अक्षय जैव ईंधन और जैव रासायनिक उत्पादन के लिए एक अपरंपरागत खमीर की जेनेटिक इंजीनियरिंग
Summary
We herein report methods on the molecular genetic manipulation of the Yarrowia lipolytica Po1g strain for improved gene deletion efficiency. The resulting engineered Y. lipolytica strains have potential applications in biofuel and biochemical production.
Abstract
Yarrowia lipolytica एक, गैर रोगजनक द्विरूपी और कड़ाई से एरोबिक खमीर प्रजातियों है। अपनी विशिष्ट शारीरिक विशेषताओं और चयापचय विशेषताओं के कारण, इस अपरंपरागत खमीर न केवल फंगल भेदभाव के मौलिक प्रकृति के अध्ययन के लिए एक अच्छा मॉडल है, लेकिन यह भी जैव रासायनिक उत्पादन और विभिन्न जैव प्रौद्योगिकी अनुप्रयोगों, जो व्यापक आनुवंशिक जोड़तोड़ की आवश्यकता के लिए एक आशाजनक माइक्रोबियल मंच है। हालांकि, वाई के आनुवंशिक जोड़तोड़ lipolytica एक कुशल और स्थिर आनुवंशिक परिवर्तन प्रणाली की कमी के रूप में अच्छी तरह से गैर मुताबिक़ पुनर्संयोजन की दर बहुत अधिक है कि मुख्य रूप KU70 जीन को जिम्मेदार ठहराया जा सकता है के कारण सीमित कर दिया गया है। यहाँ, हम कुशल आनुवंशिक परिवर्तन के लिए और वाई में जीन विलोपन के लिए एक आसान और तेजी से प्रोटोकॉल की रिपोर्ट lipolytica Po1g। सबसे पहले, वाई में exogenous डीएनए के कुशल परिवर्तन के लिए एक प्रोटोकॉल lipolytica Po1g स्थापित किया गया था। सेकोएन डी, लक्ष्य जीन के आगे हटाने के लिए बढ़ाया डबल-विदेशी मुताबिक़ पुनर्संयोजन दर प्राप्त करने के लिए, KU70 जीन 1 केबी अनुरूपता हथियार ले जा रहे एक व्यवधान कैसेट बदलने से हटाया गया था। तीसरा, KU70 जीन के हटाए जाने के बाद बढ़ाया जीन विलोपन दक्षता प्रदर्शित करने के लिए, हम व्यक्तिगत रूप से शराब डिहाइड्रोजनेज और शराब oxidase KU70 पीटकर मंच तनाव पर एक ही प्रक्रियाओं का उपयोग एन्कोडिंग 11 लक्ष्य जीन नष्ट कर दिया। यह देखा गया है कि सटीक मुताबिक़ पुनर्संयोजन की दर हटाने के लिए कम से कम 0.5% से काफी वृद्धि हुई Po1g KU70 Δ में 11 लक्ष्य जीन की एकल जीन विलोपन के लिए Po1g में KU70 जीन 33% -71% तक की। एक replicative hygromycin बी प्रतिरोध मार्कर और रचनात्मक / LoxP प्रणाली को ले जाने प्लाज्मिड निर्माण किया गया था, और खमीर पीटकर उपभेदों में चयन मार्कर जीन अंततः targe के कई दौर की सुविधा के लिए Cre recombinase की अभिव्यक्ति से हटा दिया गया थाटेड आनुवंशिक जोड़तोड़। जिसके परिणामस्वरूप एकल जीन विलोपन म्यूटेंट जैव ईंधन और जैव रासायनिक उत्पादन में संभावित आवेदन किया है।
Introduction
Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica, एक अपरंपरागत खमीर के विपरीत, पर्यावरण की स्थिति 1,2 में बदलाव के जवाब में खमीर या फुई के रूप में विकसित कर सकते हैं। इस प्रकार, इस द्विरूपी खमीर कवक भेदभाव, morphogenesis और वर्गीकरण 3,4,5 के अध्ययन के लिए एक अच्छा मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। यह आम तौर पर एक सुरक्षित (GRAS) खमीर प्रजातियों, जो व्यापक रूप से इस तरह के कार्बनिक अम्ल, polyalcohols, सुगंध यौगिकों, पायसीकारी और surfactants 6,7,8,9 के रूप में खाद्य additives की एक किस्म के उत्पादन के लिए प्रयोग किया जाता है के रूप में माना जाता है। यह एक लाचार aerobe और एक अच्छी तरह से जाना जाता है चिकना खमीर स्वाभाविक रूप से उच्च मात्रा में लिपिड जमते में सक्षम है, यानी, अप सेल सूखी वजन 10 से 70% करने के लिए है। यह भी पोषक तत्वों 11,12,13 के रूप में अपशिष्ट संसाधनों में अवशेष के विभिन्न प्रकार सहित, विकास के लिए कार्बन सूत्रों की एक व्यापक स्पेक्ट्रम का उपयोग कर सकते हैं। इन अद्वितीय सुविधाओं के सभी वाई बनाना lipolytica के लिए बहुत आकर्षकविभिन्न जैव प्रौद्योगिकी अनुप्रयोगों।
