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Neuroscience

घ्राण व्यवहार कंप्यूटर पर नज़र रखने का यत्न से Published: August 20, 2016 doi: 10.3791/54346
Automatic Translation
1, 2, 1
1The Solomon H. Snyder Department of Neuroscience, Center for Sensory Biology, Johns Hopkins University School of Medicine, 2MRC Clinical Sciences Center, Imperial College London

Abstract

तंत्रिका जीव विज्ञान में एक प्रमुख चुनौती समझने के लिए कैसे तंत्रिका सर्किट इसकी जटिल व्यवहार, शक्तिशाली आनुवंशिक तकनीक, और कॉम्पैक्ट तंत्रिका तंत्र के कारण उचित पशु व्यवहार मार्गदर्शन करने के लिए। ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर इस तरह की जाँच के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल प्रणाली है कार्य करते हैं। प्रयोगशाला व्यवहार assays लंबे (जैसे phototaxis, chemotaxis, संवेदी सीखने और स्मृति) 1-3 ड्रोसोफिला के साथ इस्तेमाल किया गया है प्राकृतिक वातावरण के गुणों का अनुकरण और इसी व्यवहार अंतर्निहित तंत्रिका तंत्र का अध्ययन करने के लिए। ट्रांसजेनिक ड्रोसोफिला लाइनों है कि विशिष्ट तंत्रिका सबसेट लेबल के बड़े संग्रह के हाल ही में उपलब्धता के साथ, व्यवहार assays व्यवहार 4-11 साथ न्यूरॉन्स से जोड़ने के लिए एक प्रमुख भूमिका पर ले लिया है। बहुमुखी और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य मानदंड, एक साथ डेटा विश्लेषण के लिए अंतर्निहित कम्प्यूटेशनल दिनचर्या के साथ, विभिन्न genotyp साथ उम्मीदवार उड़ लाइनों के तेजी से परीक्षण के लिए अपरिहार्य हैंतों। विशेष रूप से उपयोगी setups कि परीक्षण जानवरों, प्रयोगों की अवधि और प्रस्तुत उत्तेजनाओं की प्रकृति की संख्या में लचीला कर रहे हैं। पसंद की परख भी प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य डेटा हासिल करने और विश्लेषण करने के लिए आसान है कि उत्पन्न करनी चाहिए। यहाँ, हम एक प्रणाली और ड्रोसोफिला के व्यवहार प्रतिक्रियाओं परख करने की क्रिया के लिए प्रोटोकॉल के एक विस्तृत वर्णन एक बड़े चार क्षेत्र के क्षेत्र में मक्खियों प्रस्तुत करते हैं। सेटअप एक भी घ्राण प्रोत्साहन के लिए मक्खियों की प्रतिक्रियाओं परख करने के लिए यहाँ प्रयोग किया जाता है; हालांकि, एक ही सेटअप एकाधिक घ्राण, दृश्य या optogenetic उत्तेजनाओं, या इनमें से एक संयोजन का परीक्षण करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। olfactometer सेटअप odors के लिए जवाब मक्खी आबादी की गतिविधि रिकॉर्ड, और कम्प्यूटेशनल विश्लेषणात्मक तरीकों मक्खी व्यवहार यों को लागू कर रहे हैं। एकत्र आंकड़ों एक प्रायोगिक रन है, जो कुशल डेटा संग्रह और प्रयोगात्मक शर्तों के अनुकूलन के लिए आवश्यक है की एक त्वरित पढ़ने के लिए बाहर पाने के लिए विश्लेषण कर रहे हैं।

Introduction

अनुकूल है और बाहरी वातावरण के लिए प्रतिक्रिया करने की क्षमता सभी जानवरों के अस्तित्व के लिए महत्वपूर्ण है। एक जानवर खतरों से बचने के लिए, खाना बाहर की तलाश और साथियों मिल जाए, और पिछले अनुभवों से सीख की जरूरत है। संवेदी प्रणाली में इस तरह के दृश्य, रासायनिक और mechanosensory के रूप में उत्तेजनाओं की एक किस्म प्राप्त करते हैं, और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के लिए इन संकेतों को भेजने की व्याख्या की और डीकोड किया जा करने के लिए कार्य करते हैं। मस्तिष्क तो उपयुक्त मोटर इस तरह के भोजन के लिए foraging या एक शिकारी से बचने के रूप में माना जाता पर्यावरण पर आधारित व्यवहार, निर्देशन। समझ कैसे संवेदी प्रणाली बाहरी दुनिया का पता लगाने के लिए, और कैसे मस्तिष्क डीकोड और फैसलों का निर्देशन, तंत्रिका जीव विज्ञान में एक बड़ी चुनौती है।

ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर जांच कैसे तंत्रिका सर्किट गाइड व्यवहार के लिए एक शक्तिशाली मॉडल प्रणाली है। सरल और सस्ता बनाए रखने के लिए किया जा रहा है इसके अलावा, ड्रोसोफिला कई विविध और जटिल टकसाली व्यवहार प्रदर्शन, अभी तक एक कॉम्पैक्ट साथ ऐसा करते हैं100,000 के बारे में न्यूरॉन्स के तंत्रिका तंत्र टी। शक्तिशाली आनुवंशिक तकनीक ड्रोसोफिला जीनोम से छेड़छाड़ के लिए मौजूद हैं, और ट्रांसजेनिक लाइनों के हजारों उत्पन्न किया गया है कि चुनिंदा और reproducibly न्यूरॉन्स 10-13 का एक ही सबसेट लेबल। ये ट्रांसजेनिक लाइनों चुनिंदा लेबल न्यूरॉन्स (सक्रिय या रोकना) की गतिविधि में हेरफेर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और इन जोड़तोड़ कैसे तंत्रिका कार्यों गाइड व्यवहार की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

एकाधिक व्यवहार assays विभिन्न ड्रोसोफिला व्यवहार का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया है। ड्रोसोफिला, कई जानवरों की तरह है, जैसे, खाना खोजने साथियों को खोजने, और खतरों से बचने के रूप में कई व्यवहार विकल्प, मार्गदर्शन के लिए गंध की उनकी भावना का उपयोग करें। ओल्फैक्शन इसलिए जांच कैसे बाहरी उत्तेजनाओं का पता चला और एक जानवर के तंत्रिका तंत्र द्वारा व्याख्या उचित विकल्प मार्गदर्शन करने के लिए कर रहे हैं के लिए एक अच्छा संवेदी प्रणाली है। जैसे, assays के एक नंबर investiga के लिए विकसित किया गया हैटिंग लार्वा और वयस्क घ्राण व्यवहार। परंपरागत रूप से, ड्रोसोफिला में घ्राण व्यवहार एक दो विकल्प टी भूलभुलैया प्रतिमान है, जो जन्मजात परख करने की क्रिया के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और घ्राण व्यवहार 3 सीखा द्वारा यत्न कर रहे थे। इस परख में, के बारे में 50 मक्खियों दो ट्यूबों के बीच एक विकल्प दिया जाता है: एक ट्यूब प्रश्न में गंध होती है और अन्य एक नियंत्रण odorant (आमतौर पर गंध विलायक) शामिल हैं। मक्खियों एक विकल्प बनाने के लिए समय का एक निर्धारित अवधि के लिए दिया जाता है, और फिर मक्खियों कि अलग-अलग कक्षों में हैं की संख्या में गिने जाते हैं। हालांकि टी भूलभुलैया कई प्रयोगों के लिए एक सरल परख है, वहाँ कई सीमाएं हैं। उदाहरण के लिए, घ्राण व्यवहार केवल एक ही समय बिंदु पर मापा जाता है, और विभिन्न इस समय बिंदु से पहले किए गए विकल्पों खारिज कर रहे हैं। इसी तरह, आबादी के भीतर मक्खियों के अलग-अलग व्यवहार उपेक्षित रहे हैं। इसके अलावा, टी भूलभुलैया मक्खियों के मैनुअल गिनती, जो त्रुटियों को पेश हो सकता है की आवश्यकता है। अंत में, वहाँ के बाद से केवल दो मापा विकल्प हैं, इसअक्सर सूक्ष्म व्यवहार में बदलाव का पता लगाने के लिए आवश्यक सांख्यिकीय शक्ति कम कर देता है। एक दो विकल्प टी भूलभुलैया के लिए एक वैकल्पिक एक चार चतुर्थ भाग (चार क्षेत्र) olfactometer 14-18 है। इस परख में, जानवरों के एक क्षेत्र है जिसमें क्षेत्र के चार कोनों में से प्रत्येक odorized हवा का एक संभावित स्रोत से भर जाता है का पता लगाएं। क्षेत्र एक puckered सितारा आकार चार प्रयोगात्मक परिभाषित गंध quadrants के गठन को अधिकतम करने के लिए है। गंध कोनों तब से एक में आपूर्ति की जाती है, तो यह केवल यह है कि एक चक्र में निहित है। जानवरों के व्यवहार तीन नियंत्रण quadrants में उनके व्यवहार की तुलना में पता लगाया जा सकता है के रूप में वे प्रवेश और गंध चतुर्थ भाग छोड़ देते हैं, और आसानी से। चार चतुर्थ भाग olfactometer परख इस प्रकार के रिकॉर्ड एक बड़ी प्रयोगात्मक के मैदान से ज्यादा गंध उत्तेजनाओं को स्थानिक और लौकिक व्यवहार प्रतिक्रिया।

