Summary

Genetic Engineering eines Unconventional Hefe für Erneuerbare Biokraftstoff- und Biochemie Produktion

Published: September 20, 2016
doi:

Summary

We herein report methods on the molecular genetic manipulation of the Yarrowia lipolytica Po1g strain for improved gene deletion efficiency. The resulting engineered Y. lipolytica strains have potential applications in biofuel and biochemical production.

Abstract

Yarrowia lipolytica ist ein nicht-pathogen, dimorphic und streng aeroben Hefe – Arten. Aufgrund seiner besonderen physiologischen Eigenschaften und metabolischen Eigenschaften, diese unkonventionelle Hefe ist nicht nur ein gutes Modell für die Untersuchung der grundlegenden Natur der Pilz-Differenzierung, sondern auch eine vielversprechende mikrobielle Plattform für biochemische Produktion und verschiedene biotechnologische Anwendungen, die umfangreiche genetische Manipulationen erfordern. Allerdings genetische Manipulationen von Y. lipolytica sind begrenzt aufgrund des Fehlens einer effizienten und stabilen genetischen Transformationssystems sowie sehr hohe Raten von nicht-homologe Rekombination , die vor allem auf die KU70 – Gen zugeschrieben werden. Hier berichten wir über ein einfaches und schnelles Protokoll für die effiziente genetische Transformation und für die Gen – Deletion in Y. lipolytica Po1g. Zuerst wird ein Protokoll für die effiziente Transformation von exogener DNA in Y. lipolytica Po1g gegründet wurde. Second, die verbesserte Doppel-crossover homologe Rekombinationsrate für weitere Deletion von Zielgenen zu erreichen, wurde das KU70 – Gens durch Transformieren einer Unterbrechungskassette tragenden 1 kb Homologiearme gelöscht. Drittens die verstärkte Gen – Deletion Effizienz nach dem Löschen des KU70 – Gens zu zeigen, löschten wir einzeln 11 Zielgene kodieren , Alkoholdehydrogenase und Alkohol – Oxidase die gleichen Verfahren auf der KU70 – Knockout – Plattform Stamm verwenden. Es wurde beobachtet, dass die Rate der präzisen homologe Rekombination im wesentlichen von weniger als 0,5% für die Löschung erhöht des KU70 – Gens in Po1g auf 33% -71% für das einzelne Gen – Deletion der 11 Zielgene in Po1g KU70 Δ. Eine replikative Plasmid, das das Hygromycin B-Resistenzmarker und das Cre / loxP-Systems trug konstruiert, und das Selektionsmarker-Gen in der Hefe knockout Stämme wurde schließlich durch die Expression von Cre-Rekombinase entfernt, um mehrere Runden targe erleichternted genetische Manipulationen. Die sich daraus ergebenden Einzel Gen-Deletionsmutanten haben potentielle Anwendungen in der Biokraftstoff- und Biochemie Produktion.

Introduction

Im Gegensatz zu Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica, eine unkonventionelle Hefe kann in Form von Hefe oder Mycel in Reaktion auf Änderungen der Umgebungsbedingungen 1,2 wachsen. Somit ist diese dimorphic Hefe kann für die Untersuchung der Pilzdifferenzierung, Morphogenese und Taxonomie 3,4,5 als gutes Modell verwendet werden. Es wird allgemein als sicher (GRAS) Hefearten angesehen, die allgemein verwendet wird , eine Vielzahl von Lebensmittelzusatzstoffen, wie organische Säuren zu produzieren, Polyalkoholen, Aromastoffen, Emulgatoren und oberflächenaktive Mittel 6,7,8,9. Es ist ein obligat aerob und eine bekannte ölige Hefe fähig ist natürlich Lipide bei hohen Mengen, dh bis zu 70% des Zelltrockengewicht 10 ansammeln. Es kann auch ein breites Spektrum von Kohlenstoffquellen für das Wachstum, einschließlich verschiedener Arten von Rückständen in Abfallressourcen als Nährstoffe 11,12,13 nutzen. All diese einzigartigen Eigenschaften machen Y. lipolytica sehr attraktiv fürverschiedene biotechnologische Anwendungen.

