעל ניסוי נוסף עם קבוצה חדשה של זבובים, אם נדרש. אם מספר ניסויים מנוהלים באותו היום, לקחת בזהירות רבה, כדי לוודא ששום odorant נשאר במערכת מריצת בדיקה קודמת. זה בדרך כלל לא בעיה עם ריכוזים נמוכים של ניחוחי או עם CO 2, אבל עבור מרוכז מאוד גירויים עד פער 24 שעות בין ריצות ניסיוניות עשויים להיות נחוץ. בנוסף, כל הצינורות לאחר צינורות הזרימה יכולים להיות מוחלפים אם זיהום odorant חשוד במהלך ניסויים שליטים. תמיד להשאיר באוויר היבש בין הניסויים כדי לרוקן את המערכת באופן רציף
ניתוח 5. נתונים
הערה: softwar רכישת מעקב זבוב הציעדואר (המפורטים חומרים), עוקב אחר הזבובים בזמן אמת במהלך הרכישה, ושומר את חותמת זמן הקואורדינטות של כל הזבובים מזוהה בפורמט .dat *. פיתחנו שגרה מחוייט Matlab כדי להמיר את הנתונים לפורמט Matlab, ולנתח את הנתונים. דוגמאות קוד ניתנות חומרים משלימים, אך פרטים של יישום יהיו תלויים בתוכנה המשמשת לרכישת נתונים.
- טען את הנתונים הגולמיים. יצירת מסכה מרחבית, בהתאם לקווי המתאר של הזירה ולהחיל את המסכה על הנתונים הגולמיים כדי להסיר את כל נקודות נתונים שנופלים מחוץ לזירה כפי שהם מייצגים רעש (איור 4 א, משלים קוד MaskSpatialFiltering.m, Score.m, DrawCircularMask. M).
- הסר את כל נקודות נתונים שנעים במהירות מתחת 0.163 ס"מ / s עבור יותר -3, מכיוון שמידע זה עשוי להיות רעש או שנוצר על ידי זבובים שאינו זז (איור 4 ב ', משלים קוד TemporalFiltering.m).
- דמיינו נתונים הנותריםנקודות על ידי התוויית אותם בבת אחת או כמו מסלולי יחיד (איור 3, קוד משלים SingleTrajectoryViewer.m).
הערה: המיקום של גבולות ריח של שדה ארבעה תלוי סביר על מספר גורמים, כגון המאפיינים של כל odorant ושיעורי זרימת האוויר בשימוש. לדוגמא, ניחוחי בתנודתיות גבוהה ימלא ברבע הריח סביר באופן מלא יותר מאשר ניחוחי תנודתי פחות. לפיכך סביר להניח כי כל odorant עשוי להפגין גבולות ריח שונים במקצת. השימוש בגלאי photoionization למדוד גבולות ריח יכול להיות בעייתי כפי שהיא משתמשת בוואקום לדגום אוויר מנקודה מסוימת, וכך משבש את הריכוז odorant בנקודה זו. עם זאת, גבולות ריח יכולים יוערכו בהתבסס במהירות על נתונים התנהגותיים זבוב. לדוגמא, גבול ריח המבוסס על מסלולי זבוב שנצברו בתגובת ריחות שונים ניתן להבחין בבירור 3C דמויות 3D. - קאלculate אינדקס משיכה כדי לקבוע אם ניסויים שליטים לייצר שום תגובת העדפה, וגם לגשת בתגובת odorant (או 9 optogenetic) גירוי. כדי לחשב אטרקצית האינדקס (AI), להשתמש ב -5 הדקות האחרונות של הקלטה מלאה או בדיקה. כדי להשיג מידה של משיכה שנופלת בין +1 (משיכה מוחלטת) ו -1 (דחייה מוחלטת), הנוסחא הבאה משמשת לחישוב AI:
שם בדיקת N היא מספר נקודות נתונים ברבע הבדיקה, בקרת N הוא המספר הממוצע של נקודות נתוני הרביעים המלאים השלושה. צעד זה הוא אינטואיטיבי כמו העדפה תצוין ערכים אפסיים. עם זאת, זה לא נכון לציין את חלקם של המספר הכולל של זבובים ממוקמים ברבע odorant. כדי להשיג מידה זו, אחוז במדד (PI) ניתן להשתמש:![משוואה 2]("/files/ftp_upload/54346/54346eq2.jpg")