चार चतुर्थ भाग olfactometer पहले से Pettersson एट अल। 15 और पशु चिकित्सक एट अल विकसित किया गया था। 17 राजभाषा जांच करने के लिएकारखाने व्यक्ति परजीवी कलापक्ष के व्यवहार प्रतिक्रियाओं। Faucher एट अल। 18 और Semmelhack और वांग 16 व्यक्ति ड्रोसोफिला की घ्राण प्रतिक्रियाओं पर नजर रखने के लिए सेटअप अनुकूलित। चार चतुर्थ भाग olfactometer परीक्षण odorants और स्थितियों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए अनुमति देने के लिए भी उतना ही आकर्षक और प्रतिकारक प्रतिक्रियाओं के प्रति संवेदनशील है। कस्टम लिखा मक्खी ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर, एलेक्स Katsov 19 से विकसित की है और वर्तमान में जूलियन ब्राउन (सामग्री में विस्तृत) द्वारा बनाए रखा, चार चतुर्थ भाग olfactometer 14,20-23 के और अधिक हाल के कार्यान्वयन के लिए अतिरिक्त लाभ की शुरुआत की। अब यह उच्च स्थानिक पर 100 मक्खियों एक साथ (27.5 पिक्सल / सेमी) और अस्थायी समाधान है, जो इस तरह की स्थिति, किसी भी समय बिंदु पर गति और मक्खियों के त्वरण के रूप में विभिन्न मापदंडों निकालने की अनुमति देता है (प्रति सेकंड 30 फ्रेम) तक की परख के लिए संभव है। इस odors से 20 मक्खियों 'व्यवहार प्रतिक्रियाओं की गतिशीलता की जांच के लिए सक्षम बनाता है (सामग्री तालिका में विस्तृत) को शामिल करके, एक ही विन्यास लचीला ट्रैकिंग अवधि के लिए अनुमति देता है और एक कम फ्रेम दर पर छवियों को लेने के द्वारा अप करने के लिए 24 घंटे के लिए मक्खियों को ट्रैक करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यह विकल्प मक्खियों के अंडे बिछाने व्यवहार का अध्ययन करने और ovipositional वरीयताओं 14 के साथ उनके शरीर की स्थिति की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। चार-क्षेत्र olfactometer भी संवेदी उत्तेजनाओं की प्रस्तुतियों के साथ optogenetic 9 या 21 thermogenetic उत्तेजना गठबंधन करने के लिए बहुविध करने के लिए प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (जैसे घ्राण और दृश्य) उत्तेजनाओं, या। इसके अलावा, उच्च अस्थायी समाधान के लिए प्रक्षेप पथ की निकासी की अनुमति देता हैआर पहनावा डेटा सेट में प्रत्येक व्यक्ति मक्खी। इसलिए, विधि घ्राण निर्देशित आबादी व्यवहार और भी अलग-अलग सामाजिक संबंधों की जांच की अनुमति देता है। इस परख द्वारा उत्पन्न डेटा व्यवहार स्क्रीन के लिए चार-क्षेत्र olfactometer के उपयोग की अनुमति के लिए मजबूत और अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हैं।

हम यहाँ एक चार चतुर्थ भाग olfactometer के लिए जमाव विधानसभा का वर्णन है। हम आगे अत्यधिक ध्यान केंद्रित एथिल propionate के जवाब में एप्पल साइडर सिरका और प्रतिकर्षण के जवाब में घ्राण आकर्षण परख करने की क्रिया में इसके उपयोग का प्रदर्शन। अंत में, हम वर्णन और दर्ज मक्खी ट्रैकिंग डेटा के विश्लेषण के लिए उदाहरण कोड प्रदान करते हैं।

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Protocol

1. सेटअप विधानसभा

  1. निर्माण polytetrafluoroethylene (PTFE) से बाहर स्टार के आकार के मैदान (0.7 सेमी द्वारा 19.5 सेमी 19.5 सेमी) के द्वारा प्रदान की ड्राइंग (पूरक सामग्री, SupplementalSketch_StarShapedArena.pdf) के अनुसार। क्षेत्र एक वाणिज्यिक या एक कस्टम सुविधा द्वारा निर्मित किया जा सकता है।
  2. दो गिलास प्लेट (2 मिमी की मोटाई के साथ 20.25 सेमी से 20.25 सेमी) के अधिग्रहण, और एक छेद ड्रिल (~ व्यास में 0.7 सेमी) ठीक एक हीरे-लेपित ड्रिल बिट का उपयोग गिलास प्लेटों में से एक के बीच में।
  3. व्यवहार के मैदान के लिए एक प्रकाश तंग व्यवहार का डिब्बा निर्माण। इसके अलावा प्रदान चित्र (पूरक सामग्री, SupplementalSketch_LightTightBox.pdf) के अनुसार बुनियादी लाल सीसीडी वीडियो कैमरे के लिए एक प्रकाश तंग कैमरा बॉक्स का निर्माण। बक्से एक वाणिज्यिक या एक कस्टम सुविधा द्वारा निर्मित किया जा सकता है।
  4. पीछे की दीवार और व्यवहार बॉक्स के किनारे दीवारों पर एलईडी सरणियों पर एयर कंडीशनर इकाई माउंट। तापमान जांच की जगहवास्तविक समय तापमान प्रतिक्रिया और समायोजन के लिए एक ओर छेद के माध्यम से व्यवहार बॉक्स में (1 आंकड़े और जानकारी के लिए 2 देखें)।
  5. कैमरे के लिए आईआर फिल्टर और परिपत्र polarizer देते हैं, और कैमरे बॉक्स में विधानसभा माउंट। व्यवहार बॉक्स और कैमरा बॉक्स व्यवहार बॉक्स से बेहतर तापमान नियंत्रण (विवरण के लिए आंकड़े 1 और 2 देखें) के लिए एक कांच की खिड़की से अलग होती है।
  6. एक कैमरा एडाप्टर के लिए इन्फ्रारेड सीसीडी कैमरा कनेक्ट करें। एक यूएसबी कनवर्टर करने के लिए कैमरा एडाप्टर कनेक्ट। डाटा अधिग्रहण के लिए कंप्यूटर पर एक यूएसबी पोर्ट के लिए यूएसबी कनवर्टर कनेक्ट करें।
  7. निर्माता के निर्देशों के अनुसार कंप्यूटर पर वीडियो कनवर्टर के लिए ड्राइवर को स्थापित करें। वैकल्पिक रूप से, कैमरा सेटिंग और अधिग्रहण के मानकों का एक व्यापक रेंज का उपयोग करने के लिए यूएसबी वीडियो कनवर्टर के निर्माता द्वारा प्रदान की इमेज प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर स्थापित करें।
  8. "उत्पादन के माध्यम से एयर कंडीशनर इकाई (कनेक्टतापमान नियंत्रक करने के लिए तापमान नियंत्रक के पीछे) पर thermocouple "" तापमान नियंत्रक के पीछे) और तापमान जांच (के माध्यम से "। व्यवहार बॉक्स में जांच रखें।
    नोट: हमारी लेआउट में तापमान नियंत्रण प्रणाली 18 डिग्री सेल्सियस और 30 डिग्री सेल्सियस के बीच बॉक्स के तापमान को बनाए रखने में सक्षम है। अधिक या कम तापमान परिवेश thermogenetic (dTrpA1, TrpM8 या shibire टीएस) के लिए उपयोगी हो सकता है neuronal गतिविधि में हेरफेर या synaptic प्रसारण को बाधित करने के प्रयोगों। सबसे प्रयोगों के लिए, तापमान 25 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा है।
  9. (कृपया विस्तृत schematics और कनेक्शन फिटिंग के लिए चित्रा 1 बी देखें) निम्न चरणों में गंध वितरण प्रणाली को इकट्ठा:
    1. केंद्रीय एयर सिस्टम से हवा इनपुट को नियंत्रित करने के लिए हवा के दबाव नियामक का प्रयोग करें। केंद्रीय एक से हवा को शुद्ध करने के लिए दबाव नियामक को एक कार्बन हवा (लकड़ी का कोयला से भरा) फिल्टर कनेक्टआईआर प्रणाली।
    2. प्रवाह नियंत्रण उच्च संकल्प प्रवाहमापी नलियों द्वारा विनियमित कई चैनलों से मिलकर प्रणाली को इकट्ठा।
    3. के रूप में चित्रा 1 बी और 2 एफ में दिखाया गया है एक कई गुना के माध्यम से प्रवाहमापी ट्यूबों के लिए कार्बन हवा फिल्टर से उत्पादन में कनेक्ट। इलेक्ट्रॉनिक नियंत्रित 3 तरह solenoid वाल्व के माध्यम से प्रवाहमापी ट्यूबों के उत्पादन में प्रत्यक्ष यदि स्वच्छ हवा flowmeters छोड़ने के कमरे में निष्कासित कर दिया या कस्टम बनाया गंध कक्षों 24 में प्रवेश किया है विनियमित करने के लिए।
    4. निर्माता की पुस्तिका के अनुसार solenoid वाल्व नियंत्रक स्थापित करें।
  10. यह एक डाटा अधिग्रहण डिवाइस (DAQ) और निर्माता की पुस्तिका के अनुसार एक बिजली की आपूर्ति को जोड़ने के द्वारा इलेक्ट्रॉनिक वायु प्रवाह मीटर स्थापित करें। DAQ इंटरफ़ेस सॉफ्टवेयर हर प्रयोग से पहले क्षेत्र के प्रत्येक चक्र में बराबर प्रवाह दरों सत्यापित करने के लिए स्थापित करें।