Obwohl die gesamte Genomsequenz des Y. lipolytica hat 14,15, genetische Manipulation dieser unkonventionellen Hefe veröffentlicht worden ist komplexer als andere Hefearten. Erstens Transformation dieser Hefearten ist viel weniger effizient aufgrund des Fehlens eines stabilen und effizienten genetischen Transformationssystem 16,17. Zweitens mühselige genomische Integration von linearen Expressionskassetten für die Expression von Genen von Interesse allgemein verwendet , da kein natürlicher episomal Plasmid System in dieser Hefe 18 gefunden. Drittens Generation von genetischen Knock-Outs und Knock-Ins begrenzt, da das Gen Effizienz durch genaue homologe Rekombination in dieser Hefe – Targeting ist gering , und die meisten Integrationsereignisse auftreten , durch nicht-homologe Endverbindung (NHEJ) 19.

In dieser Studie berichten wir einen optimierten Transformationsprotokoll für die Y. lipolytica </em> Po1g Stamm, der einfach, schnell, effizient und reproduzierbar ist. Um die Frequenz von präzisen homologe Rekombination steigern, wir löschte das KU70 – Gen, das ein Schlüsselenzym in dem NHEJ Stoffwechselweg kodiert. Durch die optimierte Transformationsprotokoll verwendet und eine lineare Knockout – Kassette transformiert enthält flankierenden Homologiebereiche von 1 kb, das KU70 Gen des Y. lipolytica Po1g wurde erfolgreich gelöscht. Die Robustheit dieser Gen – Deletion Methodik wurde dann durch gezielte Alkoholdehydrogenase und Alkohol – Oxidase – Gene in der Po1g KU70 Δ Stamm demonstriert. Es wurde beobachtet , dass die KU70 Deletionsstamms eine wesentlich höhere Effizienz der homologen Rekombination vermittelten Gen zeigten Targeting als die des Wildtyp – Po1g Stamm. Zusätzlich wurde eine replikative Cre Expressionsplasmid den Hygromycin B-Resistenzmarker trägt, konstruiert marker rescue auszuführen. Die Markerrettung erleichtert mehrere Runden von Gen in th Targetinge Gen-Deletionsmutanten erhalten. Neben Gen – Deletion, unser Protokoll für die genetische Transformation und Gen – Deletion hier beschrieben sind, können auf Gene auf bestimmte Loci einfügen angewendet werden, und die ortsspezifische Mutationen in den Y. einführen lipolytica – Genoms.

Protocol

1. Erzeugung des Y. lipolytica KU70 Deletionsstamms Der Bau der Disruptionskassette Anmerkung: Siehe Tabelle 1 für alle Primer in der Polymerasekettenreaktion (PCR) Amplifikationen verwendet. Design Primer 20 der PCR die LEU2 Expressionskassette amplifizieren (siehe Tabelle 1) von einer Y. lipolytica Expressionsvektor und LoxP – Stellen in den 5'- und 3' – Enden der LEU2 Kassette mit einem langen…

Representative Results

Die linearisierte Y. lipolytica – Expressionsvektor wurde in das Genom von Y. in die pBR Andockplattform eingefügt lipolytica Po1g Stamm von 27 eine einzige Crossover – Rekombination durchführen. Durch die schnelle chemische Transformationsverfahren unter Verwendung der in dieser Studie festgestellt, die linearisierte Y. lipolytica – Expressionsvektor wurde in den Wildtyp – Po1g Stamm bei einer Transformationseffizienz von> 100 KBE / ug…