שם בדיקת N היא מספר נקודות נתונים ברבע הבדיקה, ומוחלט N הוא המספר הכולל של נקודות נתונים בכל ארבעת הרביעים. נוסחה זו מספקת מדד שנופל בין 0 ל -1, עם 0.25 המתאים אין העדפה התנהגותית (איור 3E ו 4C, משלים קוד AttractionIndex.m). - הפעל 5-10 חזרות על כל תנאי הניסוי, באמצעות קבוצה חדשה של זבובים לכל חוזרים. השוואת מדדי משיכה בין התנאים או נגד שולטת באמצעות מבחן קולמוגורוב-סמירנוב הלא פרמטרית (איור 3F, פונקציה kstest2 ב- Matlab).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
רשומות assay אולפקטומטר הארבעה ברבע ומנתחות את פעילות הליכת זבובים רבים על פני שטח גדול התנהגותי. יכולים להיות הציגו ניחוחות לתוך הנחלים-האוויר שנכנסים אחת, שתיים, שלוש, או כל ארבעה רביעים. בהעדר ריחות, הזבובים יהיה לנוע בחופשיות בין כל ארבעת הרביעים. התנהגות זו היא קריטית להתבונן כפי שהוא מעיד כי הטיות בלתי מכוונות לא הוכנסו לתוך assay. הטיות אלו יכולים לכלול אור, תנודות הטמפרטורה, ההבדלים זרימת האוויר, או מזהמים ריח. איור 3 ב מציג את תגובות התנהגותיות של אולפקטומטר של ארבעת הרביעים של 25 גברים ו 25 נשים זבובים לייבוש באוויר. זבוב-סינגל מהנתונים שנאספו מודגש גם באיור 3 ב, שהראה כי הזבוב הזה היה לחקור את התנהגותית כולו. הציון במדד המשיכה (AI) עבור כל המסלולים נתחו פני תקופת המבחן של 5 דקות הוא קרוב ל 0, לאינדיקציהng חוסר משיכה ברבע הריח. באופן דומה, מדד אחוז (PI) של הניסוי הוא 0.24, המציין כי זבובים חולקו למדי אפילו בכל ארבעת הרביעים בתקופת מבחן של 5 דקות.
התגובה ההתנהגותית ארבעת השדה אל odorant אטרקטיבי מוצגת באיור 3C. חומץ תפוחים הוא הציג לתוך זרם האוויר של בפינה הימנית העליונה ריח ברבע-זרם האוויר על ידי הצבת דילול 6.25% של חומץ תפוחים לתוך תא ריח הבדיקה. מסלולי הזבוב שנאספו מוצג באפור להפגין שרוב הזבובים לאסוף ברבע ריח זה, וכבר לא לחקור את כל ארבעת הרביעים. מסלול זבוב אחד בצבע מראה שברגע זבוב נכנס חומץ התפוחים ברבע הריח, הוא נוטה להישאר ברבע הריח האטרקטיבי. הבינה המלאכותית של 0.94 עבור הניסוי היא קרובה ל -1 המציין משיכה חזקה odorant זה. הבלש הפרטי של 0.92 עולה כי 92% של הזבובים r emained ברבע ריח במהלך ניתוח התקופה.
התגובה ההתנהגותית ארבעה-השדה על odorant דוחה מוצגת באיור 3D. דילול 10% של propionate אתיל odorant להציב בתא ריח שמש כמקור הריח עבור זרם האוויר השמאלי העליון. מסלולי הזבוב התקבצו הניסוי נתח להפגין הימנעות ברבע הריח, המרמז על דחיית ריח מודרך. מסלול זבוב אחד בצבע מראה כי זבוב, כאשר הוא נכנס ברבע הריח, במהירות הסתובב כדי להימנע ברבע הריח. הבינה המלאכותית של -0.68 היא פחות מ 0, אשר מציינת דחייה, והוא קרוב ל -1, מעיד על תגובת odorant דוחה חזקה. הבלש הפרטי של 0.06 עבור הניסוי עולה כי רק 6% (לעומת 25% ~ בניסויי הריח הניטראליים) של נקודות נתוני זבוב במעקב נמצאו ברבע הריח במהלך הניסוי.
"1"> מדד משיכה הוא המדד בשימוש הנרחב ביותר לניתוח נתונים ההרחה שכן הוא מאפשר ציונים גדולים מ -0 כדי לציין משיכה (חיובית) ועשרות פחות מ 0 כדי לציין דחייה (שלילי). ככל התוצאה היא +1 או -1, חזק יותר משיכה או דחייה כדי הריח, בהתאמה. כפי שתואר לעיל, מדד זה עשוי לא מצביע בבירור על האחוז או אחוז של זבובים לעקוב אחריהם עד ברבע הריח במהלך הניסוי. ובמקרה זה, מדד היחס יכול להיות אינפורמטיבי יותר. איור 3E דיאגרמות היחסים בין AI ועשרות PI, וכיצד מספרים אלה מתייחסים להתנהגויות דוחה או מושך.
