Abstract
Основной проблемой в нейробиологии, чтобы понять , как нейронные цепи функционируют , чтобы направлять соответствующее поведение животных. Дрозофилы является отличной моделью системы для таких исследований из - за его сложного поведения, мощных генетических методов и компактной нервной системы. Лабораторные анализы поведения уже давно используются с дрозофилы для моделирования свойств природной среды и изучение нейронных механизмов , лежащих в основе соответствующих навыков поведения (например , фототаксис, хемотаксис, сенсорное обучение и память) 1-3. С недавнего наличия больших коллекций трансгенных линий дрозофилы , которые маркируют специфические нейронные подмножества, поведенческие тесты взяли на себя заметную роль связать нейроны с поведением 4-11. Универсальность и воспроизводимые парадигм, вместе с основной вычислительной процедуры для анализа данных, необходимы для быстрых испытаний кандидатов летать линий с различными genotypэс. Особенно полезными являются расстановок, которые являются гибкими в количестве подопытных животных, продолжительность эксперимента и природы, представленных раздражителей. Анализ выбора также должен генерировать воспроизводимые данные, которые легко приобрести и анализировать. Здесь мы представляем подробное описание системы и протокола для опробования поведенческие реакции дрозофилы в большом четыре поля арене. Установка используется здесь для анализа ответов мух одного обонятельного стимула; Тем не менее, та же установка может быть изменен, чтобы проверить несколько обонятельные, зрительные или оптогенетика стимулы, или их комбинацию. Установка Ольфактометр регистрирует активность популяций мух реагирующих на запахи, и вычислительные методы анализа применяются для количественной оценки поведения мух. Собранные данные анализируются, чтобы получить быстрый считывание экспериментального пробега, что имеет важное значение для эффективного сбора данных и оптимизации условий эксперимента.
Introduction
Способность адаптироваться и реагировать на них внешней среды имеет решающее значение для выживания всех животных. Животное нуждается, чтобы избежать опасностей, искать еду и найти товарищей, и извлечь уроки из предыдущего опыта. Сенсорные системы функционируют, чтобы получить множество стимулов, таких, как визуальный, химической и механосенсорных, и передать эти сигналы в центральную нервную систему, чтобы быть истолковано и декодируется. Мозг затем направляет соответствующее поведение двигателя на основе воспринимаемой среды, такие как поисках пищи или спасаясь от хищника. Понимание того, как сенсорные системы обнаружения внешний мир, и как мозг декодирует и направляет решения, является одной из основных задач в нейробиологии.
Дрозофилы это мощная системная модель для исследования поведения нейронных хау схемы направляющих. Помимо того , простой и недорогой в обслуживании, Drosophila демонстрируют много разнообразных и сложных стереотипное поведение, но сделать это с COMPACт нервной системы приблизительно 100000 нейронов. Существуют мощные генетические методы для манипулирования геном дрозофилы, и тысячи трансгенных линий были сформированы , которые селективно и воспроизводимо маркировать те же подмножества нейронов 10-13. Эти трансгенные линии могут быть использованы для селективного манипулирования активность меченых нейронов (активировать или ингибировать), и эти манипуляции могут быть использованы, чтобы исследовать, как нейронные поведение функции направляющих.
Многократные поведенческие тесты были разработаны для изучения различных поведения дрозофилы. Drosophila, как и многие животные, используют свое обоняние для направления много поведенческих вариантов, таких как поиск пищи, находить товарищей, и избежать опасности. Поэтому Обоняние является хорошим сенсорная система для исследования, как внешние стимулы обнаруживаются и интерпретируются нервной системы животного, чтобы вести правильный выбор. Таким образом, целый ряд анализов, которые были разработаны для Investigaтин личинками и взрослых обонятельные поведения. Традиционно, обонятельные поведения у дрозофилы анализировали с помощью двух выбора парадигмы Т-лабиринтом, который может быть использован для опробования врожденный и узнал обонятельные поведения 3. В этом анализе, около 50 мух дают выбор между двумя трубками: одна трубка содержит запах о котором идет речь, а другой содержит контрольный одоранта (обычно запах растворителя). Мухи дают определенный период времени, чтобы сделать выбор, а затем количество мух, которые находятся в разных камерах подсчитываются. Хотя Т-лабиринте это простой тест для многих экспериментов, существует несколько ограничений. Например, обонятельные поведения измеряются только в одной временной точке, а также различные выборы, сделанные до этого момента времени отбрасываются. Аналогичным образом, отдельные модели поведения мух в популяции пренебрегают. Кроме того, Т-лабиринтом требует ручного подсчета мух, которые могут привести к ошибкам. Наконец, так как есть только два варианта измеренных, этоснижает статистическую мощность часто требуется, чтобы обнаружить тонкие изменения в поведении. Альтернатива два выбора T-лабиринт является четырехквадрантная (четыре поля) Ольфактометр 14-18. В этом анализе животных исследовать арену, в которой каждый из четырех углов арены наполнен потенциальным источником одоризованный воздуха. Арена имеет сморщенный форму звезды, чтобы максимизировать образование четырех экспериментально определенных квадранта запаха. Если запах подается в одном из углов то она содержится только в этом одном квадранте. Поведение животных можно отследить, как они входят и выходят из запах квадрант, и легко по сравнению с их поведением в трех квадрантах управления. Таким образом Ольфактометр анализа четырехквадрантная записи пространственной и временной поведенческой реакции на раздражители запах над большой экспериментальной арене.