2. घ्राण उत्तेजनाओं तैयारी

  1. 5 गंध तैयारचींटी कक्षों 24 कि एक प्लास्टिक बाहरी कंटेनर से मिलकर बनता है, कांच के भीतरी कंटेनर, एक कस्टम बनाया PTFE ढक्कन डालने, मध्य भाग के साथ मूल कंटेनर ढक्कन हटा दिया, और दो ​​एक तरह से वाल्व।
    नोट: PTFE ढक्कन के चारों ओर एक हे अंगूठी गंध छिड़काव के दौरान गंध चैम्बर से हवा रिसाव को रोकने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। योजनाबद्ध और कक्षों की तस्वीरों के लिए चित्रा 2 के लिए चित्रा 1 देखें।
  2. विलायक नियंत्रण के लिए चार odorant कक्षों, और एक परीक्षण odorant के लिए एक कक्ष का प्रयोग करें। विलायक या odorant कमजोर पड़ने के 1,000 μl के साथ कांच के कंटेनर भरें (परीक्षण odorants + उचित सॉल्वैंट्स, अच्छी तरह के प्रयोगों से पहले मिश्रण), इसी प्लास्टिक कक्ष के अंदर ग्लास कंटेनर जगह (प्लास्टिक के चेंबर में तरल बाहर गिर नहीं है) और ढक्कन को कस । हमेशा परीक्षण odorant और विलायक नियंत्रण के लिए एक स्वच्छ कक्ष का उपयोग करने के लिए सुनिश्चित करें।
    नोट: घ्राण आकर्षण w में सेब साइडर सिरका (5% अम्लता) का 1/16 कमजोर पड़ने से चालू किया जा सकता हैअटर। इसके विपरीत, घ्राण प्रतिकर्षण व्यवहार खनिज तेल में एथिल propionate की एक 10% कमजोर पड़ने का उपयोग करके अध्ययन किया जा सकता है। इन मामलों में नियंत्रण उत्तेजनाओं शुद्ध खनिज तेल के साथ गंध कक्षों हैं।

3. मक्खी तैयारी

  1. रियर मानक cornmeal माध्यम पर मक्खियों। 30 पुरुष और 30 एक मानक बोतल में मादा मक्खियों माता पिता की जगह है, और उन्हें 25 डिग्री सेल्सियस या कमरे के तापमान पर 5 दिनों के लिए अंडे देना करते हैं।
  2. एक प्रयोग के लिए, नव eclosed लीजिए (<1 दिन पुराने) 25 पुरुष और 25 महिला संक्षिप्त सीओ 2 संज्ञाहरण के तहत मक्खियों।
  3. 2-4 दिनों के लिए मानक मक्खी माध्यम के साथ एक शीशी में मक्खियों रखें।
  4. प्रयोग से पहले 40-42 घंटा, 2 संज्ञाहरण सीओ बिना मक्खियों स्थानांतरण   साथ ~ 10 मिलीलीटर 1% agarose जेल एक शीशी के लिए। यह मक्खियों भोजन है, जो उनकी हरकत गतिविधि को बढ़ाने में मदद करता है बिना humidified रखेंगे।
    नोट: मक्खियों के 90% से अधिक भुखमरी जीवित रहने चाहिए। कुछ जीनोटाइप कम चंगा हैंतेरा और एक 40 घंटा भुखमरी के माध्यम से यह नहीं कर सकता। उन मामलों में, इस तरह के 24-28 मानव संसाधन के रूप में कम समय स्वीकार्य हैं लेकिन सभी प्रयोगात्मक शर्तों और दोहराता के लिए ही रखा जाना चाहिए।