Discussion

Unser Ziel für diese Studie ist eine schnelle und effiziente Erzeugung von gezielten Gen-Knockout in der Y zu ermöglichen lipolytica Po1g Stamm. Mehrere Überlegungen müssen angegangen werden , um dies zu erreichen. Zunächst wird eine hohe Transformationseffizienz erforderlich. Somit ist eine effiziente und bequeme chemischen Transformationsprotokoll für die Y. lipolytica Po1g Stamm wurde in dieser Studie beschrieben. Die Verwendung von PEG-4000 ist ein kritischer Faktor für die…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken für die finanzielle Unterstützung von der Nationalen Umweltagentur von Singapur (ETRP 1.201.102), die Competitive Research Program der National Research Foundation of Singapore (NRF-CRP5-2009-03), der Agentur für Wissenschaft, Technologie und Forschung von Singapur ( 1324004108), globale F & E-Projekt Programm, das Ministerium für Wissensökonomie, der Republik Korea (N0000677), die Defense Threat Reduction Agency (DTRA, HDTRA1-13-1-0037) und der synthetischen Biologie Initiative der National University of Singapore ( DPRT / 943/09/14).

Materials

Reagent/Material
Oligonucleotide primers Integrated DNA Technologies 25 nmole  DNA oligos
Y. lipolytica strain Po1g Yeastern Biotech leucine auxotrophic derivative of the wild-type strain W29 (ATCC 20460)
Vector pYLEX1 Yeastern Biotech FYY203-5MG Y. lipolytica expression vector 
E. coli TOP10  Invitrogen For cloning and propagation of plasmids
pGEM-T vector  Promega A3600 TA cloning vector
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27106 For plasmid isolation
Wizard SV Gel and
PCR Clean-Up System
Promega A9282 Extract DNA fragments from agarose gels
and purify PCR products from an amplification reaction
The iProof high-fidelity
DNA polymerase
Bio-Rad 172-5302 High-fidelity DNA polymerase
BamHI  New England Biolabs R0136S Restriction enzyme
BglII  New England Biolabs R0144L Restriction enzyme
KpnI New England Biolabs R0142S Restriction enzyme
NdeI  New England Biolabs R0111S Restriction enzyme
NotI New England Biolabs R0189L Restriction enzyme
PmlI New England Biolabs R0532S Restriction enzyme
PstI  New England Biolabs R0140S Restriction enzyme
SacII New England Biolabs R0157S Restriction enzyme
SalI New England Biolabs R0138S Restriction enzyme
XhoI New England Biolabs R0146L Restriction enzyme
T4 DNA ligase New England Biolabs M0202L
Taq DNA polymerase  Bio-Rad M0267L
Ampicillin Gibco-Life Technologies 11593-027 Antibiotics
Hygromycin B PAA P21-014 Antibiotics
GeneRuler 1 kb DNA ladder Thermo Scientific SM0312 1 kb DNA ladder
PEG4000 Sigma 95904-F
Tris Promega H5135
EDTA Bio-Rad 161-0729
Salmon Sperm DNA Invitrogen 15-632-011
Lithium Acetate Sigma
Acetic acid Sigma
Glass beads (425-600 µm) Sigma G8772
RNAse A Thermo Scientific EN0531
DNA Loading Dye Thermo Scientific R0611
Bacto Yeast Extract BD 212750
Bacto Peptone BD 211677
D-Glucose 1st Base BIO-1101
YNB without amino acids Sigma Y0626
DO Supplement-Leu Clontech 630414
Glycerol Sigma G5516
Difco LB Broth BD 244620
Difco LB Agar BD 244520
Bacto Agar BD 214010
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
PCR machine Biorad T100 Thermal Cycler
Water bath Memmert WNB 14
Stationary/Shaking Incubator Yihder LM-570RD
Thermo-shaker Allsheng MS-100
Micro centrifuge Eppendorf 5424R
Centrifuge Eppendorf 5810R
Spectrophotometer Eppendorf  BioPhotometer plus
Gel imager GE Amersham Imager 600

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Yu, A., Pratomo, N., Ng, T., Ling, H., Cho, H., Leong, S. S. J., Chang, M. W. Genetic Engineering of an Unconventional Yeast for Renewable Biofuel and Biochemical Production. J. Vis. Exp. (115), e54371, doi:10.3791/54371 (2016).

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