Четырехквадрантная Ольфактометр была впервые разработана Петерсон и др. 15 и Vet и др. 17 , чтобы исследовать олаЗаводские поведенческие реакции индивидуального паразитических перепончатокрылых. Faucher и др. 18 и Semmelhack и Ван 16 приспособлены установки для контроля обонятельные реакции индивидуального дрозофилы. Четырехквадрантная Ольфактометр одинаково чувствителен к притяжения и отталкивания ответов, что позволяет в широком диапазоне испытаний отдушек и условий. Специально написанная программа отслеживания муха, разработанная Alex Кацов 19 и в настоящее время поддерживается Джулиан Браун (подробно в разделе Материалы), были введены дополнительные преимущества для более поздних реализаций четырехквадрантном ольфактометр 14,20-23. Теперь стало возможным для анализа до 100 мух одновременно с высоким пространственным (27.5 пикселей / см) и по времени (30 кадров в секунду) разрешение, которое позволяет извлекать различные параметры, такие как положение, скорость и ускорение мух в любой момент времени. Это дает возможность исследования в динамике поведенческих реакций мух "запахов 20 таблице материалов), такая же конфигурация позволяет гибкие периоды отслеживания и может быть использована для отслеживания мух до 24 часов, принимая изображения при более низкой частоте кадров. Этот вариант был использован для изучения яйцекладка поведения мух и сравнить их положение тела с ovipositional предпочтений 14. Четыре поля Ольфактометр также могут быть использованы для изучения реакции на мультимодальные (например , обонятельные и зрительные) раздражители, или сочетать оптогенетика 9 или thermogenetic 21 стимуляцию с презентациями сенсорных стимулов. Кроме того, высокое временное разрешение позволяет извлечение траекторий Foг каждая отдельная муха в ансамбле набора данных. Таким образом, метод позволяет исследовать в обонятельных наведением поведения населения, а также отдельных социальных взаимодействий. Данные, полученные с помощью данного анализа являются надежными и высокой воспроизводимостью, что обеспечивает использование четырех полевых ольфактометр поведенческих экранов.
Мы опишем здесь сборку установки для четырехквадрантном ольфактометр а. Мы также продемонстрировать его использование в опробование обонятельный привлекательность в ответ на яблочный уксус и отталкивание в ответ на высококонцентрированного этилового эфира пропионата. Наконец, мы опишем и предоставить пример кода для анализа записанных данных отслеживания муха.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Установка Сборка
- Изготовление звездообразного арене (19,5 см на 19,5 см на 0,7 см) из политетрафторэтилена (ПТФЭ) в соответствии с предусмотренными чертеж (дополнительные материалы, SupplementalSketch_StarShapedArena.pdf). Арена может быть изготовлена путем коммерческого или пользовательского объекта.
- Приобретать два стеклянных пластин (20,25 см на 20,25 см с толщиной 2 мм) и просверлить отверстие (~ 0,7 см в диаметре) точно в центре одной из стеклянных пластин с использованием алмазным покрытием сверло.
- Производство светонепроницаемый поведения ящик для поведенческого арене. Кроме того, производство светонепроницаемый ящик камеры для инфракрасной ПЗС видеокамеры в соответствии с предоставленными чертежами (дополнительные материалы, SupplementalSketch_LightTightBox.pdf). Коробки могут быть изготовлены коммерческой или пользовательского объекта.
- Установите блок кондиционера на задней стенке и светодиодных массивов на боковых стенках ящика поведения. Установите датчик температурыв коробке поведения через боковое отверстие для обратной температуры в режиме реального времени и настройки (см рисунках 1 и 2 для деталей).
- Присоединить ИК-фильтр и круговой поляризатор на камеру, и установите сборку в коробку камеры. Коробка поведение и коробки камеры разделены стеклом для лучшего контроля температуры коробки поведения (см рисунки 1 и 2 для более подробной информации).
- Подключите ИК-ПЗС-камеры к адаптеру камеры. Подключите адаптер камеры к преобразователю USB. Подключите преобразователь USB к порту USB на компьютере для сбора данных.
- Установите драйвер для видео конвертер на компьютере в соответствии с инструкциями изготовителя. При желании, установить программное обеспечение для обработки изображений, предоставляемой производителем USB видео конвертер для получения доступа к более широкому диапазону значений параметров камеры и сбора данных.
- Подключение блока кондиционера (через "выход"На обратной стороне регулятора температуры) и датчиком температуры (через" термопара "на обратной стороне регулятора температуры) до регулятора температуры. Поместите зонд в поле поведения.
Примечание: Система контроля температуры в нашем макете способна поддерживать температуру коробки от 18 ° С до 30 ° С. Более высокие или более низкие температуры окружающей среды могут быть полезны для thermogenetic (dTrpA1, TRPM8 или shibire ц) эксперименты для манипулирования нейронную активность или ингибируют синаптическую передачу. Для большинства экспериментов, температуру поддерживают на уровне 25 ° C. - Собрать систему доставки запаха в следующих шагах (см Рисунок 1В подробные схемы и соединительные фитинги):
- Используйте регулятор давления воздуха для контроля входа воздуха из центральной воздушной системы. Подключение углерода воздушный фильтр (заполненный активированным углем) с регулятором давления для очистки воздуха от центрального аИК система.
- Соберите систему управления потоком данных, состоящую из нескольких каналов, регулируемых расходомера труб с высокой разрешающей способностью.
- Подключите выход из воздушного фильтра углерода к расходомеру труб через коллектор , как показано на рисунке 1В и 2F. Прямой выход расходомера трубок с электронным управлением через 3-ходовой электромагнитный клапаны для регулирования , если чистый воздух , выходящий из Расходомеры выбрасывается в комнату или вошел в заказных запах камер 24.
- Установите электромагнитный клапан регулятора в соответствии с инструкцией завода-изготовителя.
- Установите электронный расходомер воздуха, подключив его к устройству сбора данных (DAQ) и источник питания в соответствии с инструкцией изготовителя. Установите программный интерфейс DAQ для проверки равных скоростей потока в каждом квадранте арены перед каждым экспериментом.
2. Обонятельная Стимулы Подготовка
- Подготовьте 5 запахмуравей камеры 24 , которые состоят из пластикового внешнего контейнера, внутренний контейнер из стекла, ПТФЭ вставка на заказ крышка, оригинальный контейнер с крышкой центральной части удалены, и два односторонние клапаны.
Примечание: уплотнительное кольцо вокруг крышки PTFE может быть использован, чтобы предотвратить утечку воздуха из запаха камеры во время запаха перфузией. На рисунке 1 схеме и фиг.2 для фотографий камер. - Используйте четыре одоранта камеры для контроля растворителя и одну камеру на тест одоранта. Заполните стеклянные контейнеры с 1000 мкл растворителя или одоранта разбавления (тест отдушки + соответствующие растворители, тщательно перемешать до экспериментов), поместите стеклянную емкость внутри соответствующей пластиковой камере (не выливаться жидкость в пластиковой камере) и затяните крышку , Убедитесь в том, чтобы всегда использовать чистую камеру для тестового контроля одоранта и растворителя.