4. आकर्षक और से बचाने वाली क्रीम odorants को व्यवहार प्रतिक्रियाएँ

  1. तापमान नियंत्रक पर स्विच और यह करने के लिए 25 डिग्री सेल्सियस की स्थापना की।
  2. धक्का से कनेक्ट व्यवहार बॉक्स पर फिटिंग odorant चैम्बर के आउटलेट के लिए ट्यूबिंग डालने से और करने के लिए odorant कक्षों (नियंत्रण और परीक्षण odorants) कनेक्ट।
  3. airflow मीटर का उपयोग सुनिश्चित करें कि नियंत्रण और odorant airstreams 100 मिलीग्राम / मिनट के बराबर हैं बनाने के द्वारा प्रत्येक चक्र में प्रवाह की दर की जाँच करें।
  4. साफ PTFE मक्खी के मैदान और 70% इथेनॉल 2-3 बार के साथ कांच की प्लेट और पूरी तरह से शुष्क हवा (~ 3-4 मिनट) के लिए उन्हें अनुमति देते हैं।
  5. clamps के साथ मैदान में गिलास प्लेट प्रत्यय।
  6. स्थानांतरण गिलास प्लेट में से एक में छेद के माध्यम से मैदान में 2 संज्ञाहरण सीओ बिना मक्खियों। पिछाड़ीएर हस्तांतरण, भागने से रोकने के लिए मक्खियों छेद पर एक परिपत्र जाल जगह है।
    नोट: सीओ 2 संज्ञाहरण ड्रोसोफिला व्यवहार 25 प्रभावित करने के लिए दिखाया गया है और एक व्यवहार प्रयोग के 24 घंटा के भीतर इस्तेमाल नहीं किया जाना चाहिए।
  7. प्रकाश तंग कोठरी में मक्खियों के साथ क्षेत्र की जगह, ट्यूबिंग से जुड़ी जोड़ने से चार नियंत्रण हवा धाराओं कनेक्ट धक्का से कनेक्ट अखाड़ा कोनों के लिए व्यवहार बॉक्स पर फिटिंग, कक्ष के दरवाजे बंद कर लिए और इंतजार 10 15 मिनट मक्खियों नए वातावरण के लिए जाने के लिए जलवायु के अनुकूल बनाना। यदि संभव हो तो लाइट बंद कमरे में जहां प्रयोगों का प्रदर्शन कर रहे हैं, संभव कम से कम प्रकाश रिसाव कि पूर्वाग्रह प्रयोगात्मक परिणाम हो सकता से बचने के लिए स्विच।
  8. एक 5-10 मिनट के नियंत्रण प्रयोग है, जो मक्खियों में 4 नियंत्रण हवा धाराओं को उजागर कर रहे चलाएँ।
  9. डेटा का विश्लेषण तुरंत (देखें नीचे डेटा विश्लेषण अनुभाग) यकीन है कि मक्खियों के क्षेत्र में समान रूप से वितरित कर रहे हैं बनाने के लिए, और आकर्षण सूचकांक करीब है0 करने के लिए यह कदम के रूप में यह सत्यापित करता है वहाँ वरीयता या परिहार के मैदान के भीतर का कोई अनियंत्रित स्रोतों (जैसे बाहर, असमान तापमान वितरण, असमान अखाड़ा, गंध संदूषण, आदि से लीक लाइट) हैं कि, आवश्यक है। मक्खियों असमान वितरित कर रहे हैं या उनके हरकत गतिविधि कम है, मक्खियों त्यागें, अखाड़ा फिर से साफ (चरण 4.4) और प्रयोग को दोहराने के लिए मक्खियों का एक नया बैच का उपयोग करें।
  10. 3 तरह वाल्व या फिर लगाकर कनेक्टर ट्यूब पर स्विचन द्वारा सेटअप करने के लिए परीक्षण odorant चैम्बर कनेक्ट करें।
  11. 5-10 मिनट के लिए परीक्षण प्रयोग चलाने के लिए और नीचे के रूप में खंड 5 में चर्चा डेटा का विश्लेषण (भी संदर्भ 14 और चित्रा 3 देखें)। 20 मिनट से अधिक समय रिकॉर्डिंग डेटा फ़ाइलों कि computationally प्रक्रिया के लिए मुश्किल हो सकता है हो सकता है। अब प्रयोगात्मक रिकॉर्डिंग वांछित हैं, तेजी से रोकने के लिए और ट्रैकिंग कार्यक्रम फिर से शुरू करते हैं। इस प्रयोगात्मक रिकॉर्डिंग के बीच एक ~ 10 सेकंड के अंतराल में यह परिणाम है।
  12. Discarडी मक्खियों।
  13. 70% इथेनॉल के साथ स्वच्छ अखाड़ा और गिलास प्लेट (चरण 4.4), और प्रकाश तंग बाड़े के भीतर कनेक्टर ट्यूबों की जगह। प्रयोगों में तेजी लाने के लिए, एक नया स्वच्छ क्षेत्र में इस्तेमाल किया जा सकता है, और प्रयोगात्मक रन प्रदर्शन करते हुए गंदे मैदान साफ ​​कर दिया।
  14. मक्खियों का एक नया बैच के साथ एक और प्रयोग चलाने के लिए, यदि आवश्यक। कई प्रयोगों में एक ही दिन पर चलाए जा रहे हैं, तो सुनिश्चित करें कि कोई odorant पिछले एक परीक्षण चलाने से सिस्टम में छोड़ दिया है चरम ख्याल रखना। यह सामान्य रूप से odorants की या सीओ 2 के साथ कम मात्रा के साथ एक समस्या नहीं है, लेकिन प्रयोगात्मक रन के बीच एक 24 घंटा के अंतराल के लिए ऊपर के लिए अत्यधिक ध्यान केंद्रित उत्तेजनाओं जरूरत हो सकती है। इसके अलावा, प्रवाह-ट्यूब के बाद सभी ट्यूबिंग यदि odorant प्रदूषण नियंत्रण प्रयोगों के दौरान संदिग्ध है बदला जा सकता है। हमेशा लगातार सिस्टम फ्लश करने के प्रयोगों के बीच पर शुष्क हवा छोड़

5. डेटा विश्लेषण

नोट: सुझाव मक्खी ट्रैकिंग अधिग्रहण softwarई (सामग्री में विस्तृत), अधिग्रहण के दौरान वास्तविक समय में मक्खियों पटरियों, और समय टिकट और * .dat प्रारूप में सभी का पता चला मक्खियों के निर्देशांक की बचत होती है। हम एक कस्टम बनाया मैटलैब दिनचर्या एक मैटलैब प्रारूप में डेटा परिवर्तित करने के लिए, और डेटा का विश्लेषण करने के लिए विकसित किया है। कोड उदाहरण पूरक सामग्री में प्रदान की जाती हैं, लेकिन कार्यान्वयन के विवरण डाटा अधिग्रहण के लिए इस्तेमाल किया सॉफ्टवेयर पर निर्भर करेगा।

  1. कच्चे डेटा लोड। एक स्थानिक मुखौटा है कि मैदान की आकृति बनाएं और सभी डेटा बताते हैं कि मैदान के बाहर गिर के रूप में वे शोर (चित्रा -4 ए, पूरक संहिता MaskSpatialFiltering.m, Score.m, DrawCircularMask प्रतिनिधित्व दूर करने के लिए कच्चे डेटा के लिए मुखौटा लागू होते हैं। मीटर)।
  2. सभी डेटा बताते हैं कि, 3s से अधिक समय के लिए नीचे 0.163 सेमी / एस गति के लिए कदम इस डेटा के रूप में शोर या गैर चलती मक्खियों (चित्रा 4 बी, पूरक संहिता TemporalFiltering.m) द्वारा उत्पन्न होने की संभावना है निकालें।
  3. शेष डेटा कल्पनासभी को एक बार उन्हें बाहर साजिश रचने के द्वारा या के रूप में एक प्रक्षेप पथ अंक (चित्रा 3, पूरक संहिता SingleTrajectoryViewer.m)।
    नोट: चार-क्षेत्र में गंध सीमाओं के स्थान संभावना इस्तेमाल किया जा रहा इस तरह प्रत्येक odorant की विशेषताओं और airflow दरों के रूप में कारकों की एक संख्या पर निर्भर करता है। उदाहरण के लिए, अत्यधिक अस्थिर odorants संभावना गंध चतुर्थ भाग अधिक पूरी तरह से कम अस्थिर odorants से भर जाएगा। इस प्रकार यह संभावना है कि प्रत्येक odorant थोड़ा अलग गंध सीमाओं प्रदर्शन कर सकते है। के रूप में यह एक विशेष स्थान से हवा के नमूने के लिए एक निर्वात का उपयोग करता है, और इसलिए उस स्थान पर odorant एकाग्रता बाधित एक photoionization डिटेक्टर का उपयोग गंध सीमाओं को मापने के लिए समस्याग्रस्त किया जा सकता है। बहरहाल, गंध सीमाओं जल्दी मक्खी व्यवहार डेटा के आधार पर अनुमान लगाया जा सकता है। उदाहरण के लिए, एक गंध अलग odors के जवाब में cumulated मक्खी पटरियों पर आधारित सीमा स्पष्ट रूप से आंकड़े -3 सी और 3 डी में देखा जा सकता है।
  4. कालएक आकर्षण सूचकांक culate लिए तय है कि नियंत्रण प्रयोगों कोई वरीयता प्रतिक्रिया उत्पन्न, और यह भी एक odorant (या optogenetic 9) उत्तेजना के जवाब का उपयोग करने के लिए। एक आकर्षण सूचकांक (एआई) की गणना करने के लिए, एक नियंत्रण या परीक्षण रिकॉर्डिंग के अंतिम 5 मिनट का उपयोग करें। आकर्षण का एक उपाय है कि +1 (निरपेक्ष आकर्षण) और -1 (निरपेक्ष प्रतिकर्षण) के बीच गिर प्राप्त करने के लिए, निम्न सूत्र ऐ गणना करने के लिए प्रयोग किया जाता है:
    1 समीकरण
    जहां एन परीक्षण परीक्षण चक्र में डेटा बिंदुओं की संख्या है, एन नियंत्रण तीन नियंत्रण quadrants में डेटा बिंदुओं की औसत संख्या है। इस उपाय से सहज है के रूप में कोई वरीयता लगभग शून्य मूल्यों से संकेत किया जाएगा। हालांकि, यह सही ढंग से मक्खियों कि odorant चक्र में स्थित हैं की कुल संख्या के अनुपात का संकेत नहीं है। इस उपाय प्राप्त करने के लिए, एक प्रतिशत सूचकांक (पीआई) का इस्तेमाल किया जा सकता है:
    2 समीकरण जहां एन परीक्षण परीक्षण चक्र में डेटा बिंदुओं की संख्या है, और एन कुल सभी चार quadrants में डेटा बिंदुओं की कुल संख्या है। इस फार्मूले को एक उपाय है कि 0.25 कोई व्यवहार पसंद (चित्रा 3E और 4C, पूरक संहिता AttractionIndex.m) के लिए इसी के साथ 0 और 1 के बीच गिर जाता है, प्रदान करता है।
  5. प्रत्येक प्रयोगात्मक हालत के 5-10 दोहराता भागो, प्रत्येक दोहराने के लिए मक्खियों के एक नए समूह का उपयोग कर। Kolmogorov-Smirnov गैर पैरामीट्रिक परीक्षण (चित्रा 3F, Matlab में kstest2 समारोह) का उपयोग करके स्थिति के बीच या नियंत्रण के खिलाफ आकर्षण अनुक्रमित की तुलना करें।