את assay ארבעה שדה תוצאת התנהגויות ריח חזקות לשחזור. זה מאפשר השוואות כמותיות בין מלאה תנאי הניסוי כפי שמוצג באיור 3F, וגם מאפשר זיהוי של olfactor עדיןתגובות y שחורגות ניטראלי.
כמו כן, מאחר הנתונים מתקבלים ברזולוציה גבוהה במרחב ובזמן, אפשר ללמוד גורמים רבים של תגובות התנהגותיות, כגון מסלולי זבובים יחידים (כפי שמוצג באיור 3), וכן לאפיין דינמיקת פעילות אחרת של הזבובים שדה ריח (למשל, שינויים בכיוון ומהירות 19,20).
זה יכול להיות לעיתים קרובות קשה למקם את הזירה ארבע שדה במיקום זהה עבור כל ניסוי, במיוחד מאז ניקוי תכוף של הזירה נדרש. סיפק מנתח סקריפטים לפצות על שינויים קלים אלה על ידי הראשון הולם הנתונים כפי שמוצג באיור 4 א. במקרה זה, את הצורה של זירת הארבעה השדה מחושבת, ונקודות נתונים המצויים מחוץ למרחב זה יוסרו. אובייקטים מעקב אלה לעתים קרובות מייצגים debRIS או השתקפויות כי הם עוקבים בטעות. כשהם לא משקרים בתוך הזירה ובכך מייצגים רעש, חשוב כי נקודות נתונים אלה יוסרו למנוע נתונים שגויים מנתח. בדומה לכך, זה גם חשוב להסיר נקודות נתונים במעקב שעשוי לייצג רעש או שאינו זז זבובים בתוך הזירה. כדי להשיג זאת, תסריט ניתוח מנוצל (ובתנאים כאן) מסיר נקודות נתונים כי למעשה לא זזה (כפי שמוצג באיור 4B). נקודות נתונים אלה הן בדרך כלל במיעוט, עדיין השמירה שלהם תוביל לטעויות בניתוחים.
מדד המשיך ועשרות מדד העדפה ניתן לחשב לאחר פרק זמן סביר (לדוגמא בסוף ניסוי 5 דקות כפי שמוצג באיור 3). יצוין, עם זאת, כי מאז זבובים מתבצעים מעקב אחר עם רזולוציה גבוהה במרחב ובזמן, ניתוחים דומים יכולים להתבצע לאורך כל הניסוי. זהשמוצג באיור 4C שבו עשרות המשיכו מדד האחוז במדד מחושבים בסלי 10 שניות רציפות על פני תקופת הזמן. ניתוח כזה מאפשר הערכה טובה יותר של שינויי הרחה שעשויה להתרחש לאורך כל הניסוי, כגון הרגלה אל odorant.
איור 1:. סכמטי של אולפקטומטר ארבעה-רביע (א) הגדרת התנהגות מורכבת מערכת המסירה ריח, מערכת בקרת טמפרטורה (לא ניתח), מערכת רכישת התמונה (IR LED אורות מצלמת CCD IR מחובר למחשב), בזירה של ארבעה רביעים ותיבות התנהגות בזירת אור חזקים. העיגולים האדומים לייעד רכיבים המקבילים שמוצגים באיור 2. (ב) תכנון מפורט של מערכת מסירת הריח. הדמויות הירוקות מייצגות את גדלי חיבור / מרה של fittings. צינורות של 1/16 מזהה 1/8 OD מסומנים בצהוב בעוד שאלו של 1/8 מזהה 1/4 OD מסומנים בוורוד. קיצורים: IR, אינפרא אדום; CF, דחיסה Fitting; BF, דוקרני התאמה, MNPT, נושא צנרת זכר הלאומי. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2:. תמונות של התקנת Assay חוש הריח (א) רחב בתחום לאור תיבת מצלמת תיבת התנהגות. (ב) צפה בתוך קופסא ההתנהגות. חללית הטמפרטורה, צינורות מחבר, ומערכי LED IR מסומנים. (C) בזירת ארבעה-רביע. (ד) רחב בתחום לאור מערכת מסירת ריח המחוברים לממיר ההתנהגות. תיבת המצלמה הוסרה כדי לחשוף את מצלמת CCD. (E (F) דוגמא של צינורות הריח מחוברים הסעפת. (G) צינורות זרימה ברזולוציה גבוהה להסדיר את זרימת האוויר. (ע) צינורות משלוח ריח ומחברים במורד הזרם של הרגולטורים flowtube. (I) השסתומים סולנואיד להסדיר אם אוויר נקי הוא עבר דרך תא ריח או גורשו אל החדר. (J) תאי הריח מחוברים שסתומים חד כיווניים, ומכילים מיכל זכוכית פנימי עבור odorant. (K) תיבת ההתנהגות מכילה מחוץ Push-To-Connect אבזרים המתחברים צינורות משלוח הריח. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4:. דוגמא נתונים שנוצר על ידי צעדי ניתוח הנתונים (א) סינון מרחבים של הנתונים, בביצוע MaskSpatialFiltering.m להסיר נקודות נתונים שנופלות מחוץ לזירה. עיגולים אדומים להראות בעמדות ראשוניות של המעגלים המשמשים להגדרת הגבולות של הזירה. עיגולים שחורים הם העמדות הסופיות, שנרכשו על ידי התאמת המעגל מתארות לנתונים (אפור באזור מוצל בתוך השדה הארבעה). נקודות אדומות וראשי חץ שחור מצביעים נקודות נתונים יוסרו מן הנתונים לאחר שלב הסינון הזה. (ב) סינון זמני של נתונים, בביצוע TemporalFiltering.m. צעד סינון זו מסירה נקודות נתונים שנעים מאוד slowly או בכלל לא, כפי שהם צפויים להיווצר על ידי זבובים שאינו זז או על ידי עפר / השתקפויות מהזירה. נקודה אדומה מוקפת תיבת אדום מקווקו מציין מיקומים של ~ 6,000 נקודות נתונים עם קואורדינטות זהים כי יוסרו אחר צעד סינון זה. (ג) אטרקציה אינדקס (AI) ואחוז אינדקס (PI), מחושב בסלים של 10 שניות ב -5 הדקות האחרונות של ניסוי על ידי AttractionIndex.m. פרופילים זמניים של מדדים אלה מכילים מידע על הדינמיקה של תגובות התנהגותיות עשויים לשמש לניתוח מפורט של התנהגויות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אולפקטומטר ארבע השדה המתוארת כאן הוא מערכת התנהגותית צדדית ללימוד תגובות חוש הריח של אוכלוסיות גדולות של wild-type ו מוטצית תסיסנית זבובים. כל ניסוי לוקח ~ 1 hr (כולל התקנה, ריצות ניסיון, וניקוי), ו 4-6 ניסויים ניתן לבצע באופן שיגרתי בכל יום. Assay טיפוסי באמצעות 40-50 זבובים במשך 5 דקות מייצר כ -450,000 במעקב נקודות נתונים לצורך ניתוח. תצורת המתוארים יכולה לשמש גם, עם שינויים קלים, כדי לפקח על תנועות של חרקים אחרים או זחלי חרקים בתגובת חוש ריח או גירויים חושיים אחרים על פני פרק זמן, החל דקות עד ימים. את assay הארבעה ברבע רגיש להשפעות של שני גירויים אטרקטיביים ודוחים. רוב ניחוחי ליצור אינדקסים משיכה (AI) בין -0.9 ו 0.9 (משוואה 1). AI בטווח של +0,5 כדי +1 מסמל התנהגות משיכה חזקה של זבובים לגירויים, ואילו AI בטווח של -0.5 ל -1 הואמופעל על ידי דוחים חזקים. באופן כללי, תגובה ניטראלית על ידי ריחות מלאים (אוויר יבש, אוויר humidified, שמן מינרלים) צריכה לנפול בין 0.1 ו -0.1. את AI לעתים קרובות משתנה לאורך כל תקופת ניסוי הבדיקה, המשקף את זמן זבובים דורשים ללכת לתוך נוצות odorant, משיכת גידול ראשונית של פעילות של תנועה כלפי גירוי רומן, ואת ההקהיה הסופית בתגובה לגירוי. ריצות מלאות טרום בדיקה חיוניות, וחייבות להתבצע בזהירות על מנת להבטיח כי זבובים היו מפוזרים באופן אחיד בזירה בהעדר הגירוי הרצוי.
רוב הגורמים השכיחים של הטיה מרחבית של זבובים בזירה הם: פרצי אוויר אחיד, ככל הנראה בשל צינורות מנותקים או צלחות זכוכית הידק כראוי של הזירה בצורת כוכב (מניסיוננו, זבובים מסוגלים לזהות חילוקי זרימת האוויר של מעט ככל 15 mL / min); התפלגות טמפרטורה אחידה על פני הזירה, כי ניתן לשפר על ידי קביעהמזגן יחיד ליצור חלשה יותר מפוזרת זרימת אוויר ו / או בתקופה שלפני רכישה יותר (~ 20 דקות) כדי להבטיח אפילו בטמפרטורה של הזירה; זליגת אור מינימאלית דרך פתח בדיקת הטמפרטורה, כי עשוי להיות מופחת על ידי אטימת פתח עם סרט שחור; ריח שיורית בזירה או במערכת אספקת אוויר, ובמקרה ההתקנה (בזירה, flowtubes, אביזרי של המתחם אור חזק, וכו ') יש לנקות ביסודיות להתייבש במשך כמה ימים או להחליף במידת האפשר.