Примечание: Обонятельная притяжение может быть вызвано 1/16 разбавлении яблочного уксуса (5% кислотности) в масАтера. В противоположность этому, обонятельные поведение отталкивание могут быть изучены с помощью 10% разбавление этиловый эфир пропионовой кислоты в минеральном масле. стимулы управления в этих случаях запах камеры с чистым минеральным маслом.
3. Подготовка Fly
- Задний летит на стандартной кукурузной среде. Поместите 30 мужчин и 30 женщин родительских мух в стандартной бутылке, и пусть они откладывают яйца в течение 5 дней при 25 ° С или при комнатной температуре.
- Для каждого эксперимента, собирают вновь eclosed (<1 день назад) 25 мужчина и 25 самка летит под коротких CO 2 наркозом.
- Хранить мух во флакон со стандартной зольной среде в течение 2-4 дней.
- 40-42 ч до начала эксперимента, передача мух без CO 2 анестезии во флакон с ~ 10 мл 1% -ном агарозном геле. Это будет держать мух увлажненной без пищи, что помогает увеличить их двигательную активность.
Примечание: Более 90% мух должны пережить голод. Некоторые генотипы менее заживаюттвой и не может сделать это через 40 ч голодания. В тех случаях, короткие периоды, такие, как 24-28 ч являются приемлемыми, но должны быть одинаковыми для всех условий эксперимента и повторами.
4. Поведенческие Ответы на привлекательном и репеллента Отдушки
- Включите регулятор температуры и установить его на 25 ° C.
- Подключение одоранта камеры (контрольные и тестовые одорантов), вставив трубку к выходному отверстию одоранта камеры и толчок к подключению установки на поле поведения.
- Проверьте скорость потока в каждом квадранте с помощью расходомера, чтобы убедиться, что контроль и пахучие воздушные потоки равны 100 мл / мин.
- Очистите PTFE летучую арену и стеклянные пластины с 70% этанола в 2-3 раза и позволяет им полностью высохнуть на воздухе (~ 3-4 мин).
- Наклейте стеклянные пластины на арену с зажимами.
- Передача летит без CO 2 наркозом на арену через отверстие в одной из стеклянных пластин. в кормовой частиэр передача, поместите круглую сетку на отверстие, чтобы предотвратить мух от побега.
Примечание: CO 2 анестезии было показано , что влияет на поведение Drosophila 25 и не должны быть использованы в течение 24 часов поведенческого эксперимента. - Поместите на арену с мухами в светонепроницаемый камеру, подключить четыре воздушные потоки управления путем подключения трубки, прикрепленной к нажимной к подключению установки на поле поведения на арену углов, закройте дверцу камеры и ждать 10- 15 мин, чтобы мухи акклиматизироваться в новой среде. Если это возможно, выключать освещение в помещении, где выполняются эксперименты, чтобы избежать возможной минимальной утечки света, который может смещения экспериментальный результат.
- Выполнить контрольный эксперимент 5-10 мин, в котором мухи подвергаются воздействию воздушных потоков 4 управления.
- Анализ данных немедленно (смотрите раздел анализа данных ниже), чтобы убедиться, что мухи распределены равномерно на арене, и Аттракцион индекс близок0. Этот шаг имеет важное значение, поскольку он проверяет , что нет никаких неконтролируемых источников предпочтения или избегания внутри арены (например , свет травит снаружи, неравномерное распределение температуры, неравномерное арене, загрязнения запах и т.д.). Если мухи распределены неравномерно или их двигательную активность низка, выбросьте мух, снова очистить арену (этап 4.4) и использовать новую партию мух повторить эксперимент.
- Подключите тест одоранта камеру для установки путем переключения на 3-ходовые клапаны или переподключение соединительные трубки.
- Выполнить тестовый эксперимент в течение 5-10 мин и анализировать данные , как описано в разделе 5 ниже (также см Reference 14 и рисунок 3). Записи более 20 мин может привести к файлам данных, которые могут быть трудно вычислительно процесса. Если больше экспериментальных записи желательно, быстро остановить и повторно запустить программу отслеживания. Это приводит к втор зазор ~ 10 между экспериментальными записей.
- Discarг мух.
- Чистые арены и стеклянные пластины с 70% -ным этанолом (этап 4.4) и заменить соединительные трубки в светонепроницаемый корпус. Для ускорения экспериментов, новую чистую арена может быть использована, и грязная арена очищаются при выполнении опытов.
- Выполните еще один эксперимент с новой партией мух, если это требуется. Если несколько экспериментов выполняются в тот же день, принять крайнюю осторожность, чтобы гарантировать, что ни один одорант не остается в системе из предыдущего теста. Это , как правило , не является проблемой , с низкими концентрациями пахучих или с СО 2, но высококонцентрированные раздражители до зазора 24 ч между опытов могут быть необходимы. Кроме того, все трубки после того, как Проточный трубки могут быть заменены, если одоранта загрязнение подозревается в ходе контрольных экспериментов. Всегда оставляйте сухой воздух на между экспериментами непрерывно промывать систему
5. Анализ данных
Примечание: Предложенная муха Softwar приобретения отслеживанияе (подробно описано в материалах), отслеживает мух в режиме реального времени во время приобретения, а также сохраняет метку времени и координаты всех обнаруженных мух в формате * .dat. Мы разработали на заказ Matlab процедуру для преобразования данных в формат Matlab, а также для анализа данных. Примеры кода приведены в дополнительных материалов, но детали реализации будет зависеть от используемого программного обеспечения для сбора данных.
- Загрузите исходные данные. Создать пространственную маску , которая повторяет контуры арены и нанесите маску на необработанных данных , чтобы удалить все точки данных , которые выходят за пределы арены , поскольку они представляют собой шум (рис 4A, Дополнительный код MaskSpatialFiltering.m, Score.m, DrawCircularMask. м).