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Representative Results

चार चतुर्थ भाग olfactometer परख रिकॉर्ड और एक बड़ी व्यवहार अंतरिक्ष पर कई मक्खियों के चलने की गतिविधियों का विश्लेषण करती है। Odorants एयर धाराओं कि एक, दो, तीन, या सभी चार quadrants में प्रवेश में पेश किया जा सकता है। odors के अभाव में, मक्खियों स्वतंत्र रूप से सभी चार quadrants के बीच ले जाएगा। के रूप में यह इंगित करता है कि संयुक्त राष्ट्र के जानबूझकर पूर्वाग्रहों परख में पेश नहीं किया गया है इस व्यवहार का निरीक्षण करने के लिए महत्वपूर्ण है। इन पूर्वाग्रहों प्रकाश, तापमान में उतार-चढ़ाव, हवा का प्रवाह में मतभेद, या गंध दूषित पदार्थों को शामिल कर सकते हैं। चित्रा 3 बी 25 पुरुष के चार चतुर्थ भाग olfactometer में व्यवहार प्रतिक्रियाओं से पता चलता है और 25 महिला शुष्क हवा के लिए मक्खियों। एकत्र आंकड़ों से एक मक्खी-ट्रैक भी चित्रा 3 बी में प्रकाश डाला, और यह दर्शाता है कि इस मक्खी पूरे व्यवहार के मैदान तलाश थी जाता है। आकर्षण सूचकांक स्कोर (एआई) 5 मिनट परीक्षण अवधि में सभी का विश्लेषण पटरियों के लिए 0 के करीब, indicati हैगंध चतुर्थ भाग के लिए आकर्षण की कमी एनजी। इसी तरह, प्रयोग का प्रतिशत सूचकांक (पीआई) 0.24 दर्शाता है कि मक्खियों 5 मिनट परीक्षण अवधि के दौरान सभी चार quadrants में काफी भी वितरित किए गए है।

एक आकर्षक odorant करने के लिए चार-क्षेत्र व्यवहार प्रतिक्रिया चित्रा -3 सी में दिखाया गया है। एप्पल साइडर सिरका की हवा धारा में शुरू की है   परीक्षण गंध कक्ष में सेब साइडर सिरका के एक 6.25% कमजोर पड़ने रखकर ऊपर छोड़ दिया गंध चतुर्थ भाग एयर स्ट्रीम। एकत्र मक्खी ग्रे में दिखाया गया है कि पटरियों को सबसे मक्खियों इस गंध चक्र में इकट्ठा का प्रदर्शन, और अब सभी चार quadrants का पता लगाएं। एक एकल रंग की मक्खी ट्रैक से पता चलता है कि एक बार एक मक्खी एप्पल साइडर सिरका गंध चतुर्थ भाग में प्रवेश करती है, यह आकर्षक गंध चक्र में रहने के लिए जाता है। प्रयोग के लिए 0.94 के एअर इंडिया इस odorant को मजबूत आकर्षण का संकेत है 1 के करीब है। 0.92 के पीआई इंगित करता है कि मक्खियों का 92% Rविश्लेषण की अवधि के दौरान गंध चक्र में emained।

एक repellant odorant करने के लिए चार-क्षेत्र व्यवहार प्रतिक्रिया चित्रा 3 डी में दिखाया गया है। odorant एथिल propionate एक गंध कक्ष में रखा गया के एक 10% कमजोर पड़ने शीर्ष बाएँ हवा धारा के लिए गंध के स्रोत के रूप में इस्तेमाल किया गया था। विश्लेषण किया प्रयोग के लिए जमा मक्खी पटरियों गंध चतुर्थ भाग का परिहार, गंध-निर्देशित प्रतिकर्षण का सूचक प्रदर्शित करता है। एक एकल रंग की मक्खी ट्रैक से पता चलता है कि एक मक्खी है, जब यह गंध चतुर्थ भाग में प्रवेश किया, जल्दी से दूर कर दिया गंध चतुर्थ भाग से बचने के लिए। -0.68 की ऐ 0 कम से कम जो प्रतिकर्षण को इंगित करता है, और एक मजबूत प्रतिकारक odorant प्रतिक्रिया -1 के करीब है, संकेत है। प्रयोग के लिए 0.06 के पीआई पता चलता है कि पता लगाया मक्खी डेटा बिंदुओं के केवल 6% (तटस्थ गंध प्रयोगों में ~ 25% की तुलना में) प्रयोग के पाठ्यक्रम पर गंध चक्र में पाए गए।

चित्रा 3E एअर इंडिया और पीआई स्कोर के बीच संबंध चित्र, और कैसे इन नंबरों आकर्षक या प्रतिकारक व्यवहार से संबंधित हैं।

चार-क्षेत्र परख मजबूत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य घ्राण व्यवहार में यह परिणाम है। इस रूप में चित्र में दिखाया गया है 3F नियंत्रण और प्रयोगात्मक शर्तों के बीच मात्रात्मक तुलना के लिए अनुमति देता है, और भी सूक्ष्म olfactor की पहचान के लिए सक्षम बनाता हैY प्रतिक्रियाएं कि तटस्थता से विचलित।

इसके अलावा, के रूप में डेटा उच्च स्थानिक और लौकिक संकल्प पर प्राप्त की है, यह संभव में (के रूप में 3 चित्र में दिखाया गया है) इस तरह के एकल मक्खियों के प्रक्षेप पथ के रूप में व्यवहार प्रतिक्रियाओं के कई कारकों, अध्ययन करने के लिए, साथ ही विशेषताएँ मक्खियों के अलग गतिविधि गतिशीलता है एक गंध क्षेत्र (जैसे, दिशा और वेग 19,20 में परिवर्तन)।

यह अक्सर एक प्रयोग के लिए सटीक एक ही स्थान में चार-क्षेत्र के मैदान की स्थिति के लिए, खासकर के बाद से क्षेत्र के लगातार सफाई की आवश्यकता है मुश्किल हो सकता है। प्रदान की स्क्रिप्ट के रूप में चित्रा -4 ए में दिखाया गया पहला डेटा फिटिंग द्वारा इन मामूली बदलाव के लिए क्षतिपूर्ति का विश्लेषण करती है। इस मामले में, चार क्षेत्र के मैदान के आकार गणना की जाती है, और डेटा बताते हैं कि इस अंतरिक्ष के बाहर झूठ हटा रहे हैं। इन पर नज़र रखी वस्तुओं अक्सर देब का प्रतिनिधित्वआरआईएस या विचार है कि ग़लती से ट्रैक किए गए हैं। वे क्षेत्र के भीतर झूठ नहीं है और इस प्रकार शोर प्रतिनिधित्व करते हैं, यह महत्वपूर्ण है कि इन आंकड़ों अंक गलत डेटा का विश्लेषण करती है को रोकने के लिए निकाल रहे हैं। इसी प्रकार, यह भी ट्रैक डेटा अंक शोर या क्षेत्र के भीतर गैर चलती मक्खियों का प्रतिनिधित्व हो सकता है कि दूर करने के लिए महत्वपूर्ण है। इसे पूरा करने के एक विश्लेषण स्क्रिप्ट उपयोग किया जाता है (और यहां प्रदान की) है कि डेटा बताते हैं कि अनिवार्य रूप से (के रूप में चित्रा 4 बी में दिखाया गया है) कदम नहीं हटा। इन आंकड़ों अंक अल्पमत में आम तौर पर कर रहे हैं, अभी तक उनके बनाए रखने के विश्लेषण में त्रुटियों के लिए नेतृत्व करेंगे।

(उदाहरण के लिए एक 5 मिनट के प्रयोग के अंत में 3 चित्र में दिखाया गया है) आकर्षण सूचकांक और वरीयता सूचकांक स्कोर एक निर्धारित समय अवधि के बाद की गणना की जा सकती है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए, हालांकि, उस के बाद से मक्खियों उच्च स्थानिक और लौकिक संकल्प के साथ ट्रैक किए गए हैं, इसी तरह के विश्लेषण के प्रयोग भर में प्रदर्शन किया जा सकता है। ये हैचित्रा 4C में दिखाया गया है, जिसमें आकर्षण सूचकांक और प्रतिशत सूचकांक स्कोर समय अवधि में निरंतर 10 सेकंड डिब्बे में गणना कर रहे हैं। इस तरह के विश्लेषण घ्राण परिवर्तन, इस तरह के एक odorant करने के आदी होना रूप में है कि प्रयोग के दौरान हो सकता है की बेहतर सराहना की अनुमति देता है।