תחזוקה של ציוד חוש הריח חשובה תוצאות אמינות ועקביות. Push-to-להתחבר אבזרים על קופסא התנהגות צריכת אוויר קירות פנימיים של הזירה יש לנקות עם אתנול לאחר כל ניסוי אם משמשים ריחות חזקים, להתייבש לחלוטין. לוחות הזכוכית יש לשטוף שלוש פעמים עם אתנול 70%, וזה בדרך כלל מספיק כדי להסיר ריח שיורית ולכלוך מהצלחות, אבל הקסאן שימושיבהסרת תרכובת אורגנית שהופקדה על ידי זבובים (למשל, פרומונים המורכבים שרשרות פחמימנים ארוכות). סבון הוא בדרך כלל לא מומלץ משום שהוא מכיל בדרך כלל רכיבים ארומטיים, שישפיעו התנהגויות חוש ריח. תיבת ההתנהגות צריכה להישאר מחוברי צריכת האוויר היבש בין ניסויים (למשל הלילה) כדי להקל על הסרת ריחות שיורית מהמערכת.
אם הפעילות של התנועה של הזבובים היא נמוכה, הם עלולים ליצור מעט מדי נקודות נתונים, אשר לעתים קרובות תוצאות מדד משיכת רועש משתנה. פעמים מרעב הקלטה ארוכות יותר עשויות לעזור לפתור את הבעיה הזו. לעומת זאת, אם הזבובים חולים, 24-28 שעות ברעב תהיינה בדרך כלל מספיק עבור שיפור פעילות תנועה כל עוד הוא עולה בקנה אחד ברחבי ניסויים. ישנו איזון עדין בין שמירה על מצב בריא של הזבובים והגדלת תנועה. 40 שעות רעב יכול לשמש כנקודת התחלה, ולאחר מכן שונה כמועולה צורך בכך לאור תוצאות הניסוי. אינדקסי משיכה יושפעו מעט וממשך רעב, ולכן הוא חיוני כדי להרעיב את כל חיות הניסוי באותה התקופה של זמן על מנת למנוע תופעות של בלבול זמן רעב. פעמים רעבות כבר בדרך כלל לבצע תגובות דוחות חלשות יותר (קרוב ל -0), ותגובות אטרקטיביות חזקות. זרמי אוויר בקרת האוויר יבשים נוטים לייבש הזבובים, ולא אמור לשמש למשך זמן ארוך יותר מ -40 דקות.
אולפקטומטר הארבעה ברבע ניתן להשתמש כדי ללמוד תגובות של זבובים יחידים 16,18 או מרובים כדי גירוי יחיד או ללמוד העדפת בחירה בין גירויים. לדוגמא, ריחות שונים יכולים לשמש כל אחד מהארבעה-הרביעים. זה יכול לשמש גם כדי לקבוע את התגובות-תערובות ריח ידי בחינת הגבולות-רביעי הריח. יצוין כי למרות מערכת המעקב מאפשרת שירים בודדים כדי להיות מבודדים מן הנתונים שנאספו, זהייתכן כי זבובים בודדים עשויים להתנהג באופן שונה כאשר assayed כחלק מקבוצה מאשר כאשר הם נבחנים לבד. לדוגמה, קבוצות של זבובים תפגין גדל ודחייה מונחה ריח בשל אינטראקציות פיזיות בין זבובים 26. מערכת המעקב והפריסה יכולים גם להיות מותאמת לשימוש מבחנים שאינם חוש ריח. מסגרת assay יכולה להכיל מערך LED בקלות 9 לגירוי optogenetic, או צלחת תרמית 27 עבור thermogenetics. המערכת עשויה גם להיות מותאמת ללמוד בחירות התנהגותיות של ציר זמן של רבי hr, למשל ללמוד התנהגות הטלת 14. במקרה זה, את מסגרת דולר הרכישה צריך להיות מותאם, כדי למנוע את הדור של קובצי נתונים גדולים, ומקור לחות המצע (ג'ל 1% agarose) צריכים להינתן כמו מצע הטלה.
הגבלה של התקנה זו היא כי הזבובים מתבצע המעקב אחר כמו IR-חפצים מחזירי אור ב ומתחת arena- אם כל אלמנט של optogenetic אוניסוי thermogenetic משקף אינפרא אדום, נקודות הנתונים הרלוונטיות יהיה צורך להסירו במהלך שלאחר עיבוד. בשלב זה הוא גם לא ניתן לצלם זבובים ברזולוציה מרחבית המאפשרת זבובים שונים כדי שניתן יהיה להבחין ברציפות, אבל זה עשוי להשתפר בעתיד באמצעות מצלמות וידאו מתקדם יותר. מגבלה נוספת של המערכת הנוכחית היא שהתנועה של זבובים היא מוגבלת בשני ממדים לקדם התנהגויות הליכה, ותמנע תגובות טיסת הרחה-induced.