- Удалить все точки данных , которые движутся со скоростью ниже 0,163 см / сек дольше , чем 3 секунды, так как эти данные, вероятно, будет шум или порождена неподвижную мух (рис 4В, Дополнительный код TemporalFiltering.m).
- Визуализировать оставшиеся данныеточки, откладывая их все сразу или в виде отдельных траекторий (рис 3, Дополнительный код SingleTrajectoryViewer.m).
Примечание: расположение границ запаха в четырехмерном поле, скорее всего, зависит от ряда факторов, таких как характеристики каждого одоранта и расхода воздуха используется. Например, легколетучие отдушки, скорее всего, заполнить запах квадрант более полно, чем менее летучих пахучих веществ. Таким образом, вполне вероятно, что каждый одорант может проявлять немного разные границы запаха. Использование детектора фотоионизации для измерения границ запаха может быть проблематичным, поскольку он использует вакуум, чтобы образец воздуха от определенном месте, и таким образом приводит к нарушению концентрации одоранта в этом месте. Тем не менее, границы запаха может быть быстро оценена на основе данных о поведении мух. Например, граница запаха основанный на кумулятивных лету треков в ответ на различные запахи можно ясно наблюдать на рисунках 3С и 3D. - Calculate индекс привлекательности для определения контрольных экспериментов не генерируют ли никакого ответа предпочтений, а также для получения доступа к ответ на одоранта (или оптогенетика 9) раздражитель. Для вычисления притяжения Index (AI), использовать последние 5 мин контроля или записи испытаний. Для того, чтобы получить меру притяжения, которая падает между +1 (абсолютное притяжение) и -1 (абсолютная отталкивание), то используется следующая формула для расчета AI:
где N тест число точек данных в тестовом квадранте, N управление среднее количество точек данных в трех квадрантах управления. Эта мера является интуитивно понятным, как никакого предпочтения не будут обозначены почти нулевыми значениями. Тем не менее, он не сможет правильно указывать долю от общего количества мух, которые расположены в одоранта квадранте. Для того, чтобы получить эту меру, может быть использовано в процентном индекс (PI):![Уравнение 2]("/files/ftp_upload/54346/54346eq2.jpg")
где N тест число точек данных в тестовом квадранте, и N общее общее количество точек данных во всех четырех квадрантах. Эта формула дает меру , которая падает между 0 и 1, с 0,25 , соответствующий никаких поведенческих предпочтений (рис 3Е и 4С, Дополнительный код AttractionIndex.m). - Выполните 5-10 повторов каждого условия эксперимента, используя новую группу мух для каждого повтора. Сравните привлекательность индексов между условиями или против управления с помощью Колмогорова-Смирнова непараметрический тест (рис 3F, kstest2 функции в Matlab).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Четырехквадрантный ольфактометра анализа записей и анализирует ходьбу деятельность многих мух на большой поведенческой пространстве. Отдушки могут быть введены в воздушные потоки, которые входят в один, два, три или все четыре квадранта. При отсутствии запахов, мухи свободно перемещаться между всех четырех квадрантах. Такое поведение имеет решающее значение для наблюдения, как это указывает на то, что Непреднамеренные уклоны не были введены в анализе. Эти смещения могут включать в себя свет, температурные колебания, различия в потоке воздуха или запаха загрязняющих веществ. Рисунок 3B показывает поведенческие реакции в четырехквадрантном ольфактометр 25 самцов и 25 самка летит к сухому воздуху. Одна муха-трек из собранных данных также выделяется на фигуре 3В, и демонстрирует , что эта муха изучает всю поведенческую арену. Индекс притяжения оценка (AI) для всех анализируемых треков в течение 5-минутного периода испытания близко к 0, индикацинг отсутствие влечения к запаху квадранте. Аналогичным образом, процент индекс (PI), из эксперимента 0,24, что свидетельствует о том, что мухи были распределены справедливо даже во всех четырех квадрантах в течение периода испытания 5-мин.
Четыре поля поведенческий ответ на привлекательный одоранта показан на рисунке 3C. Яблочный уксус вводят в поток воздуха верхний левый квадрант запах потока воздуха путем размещения 6,25% разведения яблочного уксуса с в испытание запаха камеры. Собранные муха треки, показанные серым цветом, показывают, что большинство мух собирают в этом квадранте запах, и больше не исследовать все четыре квадранта. Одна цветная муха трек показывает, что как только муха попадает в яблочный уксус запах квадрант, он имеет тенденцию оставаться в привлекательном запах квадранте. А.И. 0,94 для эксперимента близка к 1, что указывает сильное притяжение к этому одоранта. PI 0,92 указывает на то, что 92% от мух гemained в квадранте запаха в течение периода анализа.
Четыре поля поведенческая реакция на репеллент одоранта показан на рисунке 3D. 10% разбавление одоранта этиловый эфир пропионовой кислоты, помещенной в запах камеры был использован в качестве источника запаха для потока верхнего левого воздуха. Массированные муха дорожки для анализируемого эксперимента демонстрируют предотвращение запаха квадранте, наводит на мысль о запаха наведением отталкивания. Одна цветная муха трек показывает, что муха, когда она вошла в квадрант запах, быстро отвернулся, чтобы избежать запаха квадрант. ИИ -0.68 меньше 0, что указывает на отталкивание, и близок к -1, что свидетельствует о сильном отталкивающего одоранта ответ. ДБ 0,06 для эксперимента показывает, что только 6% (по сравнению с ~ 25% в нейтральной опытах запах) отслеживаемых точек данных мухи были найдены в запахе квадранта по ходу эксперимента.
Рисунок 3E схемы взаимосвязи между ИИ и ПИ баллов, и как эти цифры относятся к притягательные или отталкивающие поведения.
Анализ четыре поля приводит к надежным и воспроизводимым обонятельных поведения. Это позволяет для количественных сравнений между контрольной и экспериментальных условиях , как показано на рисунке 3F, а также позволяет выявить тонкие olfactorу ответы, которые отклоняются от нейтральности.