आकृति 1
चित्रा 1:। चार चतुर्थ भाग Olfactometer के योजनाबद्ध (ए) व्यवहार सेटअप एक गंध वितरण प्रणाली से बना है, तापमान नियंत्रण प्रणाली (diagrammed नहीं), छवि अधिग्रहण प्रणाली (आईआर एलईडी रोशनी और एक कंप्यूटर से जुड़ा आईआर सीसीडी कैमरा), चार चतुर्थ भाग के मैदान और हलका सा व्यवहार और अखाड़ा बक्से। लाल हलकों चित्रा 2 (बी) में दिखाया गया है इसी घटकों गंध वितरण प्रणाली की विस्तृत डिजाइन नामित। हरी पात्रों च के कनेक्शन / रूपांतरण आकार का प्रतिनिधित्वittings। 1/16 आईडी और 1/8 आयुध डिपो की ट्यूब 1/8 और 1/4 आईडी आयुध डिपो के उन गुलाबी रंग में चिह्नित कर रहे हैं जबकि पीले रंग में चिह्नित कर रहे हैं। लघुरूप: आईआर, अवरक्त; सीएफ, संपीड़न फिटिंग; बीएफ, कंटीले फिटिंग, MNPT, पुरुष राष्ट्रीय पाइप धागा। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2:। घ्राण परख सेटअप की तस्वीरें (ए) कैमरा बॉक्स और व्यवहार बॉक्स के वाइड फील्ड देखें। (बी) के व्यवहार बॉक्स के अंदर देखें। तापमान जांच, कनेक्टर ट्यूब, और आईआर एलईडी सरणियों लेबल रहे हैं। (सी) चार चतुर्थ भाग अखाड़ा। (डी) गंध वितरण व्यवहार बॉक्स से जुड़ा प्रणाली के वाइड फील्ड देखें। कैमरा बॉक्स सीसीडी कैमरा प्रकट करने के लिए हटा दिया गया है। (ई (एफ) गंध कई गुना से जुड़े नलियों का उदाहरण है। (G) उच्च संकल्प प्रवाह ट्यूबों airflow को विनियमित। (एच) गंध वितरण ट्यूबिंग और कनेक्टर्स flowtube नियामकों के बहाव। (मैं) solenoid वाल्व को विनियमित करता है, तो स्वच्छ हवा एक गंध कक्ष के माध्यम से पारित कर या कमरे के लिए निष्कासित कर दिया है। (जे) गंध कक्षों एक तरह से वाल्व से जुड़ा है, और odorant के लिए एक आंतरिक ग्लास कंटेनर को शामिल कर रहे हैं। (कश्मीर) व्यवहार बॉक्स के बाहर धक्का से कनेक्ट फिटिंग कि गंध वितरण ट्यूबिंग से कनेक्ट होता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
उदाहरण डेटा एक चार क्षेत्र घ्राण परख का उपयोग कर उत्पन्न (ए) चार-क्षेत्र के क्षेत्र के योजनाबद्ध।। (बी) के तटस्थ प्रतिक्रियाओं मनाया जाता है जब सभी चार quadrants केवल शुष्क हवा छिड़काव होते हैं। बाएँ ऊपरी वृत्त का चतुर्थ भाग से भरकर रखा सेब साइडर सिरका के एक 6.25% कमजोर पड़ने के लिए (सी) आकर्षण के हिमायती हैं। (डी) प्रतिकर्षण व्यवहार 10% एथिल propionate से शुरू हो गया। चित्रा 2 बी-2 डी में, अधिग्रहीत डेटा से एक भी प्रक्षेपवक्र साजिश रची है। एक रंग ढाल नीले और लाल रंग, शुरू करने और रिकॉर्डिंग के अंत में किया जा रहा है क्रमशः के साथ, रिकॉर्डिंग के समय पाठ्यक्रम को सूचित करने के लिए किया जाता है। (ई) आकर्षण सूचकांक (एआई) और प्रतिशत सूचकांक (पीआई) की तुलना। (एफ) औसत एअर इंडिया की कोई गंध के साथ 3- 6 प्रयोगों (नियंत्रण) की, सेब साइडर सिरका (ACV) और 10% इथाइल Propionate (ईपी)। त्रुटि सलाखों SEM संकेत मिलता है। सांख्यिकीय अंतर Kolmogorov-Smirnov ते द्वारा मूल्यांकन किया गया थाST। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4:। उदाहरण डेटा डेटा विश्लेषण कदम से उत्पन्न (ए) के डेटा, MaskSpatialFiltering.m द्वारा निष्पादित की स्थानिक छानने डेटा बताते हैं कि मैदान के बाहर गिर हटा दें। लाल हलकों हलकों कि क्षेत्र की सीमाओं को परिभाषित करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं की प्रारंभिक पदों पर दिखा। काले घेरे अंतिम स्थिति, वृत्त फिटिंग द्वारा अधिग्रहीत डेटा (चार क्षेत्र के अंदर छायांकित क्षेत्र ग्रे) के लिए रूपरेखा कर रहे हैं। लाल डॉट्स और काले तीर डेटा बताते हैं कि इस कदम के बाद छानने डाटासेट से निकाल दिया जाएगा संकेत मिलता है। (बी) के आंकड़ों के टेम्पोरल छानने, TemporalFiltering.m द्वारा प्रदर्शन किया। इस छानने कदम डेटा बताते हैं कि बहुत SLO के लिए कदम को हटाwly या बिल्कुल नहीं, क्योंकि वे गैर चलती मक्खियों द्वारा या क्षेत्र से गंदगी / प्रतिबिंब द्वारा उत्पन्न होने की संभावना है। एक लाल एक धराशायी लाल बॉक्स से घिरा डॉट समान निर्देशांक है कि इस कदम से छानने को हटा दिया जाएगा साथ ~ 6000 डेटा बिंदुओं की स्थिति को इंगित करता है। (सी) आकर्षण सूचकांक (एआई) और प्रतिशत सूचकांक (पीआई), AttractionIndex.m द्वारा एक प्रयोग के अंतिम 5 मिनट से अधिक 10 सेकंड डिब्बे में गणना की थी। इन अनुक्रमित के टेम्पोरल प्रोफाइल व्यवहार प्रतिक्रियाओं की गतिशीलता के बारे में जानकारी होती है और व्यवहार का विस्तृत विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

चार-क्षेत्र olfactometer यहाँ वर्णित जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती ड्रोसोफिला मक्खियों की बड़ी आबादी की घ्राण प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक बहुमुखी व्यवहार प्रणाली है। प्रत्येक प्रयोग (सेटअप, प्रयोगात्मक रन, और सफाई सहित) ~ 1 घंटा लेता है, और 4-6 प्रयोगों नियमित तौर पर प्रत्येक दिन किया जा सकता है। 5 मिनट के लिए 40-50 मक्खियों का उपयोग कर एक ठेठ परख उत्पन्न लगभग 450,000 विश्लेषण के लिए डेटा बिंदुओं पर नज़र रखी। वर्णित विन्यास भी मामूली संशोधनों के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है, घ्राण करने के लिए या प्रतिक्रिया एक समय अवधि में अन्य संवेदी उत्तेजनाओं में अन्य कीड़ों या कीट लार्वा की गतिविधियों पर नजर रखने के लिए, मिनट से दिन को लेकर। चार चतुर्थ भाग परख दोनों आकर्षक और प्रतिकारक उत्तेजनाओं के प्रभाव के प्रति संवेदनशील है। अधिकांश odorants -0.9 और 0.9 (समीकरण 1) के बीच आकर्षण अनुक्रमित (एआई) उत्पन्न करते हैं। 0.5 -1 की रेंज में एक AI उत्तेजनाओं को मक्खियों की मजबूत आकर्षण व्यवहार का प्रतीक है, जबकि ऐ -1 -0.5 की सीमा हैमजबूत भगाने से शुरू हो गया। सामान्यतया, नियंत्रण odors द्वारा एक तटस्थ प्रतिक्रिया (शुष्क हवा, humidified हवा, खनिज तेल) 0.1 और -0.1 के बीच गिर चाहिए। ऐ अक्सर परीक्षण प्रयोग के पाठ्यक्रम में परिवर्तन, समय मक्खियों odorant plumes, प्रारंभिक आकर्षण और एक उपन्यास प्रोत्साहन की दिशा में हरकत गतिविधि की वृद्धि हुई है, और उत्तेजना के जवाब में अंतिम desensitization में चलने के लिए की आवश्यकता को दर्शाती है। पूर्व परीक्षण नियंत्रण रन आवश्यक हैं, और यह सुनिश्चित करना है कि मक्खियों वांछित प्रोत्साहन के अभाव में क्षेत्र में समान रूप से वितरित किए गए सावधानी से किया जाना चाहिए।