יצוין כי מבחנים אוטומטיים נוספים גם פותחו כדי לחקור את התנהגות חוש הריח של יחיד או קבוצות של זבובים. העיצוב הדומה ביותר assay המתוארת כאן היא שיטה שפותחה על ידי Beshel ו ונג 28. ב assay זה, התגובות של ~ 30 זבובים מנוטרות בתוך זירה עגולה קטנה (בערך רבע באזור של זירת הארבעה-השדה) שבו ריחות מועברים מן 1 מתוך 4 יציאות ריח לאורך wa בזירהll, והוציא דרך חור במרכז הזירה המעגלית. מלבד בזירה קטנה, הבדלים עיצוביים אחרים כוללים התנהגויות המבוצעות בתנאי אור, ניחוחי בעיקר להתרכז קרוב ליציאות הריח (במקום לאורך כל הרבע odorant כפי שהורה הקירות המכווצים של זירת הארבעה-השדה). עם זאת, בזירה החוזרת הנה שיטה מתאימה להקרנת תגובות חוש ריח של זבובים, ויכולה להיות מותאמת לעיצוב מעקב זבוב המתואר כאן.
גישה חלופית היא לפקח על הפעילות בו זמני של זבובים יחידים רבים בתגובה לריחות. ב assay Flywalk, זבובים הפרט ממוקמים צינורות קטנים, והתגובות שלהם במעקב כאשר ניחוחי הם perfused דרך הצינור 29,30. שינויים בכיוון קדימה או אחורה, או שינויים מהירויות, יכול להיות מנוצל כדי לאמוד אם odorant הוא אטרקטיבי בדרך כלל או דוחה. assay זה, כמו assay ארבעה-השדה, עוקב מ לטוס באופן אוטומטיovements, וכך ניתן להשתמש כדי למדוד תגובות ריח במהירות למגוון רחב של ריחות. עם זאת, בניגוד הארבעה-השדה, דינמיקה מוטורית מורכבת, כגון זוויות הפיכת מסלול ואינטראקציות חברתיות פוטנציאל, אולי החמיצה בהקלטת assay Flywalk.
מעקב אוטומטי של זבובים הליכה אחת גם הותאם על assay ל-ט מבוך 31,32. ב assay זה, זבובים ממוקמים תאים קטנים שבו ריחות perfused מכל צד של החדר, ויציאה דרך יציאה באמצע החדר. העמדות של הזבובים גם מתבצעות מעקב אוטומטי אחרות. מחקה זה, בקנה מידה זבוב אחד, מסגרת T-מבוך. בשילוב עם optogenetics, assay זה כבר גם מתאים במיוחד עבור assaying מעגלים עצביים בתיווך למידה וזיכרון חוש ריח, והוא יכול לשמש גם כדי לאמוד את העדפות חוש הריח של זבובים יחידים. בדומה Flywalk, זה לא יכול לפקח דינמיקת פעילות מורכבת שעלולים להתרחש על פני שטחים גדולים יותר מרחבית, כגון אלה המתרחשים במהלך 14 שוחרת מזון, או התנהגויות המתרחשות רק באוכלוסיות זבוב.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Air delivery system | (Quantity needed) | ||
| Tubing and connectors | |||
| Thermoplastic NPT(F) Manifolds | Cole-Parmer, IL, USA | R-31522-31 | 1 |
| Hex reducing nipple (1/4MNPT->1/8MNPT) | McMaster-Carr, IL, USA | 5232T314 | 1 |
| Tubing (ID:1/8) | McMaster-Carr, IL, USA | 5108K43 | 50 Ft |
| Tubing (ID:1/16) | McMaster-Carr, IL, USA | 52355K41 | 100 Ft |
| Barbed tube fittings | McMaster-Carr, IL, USA | 5117K71 | 1 pack |
| Push-to-connect tube fittings | McMaster-Carr, IL, USA | 5779K102 | 4 |
| Barbed Tube Fittings (1/4MNPT->1/8BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5463K439 | 1 pack (10) |
| Barbed Tube Fittings (1/8MNPT->1/8BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5463K438 | 2 pack (10) |
| Barbed Tube Fittings (1/8MNPT->1/16BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5463K4 | 2 pack (10) |
| Barbed Tube Fittings (1/4MNPT->1/4BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5670K84 | 1 |
| Hex head plug | McMaster-Carr, IL, USA | 48335K152 | 1 |
| Air pressure regulator, air filter and flowmeters | (Quantity needed) | ||
| Labatory gas drying unit | W A HAMMOND DRIERITE CO LTD, OH, USA | Model: L68-NP-303; stock #26840 | 1 |
| Multitube frames for 150 mm flowtubes | Cole-Parmer, IL, USA | R03215-30 | 1 |
| Multitube frames for 150 mm flowtubes | Cole-Parmer, IL, USA | R03215-76 | 1 |
| 150 mm flowtubes | Cole-Parmer, IL, USA | R-03217-15 | 9 |