Кроме того, как данные получены с высоким пространственным и временным разрешением, можно изучить многочисленные факторы поведенческих реакций, таких как траекторий отдельных мух (как показано на рисунке 3), а также характеризуют различную динамику активности мух в полем запаха (например, изменения направления и скорости 19,20).
Это часто бывает трудно расположить четыре манеж в том же месте для каждого эксперимента, тем более, что частая очистка арены требуется. Предоставленный анализирует сценарии компенсировать эти незначительные отклонения от первой подгонки данных , как показано на фиг.4А. В этом случае форма четырех манеж вычисляется, и точки данных, которые лежат вне этого пространства, удаляются. Эти объекты отслеживаемые часто представляют ДебRIS или отражения, которые ошибочно отслеживаются. Поскольку они не лежат в пределах арены и, таким образом, представляют собой шум, важно, чтобы эти точки данных удаляются, чтобы предотвратить ошибочный анализ данных. Аналогичным образом, важно также, чтобы удалить точки данных гусеничные, которые могут представлять собой шум или не движется мух в пределах арены. Для достижения этой цели , скрипт анализа используется (и при условии , здесь) , который удаляет точки данных , которые по существу не перемещаются (как показано на рисунке 4B). Эти точки данных, как правило, в меньшинстве, но их удержание приведет к ошибкам в анализе.
Индекс Привлечение и индекса предпочтения баллы могут быть вычислены по истечении заданного периода времени (например , в конце 5 мин эксперимента в , как показано на рисунке 3). Следует отметить, однако, что так как мухи отслеживаются с высоким пространственным и временным разрешением, аналогичные анализ можно провести в течение всего эксперимента. Этопоказано на фигуре 4C , в котором Аттракцион индекс и индекс в процентах баллы рассчитываются в непрерывных 10 сек бункеров в течение периода времени. Такой анализ позволяет лучше оценить обонятельные изменения, которые могут произойти в течение всего эксперимента, например, привыкания к одоранта.
Рисунок 1:. Схема четырехквадрантном одориметра (A) Настройка поведения состоит из системы доставки запаха, система контроля температуры (не схематически), система получения изображений (ИК - светодиодов и ПЗС - камеры ИК , подключенные к компьютеру), четырехквадрантная арена и светонепроницаемый поведение и арены коробки. Красные круги обозначают соответствующие компоненты , показанные на рисунке 2. (B) Детальное проектирование системы доставки запах. Зеленые символы представляют размеры соединения / преобразования Рittings. Трубы из 1/16 ID и 1/8 OD помечены желтым цветом, тогда как те, 1/8 ID и 1/4 OD помечены розовым цветом. Сокращения: ИК, ИК-порт; CF, компрессионный фитинг; BF, Колючая Место, MNPT, Мужской Национальная трубная резьба. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рис . 2: Фотографии установки Обонятельная анализа (A) с широким полем поле камеры и поведение коробки. (B) Вид внутри коробки поведения. Датчик температуры, разъем трубки, и ИК-матрицы LED помечены. (C) Четыре квадранта арены. (D) , вид Широкопольные системы доставки запах , подключенного к блоку поведения. Окно камеры была удалена, чтобы открыть камеру CCD. (E (F) Пример трубок запах , соединенных с коллектором. (G) проточных труб с высокой разрешающей способностью регулировать поток воздуха. (H) Запах поставки труб и соединителей на выходе регуляторов FlowTube. (I) Электромагнитные клапаны регулируют , если чистый воздух пропускают через камеру запаха или изгнали в комнату. (J) , запах камеры соединены с односторонним движением клапанов, и содержит внутренний контейнер , стекло для одоранта. (K) Коробка поведение содержит внешние фитинги Push-To-соединения , которые подключаются к трубке подачи запаха. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4:. Пример данных , сгенерированных анализа данных шагов (A) Пространственная фильтрация данных, выполняемых MaskSpatialFiltering.m для удаления точек данных , которые выходят за пределы арены. Красные круги показывают начальные позиции кругов, которые используются для определения границ арены. Черные кружки являются конечные положения, полученные путем подгонки круг очерчивает к данным (серым цветом область внутри четыре поля). Красные точки и черные наконечники стрел указывают на точки данных, которые будут удалены из набора данных после этого шага фильтрации. (B) , временная фильтрация данных, выполняется TemporalFiltering.m. Этот шаг фильтрации удаляет точки данных, которые перемещаются очень SLOwly или нет вообще, так как они, вероятно, будут порождена неподвижную мух или грунтовыми / отражений от арены. Красная точка окруженная пунктирной красной рамкой указывает позиции ~ 6000 точек с одинаковыми координатами, которые будут удалены с помощью этой стадии фильтрации. (C) Аттракцион Index (AI) и в процентах Index (PI), рассчитанный в 10 сек бункеров в течение последних 5 мин эксперимента по AttractionIndex.m. Временные профили этих индексов содержат информацию о динамике поведенческих реакций и могут быть использованы для детального анализа поведения. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ольфактометр четыре поля , описываемого здесь является универсальным поведенческая система для изучения обонятельные реакции крупных популяций дикого типа и мутанта дрозофилы. Каждый эксперимент занимает ~ 1 час (в том числе установки, опытов и очистки), и 4-6 экспериментов можно регулярно проводится каждый день. Типичный анализ с использованием 40-50 мух в течение 5 минут генерирует около 450 000 гусеничный точек данных для анализа. Описанная конфигурация также может быть использован, с незначительными изменениями, чтобы контролировать движения других насекомых или личинок насекомых в ответ на обонятельную или других сенсорных стимулов, в течение периода времени, начиная от минут до дней. Анализ четырехквадрантная чувствителен к воздействию как притяжения и отталкивания стимулов. Большинство отдушки генерировать притяжения индексов (AI) между -0.9 и +0.9 (уравнение 1). AI в диапазоне от +0,5 до +1 означает сильное поведение привлечение мух к стимулам, в то время как AI в диапазоне от -0,5 до -1вызвано сильными репеллентов. Вообще говоря, нейтральная реакция контроля запахов (сухой воздух, увлажненный воздух, минеральное масло) должно находиться в пределах +0.1 и -0.1. AI часто меняется на протяжении тестового эксперимента, отражая время мухи требуют, чтобы идти в пахучих шлейфов, начальное привлечение и повышение двигательной активности по отношению к новому раздражителя, и в конечном итоге десенсибилизации в ответ на стимул. пробеги управления предтестовой необходимы, и должны быть выполнены тщательно, чтобы гарантировать, что мухи были распределены равномерно на арене в отсутствие нужного стимула.