क्षेत्र में मक्खियों के स्थानिक पूर्वाग्रह का सबसे लगातार कारण हैं: असमान हवा धाराओं, संभवतः काट दिया नलिका के कारण या स्टार के आकार के मैदान की अपर्याप्त clamped गिलास प्लेट (हमारे अनुभव में, मक्खियों के रूप में छोटे के airflow के मतभेद का पता लगाने में सक्षम हैं 15 मिलीग्राम / मिनट); क्षेत्र भर में असमान तापमान वितरण, कि स्थापना द्वारा सुधार किया जा सकता हैएयर कंडीशनर इकाई के मैदान का तापमान भी सुनिश्चित करने के लिए कमजोर और अधिक फैलाना हवा का प्रवाह और / या उससे अधिक समय पूर्व अधिग्रहण अवधि (~ 20 मिनट) उत्पन्न करने के लिए; तापमान जांच उद्घाटन, कि काले टेप के साथ सील खोलने के द्वारा कम किया जा सकता है के माध्यम से कम से कम प्रकाश रिसाव; क्षेत्र में या हवा वितरण प्रणाली है, जो मामले में सेटअप (अखाड़ा, flowtubes, प्रकाश तंग बाड़े, आदि की फिटिंग) अच्छी तरह से साफ करने के लिए किया है और सूखे की अनुमति दी कई दिनों के लिए या जहां संभव जगह की आवश्यकता में अवशिष्ट गंध।

घ्राण उपकरणों के रखरखाव विश्वसनीय और अनुरूप परिणाम के लिए महत्वपूर्ण है। पुश करने वाली कनेक्ट व्यवहार बॉक्स और हवा inlets और मैदान के भीतर की दीवारों पर फिटिंग हर प्रयोग के बाद इथेनॉल के साथ साफ किया जाना चाहिए कि अगर मजबूत odors उपयोग किया जाता है, और पूरी तरह से सूखे की अनुमति दी। गिलास प्लेट एक 70% इथेनॉल, जो प्लेटों से अवशिष्ट गंध और गंदगी को दूर करने के लिए आमतौर पर पर्याप्त है के साथ तीन बार धोया जाना चाहिए, लेकिन हेक्सेन उपयोगी हैकार्बनिक यौगिक मक्खियों द्वारा जमा दूर करने में (जैसे, फेरोमोन लंबे हाइड्रोकार्बन श्रृंखला से मिलकर)। साबुन आम तौर पर सिफारिश की है क्योंकि यह आम तौर पर खुशबूदार घटक है, जो घ्राण व्यवहार को प्रभावित करती होता है। व्यवहार बॉक्स प्रयोगों के बीच शुष्क हवा inlets (जैसे रातोंरात) से जुड़ा रहना चाहिए प्रणाली से अवशिष्ट odors को हटाने की सुविधा के लिए।

मक्खियों की हरकत गतिविधि कम है, तो वे भी कुछ डेटा कहते हैं, जो अक्सर एक शोर और चर आकर्षण सूचकांक में परिणाम उत्पन्न कर सकता है। लंबे समय तक भुखमरी और रिकॉर्डिंग बार इस समस्या को हल करने में मदद कर सकता है। इसके विपरीत, यदि मक्खियों बीमार हैं, भूख से 24-28 मानव संसाधन आम तौर पर जब तक यह प्रयोगों में संगत है के रूप में हरकत गतिविधि को बढ़ाने के लिए पर्याप्त होगा। वहाँ मक्खियों की एक स्वस्थ राज्य को बनाए रखने और हरकत में वृद्धि के बीच एक अच्छा संतुलन है। 40 घंटा भुखमरी एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, और बाद में संशोधितप्रयोगात्मक परिणामों के आधार पर की जरूरत है। आकर्षण इंडेक्स कुछ हद तक भुखमरी की अवधि से प्रभावित हो जाएगा, इस प्रकार यह आदेश भुखमरी समय के confounding प्रभाव से बचने के लिए समय की इसी अवधि के लिए सभी प्रायोगिक पशुओं को भूखा लिए आवश्यक है। लंबे समय तक भुखमरी बार आमतौर पर प्रतिकारक प्रतिक्रियाओं कमजोर आकर्षक प्रतिक्रियाओं को मजबूत बनाने (0 के करीब), और। सूखी हवा नियंत्रण हवा धाराओं मक्खियों सूखना जाते हैं, और अब की तुलना में 40 मिनट के लिए इस्तेमाल नहीं किया जाना चाहिए।

चार चतुर्थ भाग olfactometer एक भी प्रोत्साहन के लिए एकल या एकाधिक 16,18 मक्खियों की प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए या उत्तेजनाओं के बीच चुनाव वरीयता अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, अलग odors चार quadrants में से प्रत्येक में इस्तेमाल किया जा सकता है। यह भी गंध quadrants की सीमाओं का परीक्षण करके गंध से मिश्रण करने के लिए प्रतिक्रियाओं का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि भले ही ट्रैकिंग प्रणाली व्यक्तिगत पटरियों एकत्र आंकड़ों से अलग होने की अनुमति देता है, यह हैसंभव है कि व्यक्ति मक्खियों अलग ढंग से जब जब वे अकेले परीक्षण कर रहे हैं की तुलना में एक समूह के हिस्से के रूप यत्न व्यवहार कर सकता है। उदाहरण के लिए, मक्खियों के समूहों मक्खियों 26 के बीच शारीरिक संबंधों के कारण गंध निर्देशित प्रतिकर्षण वृद्धि हुई दिखा रहे हैं। ट्रैकिंग प्रणाली और लेआउट भी गैर घ्राण assays में उपयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। परख ढांचे आसानी से optogenetic उत्तेजना, या एक थर्मल प्लेट 27 thermogenetics के लिए के लिए एक एलईडी सरणी 9 को समायोजित कर सकते हैं। इस प्रणाली को भी, कई घंटा की एक समय के पैमाने का व्यवहार विकल्प अध्ययन करने के लिए उदाहरण के अंडे बिछाने व्यवहार 14 का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। इस मामले में, अधिग्रहण फ्रेम दर बड़े डेटा फ़ाइलों की पीढ़ी है, और नमी और सब्सट्रेट (1% agarose जेल) का एक स्रोत से बचने के लिए समायोजित करने की जरूरत अंडे बिछाने सब्सट्रेट के रूप में प्रदान किए जाने की जरूरत है।

इस सेटअप की एक सीमा है कि मक्खियों में और arena- नीचे आईआर दर्शाती वस्तुओं के रूप में ट्रैक कर रहे है अगर एक optogenetic के किसी भी तत्व याthermogenetic प्रयोग को दर्शाता है आईआर, अप्रासंगिक डेटा बिंदुओं बाद के प्रसंस्करण के दौरान हटाया जा करने की आवश्यकता होगी। वर्तमान में यह भी एक स्थानिक संकल्प है कि विभिन्न मक्खियों लगातार अलग पहचाना जा करने के लिए अनुमति देता है पर मक्खियों फिल्म के लिए संभव नहीं है, लेकिन यह भविष्य में और अधिक उन्नत वीडियो कैमरे का उपयोग करके सुधार किया जा सकता है। मौजूदा प्रणाली की एक और सीमा कि मक्खियों के आंदोलन के दो आयामों को विवश है चलने व्यवहार को बढ़ावा देने के लिए, और घ्राण प्रेरित उड़ान प्रतिक्रियाओं को रोकने जाएगा।

यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि अतिरिक्त स्वचालित assays भी मक्खियों की एकल की घ्राण व्यवहार या समूहों की जांच करने के लिए विकसित किया गया है। यहाँ वर्णित परख के लिए सबसे समान डिजाइन एक विधि Beshel और झोंग 28 द्वारा विकसित की है। इस परख में, ~ 30 मक्खियों की प्रतिक्रियाएं एक छोटे परिपत्र क्षेत्र में निगरानी कर रहे हैं, जिसमें odors के मैदान वा के साथ 4 के 1 गंध बंदरगाहों से वितरित कर रहे हैं (लगभग एक चौथाई चार क्षेत्र के क्षेत्र के क्षेत्र)करूँगा, और परिपत्र के मैदान के बीच में एक छेद के माध्यम से हटा दिया। एक छोटे क्षेत्र के अलावा, अन्य डिजाइन मतभेद मुख्य रूप से गंध बंदरगाहों के लिए करीब ध्यान दे (बजाय odorant चतुर्थ भाग के रूप में चार-क्षेत्र क्षेत्र के puckered दीवारों द्वारा निर्देशित भर के) व्यवहार प्रकाश शर्तों के तहत किया जा रहा है, और odorants शामिल हैं। बहरहाल, परिपत्र के मैदान मक्खियों की घ्राण प्रतिक्रियाओं स्क्रीनिंग के लिए एक उपयुक्त तरीका है, और मक्खी ट्रैकिंग यहाँ वर्णित डिजाइन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

एक वैकल्पिक दृष्टिकोण एक साथ odors के जवाब में कई एकल मक्खियों की गतिविधि पर नजर रखने के लिए है। Flywalk परख में, अलग-अलग मक्खियों छोटे ट्यूबों में रखा जाता है, और उनकी प्रतिक्रियाओं पर नज़र रखी जब odorants ट्यूब 29,30 के माध्यम से भरकर रखा जाता है। या वेग में परिवर्तन के आगे या विपरीत दिशा में परिवर्तन, अगर एक odorant आम तौर पर आकर्षक या प्रतिकारक है गेज करने के लिए उपयोग किया जा सकता है। इस परख, चार क्षेत्र परख की तरह, स्वचालित रूप से मक्खी मीटर पटरियोंovements, और इतनी जल्दी odors की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए घ्राण प्रतिक्रियाओं को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, चार-क्षेत्र के विपरीत, इस तरह के प्रक्षेपवक्र मोड़ कोण और संभावित सामाजिक संबंधों के रूप में जटिल मोटर गतिशीलता, शायद Flywalk परख रिकॉर्डिंग में याद किया।

एकल चलने मक्खियों की स्वचालित ट्रैकिंग भी एक टी भूलभुलैया प्रकार परख 31,32 करने के लिए अनुकूलित किया गया है। इस परख में, मक्खियों छोटे कक्षों जिसमें odors चैम्बर के बीच में एक बंदरगाह के माध्यम से चैम्बर के दोनों छोर, और बाहर निकलने से भरकर रखा जाता है में रखा जाता है। मक्खियों के पदों पर भी स्वचालित रूप से ट्रैक कर रहे हैं। यह mimics, एक मक्खी पैमाने पर, एक टी भूलभुलैया ढांचे पर। optogenetics साथ संयोजन में, इस परख विशेष रूप से अच्छी तरह से घ्राण सीखने और स्मृति मध्यस्थता तंत्रिका सर्किट परख करने की क्रिया के लिए अनुकूल कर दिया गया है, और यह भी एकल मक्खियों की घ्राण वरीयताओं गेज करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। Flywalk के लिए इसी प्रकार, यह जटिल गतिविधि गतिशीलता है कि बड़े स्थानिक क्षेत्रों में उत्पन्न हो सकती है निगरानी नहीं कर सकता, इस तरह से उन है कि भोजन की मांग 14, या व्यवहार है कि मक्खी आबादी में ही होते दौरान पाए जाते हैं।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Air delivery system  (Quantity needed)
Tubing and connectors
Thermoplastic NPT(F) Manifolds Cole-Parmer, IL, USA R-31522-31 1
Hex reducing  nipple (1/4MNPT->1/8MNPT) McMaster-Carr, IL, USA 5232T314 1
Tubing (ID:1/8) McMaster-Carr, IL, USA 5108K43 50 Ft
Tubing (ID:1/16) McMaster-Carr, IL, USA 52355K41 100 Ft
Barbed tube fittings McMaster-Carr, IL, USA 5117K71 1 pack
Push-to-connect tube fittings McMaster-Carr, IL, USA 5779K102 4
Barbed Tube Fittings (1/4MNPT->1/8BF) McMaster-Carr, IL, USA 5463K439 1 pack (10)
Barbed Tube Fittings (1/8MNPT->1/8BF) McMaster-Carr, IL, USA 5463K438 2 pack (10) 
Barbed Tube Fittings (1/8MNPT->1/16BF) McMaster-Carr, IL, USA 5463K4 2 pack (10) 
Barbed Tube Fittings (1/4MNPT->1/4BF) McMaster-Carr, IL, USA   5670K84 1
Hex head plug McMaster-Carr, IL, USA 48335K152 1
Air pressure regulator, air filter and flowmeters (Quantity needed)
Labatory gas drying unit W A HAMMOND DRIERITE CO LTD, OH, USA Model: L68-NP-303; stock #26840 1
Multitube frames for 150 mm flowtubes Cole-Parmer, IL, USA R03215-30 1
Multitube frames for 150 mm flowtubes Cole-Parmer, IL, USA R03215-76 1
150 mm flowtubes Cole-Parmer, IL, USA R-03217-15 9
Valve Cartridge Cole-Parmer, IL, USA R-03218-72 9
Precision Air regulator McMaster-Carr, IL, USA 6162K13 1
Soleniod valves Automate Scientific, Berkeley, CA 02-10i 4
Solenoid valve controller ValveLink 8.2, Automate Scientific, Berkeley, CA 01-18 1
Electronic flow meter Honeywell AWM3100V 1
DAQ (NI USB-6009, National Instruments) and a  National Instruments NI USB-6009 1
Power supply Extech Instruments 382200 1
Odor chambers
Polypropylene Wide Mouth jar 2 oz; 60 ml Nalgene 562118-0002 At least 5 are required per experiment, but a separate chamber is required for each dillution of each odorant. Available at Container Store, part #635114)
Glass odor chamber, 0.25 oz Sunburst Bottle LB4B At least 5 are required per experiment 
"In" valve for odor chamber Smart Products, Inc., CA, USA 214224PB-0011S000-4074 1 of these parts is used per odor chamber but they need to be replaced frequently
"Out" valve for odor chamber Smart Products, Inc., CA, USA 224214PB-0011S000-4074 1 of these parts is used per odor chamber but they need to be replaced frequently
O ring RT Dygert International, MN, USA AS568-029 Buna-N O-R 1 pack (100)
Fly arena, camera and behavior boxes (Quantity needed)
Behavior and camera box material Interstate plastics, CA, USA ABS black extruded (https://www.interstateplastics.com/Abs-Black-Extruded-Sheet-ABSBE~~ST.php) 1803 sq inch
Teflon for fly arena and odor chamber inserts, 3/8" thick, 12" x 12" McMaster-Carr, IL, USA 8545K27  1
Glass plates, 1/8" Thick, 9" x 9" McMaster-Carr, IL, USA 8476K191  2
Dual action thermoelectric controller WAtronix Inc, CA, USA DA12V-K-0 1
IR LED array Advanced Illumination, Rochester, VT, USA AL4554-88024, PS24-TL 2 LED arrays and one power supply
Air conditioner Unit Melcor Store  MAA280T-12 1
Imaging system (Quantity needed)
Cosmicar/Pentax C21211TH (12.5 mm F/1.4) C-mount Lens B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA PEC21211 KP 1
CCXC-12P05N Interconnect Cable B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA SOCCXC12P05N 1
DC-700 Camera Adapter B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA SODC700 1
B+W 40,5 093 IR filter B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA 65-072442 1
TiFFEN 40.5 mm Circular polarizer Amazon 1
IR Videocamera Industrial Vision Source, FL, USA Sony XC-EI50 (SY-XC-E150) 1
USB video converter The Imagingsource, NC, USA DFG/USB2-It 1
iFlySpy2 (fly tracking software) Julian Brown, Stanford, Calfornia: julianrbrown@gmail.com iFlySpy2 1
IC Capture 2.2 software The Imagingsource, NC, USA (http://www.theimagingsource.com/en_US/products/software/iccapture/)
Miscellaneous (Quantity needed)
Dremel rotary tool Dremel, Racine, WI, USA Dremel 8000-03  1
Diamond-coated drill bits for glass cutting Available from various suppliers; MSC industrial Supply Co, Melville, NY 90606328 1

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References

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घ्राण व्यवहार कंप्यूटर पर नज़र रखने का यत्न से<em&gt; ड्रोसोफिला</em&gt; एक चार चतुर्थ भाग Olfactometer में
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Lin, C. C., Riabinina, O., Potter,… More

Lin, C. C., Riabinina, O., Potter, C. J. Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer. J. Vis. Exp. (114), e54346, doi:10.3791/54346 (2016).

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