| Valve Cartridge | Cole-Parmer, IL, USA | R-03218-72 | 9 |
| Precision Air regulator | McMaster-Carr, IL, USA | 6162K13 | 1 |
| Soleniod valves | Automate Scientific, Berkeley, CA | 02-10i | 4 |
| Solenoid valve controller | ValveLink 8.2, Automate Scientific, Berkeley, CA | 01-18 | 1 |
| Electronic flow meter | Honeywell | AWM3100V | 1 |
| DAQ (NI USB-6009, National Instruments) and a | National Instruments | NI USB-6009 | 1 |
| Power supply | Extech Instruments | 382200 | 1 |
| Odor chambers | |||
| Polypropylene Wide Mouth jar 2 oz; 60 ml | Nalgene | 562118-0002 | At least 5 are required per experiment, but a separate chamber is required for each dillution of each odorant. Available at Container Store, part #635114) |
| Glass odor chamber, 0.25 oz | Sunburst Bottle | LB4B | At least 5 are required per experiment |
| "In" valve for odor chamber | Smart Products, Inc., CA, USA | 214224PB-0011S000-4074 | 1 of these parts is used per odor chamber but they need to be replaced frequently |
| "Out" valve for odor chamber | Smart Products, Inc., CA, USA | 224214PB-0011S000-4074 | 1 of these parts is used per odor chamber but they need to be replaced frequently |
| O ring | RT Dygert International, MN, USA | AS568-029 Buna-N O-R | 1 pack (100) |
| Fly arena, camera and behavior boxes | (Quantity needed) | ||
| Behavior and camera box material | Interstate plastics, CA, USA | ABS black extruded (https://www.interstateplastics.com/Abs-Black-Extruded-Sheet-ABSBE~~ST.php) | 1803 sq inch |
| Teflon for fly arena and odor chamber inserts, 3/8" thick, 12" x 12" | McMaster-Carr, IL, USA | 8545K27 | 1 |
| Glass plates, 1/8" Thick, 9" x 9" | McMaster-Carr, IL, USA | 8476K191 | 2 |
| Dual action thermoelectric controller | WAtronix Inc, CA, USA | DA12V-K-0 | 1 |
| IR LED array | Advanced Illumination, Rochester, VT, USA | AL4554-88024, PS24-TL | 2 LED arrays and one power supply |
| Air conditioner Unit | Melcor Store | MAA280T-12 | 1 |
| Imaging system | (Quantity needed) | ||
| Cosmicar/Pentax C21211TH (12.5 mm F/1.4) C-mount Lens | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | PEC21211 KP | 1 |
| CCXC-12P05N Interconnect Cable | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | SOCCXC12P05N | 1 |
| DC-700 Camera Adapter | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | SODC700 | 1 |
| B+W 40,5 093 IR filter | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | 65-072442 | 1 |
| TiFFEN 40.5 mm Circular polarizer | Amazon | 1 | |
| IR Videocamera | Industrial Vision Source, FL, USA | Sony XC-EI50 (SY-XC-E150) | 1 |
| USB video converter | The Imagingsource, NC, USA | DFG/USB2-It | 1 |
| iFlySpy2 (fly tracking software) | Julian Brown, Stanford, Calfornia: julianrbrown@gmail.com | iFlySpy2 | 1 |
| IC Capture 2.2 software | The Imagingsource, NC, USA (http://www.theimagingsource.com/en_US/products/software/iccapture/) | ||
| Miscellaneous | (Quantity needed) | ||
| Dremel rotary tool | Dremel, Racine, WI, USA | Dremel 8000-03 | 1 |
| Diamond-coated drill bits for glass cutting | Available from various suppliers; MSC industrial Supply Co, Melville, NY | 90606328 | 1 |
References
- Benzer, S. Behavioral mutants of Drosophila isolated by countercurrent distribution. Proc Natl Acad Sci U S A. 58 (3), 1112-1119 (1967).
- Thorpe, W. H. Further studies on pre-imaginal olfactory conditioning in insects. Proc R Soc B. 127 (848), 424-433 (1939).