Наиболее частыми причинами пространственного смещения мух на арене являются: неравномерные воздушные потоки, возможно, из-за отключенного трубки или плохо зажаты стеклянные пластины звездообразности арене (в нашем опыте, мухи способны обнаружить различия воздушных потоков всего лишь 15 мл / мин); Неравномерное распределение температуры по всей арене, которые могут быть улучшены путем установкикондиционер блок для создания более слабый и более диффузный поток воздуха и / или более длительный период до приобретения (~ 20 мин), чтобы обеспечить равномерное распределение температуры арены; минимальный утечки света через отверстие датчика температуры, который может быть уменьшен путем герметизации отверстия с черной лентой; остаточный запах на арене или в системе подачи воздуха, в этом случае установка (арена, расходомерные трубки, фитинги в светонепроницаемый корпус, и т.д.) должны быть тщательно очищены и дают высохнуть в течение нескольких дней или заменены , где это возможно.
Обслуживание обонятельной оборудования имеет важное значение для надежных и стабильных результатов. Push-к подключению арматуры на поле поведения и воздухозаборниками и внутренних стен арены должны быть очищены с этанолом после каждого эксперимента, если используются сильные запахи, и позволило полностью высохнуть. Стеклянные пластины должны быть промыты три раза с 70% -ным этанолом, который, как правило, достаточно, чтобы удалить остаточный запах и грязь с пластин, но гексан полезнов удалении органического соединения , осажденного мухами (например, феромоны , состоящий из длинных углеводородных цепей). Мыло, как правило, не рекомендуется, так как он обычно содержит ароматические компоненты, которые повлияли бы на обонятельные поведение. Окно поведение должно оставаться подключенным к сухим воздухозаборниками между экспериментами (например , на ночь) для облегчения удаления остаточных запахов из системы.
Если двигательную активность мух низка, они могут генерировать слишком мало точек данных, что часто приводит к шумной и переменной индекса притяжения. Более длительные голодания и время записи может помочь решить эту проблему. В отличие от этого, если мухи больны, 24-28 ч голодания, как правило, достаточно для повышения локомоторную активность до тех пор, как она согласуется на протяжении экспериментов. Существует тонкий баланс между поддержанием здорового состояния мух и увеличивая двигательную. 40 ч голодание может быть использовано в качестве отправной точки, а затем измененнеобходимо на основе экспериментальных результатов. Привлечение индексов будет несколько зависеть от продолжительности голодания, таким образом, важно, чтобы голодать все экспериментальных животных за тот же период времени, чтобы избежать искажающие эффекты времени голодания. Более длительное время голодание обычно делают отталкивающие реакции слабее (ближе к 0), а также привлекательные ответы сильнее. Сухие воздушные потоки управления воздушным, как правило, усыхают мух, и не должны быть использованы в течение более 40 мин.
Четырехквадрантная Ольфактометр могут быть использованы для изучения реакции одиночных или множественных 16,18 мух на один раздражитель или изучать предпочтения выбора между раздражителями. Например, различные запахи, могут быть использованы в каждом из четырех квадрантов-. Это также может быть использовано для определения ответов на запахам смесей путем изучения границ запаха квадрантах. Следует отметить, что даже если система слежения позволяет отдельные треки, чтобы изолировать от собранных данных, тоВозможно, что отдельные мухи могут вести себя иначе, когда анализировали, как часть группы, чем тогда, когда они будут испытаны в одиночку. Например, группы мух проявляют увеличилась запах наведением отталкивание из - за физических взаимодействий между мух 26. Система отслеживания и расположение также может быть адаптирована для использования в не-обонятельных анализов. Рамки анализа может легко разместить массив светодиодов 9 для оптогенетика стимуляции или тепловой пластины 27 для thermogenetics. Кроме того, система может быть приспособлена для изучения поведенческих выбор масштаба времени многих часов, например , для изучения откладки яиц поведения 14. В этом случае частота кадров сбора должна быть скорректирована, чтобы избежать образования больших файлов данных и источник влаги и субстрата (1% агарозном геле) должны быть предоставлены в качестве яйцекладки подложки.
Ограничение этой установки является то, что мухи отслеживаются как ИК-отражающие объекты и ниже, если какой-либо Арена элементом оптогенетика илиthermogenetic эксперимент отражает ИК, нерелевантные точки данных должны быть удалены во время последующей обработки. В настоящее время это также не представляется возможным снимать мух с пространственным разрешением, что позволяет различным мух непрерывно различимы, но это может быть улучшено в будущем за счет использования более современных видеокамер. Другим ограничением существующей системы является то, что движение мух ограничена двумя измерениями для содействия ходьбе поведения, и будет препятствовать обонятельные индуцированных ответов полета.
Следует отметить, что дополнительные автоматизированные анализы также были разработаны, чтобы исследовать обонятельные поведения одиночных или групп мух. Наиболее аналогичной конструкции для анализа , описанного здесь является метод , разработанный Beshel и Zhong 28. В этом анализе, ответы ~ 30 мух контролируются в небольшой круговой арене (примерно четверть площадь четыре поля арены), в котором запахи доставляются от 1 из 4 портов запаха вдоль арены промLL, и удаляется через отверстие в центре круглой арены. Помимо меньшей арене, другие различия дизайна включают в себя поведение совершается под световых условиях, а также отдушки основном концентрируясь близко к портам запаха (а не по всему одоранта квадранта в соответствии с указаниями сморщенный стенками четырех полей арене). Тем не менее, круговой арене является подходящим методом для скрининга обонятельные реакции мух, и могут быть адаптированы к конструкции слежения муха, описанной здесь.