हालांकि वाई के पूरे जीनोम अनुक्रम lipolytica 14,15 प्रकाशित किया गया है, इस अपरंपरागत खमीर की आनुवंशिक हेरफेर अन्य खमीर प्रजातियों की तुलना में अधिक जटिल है। सबसे पहले, यह खमीर प्रजातियों के परिवर्तन एक स्थिर और कुशल आनुवंशिक परिवर्तन प्रणाली 16,17 के अभाव के कारण बहुत कम ही कुशल है। दूसरा, रैखिक अभिव्यक्ति कैसेट की श्रमसाध्य जीनोमिक एकीकरण सामान्यतः के रूप में कोई प्राकृतिक episomal प्लाज्मिड प्रणाली इस खमीर 18 में पाया गया है हित के जीनों की अभिव्यक्ति के लिए प्रयोग किया जाता है। तीसरा, आनुवंशिक तोड़े बहिष्कार और दस्तक-इन की पीढ़ी सीमित कर रहे हैं, क्योंकि जीन इस खमीर में सटीक मुताबिक़ पुनर्संयोजन के माध्यम से दक्षता को लक्षित कम है और सबसे एकीकरण घटनाओं गैर मुताबिक़ अंत में शामिल होने के (NHEJ) 19 के माध्यम से हो।
इस अध्ययन में, हम वाई के लिए एक अनुकूलित परिवर्तन प्रोटोकॉल रिपोर्ट lipolytica </उन्हें> Po1g तनाव है, जो आसान तेजी से, कुशल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है। सटीक मुताबिक़ पुनर्संयोजन की आवृत्ति को बढ़ाने के लिए, हम KU70 जीन है, जो NHEJ मार्ग में एक महत्वपूर्ण एंजाइम को कूटबद्ध नष्ट कर दिया। अनुकूलित परिवर्तन प्रोटोकॉल का उपयोग और 1 केबी का अनुरूपता क्षेत्रों flanking, वाई के KU70 जीन से युक्त एक रेखीय पीटकर कैसेट बदलने से lipolytica Po1g सफलतापूर्वक नष्ट कर दिया गया था। इस जीन विलोपन कार्यप्रणाली की मजबूती तो Po1g KU70 Δ तनाव में शराब डिहाइड्रोजनेज और शराब oxidase जीन को निशाना द्वारा प्रदर्शन किया गया। यह देखा गया है कि KU70 विलोपन तनाव जंगली प्रकार Po1g तनाव की तुलना में लक्षित कर मुताबिक़ पुनर्संयोजन की मध्यस्थता जीन की एक काफी उच्च दक्षता का प्रदर्शन किया। इसके अलावा, एक replicative Cre अभिव्यक्ति hygromycin बी प्रतिरोध मार्कर ले जाने प्लाज्मिड मार्कर बचाव प्रदर्शन करने के लिए निर्माण किया गया था। मार्कर बचाव वीं में लक्षित जीन के कई दौर की सुविधाई जीन विलोपन म्यूटेंट प्राप्त की। जीन विलोपन इसके अलावा, आनुवंशिक परिवर्तन और जीन विलोपन यहाँ वर्णित के लिए हमारे प्रोटोकॉल विशिष्ट लोकी के लिए जीन डालने के लिए, और वाई में साइट विशेष उत्परिवर्तन लागू करने के लिए लागू किया जा सकता lipolytica जीनोम।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस अध्ययन के लिए हमारा उद्देश्य के वाई में लक्षित जीन नॉकआउट की त्वरित और कुशल पीढ़ी को सक्षम करने के लिए है lipolytica Po1g तनाव। कई कारणों से इस लक्ष्य को हासिल करने के लिए संबोधित करने की जरूरत है। स?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम कृतज्ञता सिंगापुर (ETRP 1201102) के राष्ट्रीय पर्यावरण एजेंसी से धन समर्थन स्वीकार करते हैं, सिंगापुर के नेशनल रिसर्च फाउंडेशन (एनआरएफ-CRP5-2009-03), विज्ञान, प्रौद्योगिकी और सिंगापुर के अनुसंधान के लिए एजेंसी के प्रतियोगी अनुसंधान कार्यक्रम ( 1324004108), वैश्विक अनुसंधान एवं विकास परियोजना कार्यक्रम, ज्ञान अर्थव्यवस्था मंत्रालय, कोरिया गणराज्य (N0000677), डिफेंस थ्रेट रिडक्शन एजेंसी (DTRA, HDTRA1-13-1-0037) और सिंथेटिक बायोलॉजी सिंगापुर के राष्ट्रीय विश्वविद्यालय के पहल ( DPRT / 943/09/14)।