- Tully, T., Quinn, W. G. Classical conditioning and retention in normal and mutant Drosophila melanogaster. J Comp Physiol A. 157 (2), 263-277 (1985).
- Anholt, R. R., Mackay, T. F. Quantitative genetic analyses of complex behaviours in Drosophila. Nat Rev Genet. 5 (11), 838-849 (2004).
- Vosshall, L. B.
- Wu, M. N., Koh, K., Yue, Z., Joiner, W. J., Sehgal, A. A genetic screen for sleep and circadian mutants reveals mechanisms underlying regulation of sleep in Drosophila. Sleep. 31 (4), 465-472 (2008).
- Dankert, H., Wang, L., Hoopfer, E. D., Anderson, D. J., Perona, P. Automated monitoring and analysis of social behavior in Drosophila. Nat Methods. 6 (4), 297-303 (2009).
- Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nat Methods. 6 (6), 451-457 (2009).
- Aso, Y., et al. Mushroom body output neurons encode valence and guide memory-based action selection in Drosophila. Elife. 3, e04580 (2014).
- Pfeiffer, B. D., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (28), 9715-9720 (2008).
- Pfeiffer, B. D., et al. Refinement of tools for targeted gene expression in Drosophila. Genetics. 186 (2), 735-755 (2010).
- Venken, K. J., et al. Genome engineering: Drosophila melanogaster and beyond. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. , (2015).
- Diao, F., et al. Plug-and-play genetic access to drosophila cell types using exchangeable exon cassettes. Cell Rep. 10 (8), 1410-1421 (2015).
- Lin, C. C., Prokop-Prigge, K. A., Preti, G., Potter, C. J. Food odors trigger Drosophila males to deposit a pheromone that guides aggregation and female oviposition decisions. Elife. 4, (2015).
- Pettersson, J.
- Semmelhack, J. L., Wang, J. W. Select Drosophila glomeruli mediate innate olfactory attraction and aversion. Nature. 459 (7244), 218-223 (2009).
- Vet, L. E. M., Lenteren, J. C. V., Heymans, M., Meelis, E. An airflow olfactometer for measuring olfactory responses of hymenopterous parasitoids and other small insects. Physiological Entomology. 8 (1), 97-106 (1983).
- Faucher, C., Forstreuter, M., Hilker, M., de Bruyne, M. Behavioral responses of Drosophila to biogenic levels of carbon dioxide depend on life-stage, sex and olfactory context. J Exp Biol. 209 (Pt 14), 2739-2748 (2006).
- Katsov, A. Y., Clandinin, T. R. Motion processing streams in Drosophila are behaviorally specialized. Neuron. 59 (2), 322-335 (2008).
- Gao, X. J., et al. Specific kinematics and motor-related neurons for aversive chemotaxis in Drosophila. Curr Biol. 23 (13), 1163-1172 (2013).
- Gao, X. J., Clandinin, T. R., Luo, L. Extremely sparse olfactory inputs are sufficient to mediate innate aversion in Drosophila. PLoS One. 10 (4), e0125986 (2015).
- Ronderos, D. S., Lin, C. C., Potter, C. J., Smith, D. P.
- Riabinina, O., et al. Improved and expanded Q-system reagents for genetic manipulations. Nat Methods. 12 (3), 219-222 (2015).
- Lundstrom, J. N., Gordon, A. R., Alden, E. C., Boesveldt, S., Albrecht, J. Methods for building an inexpensive computer-controlled olfactometer for temporally-precise experiments. Int J Psychophysiol. 78 (2), 179-189 (2010).
- Colinet, H., Renault, D. Metabolic effects of CO2 anaesthesia in Drosophila melanogaster. Biology Letters. 8 (6), 1050-1054 (2012).
- Ramdya, P., et al. Mechanosensory interactions drive collective behaviour in Drosophila. Nature. 519 (7542), 233-236 (2015).
- Ofstad, T. A., Zuker, C. S., Reiser, M. B. Visual place learning in Drosophila melanogaster. Nature. 474 (7350), 204-207 (2011).
- Beshel, J., Zhong, Y. Graded encoding of food odor value in the Drosophila brain. J Neurosci. 33 (40), 15693-15704 (2013).
- Steck, K., et al. A high-throughput behavioral paradigm for Drosophila olfaction - The Flywalk. Sci Rep. 2, 361 (2012).
- Thoma, M., Hansson, B. S., Knaden, M. High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm. J. Vis. Exp. (106), (2015).
- Claridge-Chang, A., et al. Writing memories with light-addressable reinforcement circuitry. Cell. 139 (2), 405-415 (2009).
- Parnas, M., Lin, A. C., Huetteroth, W., Miesenbock, G. Odor discrimination in Drosophila: from neural population codes to behavior. Neuron. 79 (5), 932-944 (2013).