Альтернативный подход заключается одновременно контролировать активность многих одиночных мух в ответ на запахи. В анализе Flywalk отдельные мух помещают в небольшие пробирки, и их ответы отслеживаются , когда отдушки перфузируют через трубку 29,30. Изменения в прямом или обратном направлении, или изменения скорости, могут быть использованы для оценки, если одорант, как правило, притяжения или отталкивания. Этот анализ, как и анализа четырехмерного поля, автоматически отслеживает муха мovements, и поэтому могут быть использованы для быстрого измерения обонятельные ответов на широкого круга запахов. Тем не менее, в отличие от четырех местах, сложная динамика моторики, такие как траекторных углов поворота и потенциальных социальных взаимодействий, возможно, пропустили в записи анализа Flywalk.
Автоматическое отслеживание отдельных пешеходных мух также была адаптирована к типу анализа 31,32 Т-лабиринте. В этом анализе мух помещают в небольшие камеры, в которых запахами перфузируют с любого конца камеры, и выход через порт в середине камеры. Позиции мух также автоматически отслеживаются. Это имитирует, по единой шкале летать, в рамках Т-лабиринте. В сочетании с оптогенетика, это исследование было особенно хорошо подходит для опробования нейронных цепей, опосредующие обонятельный обучения и памяти, а также могут быть использованы для оценки обонятельные предпочтения одиночных мух. Подобно Flywalk, она не может контролировать сложную динамику активности, которые могут возникнуть в более крупных пространственных областей, Такие , как те , которые происходят во время пищевых ищущим 14 или поведения , которые происходят только в популяциях мух.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Air delivery system | (Quantity needed) | ||
| Tubing and connectors | |||
| Thermoplastic NPT(F) Manifolds | Cole-Parmer, IL, USA | R-31522-31 | 1 |
| Hex reducing nipple (1/4MNPT->1/8MNPT) | McMaster-Carr, IL, USA | 5232T314 | 1 |
| Tubing (ID:1/8) | McMaster-Carr, IL, USA | 5108K43 | 50 Ft |
| Tubing (ID:1/16) | McMaster-Carr, IL, USA | 52355K41 | 100 Ft |
| Barbed tube fittings | McMaster-Carr, IL, USA | 5117K71 | 1 pack |
| Push-to-connect tube fittings | McMaster-Carr, IL, USA | 5779K102 | 4 |
| Barbed Tube Fittings (1/4MNPT->1/8BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5463K439 | 1 pack (10) |
| Barbed Tube Fittings (1/8MNPT->1/8BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5463K438 | 2 pack (10) |
| Barbed Tube Fittings (1/8MNPT->1/16BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5463K4 | 2 pack (10) |
| Barbed Tube Fittings (1/4MNPT->1/4BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5670K84 | 1 |
| Hex head plug | McMaster-Carr, IL, USA | 48335K152 | 1 |
| Air pressure regulator, air filter and flowmeters | (Quantity needed) | ||
| Labatory gas drying unit | W A HAMMOND DRIERITE CO LTD, OH, USA | Model: L68-NP-303; stock #26840 | 1 |
| Multitube frames for 150 mm flowtubes | Cole-Parmer, IL, USA | R03215-30 | 1 |
| Multitube frames for 150 mm flowtubes | Cole-Parmer, IL, USA | R03215-76 | 1 |
| 150 mm flowtubes | Cole-Parmer, IL, USA | R-03217-15 | 9 |
| Valve Cartridge | Cole-Parmer, IL, USA | R-03218-72 | 9 |
| Precision Air regulator | McMaster-Carr, IL, USA | 6162K13 | 1 |
| Soleniod valves | Automate Scientific, Berkeley, CA | 02-10i | 4 |
| Solenoid valve controller | ValveLink 8.2, Automate Scientific, Berkeley, CA | 01-18 | 1 |
| Electronic flow meter | Honeywell | AWM3100V | 1 |
| DAQ (NI USB-6009, National Instruments) and a | National Instruments | NI USB-6009 | 1 |
| Power supply | Extech Instruments | 382200 | 1 |
| Odor chambers | |||
| Polypropylene Wide Mouth jar 2 oz; 60 ml | Nalgene | 562118-0002 | At least 5 are required per experiment, but a separate chamber is required for each dillution of each odorant. Available at Container Store, part #635114) |
| Glass odor chamber, 0.25 oz | Sunburst Bottle | LB4B | At least 5 are required per experiment |
| "In" valve for odor chamber | Smart Products, Inc., CA, USA | 214224PB-0011S000-4074 | 1 of these parts is used per odor chamber but they need to be replaced frequently |
| "Out" valve for odor chamber | Smart Products, Inc., CA, USA | 224214PB-0011S000-4074 | 1 of these parts is used per odor chamber but they need to be replaced frequently |
| O ring | RT Dygert International, MN, USA | AS568-029 Buna-N O-R | 1 pack (100) |
| Fly arena, camera and behavior boxes | (Quantity needed) | ||
| Behavior and camera box material | Interstate plastics, CA, USA | ABS black extruded (https://www.interstateplastics.com/Abs-Black-Extruded-Sheet-ABSBE~~ST.php) | 1803 sq inch |
| Teflon for fly arena and odor chamber inserts, 3/8" thick, 12" x 12" | McMaster-Carr, IL, USA | 8545K27 | 1 |
| Glass plates, 1/8" Thick, 9" x 9" | McMaster-Carr, IL, USA | 8476K191 | 2 |
| Dual action thermoelectric controller | WAtronix Inc, CA, USA | DA12V-K-0 | 1 |
| IR LED array | Advanced Illumination, Rochester, VT, USA | AL4554-88024, PS24-TL | 2 LED arrays and one power supply |
| Air conditioner Unit | Melcor Store | MAA280T-12 | 1 |
| Imaging system | (Quantity needed) | ||
| Cosmicar/Pentax C21211TH (12.5 mm F/1.4) C-mount Lens | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | PEC21211 KP | 1 |
| CCXC-12P05N Interconnect Cable | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | SOCCXC12P05N | 1 |
| DC-700 Camera Adapter | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | SODC700 | 1 |
| B+W 40,5 093 IR filter | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | 65-072442 | 1 |
| TiFFEN 40.5 mm Circular polarizer | Amazon | 1 | |
| IR Videocamera | Industrial Vision Source, FL, USA | Sony XC-EI50 (SY-XC-E150) | 1 |
| USB video converter | The Imagingsource, NC, USA | DFG/USB2-It | 1 |
| iFlySpy2 (fly tracking software) | Julian Brown, Stanford, Calfornia: julianrbrown@gmail.com | iFlySpy2 | 1 |
| IC Capture 2.2 software | The Imagingsource, NC, USA (http://www.theimagingsource.com/en_US/products/software/iccapture/) | ||
| Miscellaneous | (Quantity needed) | ||
| Dremel rotary tool | Dremel, Racine, WI, USA | Dremel 8000-03 | 1 |
| Diamond-coated drill bits for glass cutting | Available from various suppliers; MSC industrial Supply Co, Melville, NY | 90606328 | 1 |
References
- Benzer, S. Behavioral mutants of Drosophila isolated by countercurrent distribution. Proc Natl Acad Sci U S A. 58 (3), 1112-1119 (1967).