Materials
| Reagent/Material | |||
| Oligonucleotide primers | Integrated DNA Technologies | 25 nmole DNA oligos | |
| Y. lipolytica strain Po1g | Yeastern Biotech | leucine auxotrophic derivative of the wild-type strain W29 (ATCC 20460) | |
| Vector pYLEX1 | Yeastern Biotech | FYY203-5MG | Y. lipolytica expression vector |
| E. coli TOP10 | Invitrogen | For cloning and propagation of plasmids | |
| pGEM-T vector | Promega | A3600 | TA cloning vector |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | For plasmid isolation |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System |
Promega | A9282 | Extract DNA fragments from agarose gels and purify PCR products from an amplification reaction |
| The iProof high-fidelity DNA polymerase |
Bio-Rad | 172-5302 | High-fidelity DNA polymerase |
| BamHI | New England Biolabs | R0136S | Restriction enzyme |
| BglII | New England Biolabs | R0144L | Restriction enzyme |
| KpnI | New England Biolabs | R0142S | Restriction enzyme |
| NdeI | New England Biolabs | R0111S | Restriction enzyme |
| NotI | New England Biolabs | R0189L | Restriction enzyme |
| PmlI | New England Biolabs | R0532S | Restriction enzyme |
| PstI | New England Biolabs | R0140S | Restriction enzyme |
| SacII | New England Biolabs | R0157S | Restriction enzyme |
| SalI | New England Biolabs | R0138S | Restriction enzyme |
| XhoI | New England Biolabs | R0146L | Restriction enzyme |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202L | |
| Taq DNA polymerase | Bio-Rad | M0267L | |
| Ampicillin | Gibco-Life Technologies | 11593-027 | Antibiotics |
| Hygromycin B | PAA | P21-014 | Antibiotics |
| GeneRuler 1 kb DNA ladder | Thermo Scientific | SM0312 | 1 kb DNA ladder |
| PEG4000 | Sigma | 95904-F | |
| Tris | Promega | H5135 | |
| EDTA | Bio-Rad | 161-0729 | |
| Salmon Sperm DNA | Invitrogen | 15-632-011 | |
| Lithium Acetate | Sigma | ||
| Acetic acid | Sigma | ||
| Glass beads (425-600 µm) | Sigma | G8772 | |
| RNAse A | Thermo Scientific | EN0531 | |
| DNA Loading Dye | Thermo Scientific | R0611 | |
| Bacto Yeast Extract | BD | 212750 | |
| Bacto Peptone | BD | 211677 | |
| D-Glucose | 1st Base | BIO-1101 | |
| YNB without amino acids | Sigma | Y0626 | |
| DO Supplement-Leu | Clontech | 630414 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| Difco LB Broth | BD | 244620 | |
| Difco LB Agar | BD | 244520 | |
| Bacto Agar | BD | 214010 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| PCR machine | Biorad | T100 Thermal Cycler | |
| Water bath | Memmert | WNB 14 | |
| Stationary/Shaking Incubator | Yihder | LM-570RD | |
| Thermo-shaker | Allsheng | MS-100 | |
| Micro centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Spectrophotometer | Eppendorf | BioPhotometer plus | |
| Gel imager | GE | Amersham Imager 600 | |
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