- Thorpe, W. H. Further studies on pre-imaginal olfactory conditioning in insects. Proc R Soc B. 127 (848), 424-433 (1939).
- Tully, T., Quinn, W. G. Classical conditioning and retention in normal and mutant Drosophila melanogaster. J Comp Physiol A. 157 (2), 263-277 (1985).
- Anholt, R. R., Mackay, T. F. Quantitative genetic analyses of complex behaviours in Drosophila. Nat Rev Genet. 5 (11), 838-849 (2004).
- Vosshall, L. B. Into the mind of a fly. Nature. 450 (7167), 193-197 (2007).
- Wu, M. N., Koh, K., Yue, Z., Joiner, W. J., Sehgal, A. A genetic screen for sleep and circadian mutants reveals mechanisms underlying regulation of sleep in Drosophila. Sleep. 31 (4), 465-472 (2008).
- Dankert, H., Wang, L., Hoopfer, E. D., Anderson, D. J., Perona, P. Automated monitoring and analysis of social behavior in Drosophila. Nat Methods. 6 (4), 297-303 (2009).
- Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nat Methods. 6 (6), 451-457 (2009).
- Aso, Y., et al. Mushroom body output neurons encode valence and guide memory-based action selection in Drosophila. Elife. 3, e04580 (2014).
- Pfeiffer, B. D., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (28), 9715-9720 (2008).
- Pfeiffer, B. D., et al. Refinement of tools for targeted gene expression in Drosophila. Genetics. 186 (2), 735-755 (2010).
- Venken, K. J., et al. Genome engineering: Drosophila melanogaster and beyond. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. , (2015).
- Diao, F., et al. Plug-and-play genetic access to drosophila cell types using exchangeable exon cassettes. Cell Rep. 10 (8), 1410-1421 (2015).
- Lin, C. C., Prokop-Prigge, K. A., Preti, G., Potter, C. J. Food odors trigger Drosophila males to deposit a pheromone that guides aggregation and female oviposition decisions. Elife. 4, (2015).
- Pettersson, J. An aphid sex attractant. Insect Systematics & Evolution. 1 (1), 63-73 (1970).
- Semmelhack, J. L., Wang, J. W. Select Drosophila glomeruli mediate innate olfactory attraction and aversion. Nature. 459 (7244), 218-223 (2009).
- Vet, L. E. M., Lenteren, J. C. V., Heymans, M., Meelis, E. An airflow olfactometer for measuring olfactory responses of hymenopterous parasitoids and other small insects. Physiological Entomology. 8 (1), 97-106 (1983).
- Faucher, C., Forstreuter, M., Hilker, M., de Bruyne, M. Behavioral responses of Drosophila to biogenic levels of carbon dioxide depend on life-stage, sex and olfactory context. J Exp Biol. 209 (Pt 14), 2739-2748 (2006).
- Katsov, A. Y., Clandinin, T. R. Motion processing streams in Drosophila are behaviorally specialized. Neuron. 59 (2), 322-335 (2008).
- Gao, X. J., et al. Specific kinematics and motor-related neurons for aversive chemotaxis in Drosophila. Curr Biol. 23 (13), 1163-1172 (2013).
- Gao, X. J., Clandinin, T. R., Luo, L. Extremely sparse olfactory inputs are sufficient to mediate innate aversion in Drosophila. PLoS One. 10 (4), e0125986 (2015).
- Ronderos, D. S., Lin, C. C., Potter, C. J., Smith, D. P. Farnesol-detecting olfactory neurons in Drosophila. J Neurosci. 34 (11), 3959-3968 (2014).
- Riabinina, O., et al. Improved and expanded Q-system reagents for genetic manipulations. Nat Methods. 12 (3), 219-222 (2015).
- Lundstrom, J. N., Gordon, A. R., Alden, E. C., Boesveldt, S., Albrecht, J. Methods for building an inexpensive computer-controlled olfactometer for temporally-precise experiments. Int J Psychophysiol. 78 (2), 179-189 (2010).
- Colinet, H., Renault, D. Metabolic effects of CO2 anaesthesia in Drosophila melanogaster. Biology Letters. 8 (6), 1050-1054 (2012).
- Ramdya, P., et al. Mechanosensory interactions drive collective behaviour in Drosophila. Nature. 519 (7542), 233-236 (2015).
- Ofstad, T. A., Zuker, C. S., Reiser, M. B. Visual place learning in Drosophila melanogaster. Nature. 474 (7350), 204-207 (2011).
- Beshel, J., Zhong, Y. Graded encoding of food odor value in the Drosophila brain. J Neurosci. 33 (40), 15693-15704 (2013).
- Steck, K., et al. A high-throughput behavioral paradigm for Drosophila olfaction - The Flywalk. Sci Rep. 2, 361 (2012).
- Thoma, M., Hansson, B. S., Knaden, M. High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm. J. Vis. Exp. (106), (2015).
- Claridge-Chang, A., et al. Writing memories with light-addressable reinforcement circuitry. Cell. 139 (2), 405-415 (2009).
- Parnas, M., Lin, A. C., Huetteroth, W., Miesenbock, G. Odor discrimination in Drosophila: from neural population codes to behavior. Neuron. 79 (5), 932-944 (2013).
